Summary
ניתן לשלב nanosensors סול ביולוגית pH מגיב לפולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) פיגומי electrospun. פיגומי דיווח עצמיים המיוצרים יכולים לשמש לניטור באתר של תנאי microenvironmental תוך תאי culturing על הפיגום. זה מועיל כמבנה התאי 3D יכול להיות במעקב בזמן אמת מבלי להפריע לניסוי.
Abstract
תאי culturing ב-3D על פיגומים המתאימים חשבו לחקות טוב יותר vivo microenvironment ובלהגדיל את תאי תאי אינטראקציות. המבנה התאי 3D וכתוצאה מכך לעתים קרובות יכול להיות יותר רלוונטי ללימוד אירועים המולקולריים ותאי תאי אינטראקציות יותר מניסויים דומים למדו ב2D. כדי ליצור תרבויות 3D יעילות עם כדאיות גבוהה תא לאורך כל פיגום תנאי התרבות כגון חמצן וצורך pH להיות מבוקרים בקפידה כהדרגתי בריכוז אנליטי יכולים להתקיים לאורך כל מבנה 3D. כאן אנו מתארים את השיטות של הכנת nanosensors ביולוגית pH מגיב סול ושילובם בפולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) פיגומי electrospun יחד עם ההכנה הבאה שלהם לתרבות של תאי יונקים. הפיגומים מגיבים pH יכולים לשמש ככלי לקביעת pH microenvironmental בתוך מבנה תאי 3D. יתר על כן, אנו מפרטים את המסירה של nanose התגובה pHnsors לסביבה תאית של תאי יונקים הצמיחה שנתמך על ידי פיגומי PLGA electrospun. מיקום cytoplasmic של החיישנים הזעירים מגיבים pH יכול להיות מנוצל כדי לפקח על ה-pH תאית (אובדן כושר עבודה) במהלך ניסויים מתמשכים.
Introduction
אסטרטגיה מרכזית בהנדסת רקמות היא השימוש בחומרים ביולוגית לפברק פיגומי המורפולוגיה דומה לרקמה שזה הולך להחליף, והוא גם מסוגל לתמוך בצמיחת תא ותפקודו 1,2. הפיגום מספק תמיכה מכאנית כך שהוא מאפשר מצורף תא ושגשוגם עדיין מאפשר נדידת תאים לאורך הסדקים של מבנה תאי 3D. הפיגום חייב גם לאפשר לתחבורה ההמונית של חומרים מזינים סלולריים ולא לעכב פינוי פסולת המטבולית 3.
Electrospinning התפתחה שיטה מבטיחה עבור הייצור של פיגומים פולימריים מסוגלים לתמוך 4-6 צמיחה הסלולר. סיבי electrospun ארוגים המיוצרים מתאימים לצמיחת תאים כפי שהם לעתים קרובות נקבוביים ומאפשרים אינטראקציה בין תאים, כמו גם נדידת תאים לאורך הסדקים של מבנה תאי 3D 7. חשוב לפקח על כדאיות תא במהלך tהוא תקופה של תרבות ועל מנת להבטיח כי כדאיות תא נשמר לאורך כל מבנה 3D. לדוגמא, תנאי תרבות כגון חמצן וחומציות דורשים בקרה קפדנית, כפי הדרגתיים בריכוז אנליטי יכול להתקיים בתוך מבנה 3D. יכולה להיות מועסק bioreactors או מערכות טפטוף לחקות בתנאי vivo של זרימת ביניים וכהעברת חומרי הזנה גידול תוצאה ופינוי פסולת מטבולית 8. השאלה אם מערכות כאלה הבטחת תנאי microenvironmental קבועים ניתן לטפל על ידי הערכת microenvironment הסלולרי בזמן אמת.
מדדי microenvironment מפתח שיכול להיות במעקב בזמן אמת כוללים: טמפרטורה, הרכב כימי של תקשורת סלולרי, ריכוז החמצן מומס ופחמן דו חמצני, pH, ולחות. של מדדים אלה, טמפרטורה יכולה להיות במעקב ביותר בקלות באמצעות בבדיקות באתרה. שיטות לניטור המדדים המפורטים שנותרו נפוץ בהסרת volve של aliquot לדגימה ולכן להפריע לתרבית התאים ולהגביר את הסיכון לזיהום. שיטות רציפים, בזמן אמת הם חיפשו. שיטות ניטור הנוכחיות בדרך כלל לסמוך על מכשירים שפיסיים לחקור את המבנה התאי כגון צג ה-pH או בדיקה חמצן. עם זאת, שיטות פולשניות אלה עלולות לגרום נזק למבנה התאי ולהפריע לניסוי המתמשך. ניטור פולשני של ריכוזי אנליטי בתוך מבנה 3D יכול לאפשר ניטור של היבטים סביבתיים שונים, כגון מזין דלדול 9 בזמן אמת. היכולת זו תאפשר הערכה של אספקת חומרי מזון לאזורים עמוקים יותר בתוך המבנה ולקבוע אם הפסולת המטבולית הייתה להיות הוסרה באופן יעיל 10,11. מערכות שמנסות להתייחס לנושא של הפולשנות בדרך כלל כרוכות בשימוש בתא זלוף שעובר מדיום תרבות באמצעות שני כלי התרבות וחיישנים חיצוניים כדי לפקח pH, חמצן וגלוקוז 12.מחדש הוא עניין גובר בפיתוח חיישנים שיכולים להיות משולב ישירות לתוך כלי התרבות שאינו דורשים הסרת aliquot לדגימה ובתור שכזו יספק בניטור באתרה.
כדי לטפל בליקויים כגון באתר וניטור פולשני של תנאי microenvironmental יש לנו שולבו חיישנים זעירים מגיבים אנליטי לפיגומי electrospun לייצר פיגומי דיווח עצמי 13. פיגומים הפועלים התקני חישה על ידי ניטור פעילות הקרינה כבר הכינו בעבר, שבו מכשיר החישה היה או פיגום פולימרים בפועל נוצר על ידי electrospinning או באמצעות השימוש בצבע מגיב אנליטי אשר שולב לתוך הפולימר לפני היווצרות פיגום 14,15 . עם זאת, יש מכשירי חישה אלה את הפוטנציאל לתת תפוקות אופטיות מוטעות הנגרמות על ידי הפרעה אפשרית מanalytes האחר. השימוש במכשיר חישה ratiometric such כמו אלה שהוכנו בפרוטוקול המתואר בעל הפוטנציאל לחסל את תופעות לוואי אפשריות אלה, ולתת מענה ספציפי לאנליטי בשאלה.
פיגומי electrospun המובאים כאן הוכנו מפולי שיתוף הפולימר הסינתטי (החומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA), שנבחרו בגלל שיש מזון ותרופות אמריקניות (FDA) אישור, בשל המאפיינים מתכלים ביולוגית שלה ואחר שיא בתמיכה בצמיחה ובתפקוד של סוגי תאים שונים 16-18. Nanosensors מגיב אנליטי ratiometric מוכן הם מגיבים לרמת חומציות. Nanosensors לשלב שני צבעי ניאון לתוך מטריצת סול ביולוגית שבו צבע אחד, FAM הוא מגיב לרמת חומציות ואחרת, טמרה פועלת כתקן פנימי כפי שהוא אינו מגיב לרמת חומציות. יתר על כן הקרינה של שני FAM וטמרה ניתן לנתח בנפרד כפי שהם אינם חופפים באופן משמעותי. קביעת היחס של EMI הקרינהssion של שני הצבעים באורכי גל ספציפיים נותן מענה pH עצמאי של תנאים סביבתיים אחרים. פיגומי דיווח העצמי עלולים לאפשר חוזרת הערכה של ה-pH באתר ובזמן אמת מבלי לשבש את מודל 3D המפותח. אנחנו הוכיחו שהפיגומים הללו מסוגלים לתמוך בקובץ מצורף תא ושגשוגם ולהישאר קשובים לאנליטי בשאלה. קינטיקה של חומץ על ידי מוצרים במבנים מהונדסים נותרת understudied וככזה באמצעות הפיגומים מגיבים pH יכולה להקל על מחקרים כאלה מאוד 19. יתר על כן, השימוש בפיגומי דיווח העצמי עבור יישומי הנדסת רקמות מציג את ההזדמנות להבין באופן מלא, לפקח ולייעל את הצמיחה של מבני רקמת מודל 3D במבחנה, noninvasively ובזמן אמת.
Nanosensors התגובה pH גם הועברו לסביבה תאית של fibroblasts התרבותי על פיגומי PLGA electrospunDS. היחס של פליטת הקרינה מהצבעים שמשמשים לניטור ואובדן כושר עבודה בהשוואה לחיישנים זעירים pH דיווח עצמי פיגום שילוב. המשלוח של חיישנים זעירים לתאים בתרבית בסביבת 3D יכול לאפשר ניטור של ריכוז אנליטי העמוק בתוך המבנה בצורה הרסנית. לכן חיישנים זעירים עשויים להיות כלי הדמיה קיימא להעריך nondestructively התנהגות תא לאורך 3D בונה מאפשר ניתוח לטווח ארוך. הקרנת הריכוז אנליטי של תאים בודדים בתוך מבנה 3D יכולה להבטיח כי הם מקבלים ריכוזי חומרי מזון וחמצן מספקים. פרמטרים תהליך הניטור יכולים לסייע בפיתוח של טכניקות סטנדרטיות לתחבורה ההמונית היעילה של חמצן וחומרים מזינים. המשלוח של חיישנים זעירים לסביבה ולשילוב של חיישנים זעירים לפיגומים פולימריים תאיים יכול להיות משולב כדי לאפשר הערכה של כדאיות תא, כמו גם ביצועי פיגום בתוך const 3Dructs במהלך תהליך צמיחת הרקמות. זה עשוי להוביל לידע מוגבר של המבנים הללו והתקדמות הייצור של תחליפי רקמה רלוונטיים מבחינה ביולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
סקירה
סעיף 1 מתאר את ההכנה של nanosensors התגובה pH ואפיון של תגובת nanosensor ל-pH באמצעות ספקטרומטריית הקרינה ואת גודלם באמצעות SEM.
סעיף 2 מתאר את הכנת פיגומי פולימר electrospun והאפיון של המורפולוגיה שלהם ואת הגודל באמצעות SEM. סעיף 2 גם מתאר את ההכנה של פיגומי דיווח עצמיים שהם פיגומי electrospun עם הצטרפותם של החיישנים זעירים מגיבים ה-pH. פיגומי דיווח עצמי וכתוצאה מכך הם מתאפיינים בSEM להעריך האם כל שינויים מורפולוגיים בסיבי electrospun התרחשו. הקרינה מפיגומי דיווח העצמי הנובעים מהחיישנים הזעירים המשולבים מוערכת על ידי מיקרוסקופיה confocal.
סעיף 3 מתאר את התרבות של תאים על פיגום electrospun ופיגום דיווח העצמי. הפיגומים הם מעוקרים ראשון בpreparatיון לבא תרבית תאים שהפיגומים נבחנים כדי לקבוע אם עיקור והתרבות של תאים משפיעים על יכולת הקרינה של פיגומי דיווח העצמי. הפרוטוקול מתאר גם את המסירה של חיישנים זעירים לתאים שהם מתורבתים על פיגומי electrospun. צבע Lysotracker משמש כדי להבטיח שחיישנים זעירים לא נלקחו לתאים חומצי סלולריים.
1. הכנה וניתוח של Nanosensors סול תגובה pH
1.1 הכנת Nanosensors סול תגובה pH
הערה: הכנה זו צריכה להתבצע במנדף.
- הכן את fluorophores לשימוש בתוך nanosensors pH על ידי המסת 5 - (ו- 6)-carboxyfluorescein, succinimidyl אסתר (FAM-SE) (1.5 מ"ג) בdimethylformamide (DMF) (1 מיליליטר) בסיבוב תחתית בקבוק ו6 carboxytetramethylrhodamine , Succinimidyl אסתר (טמרה-SE) (1.5 מ"ג) בDMF (1 מיליליטר) בסיבוב נוסף לתחתית בקבוק.הוסף 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) (1.5 מ"ל) לכל בקבוק ומערבבים תחת אווירה יבשה חנקן (21 מעלות צלזיוס) במשך 24 שעות בחושך כלומר לעטוף את הדגימות בנייר כסף.
- הוספת שני הצבעים לעיל (250 μl) לתערובת של אתנול (6 מיליליטר) ואמוניום הידרוקסיד (30% WT, 4 מיליליטר) הנכלל בבקבוק עגול תחתית ומערבבים במשך שעה 1 (21 מעלות צלזיוס).
- לאט לאט להוסיף tetraethylorthosilicate (TEOS) (0.5 מיליליטר) לתערובת, להמשיך לערבב כ 2 שעות נוספות. התערובת תהפוך מעוננת. ניתן לאסוף nanosensors על ידי אידוי סיבובי. ניתן לאחסן nanosensors בבקבוקון זכוכית בC o 4 לשימוש עתידי.
זהירות: טיפול נוסף של חיישנים זעירים בצורה היבשה שלהם צריך להתבצע במנדף או במקרה של שקילתם את האיזון צריך להיות סגור, למשל בWeighsafe.
1.2 Nanosensor תגובה ל-pH
- הכן את פתרונות חיץ פוספט של סורנסן החל 5.5-8.0 pH ידי Mixiיחסים ספציפיים ננוגרם של monobasic נתרן פוספט (0.2 M) וdibasic פוספט נתרן פתרונות מניות (0.2 M). בדוק את ה-pH הסופי באמצעות מד ה-pH. בצע את כל התאמות קלות לחומציות באמצעות סודיום הידרוקסיד (NaOH) (4 מ ') או חומצה הידרוכלורית (HCl) (2 מ').
- להשעות את nanosensors pH במאגרי ה-pH (5 מ"ג / מיליליטר) בראשית מחזיק את הכלי המכיל את פתרון nanosensor במערבולת במשך 3 דקות לאחר מכן הצללה הכלי בultrasonicator עד הפתרון הופך עכור (כ -5 דקות). חזור על שלבים אלה כדי להשעות באופן מלא את החיישנים הזעירים בתמיסה.
- מניחים את הפתרון הראשון לקובט אופטי ולהשתמש באורכי גל עירור של 488 ננומטר במשך 5 - (ו- 6)-carboxyfluorescein (FAM) ו568 ננומטר במשך 6 carboxytetramethylrhodamine (טמרה). לאסוף את אורכי גל הפליטה ב500-530 ננומטר לFAM ו558-580 ננומטר לטמרה באמצעות ספקטרומטר הקרינה.
- שנה את הפתרונות בקובט האופטי, כך שרמת החומציות יכולה להיות שנצפתה ב-pH שונה ולהמשיך גollecting ספקטרום הפליטה.
- לחשב את היחס של מקסימום פליטה המיוצר בכל אחד מערכי ה-pH כדי לייצר עקומת כיול.
1.3 SEM של Nanosensors
- הנח מדגם של החיישנים הזעירים על בדל מיקרוסקופ אלקטרונים פחמן מצופה וגמגום מעיל עם זהב למשך 5 דקות תחת אווירת ארגון.
- שים לב על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM). במהלך ההדמיה להתאים את מרחק עבודה, מתח וגדלה כדי למזער את טעינת אלקטרונים (איור 1).
2. הכנה וניתוח של PLGA פיגומים
2.1 Electrospinning PLGA פיגומים
- במנדף לפזר פולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) בdichloromethane (DCM) (20% (w / w)) עם formate pyridinium (PF) (1% (w / w)). מניחים את הפתרון לתוך מזרק 10 מיליליטר עם מחט 18 G בוטה מילוי ובאופן מאובטח לנכון משאבת מזרק.
- להרחיק את קצה מחט 20 ס"מ מ20סנטימטר x 15 צלחת איסוף אלומיניום סנטימטר.
- צרף את האלקטרודה של אספקת חשמל במתח גבוה ועד לקצה של המזרק ואת הארץ לצלחת איסוף אלומיניום.
יש להקפיד שמתח גבוה נמצא בשימוש כלומר תמיד להפוך את אספקת החשמל כבוי לפני טיפול בכל ציוד electrospinning: זהירות. - לספק את הפתרון באמצעות קצב זרימה מתמיד של 3.5 מ '/ שעה ב12 קילו וולט עבור 2 שעות. Electrospinning באמצעות תנאים אלה ייתן עומק פיגום של כ 60 מיקרומטר.
- השאר את הפיגום במנדף ל24 שעות כדי לאפשר לשאריות ממיסים להתאדות.
2.2 pH Electrospinning PLGA פיגומים Responsive
- הכן את הפיגומים המשלבים חיישנים זעירים מגיבים pH כאמור בסעיף 2.1 אבל עם השינוי של הוספת חיישנים זעירות לפתרון הפולימר (5 מ"ג / מיליליטר). להשעות את החיישנים הזעירים בפתרון PLGA בסיוע ultrasonication (כ -5 דקות) לפני להצבה לתוך מזרק 10 מ"ל.
2.3 SEM של PLGA פיגום ופיגום תגובה pH
- הנח מדגם של פיגום PLGA או הפיגום מגיב pH על בדל מיקרוסקופ פחמן מצופה אלקטרונים והמשך כמתואר עבור SEM של חיישנים זעירים (איור 1).
2.4 כיול של פיגום תגובה pH
- הנח מדגם של פיגום מגיב pH לתוך צלחת תרבות 35 מ"מ ולטבול בפתרונות מאגר מתאימים.
- על מיקרוסקופ confocal להשתמש בליזר ארגון 488 ננומטר כדי להלהיב את FAM וליזר קריפטון 568 ננומטר כדי להלהיב את טמרה בחיישנים הזעירים. שים לב לפליטת הקרינה לפיגומים מגיבים pH ב500-530 ננומטר לFAM ו558-580 ננומטר לטמרה. (איור 2). השתמש בסריקה רציפה כדי למנוע אוסף של אורכי גל עירור.
3. תא תרבות על PLGA פיגומים וpH PLGA פיגומים Responsive
ntent "> הערה: הבאים צריכה להתבצע בקבינט תרבית תאים.3.1 הכנת PLGA פיגומים לתרבית תאים
- חותכים את פיגומי PLGA מגיבים PLGA או pH ל2 סנטימטר 2 חתיכות.
- לעקר פיגומים על ידי הקרנה באור אולטרה סגול (UV) במרחק של 8 סנטימטר ל15 דקות מכל צד.
- העבר את הפיגומים לצלחת תרבות 12 היטב ומניח את טבעת פלדה על גבי. הוספת פתרון של פניצילין / סטרפטומיצין (5% V / V) בופר פוספט (PBS) לחלק הפנימי וחיצוני של טבעת הפלדה, דגירה הלילה (37 ° C CO, 2 5%). שים לב לטבעת הפלדה יוצרה באוניברסיטת נוטינגהם ויש לו את הממדים הבאים: קוטר חיצוני 2 סנטימטר, קוטר פנימי 1 סנטימטר, עומק 1 סנטימטר.
- הסר את פתרון החיטוי ולשטוף עם PBS.
- הוסף מדיה תרבית תאים לחלק הפנימי (500 μl) ומחוץ (500 μl) של טבעת הפלדה, המקום באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2
- הכן את ההשעיה תא ולבצע ספירת תאים באמצעות assay הדרת Trypan הכחול.
- צור השעיה תא על מנת להשיג מספר תא של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
- הסר את המדיה מבפנים ומחוץ לטבעת הפלדה.
- החלף עם תקשורת ותרבות תא prewarmed בצד החיצוני של טבעת הפלדה (1 מ ').
- הוסף 300 μl של ההשעיה התא לחלק הפנימי של טבעת הפלדה - צלחת רוק קדימה ואחורה בעדינות כדי להפיץ תאים.
- מניחים את צלחת תרבית תאים לתוך חממה (37 ° C CO, 2 5%) - מצורפים תא צריך לקחת את המקום תוך 24 שעה, עם זאת תמשיך בתרבות כל עוד הניסוי דורש - מרעננת התקשורת בכל 2-3 ימים.
3.2 משלוח Nanosensor לתאים בתרבית על PLGA פיגום
- תאי זרע על גבי פיגום PLGA כפי שתואר בסעיף 3.1. במחקר זה פיגום PLGA ריק (לא containanosensors נינג) שימש עקב חפיפה של פליטת הקרינה כאשר הדמיה.
- הנח את פיגום זרע התא לתוך חממה (37 ° C CO, 2 5%) ל72 שעות כדי לאפשר לתאים לגדול ולנדוד ברחבי הפיגום לפני Nanosensor מסירה.
- לפני Nanosensor משלוח לשטוף את התאים עם PBS ולשנות את התקשורת מתקשורת והתרבות סטנדרטית לתקשורת חופשית באנטיביוטיקה וסרום, דגירה (37 ° C CO, 5% 2) במשך שעה 1. הערה: תקשורת ותרבות רגילה עבור 3T3 תאים מורכב של המדיום של הנשר בתוספת עוברי עגל בסרום (10% (v / v)) פתרון, L-גלוטמין (2 מ"מ), פניצילין / סטרפטומיצין השתנה Dulbecco (1% (v / v)) .
- במהלך תקופת הדגירה להכין מורכב nanosensor-יפוזום ידי sonicating בקצרה חיישנים זעירים (5 מ"ג) עם OptiMEM (50 μl) כדי ליצור א פתרון
- יצירת הפתרון B על ידי הוספת Lipofectamine 2000 (μl 5) לOptiMEM (45 μl), דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
- הוספת פתרוןלפתרון B, דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות כדי ליצור C פתרון שהוא מורכב nanosensor-יפוזום.
- להוסיף C פתרון (100 μl) לתאי דגירה (37 ° C CO, 2 5%) למשך 3 שעות.
- הסר את הפיגומים שנזרעו תאים מן החממה, תקשורת לשאוב ולשטוף פעמיים עם PBS לפני הוספת PBS (1 מיליליטר), כדי לאפשר להדמיה תא חי על ידי מיקרוסקופיה confocal. הערה: PBS היה בשימוש בפרוטוקול זה, כך שהחיווי האדום פנול הנמצא בתרבית תאי תקשורת לא גרם autofluorescence וגם בגלל כיול ב-pH שונה שמתבצע. עם זאת תקשורת החופשית פנול האדום יכולה לשמש לניתוח לטווח ארוך יותר של תרביות תאים.
- לטבול את פיגום זרע התא לתוך מאגרים של pH שונה ולפקח על התגובה של החיישנים הזעירים הקשורים לתאים.
- לפקח על אובדן כושר עבודה על ידי קביעת היחס בין עוצמות הקרינה מFAM וטמרה על ידי התבוננות הקרינה באמצעות מיקרוסקופיה confocal (figuמחדש 3).
מיקום Nanosensor 3.3 בתוך תאי יונקים
- דגירה תאים עם חיישנים זעירים המכילים רק את צבע FAM כפי שתואר בסעיף 3.2 (זה בגלל פליטת הקרינה של טמרה היא באותו האזור הרפאים כאדום Lysotracker). הכן nanosensors אלה כפי שתואר בסעיף 1.1 אבל עם ההשמטה של הכנה והוספת טמרה.
- לאחר תקופת משלוח nanosensor לדלל פתרון מניות Lysotracker אדום 50 ננומטר.
- הוספת aliquot של הפתרון המדולל (2 μl) לתאים בתרבית על פיגומי PLGA.
- דגירה התאים עם Lysotracker אדום עבור שעה 1 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
- לאחר תקופת הדגירה להסיר את המדיה ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS (pH 7.4) לפני שינוי התקשורת לPBS (pH 7.4) (2 מיליליטר) כהכנה לצפייה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. הערה: תקשורת החופשית פנול האדום יכולה לשמש במקום PBS.
- הוסף את הכתם הגרעיני דראעQ5 לPBS כך הריכוז הסופי הוא מיקרומטר 5 ו דגירה עם התאים במשך 3 דקות (37 ° C-CO 2 של 5%). אין זה הכרחי כדי לשנות את התקשורת לאחר תקופת הדגירה עם Draq5.
- השתמש בליזר 488 ארגון ננומטר כדי להלהיב את FAM רק חיישנים זעירים, לייזר קריפטון 568 ננומטר לרגש האדום Lysotracker ו633 לייזר הליום ננומטר / ניאון כדי להלהיב את chromophore Draq5 ולבחון הקרינה ב500-530 ננומטר, 580-600 ננומטר, 650 -750 בהתאמה ננומטר (איור 3). השתמש בסריקה רציפה כדי למנוע אוסף של אורכי גל עירור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התפלגות הגודל של החיישנים הזעירים מגיבים pH מוכנים התאפיינה באמצעות SEM, שבו האוכלוסייה של nanosensors צילם נמדדה ונמצאה כי ממדי ננומטר בטווח של 240-470 ננומטר (איור 1 א). ההישג של קוטר צר וקטן למדי בקנה אחד עם שימוש בשיטת Stober להכין חלקיקים. זה נמצא כי שימוש בסביבת ה-pH בסיסית במהלך הסינתזה של חלקיקים כלומר חלקיקים מוכנים תוך שימוש בשיטת Stober, מאפשר שליטה טובה של הגודל, ואילו הכנה באמצעות תנאים חומציים מייצרת פיזור רחב בגודל חלקיקים. micrographs SEM נציג של סיבי electrospun PLGA המפוברק באמצעות השיטות שתוארו מוצג באיור 1 ב הוכחת כי פיגום PLGA מיוצר מורכב מסיבים לא ארוגים בו מוצגות אגלים או שבירה מינימאליים שבו יש הסיבים ממדי ננומטר. איור 1 ג באיור 1B, micrographs SEM לספק ראיות של עמותת nanosensor על פני השטח של הסיבים אולם הם עשויים גם להיות משולב בתוך סיבי הפיגום, מחקרי השפלה של פיגומי הפיגום / nanosensor אלה יכולים להתבצע בשיתוף עם SEM ו / או confocal כדי לקבוע אם זה משפיע על ביצועי nanosensor.
היכולת של החיישנים הזעירים כדי לשמור על הפעילות האופטית שלהם בעקבות שילובם בסיבי PLGA אומתה על ידי בחינת פיגומי דיווח העצמי באמצעות מיקרוסקופיה confocal. שמירה על היכולת להישאר אופטי ופעיל מבחינה כימית כאשר שולבו סיבי הפיגום יכולה לאפשר ריכוזי אנליטי כדי להיות במעקב. הקרינה הנפלטת מהחיישנים הזעירים הוכיחה כי nanosensors retained הפעילות האופטית שלהם וקשורים לסיבי הפיגום. הקרינה הנפלטת מFAM הצבעים (הירוק) וטמרה (אדום) התאגד בחיישנים הזעירים מגיבים pH מוצג ב2A דמויות ו2B בהתאמה. זו היא תוצאה חיובית שעושה את זה אפשרי עבור ריכוזי אנליטי כדי להיות במעקב באתרם. זוהי גם הפעם הראשונה שnanosensors ratiometric הפעיל אופטי שולבו סיבי פיגום PLGA באמצעות תהליך electrospinning. לאחר שאשר כי החיישנים הזעירים ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הבא התאגדות לתוך סיבי PLGA, תגובת nanosensor לשינויים בריכוז אנליטי אומתה. טבילת הפיגום לתוך מאגרים של pH שונה הביאה לשינוי של עוצמת הקרינה מצבע FAM תוך הקרינה הנפלטת לצבוע התייחסות טמרה לא השתנה באופן ניכר. היחס בין עוצמת ניאון של שני הצבעים יכול לשמש כדי לדרבןתחיקה עקומת כיול כפי שמוצג באיור 2 ג. עקום הכיול לחיישנים זעירים העריך לבד וכאשר שולבו פיגום PLGA electrospun דומה ומוכיח כי nanosensors לשמור על הפעילות האופטית שלהם בעקבות שילובם בפיגומי דיווח העצמי. היכולת של פיגום דיווח העצמי להגיב הפיכה לערכי pH שונים הוערכה על ידי לסירוגין לטבול את הפיגום במאגרים עם ערכי ה-pH של 5.5 ו7.5. ההפיכות נמצא להיות טוב מאוד כפי שמוצגים באיור 2 ד בי פיגום דיווח העצמי יכול להגיב לשינויים מחזוריים רבים בpH. מחקרים ארוך טווח לא בוצעו על מנת להעריך את ההשפעה של השפלה PLGA על התאגדות nanosensor, היא חשבה שבגלל שnanosensors לתת מענה ratiometric כמות nanosensors הנוכחי לא תשפיע על התוצאה.
אנליטי nanosensors התגובה נמסר באמצעות liposomסוכן transfection אל לסביבה תאית של 3T3 fibroblasts הצמיחה שנתמך על ידי פיגומי PLGA ריקים. תמונות מיקרוסקופיה confocal של 3T3 fibroblasts התרבותי על פיגומי PLGA ריקים להוכיח כי חיישנים זעירים הקשורים לתאים פיברובלסטים עם הקרינה נצפו מFAM וטמרה מוצג ב3A דמויות ו-B בהתאמה. כיסיתי את הקרינה מערוצים אלה מראה כי הקרינה משני הצבעים היא שיתוף מקומי, טוען כי הצבעים נשארו לכוד בתוך המטריצה של החיישנים הזעירים ביולוגית (כמתואר על ידי הקרינה צהובה באיור 3 ג). החיישנים הזעירים נחשבים בתוך הציטופלסמה של fibroblasts 3T3 ולא הכיל בתוך תאי חומצי כפי שמעיד על חוסר הקרינה מקומית במשותף מFAM רק חיישנים זעירים וצבע האדום Lysotracker המתואר באיור 3D. עוצמת הקרינה של nanosensors התגובה pH לספקאד ל3T3 fibroblasts היה פיקוח תוך התאים היו נתונים לשינויים ב-pH שתוצאותיו מוצגים באיור 3E. גרף הפיק מוכיח כי התאים בתרבית על פיגום PLGA electrospun שמרו Phi בטווח 6.8-7.0.
איור 1. micrographs SEM של חיישנים זעירים, סיבי PLGA ופיגומי דיווח עצמיים. () Nanosensors התגובה pH סול מראה חלקיקים ננומטרים כדורית בגודל (ב) סיבים ארוגים electrospun PLGA בי מורפולוגיה סיבים היא רגילה עם מינימאליים ואגלי ושבר פיגומים (C) pH תגובה דיווח עצמי שבו ניתן לצפות nanosensors להיות בולט מן המורפולוגיה עדיין סיבי PLGA נשארה דומה עם סיבי PLGA שליטה שאינו מכילים nanosensors. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. תמונות confocal מיקרוסקופ פיגומי דיווח עצמי pH מגיבים בו הקרינה ניתן לצפות מהחיישנים הזעירים הקשורים לסיבי פיגום PLGA. () FAM (ירוקה) הצבע מגיב pH ו (ב) טמרה (אדום) צבע ההתייחסות. (C) גרפים כיול של חיישנים זעירים pH מגיבים סול ופיגומים מגיבים pH demonstשיעור שהתגובה האופטית וכימית של החיישנים הזעירים לא נפגעה כאשר שולב בתוך סיבי פיגום PLGA. הפיכות (ד ') של פיגום דיווח העצמי שבוצע על ידי טבילת הפיגום בפתרונות מאגר חלופיים של pH 5.5 וpH 7.5. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. תמונות מיקרוסקופיה confocal של nanosensors התא הפנים וגרפים של ה-pH ותגובת Phi. הקרינה מהחיישנים הזעירים הפנימו () FAM (ירוק) (ב) טמרה (אדום) (ג) שיתוף לוקליזציה של הקרינה מFAM וטמרה (צהוב) ( D) FAM רק חיישנים זעירים (ירוק) נמסר לתרבות 3T3 fibroblastsד על פיגום PLGA עם תיוג Draq5 (מגנטה) של הגרעין וLysotracker אדום (אדום) תיוג של lysosomes. Fluoresence של FAM ואדום Lysotracker לא תשתף מקומיים ולכן הוכחת כי אין זה סביר כי nanosensors הופנם לתוך תאים חומצי סלולריים מדידות (E) Phi נלקחו מחיישנים זעירים נמסרו 3T3 fibroblasts התרבותי על פיגום PLGA ריק בהשוואה לכיול pH של פיגום חישת pH ללא התרבות של תאים. זה גם מוכיח כי מדידות pH בוצעו באמצעות החיישנים הזעירים הפנימו אינם חומצי כמו התאים בתרבית על פיגום PLGA electrospun שמרו Phi בטווח 6.8-7.0. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנדסת רקמות שואפת ליצור תחליפים ביולוגיים שיכולה לשמש גם כin vivo כמו במבחנה מודלים רקמות ובטיפול בתחליפי רקמות לתקן, להחליף, לשמר או לשפר את התפקוד של רקמה או איבר מסוים. תחליפים סינטטיים היו בשימוש במשך שנים רבות כדי להחליף או לתקן את הסיוע של רקמות אך אלה לעתים קרובות אינם מצליחים בשל שילוב עני עם רקמת המארח ו / או זיהום, שסופו של דבר מוביל לדחייה או ניתוח תיקון נוסף. יצירת רקמת חיה במעבדה לפני ההשתלה יכולה להתייחס לנושא של השגת אינטגרציה מלאה ולהפחית את הצורך בניתוח לתיקון. עם זאת, עבור מטרה זו להתממש התפשטות מתאימה במבחנה ומניפולציה של תאים בתוך מבני 3D צריכה להיות בשילוב עם מיזוג פיזי מתאים של הרקמות במבחנה. זו יכולה להיות מושגת במספר הדרכים אחד להיות כדי להמשיך במחקר בביולוגיה הבסיסיתמעורב, אלא גם כדי לחקור את נושאי הנדסה וייצור הקשורים לייצור של תחליפים סינטטיים. זה העניין אחרון זה, כי הפרוטוקול המתואר שואף לתרום.
השימוש המיועד של פיגומי PLGA תיארו הוא לספק תמיכה זמנית לתאי יונקים לסייע לצמיחה שלהם לתוך מבנה רלוונטי מבחינה ביולוגית. שילוב של חיישנים זעירים מגיבים אנליטי לפיגומי PLGA עלול לאפשר ריכוזי אנליטי מקומיים כדי להיות במעקב לאורך מבנה 3D במהלך תהליך צמיחת הרקמות. השימוש בפיגומים מגיבים pH עלולים לאפשר הקביעה אם חומצי על ידי מוצרים המיוצרים כתבנית מתפרקת והתאים גדלים הם סולקו ביעילות מתוך מבנה 3D. זהו צעד לכיוון טיפול בחוסר הנוכחי של מעקב אחר תהליך ובקרה של תהליכי התחדשות רקמות במבחנה. הניצול של פיגומים, כי הם עצמם חשים התקנים עשוי לאפשר בבאתרו, הערכת microenvironmental בזמן אמת. ניטור microenvironment המבנה מבלי לפגוע ברקמה חיונית ויאפשר ניטור תהליך בכל שלבי ייצור רקמה.
היכולת של הפיגום מגיב pH מיוצר לדווח ריכוז אנליטי המקומי הוערכה על ידי ניטור פלט הקרינה מן החיישנים הזעירים באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ניסוי כיול בוצע עבור פיגום חישת pH והוכיח דומה לזו של החיישנים הזעירים מגיבים pH לא שולבו סיבי PLGA. היכולת לייצר עקומת כיול מוכיחה כי nanosensors להישאר מגיב לשינויים ב-pH כאשר שולבו פיגום הפולימרים וגם כי תהליך העיקור של הפיגומים לא גרם להשפעות מזיקות ליכולת החישה של nanosensors-pH. יתר על כן, חיישנים זעירים הועברו לסביבה תאית של תאים בתרבית על פיגומי PLGA wherדואר תגובה תאית לשינויים באובדן כושר העבודה יכולה להיות במעקב. יחס בין עוצמות הקרינה מFAM וטמרה שימש כדי לפקח Phi ובהשוואה לפיגום מגיב pH, טוען כי תאי פיברובלסטים 3T3 שמרו Phi בpH הטווח 6.8-7. fibroblasts דוגרים 3T3 transfected עם חיישנים זעירים עם הכתם הגרעיני Draq5 הצביע על כך שהרוב המכריע של החיישנים זעירים הקשורים תא לא היו ממוקם באזור הגרעיני. מיקום Nanosensor אינו מופיע להיות בתוך תאים חומציים כגון endosomes או lysosomes כפי שנקבע על ידי דוגרים nanosensor transfected 3T3 fibroblasts עם Lysotracker אדום, שבו שיתוף לוקליזציה של FAM וLysotracker האדום הייתי להיות מתוארת על ידי פיקסלים צהובים בתמונות confocal. מחקרים נוספים כגון ניתוח על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) וזיהוי של סמנים ביולוגיים למסלולי הפנמה יכולים לאמת את זה עוד יותר. בנוסף, מחקרים ארוך טווח כגון מיקרוסקופיה confocal זמן נפתריכול לקבוע את גורלו לטווח הארוך של החיישנים הזעירים בתוך תאים בתרבית על פיגומי דיווח עצמיים. אם nanosensors היה להיות מועבר לסוגי תאים אחרים אז המיקום שלהם צריך להיות מזוהה כתוצאה לא יכול להיות זהה לזה שמוצג כאן.
השימוש בפיגומי דיווח עצמי יש הפוטנציאל לפקח noninvasively תנאי microenvironmental בתוך מבני רקמות מהונדסות. יש לו את היכולת לבצע במדידות באתר יכול לאפשר אופטימיזציה של הצמיחה של מבני רקמת 3D במבחנה noninvasively ובזמן אמת. מיקום cytoplasmic של החיישנים הזעירים מגיבים pH יכול להיות מנוצל כדי לפקח על אובדן כושר עבודה במהלך ניסויים מתמשכים. Nanosensors נמסר לסביבה הפנימית של תאים או פיגומי דיווח עצמיים יכול גם לשמש במערכות תרבית רקמה סטטית או דינמיות ויכול להוביל לקביעת תנאי התרבות נדרשים לצמיחה אופטימלית של מבני רקמות מהונדסות במבחנה. פיתוח נוסף יכול להוביל למערכת on-line שפועלים על דלדול מזין להבטיח אספקה עקבית של חומרים מזינים וחמצן בכל המבנה, בסופו נותן שיטה לשחזור מאוד לתרבות של מבני רקמות.
הפרוטוקולים שתוארו הכינו פיגומים עם ממדים מתאימים שיאפשר הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal עם זאת, כדי לאפשר 3D הגדול בונה להיות צילמה עירור רב פוטון עשוי להידרש כדי לאפשר הדמיה בתוך מבנים עמוקים יותר. הציוד האופטי המשמש כגון עדשת המיקרוסקופ צריך להיות שנבחר כדי לקבוע את מרחק העבודה האופטימלי לעדשה ואת ממדי המבנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מימון מBBSRC הוא הודה בחביבות (מספר מענק BB H011293 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N.
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
