Summary
Biyo-uyumlu pH duyarlı sol-jel nanosensors poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) electrospun iskeleleri katılabilecektir. Üretilen kendi-rapor iskeleleri iskelesi üzerinde hücrelerin kültürlenmesi iken microenvironmental durumların in situ izlenmesi için de kullanılabilir. 3D hücresel yapı deneyi bozmadan gerçek zamanlı olarak izlenebilir edildiğinden bu durum yararlıdır.
Abstract
Uygun desteği üzerinde 3D kültürlenmesi Hücreler daha iyi in vivo mikro taklit eden ve hücre-hücre etkileşimi geliştirmek için düşünülmektedir. Elde edilen 3D hücresel yapı, genellikle 2 boyutlu olarak incelenmiştir benzer deneyler daha moleküler olayları ve hücre-hücre etkileşimleri incelemek için daha uygun olabilir. Iskele boyunca yüksek hücre yaşayabilirliği ile etkin bir 3 boyutlu kültürleri oluşturmak için, oksijen ve dikkatli bir analit konsantrasyonunu gradyanlar gibi pH kontrol edilmesi ihtiyacı gibi kültür koşulları 3D yapısı boyunca mevcut olabilir. Burada poli memeli hücre kültürü için daha sonraki hazırlama ile birlikte (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) electrospun iskelesi olarak biyo-uyumlu bir pH duyarlı sol-jel Nanosensors ve birleşme hazırlama yöntemlerini tarif eder. PH duyarlı bir 3 boyutlu iskeleler, hücresel yapı içinde microenvironmental pH değerinin belirlenmesi için bir araç olarak kullanılabilir. Ayrıca, detay pH duyarlı nanose ve Teslimatbüyüme electrospun PLGA iskeleler ile desteklenmiştir memeli hücrelerinin hücre içi ortamı için nsors. PH duyarlı nanosensors sitoplazmik yer eden deney sırasında hücre içi pH (pHi) izlemek için kullanılabilir.
Introduction
Doku mühendisliğinde önemli bir strateji morfolojisi yerine gidiyor doku benzer ve aynı zamanda hücre büyümesi ve fonksiyonu 1,2 destekleyebilen iskeleleri imal etmek için biyouyumlu malzemelerin kullanılmasıdır. Iskele hücre bağlanması ve çoğalması henüz 3D hücresel yapının deliklerinden boyunca hücre göçü veriyor vererek mekanik destek sağlar. Skafold, aynı zamanda hücre besinlerin kütle taşınması için izin vermek ve metabolik atık 3 çıkarılmasını önleyen olmamalıdır.
Elektro-hücre büyümesi 4-6 destekleme kapasitesine sahip polimerik iskelesinin imalatı için umut verici bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Genellikle gözenekli ve 3D hücresel yapı 7'nin boşlukları boyunca hücre-hücre etkileşim hem de hücre göçünü sağlar olarak üretilen dokuma olmayan lifler electrospun hücre büyümesi için uygundur. Bu t sırasında hücre canlılığı izlemek için önemlidirO kültür dönemi ve o hücre canlılığı sağlamak için 3D yapının tamamı boyunca korunur. Analit konsantrasyonunda geçişlerini 3D yapısı içinde bulunabilir Örneğin, bu oksijen ve pH gibi kültür koşulları, dikkatli kontrolü gerektirir. Biyoreaktörler veya perfüzyon sistemleri interstisyel akış vivo koşullarda ve bir sonuç artış besin transferi ve metabolik atık temizleme 8 olarak taklit etmek için kullanılabilir. Bu tür sistemleri sürekli microenvironmental koşulları sağlamak olup olmadığı sorusu gerçek zamanlı hücresel mikroçevreyi değerlendirerek ele alınabilir.
Gerçek zamanlı olarak takip edilebilir anahtar mikro çevre ölçümler şunlardır: sıcaklık, hücre ortamının kimyasal bileşimi, çözünmüş oksijen ve karbon dioksit konsantrasyonu, pH, ve nem. Bu ölçütlerin, sıcaklık en kolay yerinde sondaları kullanılarak izlenebilir. Yaygın kalan listelenen ölçümleri izlenmesi için yöntemlerBu nedenle hızlı uzun vadeli örnekleme için bir alikot çıkarılması ve hücre kültürü rahatsız ve kirlenme riskini artırır. Sürekli, gerçek zamanlı yöntemler aranmaktadır. Şu an izleme yöntemleri genellikle fiziksel bir pH monitörü veya oksijen sondası gibi hücresel yapıyı soruşturma araçların güvenmek. Ancak, bu müdahaleci yöntemler hücresel yapı hasar ve devam eden deneme rahatsız edebilir. 3D yapı içindeki analit konsantrasyonlarının Noninvasive izlenmesi gibi besin tüketme 9 gibi çeşitli çevresel yönleri gerçek zamanlı izleme olanak verebilir. Bu yapı içinde daha derin bölgelere besin kaynağının değerlendirilmesine olanak ve metabolik atıkların etkin 10,11 kaldırılıyor olup olmadığını belirleyecek. Invazivliğinin sorunu gidermek için girişimde sistemleri genellikle pH, oksijen izlemek ve 12 glikoz kültür geminin hem aracılığıyla ve dış sensörler kültür ortamı geçer bir perfüzyon odasının kullanımını içerir.Yeniden örnekleme için doğrudan bir alikotunun kaldırılmasını gerektirmeyen ve bu gibi in situ izlenmesi sağlayacak bir kültür kabı içine entegre edilebilir sensörleri gelişmekte olan artan bir ilgi.
Yerinde ve öz-raporlama iskeleleri 13 üretmek için electrospun iskelelerinin içine analit duyarlı Nanosensors dahil etmişlerdir microenvironmental koşulları noninvaziv izlenmesi için böyle eksiklikleri gidermek için. Algılama cihazı elektroeğirme önce veya iskele oluşumu 14,15 için polimer içine dahil edilen bir analit duyarlı boyanın kullanımı ile oluşturulan gerçek polimer iskele ya da olduğu yerde floresan etkinliğini izleme ile olduğu gibi hareket algılama cihazları iskeleleri, daha önce hazırlanmış . Ancak, bu algılama cihazları diğer analitlerin olası parazit neden olduğu hatalı optik çıkış vermek için potansiyele sahiptir. Bir rasyometrik algılama cihazı su kullanımıAçıklanan protokol hazırlanan bileşikler gibi ch bu olası yan etkilerinin ortadan kaldırılması ve söz konusu analite özel bir yanıt sağlamak için potansiyele sahiptir.
Burada sunulan electrospun iskeleleri nedeniyle seçilen sentetik bir ko-polimer, poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) dan hazırlanmıştır Gıda ve İlaç bunun biyolojik olarak indirgenebilen biyolojik uyumlu ve özellikleri nedeniyle İdaresi (FDA) ve bir parça olan çeşitli hücre tipleri 16-18 büyümesini ve işlevini destekleyen kaydı. Hazırlanan rasyometrik analit duyarlı nanosensors pH duyarlı. Nanosensors bir boya FAM pH'a duyarlı ve diğer biyolojik olarak uyumlu olan bir sol-jel matris, iki floresan boyalar dahil, TAMRA bu pH'a duyarlı değil gibi bir iç standart olarak işlev görür. Önemli ölçüde üst üste olmayan Dahası FAM ve TAMRA hem de floresan ayrı ayrı analiz edilebilir. Floresan emi oranının belirlenmesiBelirli bir dalga boyunda her iki boya salgılanması diğer çevresel koşullardan bağımsız bir pH tepki verir. Self-raporlama iskeleleri geliştirilen 3D modeli bozmadan yerinde ve gerçek-zamanlı olarak pH tekrar değerlendirilmesine izin verebilir. Bunların iskeleleri hücre eki ve çoğalmasını destekleme yeteneğine sahip olan ve söz konusu analit için duyarlı kalmasını olduğunu göstermiştir. Mühendislik yapıları yan ürünlerin asidik kinetik ilgili yeterli kalır ve gibi pH duyarlı iskeleleri kullanarak büyük ölçüde bu tür çalışmalar, 19 kolaylaştırabilir. Bundan başka, doku mühendisliği uygulamaları için kendiliğinden raporlama iskelelerinin kullanılması olanağı tamamen anlamak izleme ve in vitro olarak 3D modeli yapılarının doku büyümesini, invaziv olmayan ve gerçek zamanlı olarak optimize etmek için sunulur.
PH duyarlı nanosensors da electrospun PLGA inşaat iskelelerinde üzerine kültüre fibroblast hücre içi ortama teslim edilmiştirds. Boyaların floresans emisyon oranı phi izlenmesi için kullanılan ve bir kendi kendine raporlama iskele ile birleşik pH nanosensors karşılaştırıldı. 3 boyutlu bir ortamda kültürlenen hücrelere nanosensors teslim derin yıkıcı olmayan bir şekilde bir yapı içindeki analit konsantrasyonunun izlenmesine olanak verebilir. Bu nedenle nanosensors nondestructively 3D boyunca hücre davranışlarını değerlendirmek için uygun bir görüntüleme aracı uzun vadeli analiz sağlayan yapıları olabilir. 3 boyutlu yapısı içindeki tek tek hücrelerin analit konsantrasyonunun tarama bunlar yeterli besin ve oksijen konsantrasyonları alma emin olabilir. İzleme proses parametreleri oksijen ve besin maddelerinin etkin kitle taşımacılığı için standart tekniklerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Hücre içi ortamı ve bir polimerik içine iskeleler nanosensors dahil edilmesine nanosensors teslimat 3D Kat içinde hücre canlılığının bir değerlendirme olarak iskele performansı sağlamak için birleştirilebilirdoku büyüme sürecinde Ructs. Bu, bu yapıların artan bilgi yol ve biyolojik ilgili doku vekalet imalat ilerleme olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Genel bakış
Bölüm 1 pH duyarlı nanosensors ve SEM ile floresan spektrometrisi ve boyutu kullanılarak pH nanosensor yanıtın karakterizasyonu hazırlanmasını tarif etmektedir.
Bölüm 2 electrospun polimer iskeleler ve SEM kullanılarak morfoloji ve büyüklüğü karakterizasyonu hazırlanmasını tarif etmektedir. Bölüm 2 de pH duyarlı nanosensors dahil edilmesi ile electrospun iskeleleri kendinden raporlama iskelelerinin hazırlanmasını tarif etmektedir. Elde edilen öz raporlama iskeleleri electrospun liflerin herhangi bir morfolojik değişiklikler oluşup oluşmadığını belirlemek için SEM ile karakterize edilir. Dahil nanosensors kaynaklanan kendi kendine raporlama iskeleler floresan konfokal mikroskobu ile tespit edilir.
Bölüm 3 electrospun iskele ve self-raporlama iskele üzerinde hücrelerin kültür açıklar. Iskeleleri ilk preparat sterilize ediliriskeleleri sterilizasyon ve hücrelerin kültür self-raporlama iskelelerinin floresan yeteneğini etkileyip etkilemediğini belirlemek için değerlendirilir hücre kültürü aşağıdaki için iyon. Bu protokol, aynı zamanda electrospun iskeleler üzerine kültürlenir hücrelere nanosensors teslimat açıklanmaktadır. Lysotracker boya nanosensors hücresel asidik bölmelere alınmamış olmasını sağlamak için kullanılır.
1.. Hazırlama ve pH Duyarlı Sol-jel nanosensors analizi
PH Duyarlı Sol-jel nanosensors 1.1 Hazırlanması
Not: Bu preparasyon, bir çeker ocak içinde yapılmalıdır.
- (And-6)-carboxyfluorescein, süksinimidil ester dimetilformamid (FAM-SE) (1.5 mg) (DMF) (1 mi), yuvarlak balon içinde ve 6-karboksitetrametilrodamin dipli - 5 çözülmesiyle pH nanosensors içinde kullanılmak için florofor hazırlanması Başka bir turu succinimidyl ester DMF (TAMRA-SE) (1.5 mg) (1 mi) tabanlı bir balon.Her şişeye 3-aminopropiltrietoksisilan (APTES) (1.5 mL) ekleyin ve karanlıkta 24 saat boyunca bir kuru azot atmosferi (21 ° C) altında karıştırılmıştır, yani folyo ile örnekleri sarın.
- Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde etanol (6 mi) ve amonyum hidroksit (ağırlıkça% 30, 4 mi) yukarıdaki boyaların (250 | il) her iki ilave edin ve 1 saat (21 ° C) karıştırılır.
- Yavaş yavaş ilave bir 2 saat daha karıştırmaya devam edilir, karışıma tetraethylorthosilicate (TEOS) (0.5 ml) ekleyin. Karışım bulutlu dönecek. Nanosensors döner buharlaştırma ile toplanabilir. Nanosensors ileride kullanılmak üzere 4 ° C'de o cam bir şişe içinde muhafaza edilebilir.
DİKKAT: ve bunların kuru formda nanosensors ayrıca ele bir çeker ocak içinde, bir ya da denge Weighsafe örneğin kapalı olmalıdır tartılmaları durumunda gerçekleştirilmelidir.
PH 1.2 Nanosensor cevap
- MIXI ile pH 5,5-8,0 arasında değişen Sørensen fosfat tampon çözeltiler hazırlamaksodyum fosfat monobazik (0.2 M) ve sodyum fosfat dibazik (0.2 M) stok çözeltileri ng özel oranları. Bir pH metre kullanılarak nihai pH değeri kontrol edilir. , Sodyum hidroksit (NaOH) (4 M) veya hidroklorik asit (HCI) (2 M) kullanılarak pH herhangi bir küçük ayarlamaları yapın.
- Çözelti bulanık hale gelene kadar daha sonra ilk olarak bir ultrasonicator olarak damar daldırarak 3 dakika boyunca bir girdap nanosensor çözeltiyi içeren kaba tutarak pH tampon (5 mg / ml) 'de pH Nanosensors Askıya (yaklaşık 5 dakika). Çözelti içinde tamamen Nanosensors askıya için bu adımları tekrarlayın.
- Optik bir küvet içinde, ilk solüsyonu koyun ve 5 için 488 nm eksitasyon dalga boyları kullanımı - (and-6)-karboksiflüoresein (FAM) ve 6-karboksitetrametilrodamin (TAMRA) için 568 nm. FAM ve TAMRA flöresanlı bir spektrometre kullanılarak 558-580 nm için 500-530 nm'de emisyon dalga boylarını toplayın.
- PH, farklı pH değerinde gözlenen böylece optik küvet içinde çözüm değiştirin ve c devamemisyon spektrumunu ollecting.
- Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için her bir pH değeri ile üretilen emisyon maksimumunun oranını hesaplar.
Nanosensors 1.3 SEM
- Bir karbon kaplı elektron mikroskobu kütüğü üzerine nanosensors bir numunesi yerleştirin ve bir argon atmosferi altında 5 dakika boyunca altın ile kat püskürtmeyle çökeltilmesi.
- Elektron mikroskobu (SEM) tarayarak gözlemlemek. Elektron şarj (Şekil 1) en aza indirmek için çalışma mesafesi, gerilim ve büyütmeyi ayarlayabilirsiniz görüntüleme sırasında.
2. PLGA iskelelerinin hazırlanması ve analizi
2.1 Elektrospinning PLGA iskeleleri
- Bir çeker ocak içinde poli piridinyum format ile diklorometan (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) (DCM) (% 20 (a / a)) (PF) (% 1 (ağ / ağ)) çözülür. 18 G künt dolgu iğnesi ve bir şırınga pompası güvenli uygun bir 10 ml şırınganın içine çözüm yerleştirin.
- 20 cm uzakta bir 20 iğne ucu Uzaklıkcm x 15 cm alüminyum toplama plakası.
- Alüminyum toplama plakasına şırınga ve yerin ucu için yüksek voltajlı güç kaynağının elektrodu takın.
DİKKAT: Bakım gibi yüksek gerilim yani her Elektroeğirme ekipmanın herhangi bir işlem yapmadan önce elektrik beslemesini kapatın kullanılır alınmalıdır. - 2 saat boyunca 12 kV, 3.5 m / s arasında sürekli bir akış oranı kullanılarak bir çözüm sunar. Bu koşullar kullanılarak elektroeğirme yaklaşık 60 mikron bir iskele derinlik verecektir.
- Tortu, çözücünün buharlaşmasına izin vermek için 24 saat boyunca, bir çeker ocak içinde iskele bırakın.
2.2 Elektrospinning pH Duyarlı PLGA iskeleleri
- Bölüm 2.1 'de, ancak, polimer çözeltisi (5 mg / ml) için Nanosensors eklenmesi modifikasyonu ile tarif edildiği gibi, pH duyarlı Nanosensors içeren iskeleleri hazırlayın. Ultrasonikasyon yardımı ile PLGA çözelti içinde Nanosensors Askıya (yaklaşık 5 dak) önce Bir 10 ml şırınga içine yerleştiriyor.
2.3 PLGA İskele SEM ve pH Duyarlı İskele
- Bir karbon kaplı elektron mikroskobu kütüğü üzerine PLGA iskele veya iskelenin pH duyarlı bir örnek koyun ve nanosensors SEM (Şekil 1) için tarif edildiği gibi devam edin.
PH Duyarlı İskele 2.4 Kalibrasyon
- 35 mm kültür plaka içine pH duyarlı iskele bir örnek yerleştirin ve uygun tampon solüsyonuna batırmayın.
- Konfokal mikroskop nanosensors içinde TAMRA heyecanlandırmak için FAM ve 568 nm Kripton lazer heyecanlandırmak için bir 488 nm argon lazer kullanır. FAM ve TAMRA için 558-580 nm için 500-530 nm pH duyarlı iskeleleri için floresan emisyon gözlemleyin. (Şekil 2). Uyarma dalga boyları toplanmasını önlemek için sıralı tarama kullanın.
3. PLGA iskelelerinin ve pH Duyarlı PLGA iskelelerinin üzerine Hücre Kültürü
ntent "> Not: Aşağıdaki, bir hücre kültürü kabininde yapılmalıdır.Hücre Kültür PLGA iskelelerinin 3.1 Hazırlık
- 2 cm 2 adet içine PLGA veya pH duyarlı PLGA iskeleleri kesti.
- 15 dakika boyunca her bir yan 8 cm'lik bir mesafede ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakılarak sterilize iskele.
- 12 oyuklu bir kültür plakasına iskeleleri aktarın ve üstüne bir çelik halka yerleştirin. (% 5 v / v) içine fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ve çelik halkanın dışında, bir gece boyunca inkübe Penisilin / Streptomisin bir solüsyonu (37 ° C,% 5 CO2). 2 cm dış çap, 1 cm iç çapa, 1 cm derinlik: çelik halka Nottingham Üniversitesi üretilmiş ve aşağıdaki boyutlara sahiptir edin.
- Sterilize çözüm çıkarın ve PBS ile yıkayın.
- (500 ul) ve dış (500 ul) çelik halkanın, bir kuluçka makinesi içinde yer (37 ° C,% 5 CO2 içine hücre kültürü ortamı ekleme
- Bir hücre süspansiyonu hazırlamak ve Tripan Mavisi dışlama deneyi kullanılarak bir hücre sayımı gerçekleştirin.
- 1 x 10 6 hücre / ml 'lik bir hücre sayısı elde etmek için bir hücre süspansiyonu oluşturmak.
- Çelik halkanın iç ve dış ortamları çıkarın.
- Çelik halka (1 m) dış tarafında, önceden ısıtılmış, hücre kültür ortamı ile değiştirin.
- Çelik halkanın içine hücre süspansiyonu 300 ul ekleyin - kaya plaka geriye ve ileriye doğru hafifçe hücrelerini dağıtmak için.
- Bir inkübatör içine hücre kültürü plakasını (37 ° C,% 5 CO 2) - her 2-3 gün medyayı ferahlatıcı - hücre eki ancak sürece deney gerektirdiği için kültürü devam 24 saat içinde yer almış olmalıdır.
PLGA İskele üzerine kültür hücreleri 3.2 Nanosensor Teslim
- Bölüm 3.1 'de açıklandığı gibi PLGA iskele üzerine tohum hücreleri. Bu çalışmada boş PLGA iskele (değil konteyneri içingörüntülerken, belirli lama nanosensors) dolayı floresan emisyonu üst üste için kullanılmıştır.
- (37 ° C,% 5 CO2) 72 saat için, hücreler önce teslim nanosensor iskele boyunca büyümeye ve geçiş sağlamak için bir inkübatör içine hücre tohumlanır iskele yerleştirin.
- Teslim nanosensor önce 1 saat boyunca (37 ° C,% 5 CO2) inkübe, hücrelerin PBS ile yıkayın ve standart kültür ortamından antibiyotik ve serumsuz ortam bir ortam. Not: 3T3 hücreleri standart kültür ortamı fetal dana serumu (10% (v / v)), L-glutamin çözeltisi (2 mM), penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle ortamı ihtiva eder: (1% (v / v)) .
- Kuluçka süresi boyunca kısa bir çözelti oluşturmak için A Optimem (50 ul) ile Nanosensors (5 mg) ile sonike nanosensor-lipozom kompleksinin hazırlanması
- Optimem (45 ul) ile Lipofectamine 2000 (5 ul) eklenerek çözelti B oluşturma, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Çözeltisi ekleyinBir çözelti B, nanosensor-lipozom kompleksi oluşturmak için C çözeltisi, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Hücrelere çözeltisi C (100 ul) ilave edilir ve 3 saat boyunca (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edilir.
- Inkübatör, aspirat ortamından hücre tohumlandı iskeleleri çıkarın ve konfokal mikroskopi ile canlı hücre görülmesine olanak sağlamak üzere PBS (1 mi) ilave edilmeden önce iki kez PBS ile yıkayın. Not: Farklı pH kalibrasyon yapılmaktadır çünkü hücre kültür ortamında bulunan fenol kırmızı göstergesi de otoflüoresanı neden yoktu ki PBS bu protokolü kullanılmıştır. Ancak fenol kırmızısız medya hücre kültürlerinin uzun dönemli analizi için kullanılabilir.
- Farklı pH tampon içine hücre tohumlanır iskele daldırın ve hücreler ile bağlantılı nanosensors tepkisini denetleyecektir.
- Konfokal mikroskopi (Figu kullanarak floresan gözlemleyerek FAM ve TAMRA gelen floresan yoğunluklarının oranının saptanmasıyla PHI Monitörre 3).
Memeli Hücreleri içinde 3.3 Nanosensor Yer
- Gibi, bölüm 3.2 'de anlatıldığı yalnızca FAM boya (TAMRA floresan emisyonu Lysotracker kırmızı aynı spektral bölgede olduğu için bu) ihtiva eden nanosensors hücreleri inkübe edin. Bölüm 1.1 'de, ancak hazırlanması ve TAMRA ekleme ihmal ile tarif edildiği gibi, bu Nanosensors hazırlayın.
- Nanosensor teslim döneminin ardından 50 nM Lysotracker Kırmızı stok solüsyonu sulandırmak.
- PLGA iskeleler üzerine kültürlü hücrelere seyreltilmiş solüsyon (2 ul) bir kısım ekleyin.
- 1 saat (37 ° C,% 5 CO2) için Lysotracker Kırmızı hücreler inkübe edin.
- Kuluçka döneminden sonra ortamını çıkarın ve konfokal mikroskopi kullanılarak görüntüleme için hazırlık olarak (pH 7.4) (2 mi) PBS ortamı değiştirmeden önce PBS (pH 7.4) ile iki kez hücreleri yıkayın. Not: Fenol kırmızı boş ortam yerine PBS ile kullanılabilir.
- Nükleer leke Dra eklemePBS Q5, böylece son konsantrasyonu 5 uM ve 3 dakika boyunca (37 ° C,% 5 CO2) için hücreler ile inkübe olduğunu. Bu Draq5 ile kuluçka döneminden sonra ortam değiştirme gerekli değildir.
- 650, sadece nanosensors Draq5 kromofora heyecanlandırmak ve 500-530 nm, 580-600 nm floresan gözlemlemek için Lysotracker Kırmızı ve 633 nm helyum / neon lazer heyecanlandırmak için bir 568 nm Kripton lazer FAM heyecanlandırmak için bir 488 nm argon lazer kullanmak -750 (Şekil 3), sırasıyla nm. Uyarma dalga boyları toplanmasını önlemek için sıralı tarama kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hazırlanan pH duyarlı nanosensors boyut dağılımı görüntülü nanosensors nüfus ölçülür ve 240-470 nm'de (Şekil 1A) aralığında nanometre boyutlara sahip olduğu bulunmuştur SEM, ile karakterize edilmiştir. Dar ve uygun küçük çaplı başarı nanopartiküller hazırlamak için Stöber yöntemine ile tutarlıdır. Asidik koşullar kullanılarak Müstahzar parçacık boyutu geniş bir dağılım oluşturur ise nanopartiküller Stöber yöntemi kullanılarak nanopartiküllerin sentezi sırasında temel bir pH ortamı kullanılarak hazırlanmıştır yani, ebatları iyi kontrol edilmesini sağlar bulunmuştur. Tarif edilen yöntemleri kullanarak imal PLGA electrospun elyafların Örnek SEM mikrografları üretilen PLGA iskele elyaflar nanometre boyutlarına sahip en az boncuk veya kırılmasına görüntüleme dokunmamış liflerden oluşur gösteren Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Şekil 1C Şekil 1B 'de kontrol örneği ile karşılaştırılabilir elyafları SEM mikrografları, elyafların yüzeyi üzerinde nanosensor Esas kanıt ürettiğini göstermektedir, ancak bunlar olabilir Ayrıca, iskele lifler içine dahil edilebilir, bu skafold / nanosensor iskelelerinin bozulması çalışmalar bu nanosensor performansını etkiler olmadığını belirlemek için SEM ve / veya konfokal mikroskopi ile birlikte de gerçekleştirilebilir.
PLGA lifleri içine dahil takip eden optik aktivitesini korumak için nanosensors yeteneği konfokal mikroskopi kullanılarak kendi kendine raporlama iskeleleri incelenmesi ile doğrulanmıştır. Iskele lifler içine dahil edildikleri zaman, optik ve kimyasal olarak aktif kalır yeteneğinden Tutma izlenecek analit konsantrasyonlarının olanak verebilir. Nanosensors yayılan floresan nanosensors r göstermiştiroptik aktivitesi etained ve iskele elyaflar ile ilişkilidir. Floresan boyalar FAM (yeşil) yayılan ve pH duyarlı nanosensors dahil TAMRA (kırmızı) sırasıyla Şekil 2A ve 2B'de gösterilmiştir. Bu mümkün analit konsantrasyonları yerinde izlenecek kılan olumlu bir sonucudur. Ayrıca optik aktif rasyometrik nanosensors Elektroeğirme işlemini kullanarak PLGA iskele liflerinin içine dahil edilmiştir ilk kez. Nanosensors PLGA lifler içine dahil edilmesi aşağıdaki floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir doğruladı sonra, analit konsantrasyonunun değişikliklere cevap nanosensor doğrulandı. PH farklı bir tampon içine daldırılması iskele TAMRA boya referans fark değişmedi tarafından yayılan floresan iken FAM boya flüoresan yoğunluğu bir değişiklik ile sonuçlanmıştır. Her iki boya flüoresan yoğunluğu oranı eşya için kullanılabilirŞekil 2C'de gösterildiği gibi, bir kalibrasyon eğrisi üçe. Nanosensors için kalibrasyon eğrisi, tek başına değerlendirilecek ve electrospun PLGA iskele içine dahil edildikleri takdirde karşılaştırılabilir ve nanosensors kendini raporlama iskeleler içine dahil takip eden, optik aktivitesini koruduğunu göstermektedir. Tersine çevrilebilir, farklı pH değerlerine cevap için kendi kendine raporlama iskele yeteneği alternatif olarak 5.5 ve 7.5 arasında bir pH değerinde tampon olarak iskele daldırma ile değerlendirildi. Tersinirlik kendini raporlama iskele pH çok siklik değişikliklere yanıt Şekil 2D'de gösterildiği gibi, çok iyi olduğu bulunmuştur. Uzun vadeli çalışmalar nanosensor birleşmesiyle üzerine PLGA bozulma etkisini değerlendirmek için henüz yapılmamıştır, bu nanosensors bir rasyometrik yanıt sağlamak için mevcut nanosensors miktarı sonucu etkilemez düşünülmektedir.
Analyte duyarlı nanosensors bir lipozom kullanarak teslim edildibüyüme boş PLGA iskeleler ile desteklenmiştir 3T3 fibroblast hücre ortamına al transfeksiyon ajanı. Boş PLGA iskeleler üzerine kültürlenmiş fibroblast 3T3 mikroskopla görsel nanosensors sırasıyla FAM ve TAMRA Şekil 3A'da gösterilen ve B gözlenen floresan ile fibroblast hücreleri ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu kanallar arasındaki floresan Kaplama boyaları (Şekil 3C'de sarı floresan ile gösterildiği gibi) nanosensors "biyo-uyumlu bir matris içinde tutulan ve kalmıştır düşündüren, iki boyalarından floresan birlikte lokalize olduğunu gösterir. Nanosensors FAM ko-lokalize floresans olmaması ile kanıtlandığı gibi asidik bölmeleri içinde ihtiva edilen 3T3 fibroblast olup sitoplazması içinde olduğu düşünülen sadece nanosensors ve Şekil 3B de gösterilen Lysotracker kırmızı boya. PH duyarlı nanosensors floresan yoğunluğu teslimhücreler, Şekil 3E'de gösterilmektedir ve sonuçlar da pH'ındaki değişikliklere maruz iken 3T3 fibroblastlar için ed izlenmiştir. Üretilen grafik electrospun PLGA iskelesi üzerine kültürlenmiş hücreler, 6.8-7.0 aralığında bir PHI korumuştur göstermektedir.
Şekil 1. Nanosensors, PLGA lifler ve self-raporlama iskelelerinin SEM mikrografları. (A) küresel nanometre büyüklüğünde parçacıklar (B) gösteren pH duyarlı, sol-jel nanosensors lif morfolojisi minimal boncuk ve kırılmalara nanosensors çıkıntılı olduğu görülebilir (C) pH duyarlı kendinden raporlama iskeleleri ile düzenli PLGA electrospun dokunmamış lifler PLGA henüz elyaf morfolojisinin nano parçacıkları içermeyen kontrol PLGA elyaflarla karşılaştırılabilir kalırensors. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Floresan PLGA iskele lifleri ile ilişkili nanosensors itibaren görülebilir pH duyarlı kendini raporlama iskeleleri mikroskopisi görüntüleri. (A) FAM (yeşil), pH duyarlı boya ve (B) TAMRA (kırmızı) referans boya. (C) pH duyarlı sol-jel nanosensors ve pH duyarlı iskeleleri Kalibrasyon grafikleri demonstPLGA iskele liflerinin içinde dahil olduğunda nanosensors optik ve kimyasal tepki etkilenmez olmamıştır oranı. PH 5.5 ve pH 7.5 tampon alternatif çözümlerde iskele daldırarak yapılan self-raporlama iskele (D) Tersinirlik. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Hücre içsel nanosensors ve pH ve pHi yanıt grafikleri. Floresans mikroskopisi görsel içsel nanosensors dan (A) FAM (yeşil) (B) TAMRA (kırmızı) (C) FAM ve TAMRA gelen floresans eş lokalizasyonu (sarı) ( D) FAM sadece nanosensors (yeşil) 3T3 fibroblastlar kültüre teslimÇekirdeğin Draq5 (eflatun) etiketleme ve lizozomların Lysotracker Red (kırmızı) etiketleme ile PLGA iskele üzerine d. FAM ve Lysotracker kırmızı floresans bu nedenle nanosensors (E) pHi ölçümleri pH kalibrasyonu ile karşılaştırıldığında PLGA boş bir yapı iskeleti üzerine kültürlenmiş fibroblast 3T3 teslim nanosensors alınan hücre asidik bölmelere içsel edilmiş olası olduğunu gösterir birlikte lokalize değildir hücre kültürü olmayan bir pH algılama iskele. Bu da pH ölçümleri electrospun PLGA iskelesi üzerine kültürlü hücreler aralığında 6.8-7.0 bir Phi korumuştur olarak içselleştirilmiş nanosensors asidik değildir kullanılarak gerçekleştirildi olduğunu göstermektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doku mühendisliği, özel bir doku ya da organ işlevi, onarım, değiştirme korumak veya geliştirmek için in vitro modellerde olduğu gibi, in vivo doku ve doku replasman tedavisi olarak hem de kullanılabileceğini biyolojik yerine geçen oluşturmak hedeflemektedir. Uzun yıllar değiştirmek veya dokuların onarımı yardım ancak bu genellikle nedeniyle sonunda reddi ya da daha fazla revizyon neden olan ana dokusu ve / ya da enfeksiyon ile zayıf entegrasyon başarısız için sentetik yerine kullanılmıştır. Implantasyon öncesinde laboratuvarda canlı doku üreten tam entegrasyon ulaşma sorunu gidermek ve revizyon cerrahisi için ihtiyacı azaltabilir. Bununla birlikte, fark edilmesi için, bu amaç için uygun olan in vitro yayılma ve 3D yapıları içindeki hücrelerin manipülasyonu, in vitro doku uygun fiziksel gelişim ile birlikte olmalıdır. Bu bir temel biyoloji araştırmalarını devam etmek için olan bir dizi yolla elde edilebilirilgili ama aynı zamanda sentetik vekalet üretimi ile ilgili mühendislik ve imalat konuları araştırmak. Bu, tarif edilen protokol katkı sağlamayı amaçlamaktadır, bu ikinci bir konudur.
Açıklanan PLGA iskelelerinin kullanım amacı, biyolojik olarak uygun bir yapı halinde büyüme yardımcı olmak için, memeli hücrelerine geçici bir destek sağlamaktır. PLGA iskelelerinin içine analit duyarlı nanosensors Ortaklığın yerel analit konsantrasyonları doku büyüme sürecinde bir 3D yapı boyunca izlenecek izin verebilir. PH duyarlı iskelelerinin kullanılması ile ürünlerin iskele düşürür ve hücreleri gibi üretilen asidik etkili bir 3D yapı içinde kaldırılır ediliyor büyümek olmadığını tespitine izin verebilir. Bu süreç izleme ve in vitro doku rejenerasyon süreçlerinin kontrolü mevcut olmaması ele yolunda bir adımdır. Kendileri cihazları algılama vardır iskelelerinin kullanım etkinleştirmek olabilirin situ, gerçek zamanlı microenvironmental değerlendirmesi. Dokuya zarar vermeden yapı mikroçevreyi izlenmesi önemlidir ve doku üretimin tüm aşamalarında süreç takip edilmesini sağlayacak.
Yerel analit konsantrasyonunun bildirmek için üretilen pH duyarlı skafoldun yeteneği konfokal mikroskopi kullanılarak nanosensors floresans çıkış izlenmesi ile değerlendirildi. Bir kalibrasyon deney, pH algılama iskele için gerçekleştirilir ve PLGA lifleri dahil değil pH duyarlı nanosensors karşılaştırılabilir kanıtlandı. Bir kalibrasyon eğrisi üretmek için yeteneği nanosensors iskelelerinin sterilizasyon işlemi pH nanosensors algılama yeteneği için herhangi bir zararlı etkiye neden olmayan ki, aynı zamanda, polimer içine dahil iskele ve pH değişikliklerine duyarlı kalmasını göstermektedir. Ayrıca, nanosensors PLGA iskeleler üzerine kültür hücrelerinin hücre içi ortamı teslim edildi nereyepHi değişikliklere e hücresel yanıt izlenebilir. FAM ve TAMRA gelen floresan yoğunluklarının oranı phi izlenmesi için kullanılan ve bir pH duyarlı iskele ile karşılaştırıldığında, 3T3 fibroblast hücrelerinin aralığı pH 6,8-7 bir PHI korumuştur düşündüren edilmiştir. Nükleer leke Draq5 ile nanosensors ile transfekte edilmiş 3T3 fibroblastlar, kuluçka hücresi ile ilişkili nanosensors çoğunluğu nükleer bölgesinde bulunan olmadığını göstermiştir. Nanosensor yer FAM ve Lysotracker kırmızı eş-lokalizasyonu konfokal görüntüler sarı piksel ile gösterilen olacağını Lysotracker Kırmızı ile transfekte edilmiş 3T3 fibroblastlar nanosensor inkübe edilmesi ile tespit gibi endozomlar ya da lizozomlara gibi asidik bölmelere içinde olduğu gibi görünmemektedir. Böyle transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve içselleştirme yollar için biyolojik belirteçlerin tanımlanması ile analizi gibi daha ileri çalışmalar daha bu doğrulamak olabilir. Gibi zaman çözümlü konfokal mikroskopi Buna ek olarak, uzun süreli çalışmalarıself-raporlama iskeleler üzerine kültüre hücrelerin içinde nanosensors uzun vadeli kaderini belirleyecek. Nanosensors diğer hücre tipleri teslim edilmesi olsaydı daha sonra yer bir sonucu olarak tespit edilmelidir ki, burada gösterilen ile aynı olmayabilir.
Self-raporlama iskelelerinin kullanılması noninvaziv doku mühendisliği yapıları içinde microenvironmental koşullarını izlemek için potansiyele sahiptir. Yerinde ölçümler gerçekleştirmek için yeteneği olan noninvaziv ve gerçek zamanlı vitro 3D doku yapıları gelişimini optimize sağlayabilir. PH duyarlı nanosensors sitoplazmik yer eden deney sırasında phi izlemek için kullanılabilir. Hücreler ya da kendi kendini raporlama iskelelerinin iç ortamına teslim nanosensors hem statik veya dinamik doku kültürü sistemlerinde de kullanılabilir ve doku mühendisliği yapılarının optimum büyüme için gerekli olan kültür koşullarını belirlemek için yol açabilirvitro. Daha da geliştirilmesi nihai doku yapılarının kültürü için çoğaltılabilir bir yöntem sağlayarak, yapı boyunca besin ve oksijen tutarlı bir besleyici kaynağı sağlanması tükenmesi üzerine hareket, bir on-line sistemine yol açabilir.
Açıklanan protokoller derin yapıları içinde görüntülenmesine olanak sağlamak için gerekli olabilir büyük 3D sağlamak için, ancak konfokal mikroskopi kullanılarak görüntüleme çoklu foton uyarılması yansıması için yapıları izin vermek için, uygun boyutları olan iskele hazırladık. Bu tür mikroskop lens olarak kullanılan optik aletler lens ve yapı ölçüleri için en uygun çalışma mesafesini belirlemek için seçilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
BBSRC gelen finansman nazikçe kabul edilmektedir (hibe sayısı BB H011293 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N.
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
