Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi Published: September 20, 2013 doi: 10.3791/50610
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Laboratory of Molecular Biology of the Cell, Ecole Normale Supérieure de Lyon, 2INSERM U744, Institut Pasteur de Lille, Université Lille-Nord de France, 3Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of Apoptosis and Cancer, The Rockefeller University

Summary

Domates / GFP-FLP / FRT yöntem Drosophila canlı mozaik fotoreseptör hücreleri görselleştirme içerir. Bu, gün veya hafta içinde retinada fotoreseptör hücre tek kaderlerini takip etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, retinal dejenerasyonu ve nörodejeneratif hastalıklar, fotoreseptör hücre geliştirme çalışmaları için idealdir.

Abstract

Drosophila göz çok geliştirme ve nöronal dejenerasyonun çalışmalar için bir model olarak kullanılır. Güçlü bir mitotik rekombinasyon tekniği ile, klon analizine dayalı zarif bir genetik ekranları göz gelişimi ve larva aşamalarında fotoreseptör (PR) farklılaşma dahil sinyal yollarının tanımlanmasına yol açmıştır. Burada yetişkin Drosophila yaşayan gözünde hızlı klonal analizi için kullanılabilir Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi tarif etmektedir. Floresan fotoreseptör hücreleri flipase aracılı rekombinasyon tarafından oluşturulan mozaik klonları ile retina üzerinde, kornea nötrleştirme tekniği ile görüntülü. Bu yöntem, retina klasik histolojik kısımlara göre büyük avantajlara sahiptir: yüksek miktarda madde taraması için kullanılabilir ve PR hayatta kalmasını ve fonksiyonunu düzenleyen faktörlerinin tanımlanması için etkili bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Aynı oturma Deriden PR dejenerasyon kinetik analizi için kullanılabilirdiğerleri birkaç hafta içinde, yetişkin sinek PR hayatta kalma ya da fonksiyon için spesifik genler için gereksinimi göstermek için. Bu yöntem, aynı zamanda düzlemsel bir hücre polarite kurulması etkilenir edildiği gibi gelişimsel mutantlar, hücre özerklik sorunları ele almak için yararlıdır.

Introduction

Drosophila retina polarite açık bir şekilde tanımlanmış bir eksen (Şekil 1 B) ile tam olarak düzenlenir yaklaşık 800 ommatidial birimi (Şekil 1A), oluşmaktadır. Sekiz fotoreseptör hücreleri (PR) ve koni hücreler, pigment hücreleri ve hücreler 1,2 kıl dahil 12 aksesuar hücreleri: Her ünite 20 hücreleri içerir. PR iki sınıflarının ifade rodopsin türüne (Rh) temelinde ayırt edilir. Altı dış PR (R1-6) RH1 ifade etmek ve bir trapezoid desen (Şekil 1C) düzenlenmiştir. Yamuk merkezinde, iki iç PRs (R7/R8) rodopsin dört olası türleri (RH3, RH4, RH5 veya RH6) ifade ve R7 R8 3 üstüne yatıyor şekilde düzenlenmektedir.

2500'den fazla genler de dahil olmak üzere, göz deve süreçlerinin geniş bir paneli, çalışmaları için çok güçlü bir modeli olduğunu kanıtlamıştır Drosophila göz 4, morfogenezindeki katılıyormizde, PR işe alım, farklılaşma, düzlemsel hücre polarite, morfogenez, hayatta kalma, apoptoz ve görsel iletimi 5-9.

Drosophila göz üzerinde çalışan araştırmacılar, uzun yıllar boyunca, retina görüntüleme ve sistematik genetik ekranları yürütülmesi için teknikler geliştirdik. Görüntünün en kolay yolu, yetişkin retina hareketsizleştirilmiş bir hayvan (Şekil 1A) korneanın bakmaktır. Korneanın yapı taramalı elektron mikroskobu ile tam olarak görselleştirilebilir ve URCFG konsorsiyum tarafından büyük çaplı bir genetik ekran kullanılmıştır ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Bu genellikle gelişme ya da hücre canlılığı erken adımları kontrol eden genlerin mutasyon tarafından uyarılan bu tür göz pürüzler veya parlaklık gibi kornea yapısında küresel morfolojik değişiklikler, görselleştirmek için çok etkili bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, kornea genel görüntüleme su değilPR rhabdomere morfonogenezi veya yetişkin PR canlılığını ve işlevini düzenleyen faktörleri belirlemek için fficient. Bu tür analizler retina 11-13 teğet yarı-ince reçine kesitlerin faz-kontrast mikroskobu dayalı PR bütünlüğü daha kapsamlı bir soruşturma gerektirir. Bu teknik, mutant PR kırmızı pigment 14,15 onların eksikliği tarafından tespit edilebileceği mozaik analizler için uygundur.

Mozaik mutant klonlar da floresan mikroskobu 16,17 yeşil floresan proteininin (GFP) sinyal onların eksikliği temelinde, pupa veya ergin retinanın tüm montaj disseksiyonlarında görülebilir. Bu iki teknik, çok kullanışlıdır, ancak her ikisi de emek ve zaman alıcıdır ve bu nedenle de büyük ölçekli tarama için uygun değildir. Biz ve diğerleri hızlı PR analizleri kolaylaştırmak için, floresan proteinleri 18,19 üreten PRs ve görüntüleme için kornea nötralizasyon tekniklerinin kullanımını geliştirdik. Bu teknik, mutant ileklon mozaik yetişkin Drosophila klonlarda kırmızı (+ a) pigment otoflüoresanla temelinde tespit edilebilir. Ancak, bu yöntem hücre özerklik gidermek için gerekli olan tek hücreli bir çözünürlük 19 verir sağlamaz. Biz mitotik rekombinasyon 20 ile kornea nötralize edilerek floresan proteinlerin görüntüleme birleştiren Domates / GFP-FLP / FRT yöntemini geliştirerek bu sorunun üstesinden geldi. Bu yöntem, tek hücreli çözünürlükte, yüksek verim, mozaik klonlar mutant PRs hızlı ve net bir şekilde tanımlanmasını, (sağlar http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). Bu Drosophila yaşayan haftalık bir süre boyunca tek PRs aşağıdaki için, kinetik analizlerde kullanım için uygundur. Biz mozaik gözleri basit, kinetik analizlerde kullanımı için burada Domates / GFP-FLP / FRT yöntem ve ipuçlarını anlatabilir.

Protocol

1.. Domates / GFP-FLP / FRT Hatları ile Geçişi

Mutant klon taşıyan sinekler nesil bir FRT-taşıyan mutant hattı ve ilgili Domates / GFP-FLP / FRT hat sinek arasında tek bir çapraz gerektirir.

Bu çalışma FRT-recombined mutasyonların BruinFly koleksiyonu (kullanılmaktadır http://www.bruinfly.ucla.edu ). Dört Domates / GFP-FLP / FRT hatları flipase kaynağı (ey-FLP) ve tüm dış PR '(RH1-Gal4 UAS GFP ekspresyonu ile birlikte, her biri 2 kolları ve 3 kromozomlar üzerine FRT RH1-tdtomatoninaC taşıma kullanılabilir -GFP) 20:

- 2L kol: çizgi # 43345, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2L P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 40A; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 3

- 2R kol: çizgi # 43346, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} [*] w 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2; P {ry [t7.2 +] = neoFRT} 42D P{W [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2R; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 3

- 3L kol: çizgi # 43347, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 2; P {w [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3L P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 80B/TM6B, Tb [1]

- 3R kol: çizgi # 43348, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 2; P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 82B P {w [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B, Tb [1]

Bu dört hat Bloomington Drosophila stok merkezi mevcuttur. Bunlar, mitotik klon 21 jenerasyonu için gelişmekte olan göz FLP kaynağı sağladı. Yabani-tip kromozom bir FRT sekansını taşıyan ve bir RH1-tdTomato ninaC vahşi tip ve heterozigot dış PR 'için bir işaretleyici olarak, kırmızı floresan proteini şifreleyen yapı tdTomato. Bu yapıda, ninaC en P174 izoformu, son 41 amino asitler (inaktivasyon veya aktivasyon de C) geni ap idiin-çerçeve tdTomato sekansının C-terminaline pended. P174 ninaC izoformun C-terminal kuyruk rhabdomeral proteinin 22 lokalizasyonu ve izinlerin kornea nötralizasyon tekniği kullanılarak kırmızı floresan PRs daha iyi canlı görselleştirme sorumludur. RH1 organizatörü az 234 bp (-152 +82) RH1 destekleyicisidir. Yeşil fluoresan işaretleyici GFP nedeniyle RH1-Gal4 (3kb promoter) ve UAS-GFP ninaC konstruktlarının varlığına bağlı olarak, tüm dış PRs ile ifade edilir. RH1-Gal4, ey-FLP: FRT kromozom (FRT-x) ve domates / GFP-FLP / FRT hatlarında bir mutasyon taşıyan bir uçucu x stok kırmasına aşağıdaki genotipe (2L mutasyonun örnek olarak verilmiştir) olan bir döl verimleri , FRT40A, RH1-tdTomato ninaC / FRT40A-x, UAS-GFP ninaC. Bu sinekler olarak, homozigoz mutant hücrelerin gelişmekte olan göz diski mitotik rekombinasyon tarafından üretilen ve homozigoz mutant PRs bir klon (Şekil 2A) oluşturmak için bölme vardır. Homoçevredeki vahşi tip ve heterozigot hücre tdTomato ve GFP (Şekil 2B ve B "), her ikisi de ifade oysa bunlar, yeşil floresan proteini (GFP) için ifade zygous mutant hücreleri belirlenebilir.

2. Fotoreseptör Görselleştirme Drosophila hazırlanıyor

Kornea nötrleştirme tekniği ile PR görselleştirme için, agaroz plakalar üzerine sinekler hareketsiz.

  1. 4 ° C damıtık su ile dolu bir yıkama şişesi hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin.
  2. Bir mikrodalga içinde ısıtılarak su içinde düzenli olarak agaroz (100 ml su içinde% 1.2-1.5 agaroz) çözülür. 55 ° C'de bir su banyosu içinde şişeyi yerleştirin ve agaroz çözelti, bu sıcaklıkta soğumaya bırakın. Kullanılana kadar 55 ° C 'de agaroz tutun.
  3. En az 1 dakika için CO2 ile sinekler anestezisi.
  4. Bir Petri kutusu (35 x 10 mm, 1.37 x 0.39) içine (55 ° C) sıcak agaroz çözeltisi dökün ve derhal yerrilmesi agaroz Drosophila anestezi uygulandı. Yeni başlayanlar için, Petri tabağında başına 10 sinekler ile başlayan makul. Daha büyük Petri kabı (60 x 15 mm, içinde 2,362 x 0.59) da kullanılabilir.
  5. Bir mikroskop altında, forseps ile yan Drosophila yönlendirmek agaroz içine bir itme kanat, vücut kanat ve yarım agaroz (Şekiller 3A-3A "") gömülü şekildedir. Agaroz yüzeyi üzerine, diğer kanat sopa. Not: sinekler agaroz yeterince derin gömülü değilse, sinek PR görüntüleme sırasında kafasını taşımak için ücretsiz olacak ve bu bulanık görüntüye neden olur. Gözün yönü de rahatsız olacaktır. Bu nedeniyle agaroz konsantrasyonu ya da sıcaklık ya da için, agaroz içine Drosophila atılmak için zor olabilir. Bu, daha konsantre bir agaroz sinekler gömmek için daha kolaydır, fakat agaroz çok konsantre edilir ise, sinek batabilir. Agaroz çok soğuk ise, di olabilirsinek gömmek için fficult, ancak çok yüksek bir sıcaklıkta korneaya zarar verebilir.
  6. Buz üzerinde Petri kabı koyun ve agaroz katılaşmaya izin.
  7. Forseps ile bir göz batırma objektifi maruz kalan ve bu şekilde, kafa (Şekil 3A 've 3A "") yönlendirmek. Genel olarak, göz (siyah nokta olarak görüntülenmiştir) pseudopupil gözün ortasında olduğunda de tahlil mikroskobu altında yönlendirilmiş olarak kabul edilebilir. Gözün optimum yönlendirme PR odaklı edildiği ommatidial alanının genişliğini en üst düzeye çıkarır. Yönlendirme aşamasının amacı, genellikle gözün merkezinde, odaklanmış PRs en geniş alanı ile gözün bölge bulmaktır. Bu aşama, aynı zamanda herhangi bir bacaklar kaldırılması için ya da göz kapsayan ve görselleştirme önlenmesi aristae yararlıdır.
  8. Buz soğukluğunda su ile sinek örtün ve görselleştirme kadar buz üzerinde Petri kabı bırakın. Buz soğuk su anestezi sinekler tutar.

3. GörselleştirmeMikroskop altında Fotoreseptörler

Korneadan PRs görüntülenmesi için, bu protokol, uzun bir çalışma mesafesi (W N-Achroplan 40X/0.75) ile suda objektif ile donatılmış dik bir mikroskop kullanılır.

  1. Mikroskop sahnede bir cam slayt üzerinde buz gibi soğuk su ile kaplı Petri yerleştirin (3 M.Ö. Şekiller). Petri kutusu mümkün mikrometre vida ile ilgili düzgün hareket yapma, cam slayta yapıştırılmış olabilir.
  2. Petri kabı (Şekiller 3B'-3C ') ne sahip suya daldırma objektif daldırın. (Örneğin, GFP filtresi ile başlar) uyarma kirişin altında sineğin baş yerleştirin. Işın göze yakınsar kadar aşağı ve yukarı sahneye taşımak. Göz doğru düzeyde olduğu zaman, bu uyarım ışık yansıtır.
  3. Floresan için mercek aracılığıyla bakmak. Göz görüş alanının merkezinde konumlandırıldığında, aşağıdaki odakfloresan fotoreseptörlere görselleştirmek için kornea.

Not 1: göz merceği ile bakıldığında, örneğin, sinek, özellikle karın distalini ve başın vücut parçaları ayırmak için huzursuz olabilir. Böyle durumlarda, Drosophila yeniden konumlandırmak için aşamada doğrudan bakmak gerekir.

Not 2: Klasik floresan veya konfokal mikroskopi kullanılabilir. Mikroskopisi klasik mikroskopi daha az arka plan ve odaklanmış PRs daha geniş bir alan ile görüntü verir. Bir örnek set-up 40X su amacı ile bir LSM510 konfokal mikroskop (Zeiss) 'dir. Daha iyi sonuçlar genellikle amaç için önerilir daha geniş konfokal mikroskop iğne deliği açılmasıyla elde edilebilir. Örneğin, oldukça iğne deliği açıklığı için varsayılan 98'den, 204 bir değerini kullanın.

Not 3: gözün w + pigmentasyon yüksek düzeyde arka floresan azaltır. 4. Fotoreseptör hücrelerinin zaman ders Görselleştirme

Bir süre içinde aynı göz içinde tek bir PR kaderini aşağıdaki zaman bakım gereklidir.

  1. Drosophila hayatta en üst düzeye çıkarmak için, 45 ° C agaroz sıcaklığını azaltır. Agaroz bu sıcaklıkta çok hızlı bir şekilde katılaşır. Sadece bir Drosophila sinekler gözlem sırasında karışık emin olmak için, Petri tabağı başına kullanılmalıdır.
  2. Sistematik olarak aynı göz görüntüleme için, aynı tarafta sinekler yerleştirin. Bu bir kanat tarafından şişesinden, anestezi uygulanmış sinek alarak ve agaroz üzerinde Drosophila yerleştirerek elde edilebilir. Her zaman kolay önce görülmüşlerdir PR klonlar bulmak için yapım, aynı şekilde mümkünse de göz yönlendirin.
  3. Konfokal mikroskop altında şekli temelinde klonları tanımlamak. Görüş alanı genellikle ilgi klonu yanında yer almaktadır. SÜ'dech durumlarda, göz gözün polarite (Şekil 4) bağlı olarak, ilgi konusu klonu üzerinde görüş alanını merkezi, su altında yeniden şekillendirilmelidir.

5. Görselleştirme sonra Sinekler kurtarma

  1. Petri kabı su çıkarın.
  2. Forseps ile yavaşça agaroz dışarı Drosophila çekin.
  3. Doku üzerine Drosophila kurutun.
  4. Bu gıda sıkışmış almaz sağlanması, bir şişeye Drosophila dönün. Sinek 25 ° C'de yuvarlak gelmek için izin

Representative Results

Domates / GFP-FLP / FRT yöntem olup, Drosophila retinada PRs gelişimi ve hayatta kalması üzerinde bir mutasyon ya da ektopik ifade etkisini incelemek için kullanılabilir. Son zamanlarda 20 gösterildiği gibi, tarama amaçları için idealdir, hızlıdır. Mutant PRs varlığı yanında aynı gözde yabani tip PRs için mutant PRs ile ilişkili kusurları tespit etmek ve hücre özerklik sorunu gidermek için kolaylaştırır.

Bizim analizde gözlenen gelişim kusurları PR alımları morfolojilerinden ve düzlemsel hücre polarite (PCP) kurulması (Şekil 5) de dahil olmak üzere çeşitli işlemler, etkilenen. Gıyaben yedi özellikle R7 iç PR biri için, PR alımı için gereklidir. İç PR kaybı ve bazı dış PRs (Şekil 5A) Gıyabi sonuçlarında Yediler kaybı. Grainy kafa (grh) PCP kurulması katılır ve bazı gözcüklerinin inv vardırgrh mutant klonların (Şekil 5B) erted. Bu yöntem sayesinde, gen PCP doğru elde edilmesi için gerekli olduğu PRs tanımlanmasını kolaylaştırmak, mozaik ommatidia mutant PRs belirlemek için yapar. O grh R3 öncüler 20 PCP doğru kazanılması için gerekli olduğunu göstermiştir. Gerçekten, ters ommatidia olarak, R3 öncüden kaynaklanan anormal R4, her mutant olduğu, olduğu görülmektedir. Kırıntısı (Crbs) rhabdomere morfolojilerinden 23 için gerekli bir apikal membran proteindir. Düzensiz, daha büyük veya daha küçük PR '(Şekil 5C) en Crbs 11A22 mutant sonuçlarında Crbs kaybı.

Bu yöntem, aynı zamanda yetişkinlikte sırasında bir PR 'kaderini (Şekil 6) takip etmek için kullanılabilir. Homozigoz mutant PRs bir grup görüntülenebilir ve aynı grup aynı göz bulunabilir, çünkü, nörodejeneratif hastalıklar çalışmaları için idealdirAynı gün veya hafta bir süre üzerinden uçmak. Her bir klon, göz floresan mikroskop altında konumlandırıldığında kabul edilebilir benzersiz bir şekli vardır, çünkü PR hayatta ve ölüme mahkumdur hangi belirlemek mümkündür. Retina polarize olduğu gibi, şekli temelinde, yine aynı klonu bulmak için retina yönlendirmek mümkündür. Biz fatp k10307 mutasyon erişkinlikte progresif PR dejenerasyon (Şekil 6, 24) neden olduğunu göstermek için bu yöntem kullanılır. Bu görselleştirme yöntemi, aynı zamanda, hücre özerklik analiz etmek için kullanılabilir. Fatp k10307 mozaik retinasında, PR zarar vahşi tip PR etkilenmemiştir, mutant PRs fatp sınırlıydı. PR canlılığı için fatp gereksinimi nedenle hücre özerktir. Biz de bir RH1-Gal4 sürücü ve bir UAS-fatp yapı (Şekil 7) ile vahşi tip fatp reexpressing tarafından fatp mutant PR kurtarmak için başardık.Bu tür kurtarma deneylerin gerçekleştirilmesi olasılığı reçineye gömülü retina histolojik bölümlerde göre klonal analizi üzerindeki Domates / GFP-FLP / FRT yönteminin avantajlarından biridir. Gerçekten de, domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ile klonal algılama P kullanımı ile etkilenmez (UAS, w +) transjenik yapıları, (W +) mini-beyaz bir gen ile ilişkili kırmızı pigment kırmızı pigment ile göz kapakları oysa , histolojik bölümlerde mozaik klonları maskeleme.

Şekil 1
Şekil 1. Drosophila göz organizasyonu. (A) bir stereomikroskop ile alınmış bir Drosophila göz fotoğrafı. Drosophila göz, yaklaşık 800 ommatidia oluşmaktadır. Gözün ortasında 64 ommatidia bir alanın (B) şematik diyagramı. Her ommatidium altı dış fotoreseptör nöronlar (PR),yeşil gösterilir, gözün en yakın kutupları işaret eden bir basmakalıp yamuk halinde düzenlenmiştir. Bunlar sonuç olarak ekvator olarak adlandırılır, iki parça arasındaki sınır göre ayna görüntüsü ventral ve gözün arka kısmına zıt yönlerde etmektedir ve vardır. Bir ommatidium (C) şematik diyagramı. Her ommatidium sekiz PRs içerir. Yeşil gösterilir R6 PR R1, dış PR bulunmaktadır. Onlar ışığa molekülü rhodopsin1 (RH1) ifade ve memeli çubuk hücrelerinin eşdeğerdir. İç PR, R7 ve R8, (burada R7, R8 üstüne oturur) gri gösterilmiştir. İç PR rodopsin 3, 4, 5 ya da 6 ve memeli ifade koni hücrelerinin eşdeğerdir. Basitlik için, sadece rhabdomere, PR ışığa duyarlı bölümü, her bir PR için gösterilmiştir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. Yaratma ve Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ile Drosophila göz mozaik PR klonları görüntülenmesi. Domates / GFP-FLP / FRT yöntem mozaik klonların nesil (A) şematik diyagramı. Mozaik klon nedeniyle göz gelişimi ve FRT dizileri sırasında (eyeless promoterinin kontrolü altında) flipase ekspresyonuna, mitotik rekombinasyon ile oluşturulur. FRT sırası ve hücre bölünmesi, homozigoz mutant, vahşi tip homozigot ve heterozigot hücre rekombinasyon bir heterozigot hücreden oluşturulabilir sonra. Bu hücreler yetişkin göz PRs mozaik klonlar oluşturmak için tekrar bölme. Mutant hücrelerin tanımlanması vahşi tip ve heterozigot hücreleri etiketlemek için, vahşi tip kromozom içine kırmızı floresan protein tdTomato ifade eden bir yapı sokulması ile kolaylaştırılır. T mozaik PR klonlarının (B-B'') Görselleştirmeo Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi. Domates / GFP-FLP / FRT yöntem mitotik rekombinasyon, kornea nötralizasyon ve konfokal mikroskopi birleştirir. Tüm PRs kornea nötralizasyon ve konfokal mikroskopi (B) kullanarak PRs görselleştirme kolaylaştırmak yeşil floresan protein, GFP ifade. PR tek hücre düzeyinde görselleştirilebilir. Mutant mozaik klonlar mitotik rekombinasyon tarafından oluşturulan ve kırmızı floresan protein tdTomato (B ')' nin yokluğu ile tanımlanabilir. Vahşi-tip ve heterozigot PRs (B'') sarı iken Sonuç olarak, birleştirilmiş görüntülerde, homozigot PRs, yeşil görünür. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. Visualizat için Drosophila ayarlamakornea nötralizasyonu ile iyon. Agaroz ile dolu bir plaka üzerinde hareketsiz kılınmış bir Drosophila (A-A'''') fotoğraflar. Panel A'''', sinek içeren agaroz bir parça bir profil fotoğrafı çekmek için kesilmiştir. Drosophila agaroz içinde sağ kanat, agaroz yarı gömülü ve sol kanat agaroz yüzeyi (A, A'' A'''') sıkışmış. Drosophila agaroz gömülü olduğu, onun merkez sıklıkla zayıf göz (A, A ') görüntülenmesi için konumlandırılmıştır. Kafa bu nedenle göz orta (A'', A'' ') yukarı doğru dönük olduğu gibi forseps ile reorientated gerekir. (B-B'), bir Drosophila gösteren şematik bir agaroz plaka ve konumlandırma üzerinde hareketsiz mikroskop hedefi altında Drosophila sahnede Drosophila ayarı. (C-C ') Fotoğraflarhedefine altında mikroskop. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,
Şekil 4. Zaman ders analizi için göz Oryantasyon. Şekil şematik diyagramlar olarak temsil kornea nötrleştirilmesiyle izlendi iki farklı yönelimleri ve ommatidia ilgili alanlara, bir Drosophila kafa fotoğraflarını gösterir. Ilk gözlemi sırasında (A), göz yerleştirilir örneğin (sarı) heterozigoz ya da vahşi tip PR 'bir klon ekvator (kırmızı çizgi) seviyesinde, alanın ortasında görülüyor ki. (B), ikinci gözlem sırasında göz tam genellikle değil Aynı oryantasyon. Böylece, PRs aynı grup tekrar bulunabilir, ancak görmek mümkün değildir(solda) aynı alan. Göz tekrar görülebilmesini aynı alan için Nokia'nın gerekir. Ekvator konumu bir rehber olarak kullanılabilir. Bu örnekte, gözlemlenen alanı çok ventral ve göz bu nedenle ilk gözlem olarak, yine gözlenen alanın ortasında ekvator yerleştirmek için ventral açık olması gerektiğini biliyoruz.

Şekil 5,
Şekil 5,. Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ile tespit PR geliştirme bozukluklar arasında şunlar. İç PRs kaybını gösteren mozaik sina [BG02648] mutant PRs (A) Görselleştirme. Mutant ommatidia olarak, dış PR nedeniyle iç PR R7'nin olmaması için bir araya toplanmıştır. Nitekim, sina iç PR alımı için gerekli olduğu bilinmektedir. Mozaik grh (B) Görselleştirme [s2140] kutupluluk kusurlarını gösteren mutant PRs. Mozaik mutant gözcüklerinin, surrbir daire ile ounded, bir ön-ventral inversiyon gösteren vahşi tip ommatidia zıt yöne işaret. Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ile detaylı bir çalışma grh ommatidium kutupluluk 20 doğru edinimi için R3 öncü gerekli olduğunu gösterdi. Mozaik crb [j1B5] mutant PRs (C) görselleştirilmesi, deforme homozigot mutant PRs gösteren. CRB rhabdomere morfolojilerinden için gerekli olduğu bilinmektedir.

Şekil 6,
Şekil 6,. Mozaik fatp zaman ders analizi [k10307] Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ile mutant PRs, 14 gün boyunca. Bir mozaik fatp [k10307] mutant retina günde 1 (A, A ') üzerinde gözlenen, günde 4 ( B, B '), 8. gün, (C, C') ve yumurtadan çıktıktan sonra bir gün 14 (D, D '). Mozaik PRs aynı grup foun olabilirHer bir zaman noktasında d, gözlenen alanına (beyaz dikdörtgen, A, B, C, D). Heterozigoz ve homozigoz vahşi tip PR sarı etiketlenmektedir ise PR '(A', B ', C', D ')' in, bu alanda, homozigoz mutant PR, yeşil olarak etiketlenmiştir. Günde 4 (B ') itibaren itibaren, homozigot mutant PRs fatp [k10307] mutasyon bu PRs bir ilerici dejenerasyonu neden olduğunu belirten, kaybolmaya başlar. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 7
Şekil 7. Mozaik kontrol mini-beyaz-taşıyan fatp-ifade oluşturmak. Mozaik PRs 15-günlük-eski sinekler Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ile görüntülendi. (A) Görselleştirme ile fatp kurtarma [k10307] mutant PRs PRs. (B) Vmutant PRs kaybını mozaik. (C) Görselleştirme gösteren mozaik fatp mutant PRs arasında isualization fatp dış PR (RH1> fatp) bir sinek reexpressing fatp mutant PRs. Mutant PRs kurtarıldı. Bir beyaz mini-gen ve RH1 de bağlantılı kırmızı göz pigmentasyon varlığı> fatp koşulları Domates veya GFP floresan veya klonal algılamayı değiştirmez.

Discussion

Drosophila göz yaygın olarak geliştirilmesi, proliferasyonu ve hayatta kalma düzenleyen sinyal yolları deşifre etmek için kullanılmıştır. 1990'ların başında, genetik ekranlar çok sayıda PR gelişme 25-27 başlangıç ​​aşamalarında gerekli yolları belirlemek için yapılmıştır. Genetik ekranlar verimliliği mümkün mozaik klonlar 21 kayıp fonksiyon-mutasyon test yapar mitotik rekombinasyon tekniği ile büyük ölçüde artmıştır. Bu nedenle, embriyonik öldürücü mutasyonların rolü sistematik olarak, aksi heterozigot sinekler gözünde homozigoz mutant klonlar test edilebilir. Çoğu mozaik gösterimleri erken PR işe alım, farklılaşma, aksonal projeksiyon ya da gelişmekte olan larva veya pupa 10,25-31 meydana gelen morfolojilerinden odaklanmıştır. Bugüne kadar, sadece tek bir mozaik ekran electroretin aracılığıyla görsel tepkisini izleyerek, yetişkin PR işlevi düzenleyen mekanizmaları araştırılmıştırPROGRAM ÇA Ğ RISI 32 Kayıtlar. Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ve mutant hayvanlar yaşayan zamanlı ders analizi gerçekleştirme imkanı ile, biz yetişkin PR canlılığını düzenleyen faktörlerin belirlenmesi için yeni bir yöntem tasarlanmış ve 20,24 işlev var.

Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi reçine-gömülü gözleri klasik histolojik kesit üzerinde birçok önemli avantajı vardır. İlk olarak, bu yöntem çok daha hızlı, ucuz ve histolojik yöntemi gerçekleştirmek için daha kolay, uygun bir suda daldırma objektif ile donatılmış bir fluoresans mikroskopu (Reaktifler ve Teçhizat Tablo) kullanılabilir sağlanmıştır. İkinci olarak, domates / GFP-FLP / FRT yöntem mini beyaz bir transgeni taşıyan, örneğin (W + UAS,) P ifadesi olarak, transgen ekspresyonu ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Domates / GFP-FLP / FRT sistemi, P w + klonal saptanması için kullanıldığı histolojik bölümlerde, aksine (UAS, W +) klonal d müdahale etmezDomates floresan protein göre etection. P Kullanma (UAS-fatp, + w) transgenik sinekler, biz fatp mutant PRs kurtarılmasının (Şekil 7) görselleştirmek için başardık. Üçüncüsü, Domates / GFP-FLP / FRT dayalı, kayıp PRs genotipinin belirsizlik olduğunu da dahil olmak üzere klonal analiz her türlü, önemli bir hatadır. Gerçekten de, bir PR için spesifik bir gen fonksiyon eksikliği nedeniyle ya da özellikle de mutant klonu sınırında bir hücre otonom-olmayan, etkisinin mevcut olup olmadığı açık olabilir. Domates / GFP-FLP / FRT metodu, birkaç haftalık dönemler boyunca aynı hayvanda vahşi tip ve mutant PRs takip yaparak dejenerasyon bu soruna alır. Biz kinetik bireysel PRs kaderini farklı fatp mutant sinekler üzerinde analizler (Şekil 6) takip başardık. Aynı klon için çevredeki vahşi tip klonların tam şekli, farklı zamanlarda, belirli bir hayvanda tespit edilebilir. Biz kesin göstermek başardıkTüm eksik PRs PRs içinde fatp mutantların rolü hücre özerk olduğunu gösteren, fatp için mutant olduğunu ly. Bu durumda, bir kinetik analizi PR 'kaybını izleyerek, yetişkin başlangıçlı dejenerasyonu modellerinde PRs genotipini belirlemek mümkündür. Son olarak, domates / GFP-FLP / FRT yöntem PCP 20 kurulmasını düzenleyen faktörlerin tanımlanması için çok güçlü olduğu kanıtlanmıştır. Bölümler için gerek kalmadan bir kutup fenotipi için mozaik ommatidia çok sayıda puanlama olasılığı, PCP kurulması için PR ihtiyacının hızlı bir şekilde belirlenmesini kolaylaştırır. Bununla birlikte, PR bütünlüğü ince analiz faz kontrast veya elektronik mikroskop ardından geleneksel bölümlendirilmeleri gerektirir.

Sonuç olarak, Domates / GFP-FLP / FRT yöntem, vis gibi PR gelişimsel süreçlerini ve yetişkin PR fonksiyonlarını düzenleyen faktörleri belirlemek için verimli mozaik tarama için yeni olanaklar açarual tepki ve canlılığı.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Fransa UMS3444 Biosciences, Lyon, ve PLATIM ve Droso-Tools tesisleri. Barlar ücretsiz araştırma Fondation hibe tarafından desteklenmiştir CNRS (ATIP) dan la Recherche Médicale dökün ve ANR-12-BSV1-0019-01'dir. PD Retina Fransa dernek ve Lyon Ecole Normale Supérieure (Fransa) tarafından desteklenmiştir. CL La Ligue Nationale contre le Kanser derneği tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent
Agarose Euromedex D5-E Regular agarose is used to immobilize the flies
Petri dish BD Falcon 353001 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch
Cold-ice water To maintain the flies anesthetized
  Equipment
Dissecting microscope Dutcher SMZ645  
Water Bath Julabo 9550102 To keep the agarose solution at warm temperature
40X Water objective Zeiss 420967-9900-000 Water dipping objective for the confocal microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardie, R. C. Sensory physiology 5. Ottoson, D. 5, 1-79 (1985).
  2. Wolff, T., Ready, D. F. Cell death in normal and rough eye mutants of Drosophila. Development. 113, 825-839 (1991).
  3. Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
  4. Halder, G., Callaerts, P., Gehring, W. J. Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila. Science. 267, 1788-1792 (1995).
  5. Mollereau, B., Domingos, P. M. Photoreceptor differentiation in Drosophila: from immature neurons to functional photoreceptors. Dev Dyn. 232, 585-592 (2005).
  6. Mollereau, B. Cell death: what can we learn from flies? Editorial for the special review issue on Drosophila apoptosis. Apoptosis. 14, 929-934 (2009).
  7. Charlton-Perkins, M., Brown, N. L., Cook, T. A. The lens in focus: a comparison of lens development in Drosophila and vertebrates. Mol Genet Genomics. 286, 189-213 (2011).
  8. Jenny, A. Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye. Curr Top Dev Biol. 93, 189-227 (2010).
  9. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35, 356-363 (2012).
  10. Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59 (2005).
  11. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium. Dev Biol. 120, 366-376 (1987).
  12. Mendes, C. S., et al. ER stress protects from retinal degeneration. Embo J. 28, 1296-1307 (2009).
  13. Jenny, A. Preparation of adult Drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis. J Vis Exp. , (2011).
  14. Mollereau, B., et al. Two-step process for photoreceptor formation in Drosophila. Nature. 412, 911-913 (2001).
  15. Domingos, P. M., et al. Spalt transcription factors are required for R3/R4 specification and establishment of planar cell polarity in the Drosophila eye. Development. 131, 5695-5702 (2004).
  16. Mendes, C. S., et al. Cytochrome c-d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO Rep. 7, 933-939 (2006).
  17. Domingos, P. M., et al. Regulation of R7 and R8 differentiation by the spalt genes. Dev Biol. 273, 121-133 (2004).
  18. Mollereau, B., et al. A green fluorescent protein enhancer trap screen in Drosophila photoreceptor cells. Mech Dev. 93, 151-160 (2000).
  19. Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128, 815-826 (2001).
  20. Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-134 (2011).
  21. Golic, K. G. Site-specific recombination between homologous chromosomes in Drosophila. Science. 252, 958-961 (1991).
  22. Porter, J. A., Hicks, J. L., Williams, D. S., Montell, C. Differential localizations of and requirements for the two Drosophila ninaC kinase/myosins in photoreceptor cells. J Cell Biol. 116, 683-693 (1992).
  23. Johnson, K., Grawe, F., Grzeschik, N., Knust, E. Drosophila crumbs is required to inhibit light-induced photoreceptor degeneration. Curr Biol. 12, 1675-1680 (2002).
  24. Dourlen, P., et al. Drosophila fatty acid transport protein regulates rhodopsin-1 metabolism and is required for photoreceptor neuron survival. PLoS Genet. 8, e1002833 (2012).
  25. Mlodzik, M., Hiromi, Y., Weber, U., Goodman, C. S., Rubin, G. M. The Drosophila seven-up gene, a member of the steroid receptor gene superfamily, controls photoreceptor cell fates. Cell. 60, 211-224 (1990).
  26. Gaul, U., Chang, H., Choi, T., Karim, F., Rubin, G. M. Identification of ras targets using a genetic approach. Ciba Found Symp. 176, 85-92 (1993).
  27. Wassarman, D. A., Therrien, M., Rubin, G. M. The Ras signaling pathway in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 5, 44-50 (1995).
  28. Janody, F., et al. A mosaic genetic screen reveals distinct roles for trithorax and polycomb group genes in Drosophila eye development. Genetics. 166, 187-200 (2004).
  29. Legent, K., Steinhauer, J., Richard, M., Treisman, J. E. A screen for X-linked mutations affecting Drosophila photoreceptor differentiation identifies Casein kinase 1alpha as an essential negative regulator of wingless signaling. Genetics. 190, 601-616 (2012).
  30. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
  31. Berger, J., et al. Systematic identification of genes that regulate neuronal wiring in the Drosophila visual system. PLoS Genet. 4, e1000085 (2008).
  32. Bayat, V., et al. Mutations in the mitochondrial methionyl-tRNA synthetase cause a neurodegenerative phenotype in flies and a recessive ataxia (ARSAL) in humans. PLoS Biol. 10, e1001288 (2012).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 79 Göz fotoreseptör hücrelerinin Genler Gelişim nöron görselleştirme dejenerasyon geliştirme canlı görüntüleme, Fotoreseptör kornea nötralizasyon mitotik rekombinasyon
Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptör Hücreler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dourlen, P., Levet, C., Mejat, A.,… More

Dourlen, P., Levet, C., Mejat, A., Gambis, A., Mollereau, B. The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells. J. Vis. Exp. (79), e50610, doi:10.3791/50610 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter