Summary
Biokompatiblen pH anspricht Sol-Gel-Nanosensoren können in Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) elektro Gerüste eingebracht werden. Die hergestellten Selbstberichts Gerüste können für die in situ Überwachung von Mikroumgebungsbedingungen, während die Kultivierung von Zellen auf dem Gerüst verwendet werden. Dies ist vorteilhaft, da die 3D-Zellkonstrukt kann in Echtzeit, ohne den Versuch zu stören überwacht werden.
Abstract
Kultivieren von Zellen in 3D auf entsprechenden Gerüsten wird gedacht, um besser imitieren die In-vivo-Mikroumgebung und erhöhen die Zell-Zell-Interaktionen. Das resultierende 3D-Zellkonstrukt kann oft mehr relevant für die Untersuchung der molekularen Ereignisse und Zell-Zell-Interaktionen als vergleichbare Experimente untersucht in 2D. Um wirksam zu 3D-Kulturen mit hoher Zelllebensfähigkeit in der gesamten Gerüst erstellen die Kulturbedingungen, wie Sauerstoff und pH-Wert müssen sorgfältig wie Gradienten in Analyt-Konzentration gesteuert werden kann in der gesamten 3D-Konstrukt existieren. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen pH anspricht Sol-Gel-Nanosensoren und deren Einbau in Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) elektro Gerüste sowie deren anschließende Herstellung für die Kultur von Säugetierzellen. Die pH anspricht Gerüste können als Werkzeuge zur pH der Mikroumgebung innerhalb eines 3D-Zellkonstrukt bestimmen werden. Darüber hinaus haben wir ausführlich die Lieferung der pH-Wert reagieren nanosensors auf die intrazelluläre Umgebung von Säugerzellen, deren Wachstum durch elektro PLGA Gerüste unterstützt. Die zytoplasmatische Lokalisierung der pH anspricht Nanosensoren können verwendet werden, um intrazellulären pH (pHi) im laufenden Experimenten überwachen.
Introduction
Eine Schlüsselstrategie im Tissue Engineering ist die Verwendung von biokompatiblen Materialien, um Gerüste, deren Morphologie ähnelt das Gewebe, es geht zu ersetzen und ist auch in der Lage ist das Zellwachstum und Funktion 1,2 herzustellen. Das Gerüst mechanischen Halt, indem die Zellhaftung und Proliferation ermöglicht Zellmigration noch in den Zwischenräumen eines 3D-Zellkonstrukt. Das Gerüst muss auch für den Massentransport von Zelle Nährstoffe zu ermöglichen und Abtransport von Stoffwechsel 3 nicht hemmen.
Elektro wurde als vielversprechendes Verfahren zur Herstellung von polymeren Gerüsten in der Lage ist das Zellwachstum 4-6 entstanden. Die hergestellten Vlieselektrogesponnenen Fasern sind für das Zellwachstum, wie sie sind oft porös und ermöglichen Zell-Zell-Wechselwirkung als auch die Zellmigration in den Zwischenräumen eines 3D-Zellkonstrukt 7. Es ist wichtig, die Lebensfähigkeit der Zellen während t überwachener Kulturperiode und diese Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten ist in der gesamten 3D-Konstrukt erhalten. Beispielsweise Kulturbedingungen, wie beispielsweise Sauerstoff und pH erfordern eine sorgfältige Kontrolle, wie Gradienten in Analytkonzentration innerhalb des 3D-Konstrukt vorhanden sind. Bioreaktoren oder Perfusions-Systeme eingesetzt werden, um in vivo-Bedingungen der interstitiellen Fluss und als Ergebnis Anstieg Nährstofftransfer und Stoffwechselabfallbeseitigung 8 imitieren. Die Frage, ob solche Systeme eine konstante Mikroumgebungsbedingungen, kann durch die Beurteilung der zellulären Mikroumgebung in Echtzeit behandelt werden.
Schlüssel Mikro Metriken, die in Echtzeit überwacht werden könnten, umfassen: Temperatur, chemische Zusammensetzung der Zellmedien, die Konzentration von gelöstem Sauerstoff und Kohlendioxid, pH-Wert und Feuchtigkeit. Von diesen Messdaten kann die Temperatur am leichtesten überwacht werden unter Verwendung von in situ-Sonden. Methoden für die Überwachung der übrigen aufgeführten Kennzahlen häufig involve Entfernung eines aliquoten für die Probenahme und deshalb stören die Zellkultur und das Kontaminationsrisiko zu erhöhen. Kontinuierliche Echtzeit-Methoden werden gesucht. Aktuelle Überwachungsmethoden der Regel verlassen sich auf Instrumente, die körperlich untersuchen die zelluläre Konstrukt wie einem pH-Monitor oder Sauerstoffsonde. Allerdings können diese invasiven Methoden der zellulären Konstrukt schädigen und stören den laufenden Experiments. Nichtinvasive Überwachung des Analyt-Konzentrationen in der 3D-Konstrukt konnte die Echtzeitüberwachung von verschiedenen Umweltaspekte wie Nährstoffverarmung 9 zu ermöglichen. Dies würde Beurteilung der Nährstoffzufuhr in tiefere Regionen innerhalb der Struktur zu ermöglichen und zu bestimmen, ob Stoffwechselschlacken wurde effektiv 10,11 entfernt. Systeme, die mit der Frage der Invasivität ehen versuchen im allgemeinen die Verwendung eines Durchblutung Kammer, die Kulturmedium sowohl durch das Kulturgefäß und an externe Sensoren geht auf pH-Wert, Sauerstoff-und Glukose-Monitor 12. DieRe ist ein zunehmendes Interesse an der Entwicklung Sensoren, die direkt in das Kulturgefäß, das keine Entfernung eines Aliquots zum Abtasten erfordern und als solche in-situ-Überwachung vorsehen würde integriert werden können.
Um solche Mängel zu adressieren in situ und nichtinvasive Überwachung des Mikroumgebungsbedingungen haben wir Analyten reagiert Nanosensoren in die elektro Gerüste eingebaut, um Selbst-Berichterstattung Gerüste 13 zu produzieren. Leitschienen, die als Sensoren wirken durch Überwachen Fluoreszenzaktivität vorher hergestellt worden ist, wobei die Erfassungsvorrichtung entweder die tatsächlichen Polymergerüst die durch Elektrospinnen oder durch den Einsatz eines Analyten ansprechenden Farbstoff, der in das Polymer vor der Gerüstbildung 14,15 aufgenommen wird . Allerdings haben diese Messvorrichtungen das Potenzial, fehlerhafte optische Ausgänge durch mögliche Störungen von anderen Analyten verursacht zu geben. Die Verwendung eines ratiometrischen Erfassungseinrichtung such wie in dem beschriebenen Protokoll hergestellt hält das Potential, diese mögliche Nebenwirkungen zu beseitigen und eine Antwort für den Analyten spezifisch in Frage.
Die hier vorgestellten elektro Gerüste wurden aus dem synthetischen Copolymers Poly (milch-co-Glykolsäure) (PLGA) erstellt wurde, durch ausgewählte, die Food and Drug Administration (FDA) die Genehmigung, die aufgrund ihrer biologischen Abbaubarkeit und Biokompatibilität und eine Spur Rekord, das Wachstum und die Funktion der verschiedenen Zelltypen 16-18. Die vorbereiteten ratiometrischen Analyt reagiert Nanosensoren reagieren auf pH-Wert. Die Nanosensoren sind mit zwei Fluoreszenzfarbstoffe in ein Sol-Gel biokompatiblen Matrix, einen Farbstoff, FAM ist in Reaktion auf pH-Wert und die andere wirkt TAMRA als interner Standard, da es nicht in Reaktion auf pH-Wert. Ferner die Fluoreszenz sowohl des FAM und TAMRA separat analysiert, da sie nicht wesentlich überlappen. Bestimmung des Verhältnisses der Fluoreszenz EMISsion beider Farbstoffe bei bestimmten Wellenlängen einen pH-Antwort unabhängig von anderen Umgebungsbedingungen. Die selbst Berichterstattung Gerüste könnten Wiederholungs Beurteilung der pH-Wert in situ und in Echtzeit ermöglichen, ohne dass der entwickelte 3D-Modell. Wir haben gezeigt, dass diese Gerüste sind in der Lage ist die Zellhaftung und-proliferation und weiterhin in Reaktion auf den Analyten in Frage. Die Kinetik der sauren Nebenprodukte in Konstrukte bleibt under und als solche mit den pH anspricht Gerüste könnte erheblich erleichtert diese Untersuchungen 19. Darüber hinaus stellt die Verwendung der Selbstberichts Gerüste für Tissue-Engineering-Anwendungen die Möglichkeit, vollständig zu verstehen, zu überwachen und optimieren das Wachstum von 3D-Modell in vitro Gewebekonstrukte, nicht-invasiv und in Echtzeit.
Die pH-Nanosensoren reagieren auch auf die intrazelluläre Umgebung von Fibroblasten auf PLGA elektro Gerüsten kultiviert geliefert wordends. Das Verhältnis der Fluoreszenzemission von der Farbstoffe wurden verwendet, um pHi überwachen und im Vergleich zu einem Selbst-Berichterstattung Gerüst Einarbeiten pH Nanosensoren. Die Lieferung von Nano Zellen in einer 3D Umgebung kultiviert konnte Überwachung Analytkonzentration tief innerhalb des Konstrukts in einer zerstörungsfreien Art und Weise zu ermöglichen. Daher Nanosensoren kann eine tragfähige Imaging-Tool, um zerstörungsfrei beurteilen Zellverhalten im gesamten 3D-Konstrukte ermöglicht langfristige Analyse sein. Screening der Analytkonzentration von einzelnen Zellen in einer 3D-Konstrukt könnte sicherstellen, dass sie ausreichend mit Nährstoff-und Sauerstoffkonzentrationen. Überwachungsverfahrensparameter konnte bei der Entwicklung von standardisierten Techniken zur effektiven Massentransport von Sauerstoff und Nährstoffen zu unterstützen. Die Lieferung von Nanosensoren auf die intrazelluläre Umgebung und Einbau von Nanosensoren in polymere Gerüste könnten kombiniert werden, die Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen sowie Gerüst Leistung in 3D const ermöglichenructs während der Gewebewachstumsprozess. Dies kann zu mehr Wissen dieser Konstrukte führen und Fortschritte die Herstellung von biologisch relevanten Gewebeersatz.
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Protocol
Überblick
Abschnitt 1 beschreibt die Herstellung von pH-Wert reagieren Nanosensoren und Charakterisierung von Nanosensor Reaktion auf pH-Wert mit Fluoreszenzspektroskopie und ihrer Größe mit SEM.
Abschnitt 2 beschreibt die Herstellung von elektroPolymerGerüsten und Charakterisierung von ihrer Morphologie und Größe mit SEM. Abschnitt 2 beschreibt auch die Herstellung von Selbstberichts Gerüste, die elektro Gerüste mit der Aufnahme der pH-Wert reagieren Nanosensoren sind. Die daraus resultierenden Selbstberichts Gerüste werden von SEM charakterisiert, um zu beurteilen, ob morphologische Veränderungen der elektrogesponnenen Fasern ist aufgetreten. Die Fluoreszenz von den Selbstberichts Gerüste aus den Nanosensoren eingearbeitet resultiert, wird durch konfokale Mikroskopie beurteilt.
Abschnitt 3 beschreibt die Kultur der Zellen auf die elektro Gerüst und die Selbstberichts Schafott. Die Gerüste werden zunächst in preparat sterilisiertIonen für die Zellkultur, die die folgenden Gerüsten werden bewertet, um zu bestimmen, ob die Sterilisation und die Kultur von Zellen auf die Fluoreszenzfähigkeit der Selbstberichts Gerüsten. Das Protokoll beschreibt auch die Lieferung von Nanosensoren auf Zellen, die auf elektro Gerüste kultiviert werden. Lysotracker Farbstoff wird verwendet, um sicherzustellen, dass Nanosensoren nicht in die zellulären sauren Kompartimenten entnommen.
1. Herstellung und Analyse von pH Responsive Sol-Gel-Nanosensoren
1.1 Herstellung von pH Responsive Sol-Gel-Nanosensoren
Hinweis: Diese Vorbereitung sollte in einem Abzug durchgeführt werden.
- Vorbereitung der Fluorophore zur Verwendung im pH-Nano durch Auflösen von 5 - (und-6)-Carboxyfluorescein, Succinimidylester (FAM-SE) (1,5 mg) in Dimethylformamid (DMF) (1 ml) in einem Rundkolben und 6-Carboxytetramethylrhodamin , Succinimidylester (TAMRA-SE) (1,5 mg) in DMF (1 ml) in einem anderen Rundkolben.In 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) (1,5 ml) zu jedem Kolben und rühren unter einer trockenen Stickstoffatmosphäre (21 ° C) für 24 Stunden in der Dunkelheit dh wickeln die Proben in Folie.
- Alle beide der obigen Farbstoffe (250 ul) zu einer Mischung von Ethanol (6 ml) und Ammoniumhydroxid (30 Gew.%, 4 ml) in einem Rundkolben enthalten und rühre 1 Stunde (21 ° C).
- Langsam Tetraethylorthosilikat (TEOS) (0,5 ml) zu dem Gemisch, weiterhin zugegeben und für weitere 2 Stunden. Die Mischung wird trüb. Die Nanosensoren können durch Rotationsverdampfung gesammelt werden. Nanosensoren können in einem Glasfläschchen bei 4 º C zur weiteren Verwendung gelagert werden.
ACHTUNG: die weitere Handhabung der Nanosensoren in ihrer trockenen Form sollte in einem Abzug oder im Fall der Verwiegung, die Balance sollte beigefügt werden, zum Beispiel in einem Weighsafe durchgeführt werden.
1.2 Nanosensor Antwort auf pH
- Bereiten Sørensen Phosphatpufferlösungen von pH 5,5 bis 8,0 von mixing spezifische Verhältnisse von Mononatriumphosphat (0,2 M) und Natriumhydrogenphosphat (0,2 M) stock-Lösungen. Überprüfen Sie die endgültige pH-Wert mit einem pH-Meter. Machen keine geringfügige Anpassungen der pH-Wert mit Natriumhydroxid (NaOH) (4 M) oder Salzsäure (HCl) (2 M).
- Hängen Sie das pH-Nanosensoren in den pH-Puffer (5 mg / ml), indem zunächst die Haltegefäß, das die Nanosensor-Lösung auf einem Vortex 3 min dann das Eintauchen des Schiffes in einem Ultraschallgerät, bis die Lösung trüb wird (ca. 5 min). Wiederholen Sie diese Schritte, um die Nanosensoren in Lösung vollständig auszusetzen.
- Legen Sie die erste Lösung in einem optischen Küvette und verwenden Anregungswellenlängen von 488 nm für 5 - (und-6)-Carboxy-(FAM) und 568 nm für 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA). Sammeln Sie die Emissionswellenlängen bei 500 bis 530 nm für FAM und 558-580 nm für TAMRA mit einem Fluoreszenz-Spektrometer.
- Ändern der Lösungen in der optischen Küvette, so daß der pH-Wert kann bei unterschiedlichen pH beobachtet werden und weiterhin collecting die Emissionsspektren.
- Berechnen des Verhältnisses der bei jedem pH-Wert erzeugt, um eine Kalibrierungskurve zu erzeugen Emissionsmaxima.
1.3 SEM von Nanosensoren
- Legen Sie eine Probe der Nanosensoren auf eine Kohlenstoff beschichtet Elektronenmikroskop Stub-und Sputter-Mantel mit Gold für 5 min unter Argonatmosphäre.
- Beobachten durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Während der Bilderzeugung einzustellen den Arbeitsabstand, Spannung und Vergrößerung der Elektronenladung (1) zu minimieren.
2. Herstellung und Analyse von PLGA Scaffolds
2.1 Das Elektro PLGA Scaffolds
- In einer Abzugshaube lösen Poly (milch-co-glykolsäure) (PLGA) in Dichlormethan (DCM) (20% (w / w)) mit Pyridinium-Formiat (PF) (1% (w / w)). Platzieren der Lösung in einen 10-ml-Spritze mit einer 18 G Nadel stumpf Füllung und sicheren Sitz mit einer Spritzenpumpe.
- Entfernung der Nadelspitze 20 cm von einem 20cm x 15 cm Aluminium-Sammelplatte.
- Befestigen der Elektrode von einer Hochspannungsstromversorgung mit der Spitze der Spritze und der Erde, um die Aluminiumsammelplatte.
VORSICHT: Achten Sie darauf, wie Hochspannung wird verwendet, dh immer schalten die Stromversorgung aus, bevor Umgang mit einem der Elektrogeräte werden. - Geben Sie sich die Lösung unter Verwendung eines konstanten Fließgeschwindigkeit von 3,5 m / h bei 12 kV für 2 Stunden. Elektrospinning mit diesen Bedingungen geben ein Gerüst Tiefe von etwa 60 um.
- Lassen Sie das Gerüst in einem Abzug für 24 Stunden, damit Lösungsmittelreste zu verdampfen.
2.2 Das Elektro pH Responsive PLGA Scaffolds
- Bereiten Gerüste Einbeziehung pH-Wert reagieren Nanosensoren wie in Abschnitt 2.1, aber mit der Modifikation, dass Nanosensoren zur Polymerlösung (5 mg / ml) beschrieben. Suspend die Nanosensoren in der PLGA-Lösung mit Hilfe der Ultraschallbehandlung (ca. 5 min) vor dem Platzieren in einen 10-ml-Spritze.
2.3 SEM von PLGA Gerüst-und pH-Responsive Gerüst
- Legen Sie eine Probe des PLGA-Gerüst-oder pH-Gerüst reagiert auf eine Kohlenstoff beschichtet Elektronenmikroskop Stub und gehen Sie wie bei SEM von Nanosensoren (Abbildung 1) beschrieben.
2.4 Kalibrierung von pH Responsive Gerüst
- Legen Sie eine Probe der pH-Wert reagieren Gerüst in eine 35 mm Kulturplatte und tauchen in geeigneten Pufferlösungen.
- Auf einem konfokalen Mikroskop mit einem 488 nm Argon-Laser, um die FAM und einem 568 nm Krypton-Laser, die in den Nanosensoren TAMRA erregen erregt. Beachten Sie die Fluoreszenzemission für pH reagiert Gerüste bei 500-530 nm für FAM und 558-580 nm für TAMRA. (Abbildung 2). Verwenden sequentielle Scannen Sammlung von Anregungswellenlängen zu vermeiden.
3. Zellkultur auf PLGA Scaffolds und pH-Responsive PLGA Scaffolds
ntent "> Hinweis: Die folgende Beschreibung ist in einem Zellkulturschrank durchgeführt werden.3.1 Herstellung von PLGA Scaffolds für die Zellkultur
- Schneiden Sie die PLGA-oder pH-Wert reagieren PLGA Scaffolds in 2 cm 2 Stück.
- Sterilisieren Gerüste durch Bestrahlen mit ultraviolettem Licht (UV) in einem Abstand von 8 cm für 15 min auf jeder Seite.
- Übertragen Sie die Gerüste zu einer 12-Well-Kulturplatte und legen Sie eine Stahlring an der Spitze. Eine Lösung von Penicillin / Streptomycin (5% v / v) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf der Innenseite und der Außenseite des Stahlrings, über Nacht inkubiert (37 ° C, 5% CO 2). Hinweis der Stahlring wurde an der Universität von Nottingham hergestellt und hat folgende Abmessungen: Außendurchmesser 2 cm, 1 cm Innendurchmesser von 1 cm Tiefe.
- Entfernen Sie die Sterilisationslösung und waschen mit PBS.
- Hinzufügen Zellkulturmedien auf die Innenseite (500 ul) und außerhalb (500 ul) des Stahlrings, in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2
- Bereiten Sie eine Zellsuspension und führen Sie eine Zellzahl mit einer Trypanblau-Ausschluss-Assay.
- Erstellen einer Zellsuspension bis zu einer Zellzahl von 1 x 10 6 Zellen / ml zu erreichen.
- Entfernen Medien von der Innenseite und Außenseite des Stahlrings.
- Ersetzen mit vorgewärmtem Zellkulturmedium auf der Außenseite des Stahlrings (1 m).
- In 300 ul der Zellsuspension auf der Innenseite der Stahlring - Felsplatte hin und her vorsichtig, um Zellen zu verteilen.
- Setzen Sie den Zellkulturplatte in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) - sollte die Zellhaftung innerhalb von 24 Stunden genommen haben, aber Kultur weiterhin so lange wie das Experiment erfordert - erfrischend die Medien alle 2-3 Tage.
3.2 Nanosensor Lieferung Cells auf PLGA-Gerüst kultiviert
- Seed Zellen auf PLGA-Gerüst, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben. Für diese Studie eine leere PLGA-Gerüst (nicht Containing Nanosensoren) wurde aufgrund der Überlappung der Fluoreszenzemission verwendet bei der Abbildung.
- Küvette ausgesät Gerüst in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 72 Stunden, damit die Zellen wachsen und in dem Gerüst vor der Auslieferung Nano migrieren.
- Vor der Auslieferung Nanosensor (37 ° C, 5% CO 2) Waschen Sie die Zellen mit PBS und ändern Sie das Medium aus Standard-Kulturmedien Antibiotika und Serum-freie Medien, Inkubation für 1 Stunde. Hinweis: Standardkulturmedien für 3T3-Zellen besteht aus Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit fötalem Kälberserum (10% (v / v)), L-Glutamin-Lösung (2 mM), Penicillin / Streptomycin (1% (v / v)) .
- Während der Inkubationszeit bereiten die Nanosensor-Liposom-Komplex durch kurzes Beschallen Nanosensoren (5 mg) mit Optimem (50 ul) der Lösung A erstellen
- Lösung B erstellen, indem Lipofectamine 2000 (5 ul) zu Optimem (45 ul), Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min.
- In LösungA zu Lösung B, Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min Lösung C, die der Nanosensor-Liposom-Komplex zu bilden.
- Lösung C (100 ul) zu den Zellen und inkubiert (37 ° C, 5% CO 2) für 3 Stunden.
- Entfernen Sie die Zelle ausgesät Gerüste aus dem Inkubator, absaugen Medien und zweimal waschen mit PBS, bevor PBS (1 ml), um Live-Cell-Visualisierung durch konfokale Mikroskopie zu ermöglichen. Hinweis: PBS wurde in diesem Protokoll verwendet, so daß der Indikator Phenolrot in Zellkulturmedium nicht vorhanden Autofluoreszenz verursachen und auch, weil eine Kalibrierung bei verschiedenen pH-Wert durchgeführt wird. Allerdings könnte Phenolrot freien Medien für längerfristige Analyse von Zellkulturen verwendet werden.
- Tauchen der Zelle seeded Gerüst in Puffern mit unterschiedlichen pH-und überwacht die Reaktion der Nano mit den Zellen verbunden.
- Überwachen Sie die pHi durch Bestimmung des Verhältnisses der Fluoreszenzintensitäten von FAM und TAMRA durch Beobachtung Fluoreszenz mittels konfokaler Mikroskopie (Figure 3).
3.3 Nanosensor Lage im Säugetierzellen
- Inkubieren Zellen mit Nanosensoren, die nur die, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben FAM-Farbstoff (das ist, weil die Fluoreszenzemission von TAMRA ist in der gleichen Region wie die LysoTracker Rot). Bereiten Sie diese Nanosensoren wie in Abschnitt 1.1, aber mit dem Wegfall der Vorbereitung und Zugabe TAMRA beschrieben.
- Nach der Nanosensor Lieferfrist verdünnen LysoTracker Red-Stammlösung zu 50 nM.
- In einen aliquoten Teil des verdünnten Lösung (2 ul), um Zellen auf PLGA Scaffolds kultiviert.
- Inkubieren der Zellen mit LysoTracker Red 1 h (37 ° C, 5% CO 2).
- Nach der Inkubationsperiode entfernen Medien und wasche die Zellen zweimal mit PBS (pH 7,4) vor dem Wechsel der Medien zu PBS (pH 7,4) (2 ml) in Vorbereitung für die Anzeige mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Hinweis: Phenolrot freien Medien könnte anstelle von PBS verwendet werden.
- Fügen Sie die Kernfärbung Draq5 zum PBS so die Endkonzentration 5 &mgr; M und Inkubation mit den Zellen für 3 min (37 ° C 5% CO 2). Es ist nicht notwendig, um die Medien nach der Inkubationszeit mit DRAQ5 ändern.
- Verwenden Sie einen 488-nm-Argon-Laser, um die FAM nur Nanosensoren anzuregen, eine 568 nm Krypton-Laser, um die LysoTracker Rote und 633 nm Helium / Neon-Laser zu erregen, um die DRAQ5 Chromophor begeistern und zu beobachten Fluoreszenz bei 500-530 nm, 580 bis 600 nm, 650 -750 Nm (Abbildung 3). Verwenden sequentielle Scannen Sammlung von Anregungswellenlängen zu vermeiden.
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Representative Results
Die Größenverteilung der hergestellten pH-Wert reagieren Nanosensoren wurde mit SEM, wo die Bevölkerung von Nanosensoren abgebildet wurden gemessen und mit Nanometer-Dimensionen im Bereich von 240 bis 470 nm (Abbildung 1A) gekennzeichnet haben. Das Erreichen einer engen und relativ kleinen Durchmesser ist konsistent mit der Verwendung der Stöber-Methode, um Nanopartikel herzustellen. Es wurde festgestellt, dass mit einem basischen pH-Umgebung während der Synthese von Nanopartikeln, dh Nanopartikel, die unter Verwendung der Stöber-Methode, ermöglicht eine gute Steuerung der Größe, während Vorbereitung mit sauren Bedingungen produziert eine breite Streuung der Partikelgröße. Repräsentative Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der PLGA elektrogesponnenen Fasern hergestellt unter Verwendung der beschriebenen Verfahren sind in Fig. 1B dargestellt zeigt, daß der hergestellte PLGA-Gerüst besteht aus Vliesfasern Anzeige minimal Bördeln oder Bruch wobei die Fasern Nanometerdimensionen. 1C 1B sind die REM-Aufnahmen belegen Nano Verband auf der Oberfläche der Fasern, jedoch können sie auch innerhalb der Gerüstfasern eingearbeitet werden kann, könnte dieser Abbaustudien Gerüst / Nanosensor Gerüste in Verbindung mit SEM und / oder konfokalen Mikroskopie durchgeführt, um festzustellen, ob sich dies auf die Leistung Nanosensor werden.
Die Fähigkeit der Nano ihrer optischen Aktivität behalten nach Einbau in den PLGA-Fasern wurde durch Untersuchung der Selbstbericht Gerüste mittels konfokaler Mikroskopie verifiziert. Beibehaltung der Fähigkeit, optisch und chemisch aktiv bleiben, wenn sie in die Gerüstfasern einge könnte Analytkonzentrationen überwachen zu können. Das aus den Nanosensoren emittierten Fluoreszenz gezeigt, dass die Nanosensoren retained ihrer optischen Aktivität und sind mit den Gerüstfasern verbunden. Fluoreszenz von der Farbstoffe FAM (grün) emittiert und TAMRA (rot) in den pH anspricht Nanosensoren aufgenommen wird in den 2A und 2B gezeigt. Dies ist ein positives Ergebnis, dass es möglich für Analytkonzentrationen in situ überwacht werden läßt. Es ist auch das erste Mal, dass optisch aktive ratiometrischen Nanosensoren sind mit dem Elektrospinnverfahren in PLGA Gerüstfasern eingearbeitet. Nachdem bestätigt, dass die Nanosensoren können unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie nach Einbau in PLGA Fasern sichtbar werden, wurde die Nano Reaktion auf Änderungen der Analytkonzentration verifiziert. Eintauchen des Gerüsts in Puffern mit unterschiedlichen pH führte zu einer Änderung der Fluoreszenzintensität von der FAM-Farbstoff, während die Fluoreszenz, die von der Referenzfarbstoff TAMRA nicht merklich ändern emittiert. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensität beider Farbstoffe können zu prod verwendet werdenUCE eine Eichkurve wie in Fig. 2C gezeigt. Allein die Eichkurve für Nanosensoren beurteilt und, wenn sie in elektrostatisch PLGA-Gerüst eingebaut ist vergleichbar und zeigt, dass die Nanosensoren behalten ihre optische Aktivität nach der Einarbeitung in die Selbst-Berichterstattung Gerüste. Die Fähigkeit der Selbstberichts Gerüst reversibel an unterschiedlichen pH-Werten reagieren, wurde durch abwechselndes Eintauchen des Gerüsts in Puffern mit pH-Werten von 5,5 und 7,5 ermittelt. Die Reversibilität wurde als sehr gut, wie in Fig. 2D, wo die Selbsterklärung Gerüst kann zu zahlreichen zyklischen Änderungen im pH-Wert reagieren, gezeigt. Langzeitstudien wurden nicht durchgeführt, um die Wirkung von PLGA Abbau bei der Nanosensor Aufnahme beurteilen, es wird vermutet, dass, weil die Nanosensoren bieten eine ratiometrische Reaktion die Menge des vorhandenen Nanosensoren wird das Ergebnis nicht beeinflussen.
Analyten reagiert Nanosensoren wurden mit einem Liposom geliefertal Transfektion Mittel auf die intrazelluläre Umgebung von 3T3 Fibroblasten, deren Wachstum durch Leer PLGA Scaffolds unterstützt. Die konfokale Mikroskopie Bilder von 3T3 Fibroblasten auf PLGA leere Gerüste kultiviert zeigen, dass Nanosensoren sind mit den Fibroblasten-Zellen mit Fluoreszenz von FAM und TAMRA in den 3A und B jeweils beobachtet verbunden. Die Überlagerung der Fluoreszenz von dieser Kanäle zeigt, dass die Fluoreszenz von den beiden Farbstoffe wird co-lokalisiert, was darauf hindeutet, dass die Farbstoffe wurden in den Nanosensoren "biokompatible Matrix (wie durch gelbe Fluoreszenz in 3C dargestellt) gefangen geblieben. Die Nanosensoren sind gedacht, um im Zytoplasma der 3T3 Fibroblasten und nicht in sauren Kompartimenten enthalten wie durch das Fehlen von co-lokalisiert Fluoreszenz von FAM belegt nur Nanosensoren und Lysotracker Red Farbstoff in 3D dargestellt. Die Fluoreszenzintensität der pH-Wert reagieren Nanosensoren lieferned auf 3T3-Fibroblasten wurde überwacht, während die Zellen auf Änderungen im pH, deren Ergebnisse sind in Fig. 3E gezeigt, unterzogen. Die erzeugte Grafik zeigt, dass die Zellen auf die elektro PLGA-Gerüst kultiviert haben eine pHi im Bereich von 6,8 bis 7,0 gehalten.
Fig. 1 ist. REM-Aufnahmen von Nanosensoren, PLGA Fasern und Selbstberichts Gerüste. (A) pH-Wert reagieren Sol-Gel-Nanosensoren, welche sphärische Nanometer große Partikel (B) PLGA elektroVliesFasern in dem Fasermorphologie ist regelmäßig mit minimalen Sicken und Brüche (C) pH-Wert reagieren Selbst-Berichterstattung Gerüste, wo die Nanosensoren beobachtet werden kann, um von vorstehen die PLGA noch Fasermorphologie vergleichbar bleibt mit Steuer PLGA Fasern, die nanos nicht enthaltenEnsors. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
2. Die konfokale Mikroskopie Bilder der pH-Wert reagieren Selbst-Berichterstattung, wo Gerüste Fluoreszenz kann von den Nanosensoren mit den PLGA-Gerüst Fasern verbunden beobachtet werden. (A) FAM (grün) der pH-Wert reagieren Farbstoff und (B) TAMRA (rot) der Referenzfarbstoff. (C) Kalibrierung pH ansprechende Diagramme der Sol-Gel-Nanosensoren und pH-Wert reagieren Gerüste demonstRate, die die optischen und chemischen Reaktion der Nanosensoren nicht betroffen ist, wenn innerhalb der PLGA-Gerüst Fasern eingearbeitet. (D) Reversibilität der Selbstberichts Gerüst durch Eintauchen des Gerüsts in alternativen Pufferlösungen von pH 5,5 und pH 7,5 durchgeführt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3. Die konfokale Mikroskopie Bilder der Zelle internalisiert Nanosensoren und Grafiken der pH-Wert und pHi Antwort. Fluoreszenz von den verinnerlichten Nanosensoren (A) FAM (grün) (B) TAMRA (rot) (C) Co-Lokalisation der Fluoreszenz von FAM und TAMRA (Gelb) ( D) FAM nur Nanosensoren (grün) bis 3T3-Fibroblasten-Kultur geliefertd auf PLGA-Gerüst mit DRAQ5 (magenta) Kennzeichnung des Zellkern und LysoTracker Red (rot) Kennzeichnung von Lysosomen. Die Fluoreszenz von FAM und Lysotracker rot sind nicht co-lokalisiert daher zeigen, dass es unwahrscheinlich ist, dass Nanosensoren wurden in zelluläre Kompartimente internalisiert sauren (E) pHi Messungen von Nanosensoren auf 3T3-Fibroblasten auf einem leeren PLGA Gerüst kultivierten Vergleich zu der pH-Kalibrierung geliefert genommen ist einer pH-Sensorgerüst ohne die Kultur von Zellen. Dies zeigt auch, dass die pH-Messungen durchgeführt, die mit Nanosensoren verinnerlicht sind nicht sauer, wie die Zellen auf die elektro PLGA-Gerüst kultiviert haben eine pHi im Bereich von 6,8 bis 7,0 gehalten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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Discussion
Tissue Engineering strebt biologischen Ersatz zu schaffen, die sowohl in vivo wie in vitro Gewebemodellen und in Gewebeersatztherapie verwendet werden können, um zu reparieren, zu ersetzen, aufrecht zu erhalten oder zu verbessern die Funktion eines bestimmten Gewebe oder Organ. Synthetische Ersatzstoffe verwendet wurden, für viele Jahre zu Hilfe Reparatur von Gewebe zu ersetzen oder aber diese oft nicht aufgrund der schlechten Integration in das Wirtsgewebe und / oder Infektion, die letztlich zu Ablehnung oder weitere Überarbeitung der Operation. Generieren von lebendem Gewebe im Labor vor der Implantation kann die Ausgabe der Verwirklichung einer vollständigen Integration anzugehen und reduzieren die Notwendigkeit für eine Revisionsoperation. Jedoch dieses Ziel verwirklicht werden entsprechende in vitro-Vermehrung und Manipulation von Zellen in der 3D-Konstrukte sollten geeignete physikalische Konditionierung des Gewebes in vitro gekoppelt werden. Dies kann auf verschiedene Weise an einer Erforschung der biologischen Grundlagen weiterhin erreicht werden,beteiligt, sondern auch die Engineering-und Fertigungsprobleme für die Produktion von synthetischen Ersatzbezogenen Forschung. Es ist dieser letzte Punkt, dass die beschriebenen Protokoll zielt darauf ab, bei.
Der Verwendungszweck der beschriebenen PLGA Gerüsten ist es, einen temporären Träger, um Säugetierzellen bereitzustellen, um ihr Wachstum in einem biologisch relevanten Struktur unterstützen. Der Einbau von Analyten reagiert Nanosensoren in die PLGA Gerüste können lokale Analyt-Konzentrationen in der gesamten 3D-Konstrukt während der Gewebewachstumsprozess überwacht werden. Die Verwendung von pH-Wert anspricht, Gerüste könnte die Bestimmung, ob sauren Nebenprodukte als Gerüst abbaut und wachsen in Zellen produziert werden effektiv aus einem 3D-Konstrukt entfernt zu ermöglichen. Dies ist ein Schritt, um den derzeitigen Mangel an Prozessüberwachung und Steuerung von in-vitro-Geweberegenerationsprozessen. Die Nutzung von Gerüsten, die werden sich Messvorrichtungen können aktivierensitu, Echtzeit-Mikroumgebungsbewertung. Die Überwachung der Mikroumgebung Konstrukt ohne Beschädigung des Gewebes ist wichtig, und wird die Prozessüberwachung in allen Phasen der Tissue-Produktion zu ermöglichen.
Die Fähigkeit des hergestellten pH anspricht Gerüst, um die lokale Konzentration des Analyten zu melden wurde durch Überwachen der Fluoreszenzausgabe von den Nano mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Eine Kalibrierung Experiment wurde für die pH-Mess Gerüst durchgeführt und nachgewiesen vergleichbar mit der von den pH anspricht Nano nicht in PLGA Fasern eingebaut. Die Fähigkeit, eine Kalibrierungskurve zu erzeugen zeigt, dass die Nano verbleiben als Reaktion auf Änderungen im pH, wenn sie in dem Polymergerüst eingebaut und auch, dass der Prozess der Sterilisation der Gerüste keine nachteiligen Auswirkungen auf die Fähigkeit der Sensor pH Nano verursachen. Weiterhin wurden Nanosensoren auf die intrazelluläre Umgebung von Zellen auf PLGA Scaffolds kultiviert geliefert where zelluläre Reaktion auf Änderungen der pHi überwacht werden. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von FAM und TAMRA wurden verwendet, um den pH i zu überwachen und mit einem pH-Wert anspricht, Gerüst, was darauf hindeutet, dass die 3T3-Fibroblasten-Zellen eine pHi im Bereich von pH 6,8 bis 7 gehalten. Inkubieren 3T3 Fibroblasten, die mit Nanosensoren mit der Kernfärbung DRAQ5 transfiziert zeigte, dass die Mehrheit der Zelle zugeordneten Nanosensoren nicht in der Kernregion. Nanosensor Lage scheint nicht in sauren Kompartimente wie Endosomen oder Lysosomen, wie durch Inkubation der Nanosensor transfizierten 3T3-Fibroblasten mit LysoTracker Rot, wo die Co-Lokalisierung von FAM und LysoTracker Red würde durch gelbe Pixel in konfokalen Bildern dargestellt werden bestimmt. Weitere Studien wie die Analyse durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Identifizierung biologischer Marker für die Internalisierung Wege könnte dies weiter zu verifizieren. Zusätzlich Langzeitstudien wie zeitaufgelöste konfokale Mikroskopiekönnte die langfristige Schicksal der Nanosensoren in den Zellen auf Selbstberichts Gerüste kultiviert bestimmen. Wenn Nano waren, um zu anderen Zelltypen abgegeben werden dann ihre Lage als Folge identifiziert werden können, nicht das gleiche wie das hier gezeigt ist.
Die Verwendung von Selbstberichts Gerüste haben das Potenzial, Mikroumgebungsbedingungen innerhalb des Gewebes Konstrukte nichtinvasiv zu überwachen. Mit der Fähigkeit zur in-situ-Messungen durchgeführt werden konnten ermöglichen die Optimierung des Wachstums von 3D-Gewebekonstrukten in vitro nichtinvasiv und in Echtzeit. Die cytoplasmatische Lage der pH-Wert reagieren Nanosensoren können eingesetzt werden, um pHi während des laufenden Experimente überwachen. Die an die interne Umgebung von Zellen oder Selbstberichts Gerüste geliefert Nanosensoren können sowohl innerhalb als statische oder dynamische Zellkultur-Systemen verwendet werden und kann auf die Bestimmung der für ein optimales Wachstum von Gewebe Konstrukte in erforderlich Kulturbedingungen führenvitro. Die weitere Entwicklung kann zu einem Online-System, die auf Nährstoffverarmung handeln gewährleisten eine konsistente Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff durch das Konstrukt letztlich die ein sehr reproduzierbare Methode für die Kultur der Gewebekonstrukte führen.
Die beschriebenen Protokolle wurden Gerüste mit geeigneten, damit Bildgebung mittels konfokaler Mikroskopie jedoch zu größeren 3D-Konstrukte ermöglichen Multi-Photonen-Anregung abzubildenden Abmessungen hergestellt werden, können erforderlich sein, um tiefer in Abbildungs Konstrukte ermöglichen. Die optische Ausrüstung wie das Mikroskop-Objektiv verwendet wird, sollte ausgewählt werden, um den optimalen Arbeitsabstand für die Linse und das Konstrukt Dimensionen zu bestimmen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Finanzierung aus dem BBSRC wird freundlich quittiert (Förderkennzeichen BB H011293 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
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