O método de tomate / GFP-FLP / FRT envolve visualizando células fotorreceptoras mosaico em viver Drosophila. Ele pode ser usado para seguir os destinos das células fotorreceptoras individuais na retina durante dias ou semanas. Este método é ideal para estudos de degeneração da retina e doenças neurodegenerativas ou o desenvolvimento de células fotorreceptoras.
O olho de Drosophila é largamente utilizado como um modelo para estudos de desenvolvimento e degeneração neuronal. Com a poderosa técnica de recombinação mitótico, telas elegantes genéticos baseados na análise clonal levaram à identificação de vias de sinalização envolvidos no desenvolvimento do olho e dos fotorreceptores (PR), a diferenciação em estádios larvares. Nós descrevemos aqui o método de tomate / GFP-FLP / DRF, o qual pode ser utilizado para análise rápida clonal no olho vivo adulto de Drosophila. As células fotorreceptoras fluorescentes são visualizados com a técnica de neutralização de córnea, em retinas com clones de mosaico gerados por recombinação mediada por flipase. Este método possui várias vantagens importantes sobre o seccionamento histológico clássico da retina: ele pode ser usado para o rastreio de alto rendimento e provou ser um método eficaz para identificar os factores que regulam PR sobrevivência e função. Ele pode ser utilizado para análises de cinética de PR degeneração da mesma estar animAl ao longo de várias semanas, para demonstrar a necessidade de genes específicos para PR a sobrevivência ou função na mosca adulta. Este método também é útil para abordar questões de autonomia em células mutantes para o desenvolvimento, tais como aqueles em que o estabelecimento da polaridade celular planar é afectada.
A retina de Drosophila é composto de cerca de 800 unidades ommatidial (Figura 1A), que são precisamente organizados, com um eixo claramente definida de polaridade (Figura 1B). Cada unidade contém 20 células: oito células fotorreceptoras (PRS) e 12 células acessórias, incluindo cones, células de pigmento e de cerdas células 1,2. Duas classes de PR são distinguidas com base no tipo de rodopsina (Rh) que expressam. Os seis PRs exteriores (R1-6) expressam Rh1 e estão dispostos num padrão trapezoidal (Figura 1C). No centro do trapézio, os dois PRs interiores (R7/R8) expressar quatro tipos possíveis de rodopsina (RH3, RH4, RH5 ou RH6) e estão organizados de tal modo que R7 se encontra no topo da R8 3.
Mais de 2.500 genes estão envolvidos na morfogênese do olho Drosophila 4, que provou ser um modelo muito poderosa para estudos de um grande painel de processos, incluindo o desen olhovolvimento, recrutamento PR, diferenciação, polaridade celular planar, morfogênese, a sobrevivência, a apoptose e transdução visuais 5-9.
Os investigadores que trabalham no olho Drosophila têm, ao longo de muitos anos, desenvolveu técnicas de imagem da retina e realização telas genéticos sistemáticos. A maneira mais fácil para a imagem da retina adulta é olhar para a córnea em um animal imobilizado (Figura 1A). A estrutura da córnea pode ser visualizado precisamente por microscopia electrónica de varrimento e foi usado em uma tela genética em larga escala pelo consórcio URCFG ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Esta é uma abordagem muito eficaz para a visualização de mudanças globais morfológicas na estrutura da córnea, tais como rugosidade olho ou brilho, muitas vezes induzidos por mutações em genes que controlam os primeiros passos no desenvolvimento ou viabilidade celular. No entanto, a visualização global de córnea não é sufficient para identificar os fatores que regulam PR rhabdomere morfogênese ou adulto PR viabilidade e função. Tais análises exigem uma investigação aprofundada mais de integridade PR, com base em microscopia de contraste de fase de secções de resina semi-finas tangenciais da retina 11-13. Esta técnica é adequada para análise de mosaico, em que RP mutantes podem ser identificadas pela sua falta de 14,15 pigmento vermelho.
Clones mutantes Mosaico também pode ser visualizado em dissecções Todo-mount da pupa ou adulto retina, com base na sua falta de proteína verde fluorescente sinal (GFP) em microscopia de fluorescência 16,17. Estas duas técnicas são muito úteis, mas ambas são trabalhosas e demoradas e não são, portanto, adequados para o rastreio em larga escala. Nós e outros têm desenvolvido o uso de técnicas de córnea de neutralização para a imagiologia de RP produzindo proteínas fluorescentes 18,19, para facilitar a rápida análise de RP. Com esta técnica, mutanteOs clones podem ser identificados com base na autofluorescência do (w +) pigmento vermelho em adultos clones Drosophila mosaico. No entanto, este método não proporciona a resolução de uma única célula é necessária para tratar autonomia célula emite 19. Nós resolvemos esse problema através do desenvolvimento do método de Tomate / GFP-FLP / FRT, que combina a imagem de proteínas fluorescentes por neutralização córnea com recombinação mitótica 20. Este método permite que o alto rendimento, a identificação rápida e precisa de PRs mutantes em clones de mosaico, com resolução de uma única célula ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). Ele é adequado para uso em análises cinéticas, para seguir PRs individuais ao longo de um período de semanas em viver Drosophila. Descrevemos aqui o método de tomate / GFP-FLP / FRT e dicas para a sua utilização em análises simples, cinéticos de olhos de mosaico.
O olho de Drosophila tem sido amplamente utilizada para decifrar as vias de sinalização que regulam o desenvolvimento, a sobrevivência e proliferação. No início de 1990, um grande número de telas genéticos foram realizados para identificar os caminhos necessários durante as fases iniciais de desenvolvimento do PR 25-27. A eficiência de telas genéticos foi aumentada grandemente através da técnica de recombinação mitótico, que faz com que seja possível testar as mutações de perda de função em clones de mosaico 21. Assim, o papel das mutações letais embrionárias poderiam ser sistematicamente testados em clones mutantes homozigotos nos olhos de moscas que eram de outra maneira heterozigotos. A maioria das projeções de mosaico têm-se centrado sobre o recrutamento PR cedo, a diferenciação, a projeção axonal ou morfogênese ocorrendo nas larvas ou pupas 10,25-31 desenvolvimento. Até o momento, apenas uma tela mosaico investigou os mecanismos que regulam a função adulto PR, através do monitoramento da resposta visual via electroretinOgram gravações 32. Com o método de Tomate / GFP-FLP / FRT ea possibilidade de realização de análise de curso de tempo em que vivem os animais mutantes, criamos um novo método para identificar os fatores que regulam adulto viabilidade PR e funcionar 20,24.
O método de tomate / GFP-FLP / FRT tem várias vantagens importantes sobre o corte histológico clássico de olhos embebidos em resina. Em primeiro lugar, este método é muito mais rápido, mais barato e mais fácil de realizar do que o método histológico, desde que um microscópio de fluorescência equipado com um objetivo de imersão de água apropriado está disponível (ver Tabela de Reagentes e Equipamentos). Em segundo lugar, o método de tomate / GFP-FLP / DRF pode ser usado em conjunção com a expressão do transgene, tais como a expressão de P (UAS, w +), transportando uma mini-branco do transgene. Em contraste com os cortes histológicos, em que w + é utilizado para a detecção clonal no sistema de tomate / GFP-FLP / FRT, P (UAS, w +) não interfere com d clonaletection base de proteína fluorescente tomate. Usando P (UAS-FATP, w +) moscas transgénicas, fomos capazes de visualizar o resgate de PRs mutantes FATP (Figura 7). Em terceiro lugar, uma armadilha chave de todos os tipos de análise clonal, incluindo as baseadas em tomate / GFP-FLP / FRT, é a ambigüidade do genótipo de PRs perdidos. De facto, pode não ser claro se a PR está ausente, devido à falta de uma função de um gene específico, ou por causa de um efeito celular não autónomo, particularmente na fronteira entre o clone mutante. O método de tomate / GFP-FLP / FRT contorna este problema, para a degeneração, tornando possível seguir do tipo selvagem e mutantes PRs no mesmo animal em períodos de várias semanas. Nós fomos capazes de seguir o destino de PRs individuais por cinética análises sobre diferentes FATP moscas mutantes (Figura 6). O mesmo clone pode ser reconhecido num dado animal em momentos diferentes, por causa da forma precisa dos clones de tipo selvagem circundantes. Fomos capazes de mostrar inequívocaly que todos os PRs em falta foram mutante para FATP, indicando que o papel dos mutantes FATP em PRs é célula-autônoma. Assim, através da monitorização da perda de fotorreceptores na análise cinética, é possível determinar o genótipo de fotorreceptores em modelos de degeneração de início adulto. Finalmente, o método de tomate / GFP-FLP / FRT provou ser muito poderosa para a identificação de factores que regulam o estabelecimento de PCP 20. A possibilidade de atingir um grande número de ommatidia mosaico para um fenótipo de polaridade, sem a necessidade de secções, facilita a determinação rápida do PR requisito para o estabelecimento de PCP. No entanto, a análise mais fina da integridade PR exigiria o corte tradicional seguido por contraste de fase ou microscopia eletrônica.
Em conclusão, o método de tomate / GFP-FLP / FRT abre novas possibilidades para a seleção mosaico eficiente para identificar os fatores que regulam os processos de desenvolvimento de relações públicas e funções adulto PR, como a visresposta ual e viabilidade.
The authors have nothing to disclose.
PLATIM e droso-Tools instalações do UMS3444 Biosciences, Lyon, França. A pesquisa da BM foi apoiada por doações da Fondation pour la Recherche Médicale do CNRS (ATIP) ea ANR-12-BSV1-0019-01. PD foi apoiado por Retina França associação e da École Normale Supérieure de Lyon (França). CL foi apoiado por La Ligue Nationale contre le Cancer associação.
Reagent | |||
Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
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Equipment | |||
Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |