Summary
PH biocompatibles adaptés nanocapteurs sol-gel peuvent être incorporés dans le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) échafaudages électrofilées. Les échafaudages d'auto-déclaration produits peuvent être utilisés pour la surveillance in situ des conditions micro-environnementales dans tout la culture de cellules sur l'échafaud. Cela est bénéfique que la construction cellulaire 3D peut être contrôlé en temps réel sans perturber l'expérience.
Abstract
La culture de cellules en 3D sur des échafaudages appropriés est pensé pour mieux imiter le microenvironnement in vivo et augmenter les interactions cellule-cellule. La construction cellulaire 3D obtenu peut souvent être plus pertinent d'étudier les événements moléculaires et interactions cellule-cellule que des expériences similaires étudiés en 2D. Pour créer des cultures 3D efficaces avec la viabilité cellulaire élevée tout au long de l'échafaud les conditions de culture tels que l'oxygène et le pH ont besoin d'être soigneusement contrôlé que les gradients de concentration de l'analyte peuvent exister tout au long de la construction 3D. Nous décrivons ici des procédés de préparation de pH biocompatibles adaptés nanocapteurs sol-gel et leur incorporation dans le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) échafaudages électrofilées ainsi que leur préparation ultérieure pour la culture de cellules de mammifères. Les échafaudages pH sensibles peuvent être utilisés comme outils pour déterminer microenvironnement pH dans une construction cellulaire 3D. En outre, nous détaillons la livraison de pH nanose sensiblensors à l'environnement intracellulaire de cellules de mammifères dont la croissance a été soutenue par des échafaudages PLGA électrofilé. La localisation cytoplasmique des pH nanocapteurs sensibles peut être utilisé pour contrôler le pH intracellulaire (pHi) lors de l'expérimentation en cours.
Introduction
Une stratégie clé dans l'ingénierie tissulaire est l'utilisation de matériaux biocompatibles pour fabriquer des échafaudages dont la morphologie ressemble le tissu qu'il va remplacer et est également capable de soutenir la croissance et la fonction 1,2 cellule. La matrice de support fournit un support mécanique en permettant la fixation des cellules et la prolifération permet encore de la migration des cellules à travers les interstices d'une construction cellulaire 3D. L'échafaudage doit également permettre le transport de masse de nutriments cellulaires et pas inhiber l'enlèvement des déchets métaboliques 3.
Électrofilage a émergé comme un procédé prometteur pour la fabrication d'échafaudages polymères capables de soutenir la croissance cellulaire de 4-6. Les fibres électrofilées non tissées produites sont appropriées pour la croissance cellulaire car elles sont souvent poreuses et permettent l'interaction cellule-cellule, ainsi que la migration des cellules à travers les interstices d'une construction 3D cellulaire 7. Il est important de surveiller la viabilité des cellules au cours de til période de culture et de faire en sorte que la viabilité cellulaire est maintenue tout au long de l'ensemble de la construction 3D. Par exemple, des conditions de culture, tels que l'oxygène et le pH nécessitent un contrôle soigneux, que les gradients de concentration de l'analyte peut exister dans le produit de construction 3D. Bioréacteurs ou des systèmes de perfusion peuvent être utilisés pour mimer les conditions in vivo de débit interstitiel et en tant que résultat de l'augmentation transfert des nutriments et l'élimination des déchets du métabolisme 8. La question de savoir si ces systèmes sont en s'assurant des conditions de micro constants peut être adressée en évaluant le microenvironnement cellulaire en temps réel.
Les principaux paramètres de micro-environnement qui pourraient être surveillés en temps réel comprennent: la température, la composition chimique du support de cellules, la concentration de l'oxygène dissous et le gaz carbonique, le pH et l'humidité. Parmi ces paramètres, la température peut être plus facilement contrôlée en utilisant des sondes in situ. Méthodes de suivi des mesures énumérées restants couramment dansenlèvement de volve d'une aliquote d'échantillonnage et donc perturbent la culture cellulaire et d'augmenter le risque de contamination. , Les méthodes en temps réel en continu sont recherchés. Méthodes actuelles de surveillance s'appuient généralement sur des instruments qui sondent physiquement la construction cellulaire comme un moniteur de pH ou de la sonde d'oxygène. Cependant, ces méthodes intrusives peuvent endommager la construction cellulaire et perturber l'expérience en cours. Surveillance non invasive des concentrations de l'analyte dans la construction 3D pourrait permettre un suivi en temps réel des différents aspects environnementaux tels que l'épuisement des nutriments 9. Cela permettrait une évaluation de l'apport de nutriments à l'intérieur des régions plus profondes de la structure et déterminer si les déchets métaboliques a été éliminé efficacement 10,11. Les systèmes qui tentent de répondre à la question de l'invasivité impliquent généralement l'utilisation d'une chambre de perfusion qui passe à travers un milieu de culture à la fois du récipient de culture et à des capteurs externes pour surveiller le pH, l'oxygène et le glucose, 12. Lare un intérêt croissant dans le développement de capteurs qui peuvent être directement intégrées dans le récipient de culture qui ne nécessitent pas l'élimination d'une partie aliquote de l'échantillonnage et en tant que tel serait d'assurer une surveillance in situ.
Pour remédier à ces lacunes pour in situ et de la surveillance non invasive des conditions micro-environnementales que nous avons incorporés analyte nanocapteurs sensibles dans les échafaudages électrofilées à produire des échafaudages d'auto-déclaration 13. Les échafaudages qui agissent dispositifs comme de détection par contrôle de l'activité de fluorescence ont été préparés préalablement, où le dispositif de détection est soit l'échafaudage polymérique réelle créée par électrofilage ou par l'utilisation d'un colorant sensible à l'analyte, qui est incorporé dans le polymère avant la formation de l'échafaudage 14,15 . Cependant, ces dispositifs de détection ont le potentiel d'améliorer les sorties optiques erronées causées par des interférences provenant d'autres analytes possible. L'utilisation d'un dispositif de détection ratiométrique such que ceux préparés dans le protocole décrit détient le potentiel d'éliminer ces effets indésirables possibles et apporter une réponse spécifique à l'analyte en question.
Les échafaudages électrofilées présentés ici ont été préparés à partir de poly co-polymère synthétique (acide lactique-co-glycolique) (PLGA), choisi en raison d'avoir Food and Drug Administration (FDA), en raison de ses propriétés biodégradables et biocompatibles et une piste enregistrement de soutenir la croissance et la fonction des divers types de cellules 16 à 18. Les analytes quotientométrique nanocapteurs sensibles préparés sont sensibles au pH. Les nanocapteurs incorporent deux colorants fluorescents dans une matrice sol-gel biocompatible, où un colorant, FAM est sensible au pH et l'autre, TAMRA agit comme étalon interne car il n'est pas sensible aux pH. En outre, la fluorescence des deux FAM et TAMRA peut être analysé séparément car elles ne se chevauchent pas de manière significative. La détermination du rapport de la fluorescence de emission de deux colorants à des longueurs d'onde spécifiques donne une réponse de pH indépendant d'autres conditions environnementales. Les échafaudages d'auto-déclaration pourraient permettre l'évaluation de la répétition de pH in situ et en temps réel sans perturber le modèle 3D développé. Nous avons démontré que ces échafaudages sont capables de supporter la fixation et la prolifération cellulaire et restent sensibles à l'analyte en question. La cinétique de sous-produits acides dans les constructions du génie reste peu étudié et en tant que tel en utilisant les réactifs pH échafaudages peuvent considérablement faciliter ces études 19. En outre, l'utilisation des échafaudages d'auto-déclaration pour les applications d'ingénierie tissulaire présente la possibilité de comprendre, surveiller et optimiser la croissance de modèle constructions de tissu 3D in vitro, de manière non invasive et en temps réel.
Les pH nanocapteurs sensibles ont également été livrés à l'environnement intracellulaire de fibroblastes cultivés sur électrofilé scaffol PLGAds. Le ratio de l'émission de fluorescence à partir des colorants ont été utilisés pour surveiller le pHi et comparée à un échafaudage nanocapteurs Incorporation de pH d'auto-vérification. La livraison des nanocapteurs de cellules cultivées dans un environnement 3D peut permettre la surveillance de la concentration de substance à analyser en profondeur dans le produit d'assemblage d'une manière non destructive. Par conséquent nanocapteurs peuvent être un outil d'imagerie viable pour évaluer de façon non destructive comportement des cellules tout au long de 3D construit permettant l'analyse à long terme. La sélection de la concentration en analyte de cellules individuelles au sein d'une construction 3D pourrait assurer qu'ils reçoivent en nutriments et en oxygène des concentrations suffisantes. paramètres du procédé de surveillance pourraient aider dans le développement de techniques normalisées pour le transport de masse efficace de l'oxygène et de nutriments. La livraison des nanocapteurs à l'environnement intracellulaire et l'incorporation de nanocapteurs dans échafaudages polymères pourrait être combinée à permettre l'évaluation de la viabilité des cellules ainsi que la performance de l'échafaudage dans const 3Dructs au cours du processus de croissance de tissu. Cela peut conduire à une meilleure connaissance de ces constructions et progresser la fabrication de produits de remplacement de tissus biologiques pertinents.
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Protocol
Vue d'ensemble
Section 1 décrit la préparation de pH nanocapteurs sensibles et la caractérisation de la réponse de nanocapteurs à pH en utilisant la spectrométrie de fluorescence et leur taille au MEB.
Section 2 décrit la préparation d'échafaudages polymères électrofilées et caractérisation de leur morphologie et de la taille par MEB. Section 2 décrit également la préparation d'échafaudages d'auto-déclaration qui sont échafaudages électrofilées avec l'inclusion des pH nanocapteurs sensibles. Les échafaudages auto-déclaration qui en résultent sont caractérisés par SEM d'évaluer si des changements morphologiques dans les fibres électrofilées s'est produite. La fluorescence à partir des échafaudages d'auto-vérification qui résultent des nanocapteurs intégrés est évaluée par microscopie confocale.
La section 3 décrit la culture de cellules sur l'échafaud électrofilé et l'échafaud de l'auto-déclaration. Les échafaudages sont d'abord stérilisés en préparation pour la culture cellulaire après quoi les échafaudages sont évaluées afin de déterminer si la stérilisation et la culture de cellules influent sur la capacité de la fluorescence des échafaudages d'auto-vérification. Le protocole décrit également la livraison de nanocapteurs à des cellules qui sont cultivées sur des échafaudages électrofilées. Lysotracker colorant est utilisé pour s'assurer que les nanocapteurs n'ont pas été prises en compartiments acides cellulaires.
Une. Préparation et analyse de pH Responsive nanocapteurs Sol-gel
1.1 Préparation des réactifs pH nanocapteurs Sol-gel
Remarque: Cette préparation doit être effectuée dans une hotte de laboratoire.
- Préparer les fluorophores destiné à être utilisé dans le cadre des nanocapteurs de pH par dissolution de 5 - (et-6)-carboxyfluorescéine, ester de succinimidyle (FAM-SE) (1,5 mg) dans du diméthylformamide (DMF) (1 ml) dans un ballon à fond rond et 6-carboxytétraméthylrhodamine , ester de succinimidyle (TAMRA-SE) (1,5 mg) dans du DMF (1 ml) dans un autre ballon à fond rond.Ajouter 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) (1,5 ml) à chaque flacon et agiter sous une atmosphère d'azote sec (21 ° C) pendant 24 heures dans l'obscurité dire envelopper les échantillons dans du papier.
- Ajouter à la fois des colorants ci-dessus (250 ul) à un mélange d'éthanol (6 ml) et de l'hydroxyde d'ammonium (30% en poids, 4 ml) contenu dans un ballon à fond rond et on agite pendant 1 heure (21 ° C).
- Ajouter lentement le tétraéthylorthosilicate (TEOS) (0,5 ml) au mélange, continuer l'agitation pendant encore 2 h. Le mélange va devenir trouble. Les nanocapteurs peuvent être recueillies par evaporation rotative. Nanocapteurs peuvent être stockées dans un flacon en verre à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
ATTENTION: la manipulation ultérieure des nanocapteurs dans leur forme sèche doit être effectuée dans une hotte ou dans le cas de les peser la balance doit être fermée, par exemple dans un Weighsafe.
1.2 Réponse nanocapteur à pH
- Préparer les solutions tampons de phosphate de Sorensen allant de pH 5,5 à 8,0 par mixing ratios spécifiques de phosphate monosodique (0,2 M) et de phosphate disodique (0,2 M) de solutions mères. Vérifier le pH final à l'aide d'un pH-mètre. Faire les ajustements mineurs au pH à l'aide d'hydroxyde de sodium (NaOH) (4 M) ou de l'acide chlorhydrique (HCl) (2 M).
- Suspendre les nanocapteurs de pH dans les tampons de pH (5 mg / ml) en maintenant tout d'abord la cuve contenant la solution de nanocapteur au vortex pendant 3 minutes, puis l'immersion du récipient dans un appareil à ultrasons jusqu'à ce que la solution devienne trouble (environ 5 min). Répétez ces étapes pour suspendre totalement les nanocapteurs en solution.
- Placez la première solution dans une cuvette optique et utiliser des longueurs d'onde d'excitation de 488 nm pour 5 - (et 6)-carboxyfluorescéine (FAM) et 568 nm pour 6 carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA). Recueillir les longueurs d'onde d'émission à 500-530 nm pour FAM et TAMRA 558 à 580 nm pour l'aide d'un spectromètre à fluorescence.
- Changer les solutions dans la cuve optique de sorte que le pH peut être observée à un pH différent et continuer collecting les spectres d'émission.
- Calculer le rapport des maxima d'émission produite à chaque valeur de pH pour produire une courbe d'étalonnage.
1.3 SEM de nanocapteurs
- Placez un échantillon des nanocapteurs sur un microscope électronique à talon recouvert de carbone et de projections manteau d'or pendant 5 min sous atmosphère d'argon.
- Observer par microscopie électronique à balayage (MEB). Au cours de l'imagerie de régler la distance de travail, de la tension et de l'agrandissement d'électrons pour réduire au minimum la charge (figure 1).
2. Préparation et analyse de PLGA échafaudages
2.1 Électrofilage PLGA échafaudages
- Dans une hotte dissoudre le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) dans du dichlorométhane (DCM) (20% (w / w)) avec le formiate de pyridinium (PF) (1% (p / p)). Placer la solution dans une seringue de 10 ml avec une aiguille émoussée de remplissage 18 G et en toute sécurité, en forme d'une pompe à seringue.
- Distance de la pointe de l'aiguille 20 cm à partir d'un 20cm x 15 cm plateau de collecte d'aluminium.
- Attachez l'électrode d'une alimentation électrique à haute tension à l'extrémité de la seringue et de la terre à la plaque d'aluminium de collecte.
ATTENTION: Il faut faire attention que la haute tension est utilisé à savoir toujours couper l'alimentation électrique avant de manipuler un des équipements de électrofilature. - Livrer la solution en utilisant un débit constant de 3,5 m / h à 12 kV pendant 2 heures. Électrofilage utilisant ces conditions donnera une profondeur d'environ 60 um d'échafaudage.
- Laissez l'échafaud dans une hotte pendant 24 heures pour permettre résidu de solvant s'évapore.
2.2 Électrofilage pH Responsive PLGA échafaudages
- Préparer échafaudages incorporant pH nanocapteurs sensibles comme décrit dans la section 2.1, mais avec la modification de l'ajout de nanocapteurs pour la solution de polymère (5 mg / ml). Suspendre les nanocapteurs dans la solution de PLGA avec l'aide d'ultrasons (environ 5 min) avant à placer dans une seringue de 10 mL.
2.3 SEM de PLGA Échafaudages Échafaudages et pH Responsive
- Placez un échantillon de l'échafaud PLGA ou pH échafaud sensible sur un électron revêtu microscope talon de carbone et procéder comme décrit pour SEM de nanocapteurs (Figure 1).
2.4 Étalonnage du pH Échafaudages Responsive
- Placez un échantillon de pH échafaud sensible dans une plaque de culture de 35 mm et plonger dans des solutions tampons appropriées.
- Sur un microscope confocal en utilisant un laser à argon de 488 nm pour exciter la FAM et un laser à krypton 568 nm pour exciter le TAMRA à l'intérieur des nanocapteurs. Observer l'émission de fluorescence pour pH échafaudages sensibles à 500-530 nm pour FAM et 558-580 nm pour TAMRA. (Figure 2). Utilisation balayage séquentiel pour éviter la collecte de longueurs d'onde d'excitation.
3. Culture cellulaire sur PLGA échafaudages et pH Responsive PLGA échafaudages
ntent "> Note: Ce qui suit doit être effectué dans une armoire de culture cellulaire.3.1 Préparation de PLGA échafaudages pour la culture cellulaire
- Couper les PLGA ou pH sensibles échafaudages PLGA dans 2 cm 2 pièces.
- Stériliser par irradiation d'échafaudages avec des rayons ultraviolets (UV), à une distance de 8 cm pour 15 min de chaque côté.
- Transférer les échafaudages sur une plaque de culture de 12 puits et placer un anneau en acier sur le dessus. Ajouter une solution de pénicilline / streptomycine (5% v / v) dans du tampon phosphate salin (PBS) à l'intérieur et à l'extérieur de la bague en acier, laisser incuber pendant une nuit (37 ° C, 5% CO 2). Notez l'anneau d'acier a été fabriqué à l'Université de Nottingham et a les dimensions suivantes: diamètre extérieur de 2 cm, 1 cm de diamètre intérieur, 1 cm de profondeur.
- Retirer la solution de stérilisation et de lavage avec du PBS.
- Ajouter milieux de culture cellulaire à l'intérieur (500 pl) et à l'extérieur (500 ul) de la bague d'acier, placer dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2
- Préparer une suspension de cellules et effectuer un comptage des cellules en utilisant un dosage d'exclusion au bleu Trypan.
- Créer une suspension de cellules pour obtenir un nombre de cellules de 1 x 10 6 cellules / ml.
- Retirez le support de l'intérieur et à l'extérieur de la bague d'acier.
- Remplacer préchauffé avec des milieux de culture cellulaire à l'extérieur de la bague en acier (1 m).
- Ajouter 300 ul de la suspension de cellules à l'intérieur de la bague en acier - plaque de roche vers l'arrière et vers l'avant en douceur pour distribuer des cellules.
- Placer la plaque de culture cellulaire dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2) - la fixation des cellules aurait dû avoir lieu dans les 24 heures, mais continuer la culture pour aussi longtemps que l'expérience nécessite - rafraîchissant les médias tous les 2-3 jours.
3.2 nanocapteur livraison de cellules cultivées sur PLGA Échafaudages
- cellules de semences donnant sur PLGA échafaud, comme décrit dans la section 3.1. Pour cette étude, un échafaudage PLGA vierge (non containanocapteurs ning) a été utilisé en raison du chevauchement de l'émission de fluorescence lors de l'imagerie.
- Placez la cellule échafaudage tête de série dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2) pendant 72 heures pour permettre aux cellules de se développer et migrent à travers l'échafaud avant nanocapteur livraison.
- Avant nanocapteur livraison laver les cellules avec du PBS et changer le support du milieu de culture standard pour des médias libres antibiotiques et de sérum, incuber (37 ° C, 5% CO 2) pendant 1 heure. Remarque: les milieux de culture standard pour les cellules 3T3 comprend de Eagle modifié de milieu de Dulbecco additionné de sérum de veau foetal (10% (v / v)), solution de L-glutamine (2 mM), de pénicilline / streptomycine (1% (v / v)) .
- Au cours de la période d'incubation préparer le complexe nanocapteur-liposomes par sonication brièvement nanocapteurs (5 mg) avec Optimem (50 pi) pour créer la solution A.
- Créer une solution B en ajoutant Lipofectamine 2000 (5 pi) de Optimem (45 ul), incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter solutionA à la solution B, incuber à température ambiante pendant 20 min pour former une solution C, qui est le complexe liposome-nanocapteur.
- Ajouter la solution C (100 ul) aux cellules et incuber (37 ° C, 5% CO2) pendant 3 heures.
- Retirez les échafaudages ensemencés de cellules de l'incubateur, les médias aspirer et laver deux fois avec du PBS avant d'ajouter PBS (1 ml) pour permettre la visualisation des cellules vivantes par microscopie confocale. Note: Le PBS a été utilisé dans ce protocole pour que l'indicateur rouge de phénol présent dans les milieux de culture cellulaire n'a pas causé autofluorescence et aussi parce qu'un étalonnage à différents pH a été effectuée. Cependant phénol médias libres rouges pourraient être utilisés pour analyse à plus long terme de cultures cellulaires.
- Plonger la cellule échafaudage tête de série dans les tampons de pH différents et surveiller la réponse des nanocapteurs associés aux cellules.
- Surveiller le pHi par la détermination du rapport des intensités de fluorescence de la FAM et TAMRA par l'observation de la fluorescence en utilisant la microscopie confocale (Figure 3).
3.3 nanocapteur Situation dans les cellules de mammifères
- Incuber les cellules avec nanocapteurs ne contenant que le colorant FAM comme décrit dans la section 3.2 (c'est parce que l'émission de fluorescence de TAMRA est dans la même région spectrale que le Lysotracker rouge). Préparer ces nanocapteurs comme décrit dans la section 1.1, mais avec l'omission de la préparation et en ajoutant TAMRA.
- Après la période de livraison nanocapteur diluer la solution mère Lysotracker Rouge à 50 nM.
- Ajouter une fraction aliquote de la solution diluée (2 ul) de cellules cultivées sur des échafaudages de PLGA.
- Incuber les cellules avec Lysotracker rouge pendant 1 heure (37 ° C, 5% CO 2).
- Après la période d'incubation, retirer le support et laver les cellules deux fois avec du PBS (pH 7,4) avant de changer le média de PBS (pH 7,4) (2 ml) en vue de la visualisation en utilisant la microscopie confocale. Remarque: phénol médias libres rouges pourraient être utilisés à la place de PBS.
- Ajouter le colorant nucléaire Draq5 au PBS de sorte que la concentration finale est de 5 uM et incuber avec les cellules pendant 3 min (à 37 ° C, 5% CO 2). Il n'est pas nécessaire de changer les médias après la période d'incubation avec DRAQ5.
- Utilisez un laser 488 nm de l'argon pour exciter le FAM ne nanocapteurs, un laser krypton 568 nm pour exciter le Lysotracker rouge et 633 nm hélium / néon laser pour exciter le chromophore DRAQ5 et observer la fluorescence à 500-530 nm, 580-600 nm, 650 -750 nm, respectivement (Figure 3). Utilisation balayage séquentiel pour éviter la collecte de longueurs d'onde d'excitation.
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Representative Results
La distribution de taille des pH nanocapteurs sensibles préparés a été caractérisé par MEB, où la population de nanocapteurs imagées ont été mesurés et ont des dimensions nanométriques dans la gamme de 240 à 470 nm (figure 1A). La réalisation d'un petit diamètre et assez petit est conforme à l'aide de la méthode Stöber pour préparer des nanoparticules. Il a été trouvé que l'utilisation d'un environnement à pH basique au cours de la synthèse de nanoparticules IE nanoparticules préparées selon la méthode Stöber, permet un bon contrôle de la taille, tandis que la préparation en utilisant des conditions acides produit une large dispersion de la taille des particules. Micrographies MEB représentatifs des fibres électrofilées PLGA fabriqués en utilisant les procédés décrits sont représentés à la figure 1B montrant que l'échafaud PLGA produite est constituée de fibres non tissées présentant des perles ou de rupture minimale, où les fibres ont des dimensions nanométriques. Figure 1C la figure 1B, Les micrographies MEB fournissent la preuve de l'association de nanocapteur sur la surface des fibres mais ils peuvent également être incorporé dans les fibres de l'échafaudage, les études de dégradation de ces échafaudages échafaudage / nanocapteurs pourraient être effectuées en collaboration avec la SEM et / ou la microscopie confocale pour déterminer si cela affecte les performances du nanocapteur.
La capacité des nanocapteurs pour conserver leur activité optique suivant la constitution dans les fibres PLGA a été vérifiée en examinant les échafaudages auto-déclaration utilisant la microscopie confocale. Rétention de la capacité de rester actif optiquement et chimiquement lorsqu'elles sont incorporées dans les fibres de l'échafaudage pourrait permettre à des concentrations de l'analyte à surveiller. La fluorescence émise à partir des nanocapteurs démontré que les nanocapteurs retained leur activité optique et sont associées à des fibres d'échafaudage. La fluorescence émise à partir de la FAM de colorants (vert) et TAMRA (rouge) incorporé dans les nanocapteurs pH sensibles est représenté sur les figures 2A et 2B respectivement. Il s'agit d'un résultat positif, il est possible que pour des concentrations de l'analyte à surveiller in situ. C'est aussi la première fois que nanocapteurs ratiométriques optiquement actifs ont été incorporés dans des fibres d'échafaudage PLGA en utilisant le procédé de filage électrostatique. Après avoir confirmé que les nanocapteurs peuvent être visualisées par microscopie à fluorescence suivant l'incorporation dans les fibres de PLGA, la réponse nanocapteur aux changements de concentration de l'analyte a été vérifiée. L'immersion de l'échafaudage dans des tampons de pH différant a entraîné un changement de l'intensité de fluorescence du colorant FAM, tandis que la fluorescence émise par le colorant TAMRA référence ne change pas notablement. Le rapport de l'intensité de fluorescence des deux colorants peut être utilisé pour prodUCE une courbe d'étalonnage comme illustré sur la figure 2C. La courbe d'étalonnage pour nanocapteurs évalué seul et lorsqu'il est incorporé dans électrofilé échafaud PLGA est comparable et démontre que les nanocapteurs conservent leur activité optique suivant la constitution dans les échafaudages d'auto-déclaration. La capacité de l'échafaudage pour l'auto-déclaration de réagir de façon réversible à différentes valeurs de pH a été évaluée par immersion de l'échafaudage en alternance dans des tampons dont le pH est de 5,5 et 7,5. La réversibilité a été jugée très bonne comme le montre la figure 2D où l'échafaud de l'auto-déclaration peut répondre à de nombreux changements cycliques de pH. Des études à long terme n'ont pas été réalisées pour évaluer l'effet de la dégradation de PLGA lors de la constitution de nanocapteurs; on pense que parce que les nanocapteurs apportent une réponse quotientométrique la quantité de nanocapteurs présents n'affectera pas le résultat.
Analyte nanocapteurs sensibles ont été livrés en utilisant un liposomeal transfection agent pour l'environnement intracellulaire de fibroblastes 3T3 dont la croissance a été soutenue par des échafaudages PLGA vierges. Des images de microscopie confocal de fibroblastes 3T3 cultivées sur des échafaudages de PLGA blank démontrent que nanocapteurs sont associés aux cellules de fibroblastes avec fluorescence observées à partir de FAM et TAMRA représenté sur les figures 3A et B, respectivement. La superposition de la fluorescence à partir de ces canaux montre que la fluorescence des deux colorants est co-localisée, ce qui suggère que les colorants sont restés piégés à l'intérieur de la matrice biocompatible nanocapteurs (comme représenté par fluorescence jaune à la figure 3C). Les nanocapteurs sont pensés pour être dans le cytoplasme des fibroblastes 3T3 et qui ne figurent pas dans les compartiments acides comme en témoigne l'absence de fluorescence co-localisé de FAM seulement nanocapteurs et Lysotracker colorant rouge représenté sur la figure 3D. L'intensité de fluorescence de pH nanocapteurs sensibles livrered de fibroblastes 3T3 a été surveillée tandis que les cellules ont été soumises à des changements de pH et dont les résultats sont représentés sur la figure 3E. Le graphique produite démontre que les cellules cultivées sur l'échafaud PLGA électrofilé ont maintenu un pHi dans la gamme 6,8-7,0.
Figure 1. Micrographies MEB de nanocapteurs, les fibres de PLGA et des échafaudages d'auto-déclaration. (A) pH sensibles nanocapteurs sol-gel montrant des particules de taille nanométrique sphérique (B) PLGA électrofilé fibres non tissées où morphologie de la fibre est régulière avec des perles minimal et ruptures (C) pH sensibles échafaudages auto-déclaration où les nanocapteurs peuvent être observés à être en saillie de PLGA la morphologie des fibres reste encore comparable avec des fibres de PLGA de contrôle qui ne contiennent pas nanosEnsors. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Images de microscopie confocale de pH adaptés échafaudages auto-déclaration où la fluorescence peut être observée à partir des nanocapteurs associés aux fibres d'échafaudage PLGA. (A) FAM (vert), le pH colorant réactif et (B) TAMRA (rouge), le colorant de référence. (C) graphiques d'étalonnage de pH adaptés nanocapteurs sol-gel et pH échafaudages sensibles demonsttaux que la réponse optique et chimique des nanocapteurs n'a pas été affectée lorsqu'il est incorporé dans les fibres d'échafaudage PLGA. (D) La réversibilité de l'échafaudage de l'auto-déclaration effectuée par immersion de l'échafaudage dans des solutions tampons de rechange de pH 5,5 et pH 7,5. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Images de microscopie confocale de cellules nanocapteurs intériorisées et des graphiques de pH et la réponse pHi. Fluorescence des nanocapteurs intériorisées (A) FAM (vert) (B) TAMRA (rouge) (C) la co-localisation de la fluorescence de FAM et TAMRA (jaune) ( D) FAM ne nanocapteurs (vert) livré à la culture des fibroblastes 3T3d sur PLGA échafaud avec DRAQ5 (magenta) l'étiquetage du noyau et Lysotracker Red (rouge) l'étiquetage des lysosomes. La fluorescence de FAM et Lysotracker rouge ne sont pas co-localisé donc démontrer qu'il est peu probable que les nanocapteurs ont été internalisés dans les compartiments acides cellulaires mesures (E) PHI prises de nanocapteurs livrés à des fibroblastes 3T3 cultivées sur un échafaud PLGA vide par rapport à l'étalonnage du pH d'un échafaudage de détection de pH sans la culture de cellules. Cela démontre également que les mesures de pH réalisées en utilisant les nanocapteurs intériorisées sont pas acides comme les cellules cultivées sur l'échafaud électrofilé PLGA ont maintenu un pHi dans la gamme 6,8-7,0. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
L'ingénierie tissulaire aspire à créer des substituts biologiques pouvant être utilisé à la fois in vivo comme des modèles in vitro de tissus et dans la thérapie de remplacement de tissu à réparer, de remplacer, de maintenir ou d'améliorer la fonction d'un tissu ou d'un organe particulier. Substituts synthétiques ont été utilisés pendant de nombreuses années pour remplacer ou réparer des tissus de l'aide, mais ceux-ci échouent souvent en raison de la faible intégration avec le tissu et / ou une infection hôte, ce qui conduit finalement à un rejet ou encore la chirurgie de révision. Génération tissus vivants dans le laboratoire avant l'implantation peut aborder la question de la réalisation de la pleine intégration et de réduire le besoin de chirurgie de révision. Toutefois, pour atteindre cet objectif à réaliser propagation approprié in vitro et la manipulation de cellules dans les constructions 3D doivent être couplés avec conditionnement physique approprié du tissu in vitro. Ceci peut être réalisé dans un certain nombre de façons un étant de poursuivre les recherches sur la biologie fondamentaleen cause, mais aussi d'approfondir les questions d'ingénierie et de fabrication liés à la production de substituts synthétiques. C'est ce dernier point que le protocole décrit vise à contribuer.
L'utilisation prévue des échafaudages PLGA décrites est de fournir un support temporaire pour les cellules de mammifères pour aider à leur croissance dans une structure biologiquement pertinente. L'incorporation de la substance à analyser dans des nanocapteurs réagissant échafaudages PLGA pourrait permettre à des concentrations d'analyte locaux à surveiller tout au long d'une construction en 3D au cours du processus de croissance de tissu. L'utilisation de pH échafaudages sensibles pourrait permettre de déterminer si sous-produits acides produits comme les dégrade d'échafaudage et les cellules se développent sont effectivement retirés de l'intérieur d'une construction 3D. Il s'agit d'une étape vers la résolution du manque actuel de suivi et de contrôle des processus in vitro de la régénération tissulaire processus. L'utilisation des échafaudages qui sont eux-mêmes des dispositifs de détection peut permettre àsitu, l'évaluation des microenvironnement en temps réel. Suivi de la micro-environnement de construction sans endommager le tissu est essentielle et permettra la surveillance des processus à toutes les étapes de la production de tissus.
La capacité de l'échafaudage pH sensible produite pour signaler la concentration locale de l'analyte a été évaluée en surveillant la sortie de fluorescence à partir des nanocapteurs utilisant la microscopie confocale. Un essai d'étalonnage a été effectué pour la détection du pH échafaudage et s'est avéré comparable à celle des nanocapteurs pH réagissant pas incorporées dans les fibres de PLGA. La capacité de produire une courbe d'étalonnage démontre que les nanocapteurs restent sensibles aux variations de pH lorsqu'il est incorporé dans le squelette de polymère et également que le procédé de stérilisation des échafaudages n'a pas provoqué d'effets préjudiciables à la capacité de détection des nanocapteurs de pH. En outre, nanocapteurs ont été livrés à l'environnement intracellulaire de cellules cultivées sur des échafaudages PLGA where réponse cellulaire aux changements de pHi peut être surveillée. Le rapport des intensités de fluorescence de la FAM et TAMRA ont été utilisés pour surveiller le pHi et comparée à un échafaudage sensible au pH, ce qui suggère que les cellules de fibroblastes 3T3 ont maintenu un pHi dans la plage de pH de 6,8 à 7. Des fibroblastes 3T3 transfectés avec Incubation nanocapteurs avec le colorant nucléaire DRAQ5 ont indiqué que la majorité des nanocapteurs associés aux cellules n'était pas situé dans la région nucléaire. Lieu de nanocapteur ne semble pas être à l'intérieur des compartiments acides, tels que les endosomes ou les lysosomes telle que déterminée par l'incubation de l'nanocapteur transfectées avec des fibroblastes 3T3 Lysotracker rouge, où la co-localisation de la FAM et Lysotracker rouge serait représentée par des pixels jaunes dans les images confocales. D'autres études telles que l'analyse par microscopie électronique à transmission (TEM) et à l'identification de marqueurs biologiques pour des voies d'internalisation ont pu vérifier cet autre. En outre, les études à long terme telles que la microscopie confocale en temps résolupourrait déterminer le devenir à long terme des nanocapteurs dans les cellules cultivées sur des échafaudages d'auto-déclaration. Si nanocapteurs devaient être livrés à d'autres types de cellules, puis leur emplacement doit être identifié comme le résultat peut ne pas être le même que celui représenté ici.
L'utilisation des échafaudages d'auto-déclaration ont le potentiel pour surveiller de manière non invasive des conditions de micro dans les constructions de l'ingénierie tissulaire. Ayant la capacité d'effectuer des mesures in situ pourrait permettre l'optimisation de la croissance des constructions de tissu 3D de manière non invasive et in vitro en temps réel. La localisation cytoplasmique des nanocapteurs pH réactifs peut être utilisée pour contrôler au cours de l'expérimentation en cours pHi. Les nanocapteurs livrés à l'environnement interne des cellules ou des échafaudages d'auto-déclaration peuvent tous deux être utilisés dans les systèmes de culture des tissus statiques ou dynamiques et peuvent conduire à la détermination des conditions de culture nécessaires pour une croissance optimale des constructions de l'ingénierie tissulaire envitro. Son développement peut conduire à un système en ligne qui agissent sur l'épuisement des nutriments assurant un approvisionnement constant de nutriments et d'oxygène dans la construction, en fin de compte donner une méthode hautement reproductible pour la culture de constructions de tissu.
Les protocoles décrits ont préparé des échafaudages ayant des dimensions appropriées pour permettre l'imagerie par microscopie confocale cependant plus large pour permettre à 3D construit à imager excitation à photons multiples peuvent être nécessaires pour permettre l'imagerie à l'intérieur des constructions plus profondes. L'équipement optique utilisé comme l'objectif du microscope doit être sélectionné pour déterminer la distance de travail optimale pour la lentille et les dimensions de construct.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Le financement du BBSRC est aimablement reconnu (numéro de subvention BB H011293 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N.
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
