Summary
De Tomaat / GFP-FLP / FRT methode houdt in het visualiseren van mozaïek fotoreceptorcellen in levende Drosophila. Het kan worden gebruikt om individuele fotoreceptor celtypes in het netvlies te volgen gedurende dagen of weken. Deze methode is geschikt voor studies van retinale degeneratie en neurodegeneratieve ziekten of fotoreceptorcel ontwikkeling.
Abstract
De Drosophila oog wordt veel gebruikt als een model voor studies van ontwikkeling en neuronale degeneratie. Met de krachtige mitotische recombinatie techniek, hebben elegante genetische screens op basis van klonale analyse leidde tot de identificatie van signaalwegen betrokken bij de ontwikkeling en fotoreceptor (PR) differentiatie in larvale stadia oog. We beschrijven hier de Tomaat / GFP-FLP / FRT-methode, die kan worden gebruikt voor snelle klonale analyse in het oog van levende volwassen Drosophila. Fluorescerende fotoreceptorcellen worden afgebeeld met het hoornvlies neutralisatie techniek, op netvliezen met mozaïek klonen gegenereerd door-flipase gemedieerde recombinatie. Deze methode heeft een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van klassieke histologische coupes van het netvlies: het kan worden gebruikt voor high-throughput screening en doeltreffend is voor het identificeren van de factoren die de PR overleving en functie te. Het kan worden gebruikt voor kinetische analyses PR degeneratie in dezelfde levende Animal gedurende een aantal weken, met de vereiste specifieke genen PR overleving of functie in de volwassen vlieg tonen. Deze methode is ook bruikbaar voor het aanpakken cel autonomie kwesties ontwikkelings mutanten, zoals die waarbij de inrichting planaire celpolariteit beïnvloed.
Introduction
De Drosophila netvlies bestaat uit ongeveer 800 ommatidial eenheden (figuur 1A), die juist georganiseerd, met een duidelijk gedefinieerde as polariteit (figuur 1B). Elke eenheid bestaat uit 20 cellen: acht fotoreceptorcellen (PRS) en 12 accessoire cellen, met inbegrip kegel cellen, pigmentcellen en varkenshaar cellen 1,2. Twee klassen PR onderscheiden op basis van de aard van rhodopsine (Rh) zij uitdrukken. De zes buitenste PR (R1-6) tot expressie Th1 en zijn gerangschikt in een trapezium patroon (figuur 1C). In het midden van de trapezoïde, de twee binnenste PR (R7/R8) expressie vier mogelijke typen rhodopsine (Th3, Rh4, Rh5 of Th6) en zodanig dat R7 ligt bovenop R8 3 georganiseerd.
Meer dan 2500 genen betrokken bij de morfogenese van het Drosophila oog 4, dat een zeer krachtig model voor studies van een breed panel van processen, waaronder oog ont geblekenkeling, PR werving, differentiatie, vlakke cel polariteit, morfogenese, overleving, apoptose en visuele transductie 5-9.
Onderzoekers werken aan de Drosophila oog hebben, gedurende vele jaren, ontwikkelde technieken voor beeldvorming van het netvlies en het uitvoeren van systematische genetische screens. De eenvoudigste manier om het imago van de volwassen netvlies is te kijken naar het hoornvlies in een geïmmobiliseerde dier (Figuur 1A). De structuur van het hoornvlies nauwkeurig kan worden gevisualiseerd door scanning elektronenmicroscopie en is een grote genetische screen door de URCFG consortium ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Dit is een zeer effectieve aanpak voor het visualiseren globale morfologische veranderingen in corneale structuur, zoals oog-uitsteeksels of glans, vaak veroorzaakt door mutaties in genen vroege stappen in ontwikkeling of cellevensvatbaarheid regelen. Echter, wereldwijde visualisatie van het hoornvlies is niet sufficient naar de factoren die de PR rhabdomere morfogenese of volwassene PR levensvatbaarheid en functie te identificeren. Dergelijke analyses vereisen een grondiger onderzoek van PR integriteit, op basis van fase-contrast microscopie van tangentiële semi-dunne harssecties van het netvlies 11-13. Deze techniek is geschikt voor mozaïek analyses waarin mutant PR's kunnen worden geïdentificeerd door hun gebrek aan rode pigment 14,15.
Mosaic mutante klonen kunnen worden gevisualiseerd geheel-mount ontledingen van het popstadium of volwassene retina, op basis van het ontbreken van groen fluorescerend eiwit (GFP) signaal op fluorescentiemicroscopie 16,17. Beide technieken zijn zeer nuttig, maar beide zijn arbeidsintensief en tijdrovend en daarom niet geschikt voor grootschalige screening. Wij en anderen hebben het gebruik van het hoornvlies neutralisatie technieken voor de beeldvorming van PR's produceren fluorescerende eiwitten 18,19 ontwikkeld, te vergemakkelijken een snelle PR analyses. Met deze techniek, mutantklonen kunnen worden geïdentificeerd op basis van de autofluorescentie van het rode (w +) pigment in mozaïek volwassen Drosophila klonen. Echter, deze methode niet in de single-cell gewenste resolutie wordt naar cel autonomie te pakken kwesties 19. We losten dit probleem op door het ontwikkelen van de Tomaat / GFP-FLP / FRT methode, die de beeldvorming van fluorescerende eiwitten door hoornvlies neutralisatie met mitotische recombinatie 20 combineert. Deze methode laat de high-throughput, snelle en nauwkeurige identificatie van mutant PR's in mozaïek klonen, bij eencellige resolutie ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). Het is geschikt voor kinetische analyses voor volgende afzonderlijke PR gedurende weken in levende Drosophila. We beschrijven hier de Tomaat / GFP-FLP / FRT werkwijze en tips voor het gebruik ervan in eenvoudige, kinetische analyses van mozaïek ogen.
Protocol
1. Kruising met Tomaat / GFP-FLP / FRT Lines
De generatie van vliegen die de mutant kloon vereist een kruising tussen een-FRT dragende mutant lijn en de bijbehorende Tomaat / GFP-FLP / FRT vliegen lijn.
Dit werk gebruikt de BruinFly collectie van FRT-gerecombineerde mutaties ( http://www.bruinfly.ucla.edu ). Vier Tomaat / GFP-FLP / FRT-lijnen worden gebruikt, dragen FRT Th1-tdtomatoninaC op elke arm van de 2e en 3e chromosomen gecombineerd met de bron van flipase (ey-FLP) en expressie van GFP in alle buitenste PR (Th1-Gal4 UAS -GFP) 20:
- 2L arm: lijn # 43345, P {ry [+ t7.2] = rh1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2L P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 40A; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 3
- 2R arm: lijn # 43346, P {ry [+ t7.2] = rh1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 42D P{W [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2R; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 3
- 3L arm: lijn # 43347, P {ry [+ t7.2] = rh1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 2; P {w [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3L P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 80B/TM6B, Tb [1]
- 3R arm: lijn # 43348, P {ry [+ t7.2] = rh1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 2; P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 82B P {w [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B, Tb [1]
Deze vier lijnen zijn verkrijgbaar aan de Bloomington Drosophila voorraad centrum. Ze boden een bron van FLP in de ontwikkeling oog voor het genereren van mitotische klonen 21. De wild-type chromosoom draagt een FRT sequentie en een rh1-tdTomato ninaC construct dat codeert voor de rode fluorescente eiwit tdTomato, als een marker voor wild-type en heterozygote buitenste PR's. In dit construct, de laatste 41 aminozuren van de P174 isovorm van de ninaC (geen inactivatie of activatie C) gen was appended in-frame aan de C-terminus van de sequentie tdTomato. De C-terminale staart van de P174 ninaC isovorm verantwoordelijk voor rhabdomeral lokalisatie van het eiwit 22 en maakt dat betere leven visualisatie van fluorescerende PR via het hoornvlies neutralisatie techniek. De rh1 promotor is de minimale 234 bp (-152 +82) rh1 promotor. De groene fluorescente merker GFP expressie wordt gebracht door alle buitenste PR, door de aanwezigheid van de RH1-Gal4 (3kb promoter) en UAS-GFP ninaC constructen. Kruisingen tussen een vlieg voorraad die een mutatie x op de FRT chromosoom (FRT-x) en de Tomaat / GFP-FLP / FRT lijnen levert een nageslacht met de volgende genotype (voorbeeld van mutatie op 2L): rh1-Gal4, ey-FLP ; FRT40A, rh1-tdTomato ninaC / FRT40A-x, UAS-GFP ninaC. In deze vliegen zijn homozygoot mutant cellen gegenereerd door mitotische recombinatie in de oog-schijf en delen om een kloon van homozygote mutant PR (Figuur 2A) genereren. Homozygous mutante cellen kunnen worden geïdentificeerd omdat expressie alleen de groene fluorescent eiwit (GFP), terwijl de omringende wild-type en heterozygote cellen brengen zowel tdTomato en GFP (Figuren 2B en B ").
2. Voorbereiden van Drosophila voor Photoreceptor Visualisatie
Voor PR visualisatie door het hoornvlies neutralisatie techniek, immobiliseren vliegen op agaroseplaten.
- Bereid een spuitfles gevuld met 4 ° C gedestilleerd water en plaats het op het ijs.
- Los regelmatige agarose in water (1,2-1,5% agarose in 100 ml water) door verwarmen in een magnetron. Plaats de kolf in een waterbad van 55 ° C en laat de agarose oplossing op deze temperatuur. Houd de agarose bij 55 ° C tot gebruik.
- Verdoven de vliegen met CO2 gedurende ten minste 1 minuut.
- Giet de warme agarose oplossing (bij 55 ° C) in een petrischaal (35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 cm) en plaats onmiddellijklijk het verdoofd Drosophila op de agarose. Voor beginners, te beginnen met 10 vliegen per petrischaal is redelijk. Grotere petrischaal (60 x 15 mm, 2,362 x 0,59 cm) kunnen ook worden gebruikt.
- Onder een stereomicroscoop, oriënteren de Drosophila op zijn kant met forceps, duw een vleugel in de agarose, zodat de vleugel en de helft van het lichaam zijn ingebed in de agarose (Figuren 3A-3A ""). Plak de andere vleugel op het oppervlak van de agarose. Opmerking: Als de vliegen niet diep genoeg zijn ingebed in de agarose, de vlieg vrij zijn kop tijdens de beeldvorming van het PR bewegen, en dit zal resulteren in vage beelden. De oriëntatie van het oog zal worden verstoord. Het kan moeilijk zijn om de Drosophila duik in de agarose, van zowel de concentratie van de agarose of de temperatuur. Het is gemakkelijker om vliegen meer geconcentreerde agarose insluiten, maar als de agarose te geconcentreerd, kan de vlieg zinken. Als de agarose te koelen, kan het difficult om de vliegen verankeren, maar een te hoge temperatuur kan de cornea beschadigen.
- Plaats de petrischaal op ijs en laat de agarose stollen.
- Met tang, oriënteren de kop zodat een oog wordt blootgesteld aan de immersie objectief (Figuur 3A en 3A ""). In het algemeen kunnen de gaten worden geacht goed georiënteerd onder de stereomicroscoop bij de pseudopupil (zichtbaar als zwarte punt) in het midden van het oog. Een optimale oriëntatie van het oog maximaliseert de breedte van het ommatidial veld waarin PR gericht. Het doel van de oriëntatie stap is het gebied van het oog te vinden met het breedste gebied van gerichte PR, gewoonlijk in het midden van het oog. Deze stap is ook nuttig voor het verwijderen van benen of aristae die het oog en het voorkomen van de visualisatie.
- Bedek de vlieg met ijskoud water en laat de petrischaal op ijs tot visualisatie. Ijskoud water houdt de vliegen verdoofd.
3. VisualiserenPhotoreceptors onder de microscoop
Voor de visualisatie van PR's door de cornea, dit protocol gebruikt een rechtopstaande microscoop uitgerust met een water-objectief met een lange werkafstand (W N-Achroplan 40X/0.75).
- Plaats de petrischaal bedekt met ijs-koud water op een glasplaatje op het podium van de microscoop (figuren 3 v. Chr.) De petrischaal kan worden gelijmd aan het glaasje, waardoor het mogelijk is om soepel met de micrometerschroeven.
- Dompelen de immersie-objectief in het water van de petrischaal (figuren 3B'-3C '). Plaats de kop van de vlieg onder excitatiebundel (beginnen met de GFP filter, bijvoorbeeld). Verplaats het podium op en neer tot de bundel convergeert op het oog. Wanneer het oog op het juiste niveau, neigt het excitatie licht reflecteren.
- Kijk door het oculair voor fluorescentie. Wanneer het oog wordt gepositioneerd in het midden van het gezichtsveld, gericht onder dehoornvlies de fluorescerende fotoreceptoren visualiseren.
Opmerking 1: Bij het zoeken door het oculair kan het ongemakkelijk om de lichaamsdelen van de vlieg, met name het distale deel van de buik en het hoofd onderscheiden, bijvoorbeeld. In dergelijke gevallen moet u rechtstreeks naar het podium om de positie van de Drosophila.
Noot 2: Klassiek fluorescentie of confocale microscopie gebruikt worden. Confocale microscopie geeft beelden met minder achtergrond en een breder gerichte PR's dan de klassieke microscopie. Een voorbeeld set-up is een LSM510 confocale microscoop (Zeiss) met een 40X water doelstelling. Betere resultaten kunnen worden verkregen door het openen pengat van de confocale microscoop breder dan wordt meestal aanbevolen voor de doelstelling. Gebruik bijvoorbeeld een waarde van 204, in plaats van de standaard 98 voor de opening van de pinhole.
Noot 3: Hogere niveaus van w + pigmentatie van de ogen te verminderen de achtergrond fluorescentie. 4. Tijdsverloop Visualisatie van fotoreceptorcellen
Care wanneer na het lot van een individu PR in hetzelfde oog gedurende een tijdsperiode vereist.
- Verlaag de temperatuur van de agarose 45 ° C, bij Drosophila overleving maximaliseren. De agarose stolt snel bij deze temperatuur. Slechts een Drosophila worden gebruikt per Petrischaal, zodat vliegen niet tijdens waarnemingen gemengd.
- Systematisch positie de vliegen aan dezelfde kant, voor het bekijken van hetzelfde oog. Dit kan worden bereikt door de verdoofde vlieg op te zuigen met een vleugel en het Drosophila de agarose. Oriënteren altijd het oog op dezelfde wijze, indien mogelijk, waardoor het gemakkelijk is om PR klonen die eerder zijn bekeken te vinden.
- Identificeer de klonen op basis van hun vorm onder de confocale microscoop. Het gezichtsveld wordt vaak naast de kloon van belang. In such gevallen het oog worden geheroriënteerd onder water, het gezichtsveld centreren op de kloon van belang op basis van de polariteit van het oog (figuur 4).
5. Herstellende Flies na Visualisatie
- Verwijder het water uit de petrischaal.
- Trek de Drosophila uit de agarose met een tang.
- Droog de Drosophila op een tissue.
- De terugkeer van de Drosophila een flesje, zodat deze niet vast komen te zitten in het voedsel. Mag de vlieg om langs te komen bij 25 ° C.
Representative Results
De Tomaat / GFP-FLP / FRT methode kan worden gebruikt om het effect van een mutatie of ectopische expressie op de ontwikkeling en overleving van PR in de Drosophila retina bestuderen. Het is snel, waardoor het ideaal is voor screening doeleinden, zoals onlangs aangetoond 20. De aanwezigheid van mutant PR naast wildtype PR in hetzelfde oog maakt het gemakkelijk om gebreken geassocieerd met mutant PR sporen en de cel autonomie kwestie.
De ontwikkelingsstoornissen waargenomen in onze analysen verschillende processen, zoals PR rekrutering, morfogenese en planaire celpolariteit (PCP) inrichting (figuur 5). Zeven verstek is vereist voor PR rekrutering, met name voor R7 een van de binnenste PR. Het verlies van zeven bij verstek resulteert in het verlies van de innerlijke PR en een aantal uiterlijke PR's (figuur 5A). Korrelige hoofd (GRH) is betrokken bij PCP vestiging en sommige ommatidia zijn inverted in GRH mutant klonen (5B). Deze methode maakt het mogelijk de mutant PR in mozaïek ommatidia identificeren, vergemakkelijken de identificatie van de PR waarin het gen vereist is voor de correcte overname van PCP. We hebben aangetoond dat grh nodig voor de correcte overname van PCP in R3 precursoren 20. Inderdaad waargenomen dat, in de omgekeerde ommatidia, R4, die abnormaal afkomstig van de R3 precursor was altijd mutant. Crumbs (CRBS) is een apicale membraan eiwit nodig voor rhabdomere morfogenese 23. Het verlies van CRBS in de CRBS 11A22 mutant resultaten in onregelmatige, grotere of kleinere PR's (figuur 5C).
Deze methode kan ook worden gebruikt om het lot van afzonderlijke PR op volwassen leeftijd (figuur 6) te volgen. Het is ideaal voor neurodegeneratie studies, omdat een groep van homozygote mutant PR's kunnen worden bekeken en dezelfde groep te vinden in hetzelfde oog van dedezelfde vliegen over een periode van dagen of weken. Het is dus mogelijk om te bepalen welke PR's overleven en die gedoemd zijn te sterven, omdat elke kloon heeft een unieke vorm die kan worden herkend wanneer het oog wordt gepositioneerd onder de fluorescentiemicroscoop. Omdat het netvlies is gepolariseerd, is het mogelijk om de retina oriënteren dezelfde kloon terug te vinden op basis van zijn vorm. We gebruikten deze methode aan te tonen dat FATP k10307 mutatie leidt tot progressieve PR degeneratie in de volwassenheid (Figuur 6, 24). Deze visualisatie methode kan ook worden gebruikt om cel autonomie analyseren. In FATP k10307 mozaïek netvlies, werd PR verlies beperkt tot mutant PR FATP, de wild-type PR's waren beïnvloed. De eis van FATP voor PR levensvatbaarheid is dus cel autonoom. We waren ook in staat om de FATP mutant PR redden door reexpressing wild-type FATP met een rh1-Gal4 driver en een UAS-FATP construct (figuur 7). Demogelijkheid van het uitvoeren van dergelijke reddingsoperaties experimenten is een van de voordelen van de Tomaat / GFP-FLP / FRT methode over klonale analyse op basis van histologische coupes van hars ingebed netvlies. Inderdaad, klonale detectie met de Tomaat / GFP-FLP / FRT methode niet beïnvloed door het gebruik van de P (UAS, w +) transgene constructen, terwijl de rode pigmentatie in verband met de mini-wit gen (w +) dekt het oog met rode pigment , maskeren mozaïek klonen in histologische coupes.
Figuur 1. Organisatie van de Drosophila oog. (A) Foto van een Drosophila oog genomen met een stereomicroscoop. De Drosophila oog is uit ongeveer 800 ommatidia. (B) Schematische weergave van een gebied van 64 ommatidia in het midden van het oog. De zes buitenste fotoreceptor neuronen (PRS) van elk ommatidium,in het groen, zijn georganiseerd in een stereotiepe trapezium die verwijst naar de dichtstbijzijnde polen van het oog. Ze spiegelbeeld vertonen bijgevolg in tegengestelde richtingen in het ventrale en het dorsale deel van het oog en zijn volgens de grens tussen de twee delen, waarbij de evenaar wordt genoemd. (C) Schematische weergave van een ommatidium. Elke ommatidium bevat acht PR's. PR R1 tot R6, in het groen, zijn de buitenste PR's. Zij drukken de lichtgevoelige molecuul rhodopsin1 (Th1) en zijn het equivalent van zoogdieren staaf cellen. De binnenste PR's, R7 en R8, worden grijs weergegeven (R7 zit bovenop R8). De binnenste PR expressie rhodopsine 3, 4, 5 of 6 en zijn het equivalent van zoogdieren kegeltjes. Voor de eenvoud, alleen de rhabdomere, het lichtgevoelige deel van de PR, vindt u voor elk PR. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Het opzetten van de Drosophila voor visualization door hoornvlies neutralisatie. (A-A'''') Foto's van een Drosophila geïmmobiliseerd op een bord gevuld met agarose. In paneel A'''', een stukje van agarose met de vlieg is teruggebracht tot een foto profiel nemen. De Drosophila half is ingebed in de agarose, met de rechtervleugel binnen de agarose en de linker vleugel vast op de agarose oppervlak (A, A'', A''''). Wanneer de Drosophila is ingebed in de agarose wordt de kop vaak slecht gepositioneerd voor de visualisatie van het oog (A, A '). De kop moet worden geheroriënteerd met een pincet zodat het midden van het oog naar boven (A'' A'' '). (B-B) Schematische weergave van een Drosophila geïmmobiliseerd op een agarose plaat en de positionering van de Drosophila kader van de doelstelling van de microscoop. (C-C) Foto's van de instelling van de Drosophila op het podium van demicroscoop onder haar doelstelling. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Oriëntatie van het oog voor tijdsverloop analyse. De figuur toont foto's van een Drosophila hoofd in twee verschillende oriëntaties en de bijbehorende velden van ommatidia bekeken door hoornvlies neutralisatie, weergegeven als schematische diagrammen. (A) Tijdens de eerste waarneming, is het oog geplaatst zodat een kloon van heterozygote of wildtype PR (geel) wordt gezien in het midden van het veld op het niveau van de evenaar (rode lijn). (B) Tijdens de tweede waarneming, het oog vaak niet precies dezelfde oriëntatie. Aldus kan dezelfde groep PR meer gevonden, maar het is niet mogelijk om de gevondenexact hetzelfde veld (links). Het oog moet worden geheroriënteerd voor hetzelfde veld opnieuw bekeken. De positie van de evenaar kan worden gebruikt als een gids. In dit voorbeeld, weten we dat het waargenomen veld te ventrale en de ogen moet dus ventraal gedraaid worden evenaar plaatsen in het midden van het waargenomen gebied weer, zoals bij de eerste waarneming.
Figuur 5. Voorbeelden van PR gedetecteerd door de Tomaat / GFP-FLP / FRT methode ontwikkeling gebreken. (A) Visualisatie van mozaïek sina [BG02648] mutant PR's, toont het verlies van innerlijke PR's. In de mutant ommatidia zijn buitenste PR geclusterd door het ontbreken van de binnenste PR R7. Inderdaad, is sina bekend worden verplicht voor innerlijke PR werving. (B) Visualisatie van mozaïek grh [s2140] mutant PR's tonen polariteit gebreken. Het mozaïek mutant ommatidia, SURRounded door een cirkel, wijzen in de tegenovergestelde richting van de wild-type ommatidia, wat wijst op een dorso-ventrale inversie. Een gedetailleerde studie met de Tomaat / GFP-FLP / FRT methode bleek dat grh nodig was in de R3 voorloper voor de correcte overname van ommatidium polariteit 20. (C) Visualisatie van mozaïek CRB [j1B5] mutant PR's, tonen vervormd homozygote mutant PR's. CRB is bekend dat vereist voor rhabdomere morfogenese.
Figuur 6. Tijdsverloop analyse van mozaïek FATP [k10307] mutant PR's met de Tomaat / GFP-FLP / FRT-methode, meer dan 14 dagen. Een mozaïek FATP [k10307] mutant netvlies wordt waargenomen op dag 1 (A, A '), dag 4 ( B, B '), dag 8 (C, C') en dag 14 (D, D ') na het uitkomen. Dezelfde groep mozaïek PR's kan zijn stichtingend op elk tijdstip in het waargenomen gebied (witte rechthoek, A, B, C, D). In dit gebied van PR (A ', B', C ', D'), zijn homozygote mutant PRs groen gemarkeerd, terwijl heterozygote en homozygote wild-type PR's worden gelabeld in het geel. Vanaf dag 4 (B ') verder, de homozygote mutant PR's beginnen te verdwijnen, wat aangeeft dat de FATP [k10307] mutatie leidt tot een progressieve degeneratie van deze PR's. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 7. Redding van FATP [k10307] mutant PR's met een mini-wit-dragende-FATP uiten construeren. Het mozaïek PR's worden gevisualiseerd met de Tomaat / GFP-FLP / FRT-methode in 15 dagen oude vliegen. (A) Visualisatie van mozaïek controle PR's. (B) Visualization mozaïek FATP mutant PR's, toont het verlies van mutant PR's. (C) Visualisatie van mozaïek FATP mutant PR's in een vlieg reexpressing FATP in buitenste PR (rh1> FATP). De mutant PR's worden gered. De aanwezigheid van een mini-witte gen en het bijbehorende rode oogpigmentatie in rh1> FATP voorwaarden niet wijzigt Tomaat of GFP-fluorescentie of klonale detectie.
Discussion
De Drosophila oog is wijd gebruikt om de signaalwegen reguleren ontwikkeling, proliferatie en overleving ontcijferen. In de vroege jaren 1990, een groot aantal genetische screens uitgevoerd om de vereiste tijdens de eerste fasen van ontwikkeling PR 25-27 paden identificeren. De efficiëntie van genetische screens werd sterk verhoogd door de mitotische recombinatie techniek, waardoor het mogelijk verlies-van-functie mutaties testen mozaïek klonen 21. Derhalve zou de rol van embryonale letale mutaties systematisch getest homozygote mutante klonen in de ogen van vliegen die anders heterozygoot waren. De meeste mozaïek screenings hebben zich gericht op de vroege recruitment PR, differentiatie, axonale projectie of morfogenese zich in de ontwikkeling van larven of poppen 10,25-31. Tot op heden heeft slechts een mozaïek scherm onderzocht de mechanismen tot regeling van volwassen PR-functie, door het bewaken van de visuele respons via electroretinOGRAMMA recordings 32. Met Tomaat / GFP-FLP / FRT werkwijze en de mogelijkheid van het uitvoeren tijdsverloop analyse levende mutante dieren, hebben we een nieuwe methode om de factoren die de volwassen PR levensvatbaarheid ontworpen en functie 20,24.
De Tomaat / GFP-FLP / FRT methode heeft een aantal grote voordelen ten opzichte van de klassieke histologische coupes van hars ingebed ogen. Ten eerste is deze werkwijze sneller, goedkoper en gemakkelijker uit te voeren dan de histologische methode, mits een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een geschikte water dompelen doel beschikbaar (zie Tabel Reagentia en apparatuur). Ten tweede kan de Tomaat / GFP-FLP / FRT-methode worden gebruikt in combinatie met transgene expressie, zoals de uitdrukking van P (UAS, w +), met een mini-witte transgen. In tegenstelling tot histologische secties, waarbij w + wordt gebruikt voor klonale detectie in de Tomaat / GFP-FLP / FRT-systeem, P (UAS, + w) niet belemmert klonale detection gebaseerd op tomaten fluorescerend eiwit. Met P (UAS-FATP, w +) transgene vliegen, waren we in staat om de redding van FATP mutant PR's (figuur 7) te visualiseren. Ten derde, een belangrijke valkuil van alle soorten klonale analyse, zoals op basis van Tomaat / GFP-FLP / FRT, is de dubbelzinnigheid van het genotype van verloren PR's. Inderdaad kan het onduidelijk of een PR afwezig vanwege het ontbreken van een specifiek gen functie of door een cel non-zelfstandige werking, vooral op de grens van de mutant kloon. De Tomaat / GFP-FLP / FRT methode omzeilt dit probleem voor degeneratie door de mogelijkheid om wild-type en mutant PR's volgen in hetzelfde dier over periodes van enkele weken. We waren in staat om het lot van individuele PR door kinetische analyses op verschillende FATP mutantvliegen (Figuur 6) te volgen. Hetzelfde kloon te herkennen in een bepaald dier op verschillende tijdstippen, omdat de precieze vorm van de omringende wildtype klonen. We waren in staat om ondubbelzinnig aan te tonenly dat alle ontbrekende PR's waren mutant voor FATP, wat aangeeft dat de rol van FATP mutanten in PR is cel-autonoom. Dus door het bewaken van het verlies van PR in een kinetische analyse is het mogelijk om het genotype van PR in modellen van adult-onset degeneratie bepalen. Ten slotte heeft de Tomaat / GFP-FLP / FRT methode zeer krachtig gebleken voor de identificatie van factoren die de vestiging van PCP 20. De mogelijkheid van het maken van een groot aantal mozaïek ommatidia een polariteit fenotype zonder dat gedeelten vergemakkelijkt snelle bepaling van de PR vereiste voor de instelling van PCP. Toch zou fijnere analyse van PR integriteit traditionele opdeling gevolgd door fase-contrast of elektronische microscopie vereisen.
Concluderend, de tomaat / GFP-FLP / FRT werkwijze opent nieuwe mogelijkheden voor efficiënte mozaïek screening factoren die de PR ontwikkelingsprocessen en volwassen PR functies, zoals vis identificerenseksuele respons en levensvatbaarheid.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
PLATIM en Droso-Tools faciliteiten van de UMS3444 Biosciences, Lyon, Frankrijk. BM's onderzoek werd gesteund door subsidies van de Fondation pour la Recherche Medicale van het CNRS (ATIP) en de ANR-12-BSV1-0019-01. PD werd ondersteund door Retina Frankrijk vereniging en de Ecole Normale Superieure van Lyon (Frankrijk). CL werd ondersteund door La Ligue Nationale contre le Cancer vereniging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
| Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
| Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
| Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
| 40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |
References
- Hardie, R. C. Sensory physiology 5. Ottoson, D. 5, 1-79 (1985).
- Wolff, T., Ready, D. F. Cell death in normal and rough eye mutants of Drosophila. Development. 113, 825-839 (1991).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Halder, G., Callaerts, P., Gehring, W. J. Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila. Science. 267, 1788-1792 (1995).
- Mollereau, B., Domingos, P. M. Photoreceptor differentiation in Drosophila: from immature neurons to functional photoreceptors. Dev Dyn. 232, 585-592 (2005).
- Mollereau, B. Cell death: what can we learn from flies? Editorial for the special review issue on Drosophila apoptosis. Apoptosis. 14, 929-934 (2009).
- Charlton-Perkins, M., Brown, N. L., Cook, T. A. The lens in focus: a comparison of lens development in Drosophila and vertebrates. Mol Genet Genomics. 286, 189-213 (2011).
- Jenny, A. Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye. Curr Top Dev Biol. 93, 189-227 (2010).
- Montell, C.
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59 (2005).
- Tomlinson, A., Ready, D. F.
- Mendes, C. S., et al. ER stress protects from retinal degeneration. Embo J. 28, 1296-1307 (2009).
- Jenny, A. Preparation of adult Drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis. J Vis Exp. , (2011).
- Mollereau, B., et al. Two-step process for photoreceptor formation in Drosophila. Nature. 412, 911-913 (2001).
- Domingos, P. M., et al. Spalt transcription factors are required for R3/R4 specification and establishment of planar cell polarity in the Drosophila eye. Development. 131, 5695-5702 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c-d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO Rep. 7, 933-939 (2006).
- Domingos, P. M., et al. Regulation of R7 and R8 differentiation by the spalt genes. Dev Biol. 273, 121-133 (2004).
- Mollereau, B., et al. A green fluorescent protein enhancer trap screen in Drosophila photoreceptor cells. Mech Dev. 93, 151-160 (2000).
- Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128, 815-826 (2001).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-134 (2011).
- Golic, K. G. Site-specific recombination between homologous chromosomes in Drosophila. Science. 252, 958-961 (1991).
- Porter, J. A., Hicks, J. L., Williams, D. S., Montell, C. Differential localizations of and requirements for the two Drosophila ninaC kinase/myosins in photoreceptor cells. J Cell Biol. 116, 683-693 (1992).
- Johnson, K., Grawe, F., Grzeschik, N., Knust, E. Drosophila crumbs is required to inhibit light-induced photoreceptor degeneration. Curr Biol. 12, 1675-1680 (2002).
- Dourlen, P., et al. Drosophila fatty acid transport protein regulates rhodopsin-1 metabolism and is required for photoreceptor neuron survival. PLoS Genet. 8, e1002833 (2012).
- Mlodzik, M., Hiromi, Y., Weber, U., Goodman, C. S., Rubin, G. M. The Drosophila seven-up gene, a member of the steroid receptor gene superfamily, controls photoreceptor cell fates. Cell. 60, 211-224 (1990).
- Gaul, U., Chang, H., Choi, T., Karim, F., Rubin, G. M. Identification of ras targets using a genetic approach. Ciba Found Symp. 176, 85-92 (1993).
- Wassarman, D. A., Therrien, M., Rubin, G. M. The Ras signaling pathway in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 5, 44-50 (1995).
- Janody, F., et al. A mosaic genetic screen reveals distinct roles for trithorax and polycomb group genes in Drosophila eye development. Genetics. 166, 187-200 (2004).
- Legent, K., Steinhauer, J., Richard, M., Treisman, J. E. A screen for X-linked mutations affecting Drosophila photoreceptor differentiation identifies Casein kinase 1alpha as an essential negative regulator of wingless signaling. Genetics. 190, 601-616 (2012).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Berger, J., et al. Systematic identification of genes that regulate neuronal wiring in the Drosophila visual system. PLoS Genet. 4, e1000085 (2008).
- Bayat, V., et al. Mutations in the mitochondrial methionyl-tRNA synthetase cause a neurodegenerative phenotype in flies and a recessive ataxia (ARSAL) in humans. PLoS Biol. 10, e1001288 (2012).
