Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

Summary

O miofibroblastos é uma célula estromal influente do tracto gastrointestinal, que regula os processos fisiológicos importantes em estados normais e de doença. Descrevemos uma técnica que permite o isolamento de miofibroblastos primários de rato e tanto o tecido do cólon humano, o que pode ser utilizado para experimentação in vitro.

Abstract

O miofibroblastos é uma célula estromal do tracto gastrointestinal (GI) que tem vindo a ganhar uma atenção considerável para o seu papel fundamental em muitas funções gastrointestinais. Enquanto várias linhas de células de miofibroblastos são comercialmente disponíveis para estudar estas células in vitro, os resultados da pesquisa de uma linha de células expostas a condições de cultura de células experimentais têm limitações inerentes devido à natureza excessivamente redutora do trabalho. Utilização de miofibroblastos primárias oferece uma grande vantagem em termos de resultados experimentais, confirmando identificados numa linha celular. Isolamento de miofibroblastos primárias a partir de um modelo animal, permite o estudo dos miofibroblastos, em condições que mais de perto simulam o estado da doença a ser estudada. Isolamento de miofibroblastos primários de tecido do cólon humano oferece, sem dúvida, os dados experimentais mais relevantes, uma vez que as células vêm diretamente de pacientes com a doença de base. Nós descrevemos uma técnica bem estabelecida, que pode ser utilized isolar myofibroblasts primários do mouse e do tecido do cólon humano. Estas células isoladas foram caracterizadas como actina alfa de músculo liso e vimentina-positivas, e desmina-negativos, de acordo com miofibroblastos subepiteliais intestinais. Células de miofibroblastos primárias podem ser cultivadas em cultura de células e utilizadas para fins experimentais mais de um número limitado de passagens.

Introduction

A regulação da função do trato gastrointestinal (GI), envolve interações dinâmicas complexas entre a camada mucosa e seu mesênquima subjacente. Estas interacções normalmente servem para manter a homeostase, mas também pode levar ao desenvolvimento de estados de doença, em condições patológicas ^1. Os miofibroblastos são uma subpopulação de células estromais localizados subjacente à camada epitelial que comunicar de uma forma parácrina com áreas subpopulações de células para regular um número de processos críticos do tracto GI que incluem regeneração das mucosas, reparação, e fibrose ^2.

A linha celular de 18Co é um exemplo de uma linha celular humana do cólon miofibroblastos que tem sido amplamente utilizado para estudar a função de miofibroblastos porque partilha muitas das características de primário em miofibroblastos situ. Estes incluem a expressão de proteínas de um-actina de músculo liso (α-SMA) e vimentina, bem como a expressão de uma sériede receptores de superfície celular, tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico, ou receptores de ^3,4 ácido lisofosfatídico. Devido a estas características ultra-estruturais comuns, bem como similaridades na função biológica ^5, a linha de células de 18Co tem sido amplamente utilizado para estudar a função de miofibroblastos no contexto de muitos estados de doença, tais como a doença inflamatória do intestino ou ^3,6 cancro colorectal. No entanto, existem limitações inerentes e preocupações na utilização de uma linha celular. Estes incluem a instabilidade genotípica ao longo do tempo que diferencia as linhas celulares a partir de células primárias, alterando o fenótipo e função biológica da célula, incluindo as taxas de crescimento e as interacções com outras populações de células. As linhas celulares também não possuem os componentes normais do microambiente GI (epitelial, estromal, e componentes vasculares), que é uma limitação importante à sua utilização. Portanto, as conclusões da pesquisa linhagem celular experimental requer uma validação adicional para reduzir o risk de má interpretação.

Miofibroblastos primárias podem ser obtidas a partir de tecido de cólon humano e de ratinho para confirmar os resultados experimentais identificados em uma linha de células ^7. O método foi descrito originalmente por Mahida et al. ^8, e o nosso protocolo é uma das várias técnicas bem definidas que podem ser utilizadas para isolar os miofibroblastos primários de ratinho e de cólon humano ^9. Para qualquer modelo do rato da doença colônica, esta técnica pode ser usada para isolar myofibroblasts principais para estudar a forma como eles interagem com as células vizinhas ou contribuir para tanto normal ou patológica GI processa ^10,11. Esta técnica pode ser usada para estudar como miofibroblastos contribuir para a cicatrização da mucosa, fibrose, e o desenvolvimento de adenomas e carcinomas. Miofibroblastos primárias também pode ser obtido a partir de tecido de cólon humano que foi ressecado, no momento da operação de benigna (doença inflamatória do intestino, estenoses, diverticulite) ou maligno cCONDIÇÕES. As células primárias isoladas a partir de tecido de cólon humano e de ratinho podem ser cultivadas em cultura celular e utilizada ao longo de um número limitado de passagens.

Protocol

1. Obter Colon Tissue

Mouse

Um protocolo para realizar experimentos com animais, detalhando os fundamentos e objetivos da pesquisa, foi submetido e aprovado pelo nosso Departamento de Pesquisa institucional Supervisão Animal.

1. Eutanásia o mouse com isoflurano inalado seguido por deslocamento cervical.
2. Faça uma incisão na linha média ventral, retraia o intestino delgado de distância e identificar o cólon. Recolha a bexiga e o útero (se presente) lateralmente e identificar o osso púbico e cortar com uma tesoura fina para expor o recto.
3. Dissecar o mesentério dorsal do recto fora do cólon e mobilizar o cólon a partir do ânus ao ceco, e cortar através de que a desconectar o cólon a partir do intestino delgado.
4. Coloque as amostras em solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS).
5. Encha uma seringa de 10 ml com PBS gelado e lavar o cólon lúmen várias vezes para limpar o seu conteúdo, em seguida, corte o ope cólonn longitudinalmente com uma tesoura.
6. Coloque o cólon num tubo cónico de 50 ml contendo 20 ml de PBS gelado. O cólon não tem de ser colocado em qualquer orientação particular. Lavar o cólon, substituindo o PBS até que o líquido é claro, sem material particulado.

Humano

Um protocolo para obtenção de tecido humano de pacientes cirúrgicos, detalhando a importância de se obter este tecido, bem como uma avaliação dos riscos e benefícios potenciais, foi submetido e aprovado pelo nosso escritório institucional do Programa de Proteção Human Research.

1. Colaboração na investigação com um cirurgião colorretal é necessário para ser capaz de obter o tecido humano para a sua pesquisa. Um protocolo para obtenção de tecido de cólon humano deve ser submetido e aprovado pelo seu conselho de revisão institucional.
2. O consentimento informado é obtido a partir do paciente antes do procedimento cirúrgico.
3. O cirurgião irá realizar uma ressecção do cólon no standmoda ard. Uma vez que o cólon foi removido a partir do paciente, o espécimen é imediatamente feita a patologia. A 0,5 em secção de espessura total da parede do cólon não são necessários para a avaliação patológica é fornecida e é imediatamente colocado em PBS gelado. Este espécime não deve incluir o mesentério do cólon, e apêndices epiplóico devem ser removidos, bem como, uma vez que a presença de gordura vai afetar o processo de digestão.

2. Desnudar células epiteliais

1. Incubar todo o cólon do rato em 25 ml de EDTA 5 mM em HBSS (temperatura ambiente) em um tubo de 50 ml. Colocar o tubo cónico de 37 ° C agitando banho de ar (250 rpm) durante 15 min. Após 15 minutos, cuidadosamente deitar fora o líquido e encher o tubo com 25 ml de EDTA 5 mM, para repetir um total de cinco lavagens. Para cólon humano, após a obtenção de uma faixa de parede do cólon ½ polegada a partir do patologista cortar o cólon com uma tesoura em quatro partes de igual tamanho. Coloque duas das peças em um tubo de 50 ml, ecolocar as restantes duas peças de tecido do cólon para um tubo cónico de 50 ml separado. Em seguida incubar com 25 ml de EDTA 5 mM em HBSS e executar lavagens, tal como descrito acima.
2. Lavar o cólon duas vezes em 20 ml de PBS gelado.
3. Colocar o tecido do cólon do rato em um novo tubo de 50 ml contendo 20 ml de meio RPMI-5, 10 L de dispase, e 2,000 U de colagenase D (temperatura ambiente). Para o tecido do cólon humano, usar o dobro da quantidade de dispase e colagenase (20 U dispase, 4000 U de colagenase D).
4. Colocar o tubo num banho de ar de 37 ° C agitando orientada verticalmente (Se for colocado horizontalmente, há muito arejamento e danos celulares). Agitar a 250 rpm, durante até 60 min. Após a exposição ao dispase e colagenase D, o tecido do cólon vai começar a digerir o tecido do cólon e começará a procurar fibroso. Isso geralmente leva cerca de 30 min. Quando o cólon tem esta aparência, remover o cólon das enzimas.
5. Agitar cada tubo de cima e para baixo 2-4 vezes para romper o tecido. PEllet o tecido a 200 xg numa centrifugadora de mesa (4 ° C) durante 5 min. Despeje cuidadosamente o sobrenadante e descartar.

3. Isolamento e Cultura de miofibroblastos

1. Ressuspender a cada sedimento por adição de 10 ml de tampão de lise ACK (47 ° C). Centrifugar novamente a 200 x g durante 5 minutos (4 ° C), deitar fora e desprezar o sobrenadante.
2. Ressuspender a cada sedimento por adição de 10 ml de RPMI-5 com uma pipeta.
3. Passa metade da suspensão de células (5 ml) através de uma peneira de malha 70 mM com uma pipeta de 10 ml para uma placa de 100 mm tratadas com TC. Em seguida, adicionar um adicional de 15 ml de RPMI-5. Repetir com os restantes 5 ml de suspensão de células para um prato de 100 mm diferente tratados com TC. Um rato de cólon, portanto, deu dois pratos tratados com TC 100 mm. Tira de tecido de cólon humano Uma ½ polegada irá produzir um total de quatro placas tratadas com TC de 100 mm.
4. Colocar as placas de cultura de tecido em 10% de _CO2 a 37 ° C. As condições de cultura são as mesmas fou mouse e células primárias humanas.
5. Após 3 h, lavar suavemente as células não aderentes, com duas alterações de HBSS. O flutuante de detritos devem ser lavadas delicadamente fora. As células aderentes são compostas por células epiteliais, macrófagos e miofibroblastos. Uma semana após a semeadura, apenas miofibroblastos dividir, macrófagos e células epiteliais senesce após a primeira passagem. Adicionar fresco RPMI-5 e cultivar as células em cultura de células.
6. As células são passadas por tripsinização, durante 5 min e são divididas 2:1.

Abreviaturas

HBSS: solução de sal equilibrada de Hank; RPMI-5: meios de Roswell Park Memorial Institute; ACK: Cloreto de amónio--potássio; FCS: soro fetal de vitelo; TC-tratados: cultura de tecidos tratados

Soluções

Tampão de lise ACK - (4,15 g de _NH4Cl, 0,5 g _{de KHCO3,} 18,6 mg de Na ₂ EDTA, 400 ml de H ₂ O, ajustar o pH a 7,2-7,4 com HCl 1 N). Filtro esterilizadore através de um filtro de 0,2 um e armazenar a 4 ° C. RPMI-5 - (a perfazer 500 ml: 454,5 ml de RPMI, FCS 25 ml, 5 ml de 200 mM de L-glutamina, 5 mL de HEPES 1 M, pH 7,4, 5 ml 100 mM de piruvato de sódio, 5 ml de 100x Pen-Strep, 500 ml de 50 mM B-ME em PBS).

Representative Results

Uma vez isolado, miofibroblastos humanas primárias podem ser cultivadas em cultura celular e utilizada ao longo de um número limitado de passagens (até à passagem 4). Estas células são caracterizados como sendo um liso-actina de músculo e vimentina positivo, e desmina negativa (Figura 1A), consistente com os miofibroblastos subepiteliais intestinais ^5,7. Eles também têm uma estreladas morfologia característica (Figura 1B). Miofibroblastos primários podem então ser utilizados para confirmar os resultados experimentais identificados numa linha celular. Esta abordagem foi utilizada para demonstrar que a citocina TNF-α pró-inflamatória (10 ng / mL) induziu a supra-regulação da expressão do receptor de EGF e de sinalização nestas células ^7. A expressão do receptor de EGF e de sinalização regulada positivamente foi inicialmente encontrado utilizando a linha de células de miofibroblastos anteriormente mencionado cólon humano 18Co (Figura 2). Na Figura 2A, que demonstram que a exposição de células de 18Co para TNF-45; conduziu a um aumento dependente do tempo da expressão do receptor EGF. Este correlacionado com aumentada da COX-2, a expressão induzida por EGF e p42/44 MAPK fosforilação nestas células (Figura 2B). Para validar estes resultados experimentais, os experimentos foram repetidos com miofibroblastos primárias humanas isoladas de cólon ressecado cirurgicamente de pacientes com câncer colorretal. Como mostrado na figura 2C e 2D, miofibroblastos humanas primárias de perto imita as descobertas experimentais inicialmente identificados na linha celular de 18Co ^7.

Figura 1. Miofibroblastos primárias pode ser isolado a partir de tecido de cólon humano ^7. Pilhas isoladas demonstram um fenótipo de miofibroblastos, como que são consistentemente a-SMA e vimentina positivo (Figura 1A) e demonstrar uma morfologia estrelada (

Figura 2. Resultados experimentais em uma linha celular estão comprovadas com células humanas primárias miofibroblastos ^7. A linha de células de cólon humano de miofibroblastos 18Co foi utilizado para demonstrar que o TNF-α induz a regulação positiva da expressão do receptor de EGF e de sinalização nestas células (Figura 2A). Esta supra-regulação da expressão do receptor de EGF foi associada com um aumento de sinalização do receptor de EGF, mostrado na Figura 2B, em que a exposição subsequente ao EGF levou a um aumento da fosforilação da MAPK p42/44 e COX-2 de expressão. Estes efeitos foram completamente inibida com o inibidor do receptor de EGF AG1478. Miofibroblastos humanos primários isolados de cólon ressecado cirurgicamente de pacientes com câncer colorretal confirmar estes resultados experimentais (Figuras 2Ce 2D). Fator de necrose tumoral-alfa TNF-α =, EGFR = receptor EGF, AG = AG1478, COX-2 = ciclo-oxigenase-2. Clique aqui para ver maior figura.

Figura 3. Miofibroblastos primárias pode ser isolado a partir de tecido do cólon do rato. A vista 10X de células miofibroblastos rato primários. Clique aqui para ver maior figura.

Discussion

A técnica geral é semelhante ao usar o mouse ou o cólon humano. Esta técnica também pode ser usada para isolar os miofibroblastos do intestino delgado. Detalhes específicos para o isolamento de miofibroblastos de 1. rato e 2. cólon humano são discutidos abaixo.

1. Rato Colon

Irrigação do cólon do rato é facilitada pela fixação de um 4 em 16 L Popper agulha de extremidades cegas para uma das extremidades do cólon. Isso também ajuda quando o corte do cólon longitudinalmente. Você pode acordeão o tecido do cólon para a agulha, em seguida, coloque uma ponta da tesoura com a ponta para cima e deslize o tecido do cólon sobre a borda tesoura ao cortar para abri-la longitudinalmente.

No passo 2.1, é importante entender que o material nuclear a partir de células mortas pode conduzir a aglutinação celular. A adição de ADNase (50 mg / ml) podem ser utilizados para resolver este problema.

O passo mais importante é o passo 2.4. Mantenha um carelógio REFUL do tecido do cólon. Quando o cólon começa a procurar fibroso, remover o cólon das enzimas. Você não precisa para incubar os dois pontos para toda a 60 min. Se o tecido do cólon é exposta ao dispase e colagenase D durante demasiado tempo, as células morrem. Este é um erro comum que irá resultar em um baixo rendimento celular.

A contaminação das células é outro problema comum. Técnica cuidadosa, lavagem adequada e filtragem irá minimizar o risco de contaminação, juntamente com técnicas estéreis padrão usados ​​para o trabalho de cultura de células.

2. Cólon Humano

O período de tempo para a incubação com as enzimas depende do tamanho da amostra que está a ser digerido. Nós normalmente recebem uma tira de espessura total de ½ polegada de parede do cólon humano. Há uma alteração no passo 2.3 ao isolar miofibroblastos de tecido de cólon humano. Para a etapa 2.3, para cólon humano você deve dobrar a quantidade de dispase (20 U) e collagenase D (4000 L) utilizado. Um segmento ainda maior de cólon vai exigir um período de incubação mais longo. Além disso, mantenha em mente que a atividade específica das enzimas pode variar com muitos, assim você pode ter que ajustar o tempo de incubação em conformidade.

Para tanto rato primária e miofibroblastos humanos, 0nce cultivadas em cultura, as células isoladas deve ser avaliada para determinar a pureza das células e para confirmar que as células são de miofibroblastos semelhante. Isto pode ser feito com uma variedade de técnicas, incluindo coloração imuno-histoquímica (anticorpos para miofibroblastos marcadores incluem liso-actina de músculo e Vimentina, anticorpo monoclonal para o CD68 é específico para os macrófagos, o CD31 é específico para as células endoteliais, e CD45 é específico para células imunológicas; anticorpos para a E-caderina e várias citoqueratinas são específicos para as células epiteliais. expressão de mRNA também pode ser avaliada por RT-PCR ^12. citometria de fluxo também pode ser utilizada para a análise de células ^13.

in vitro e co-cultura. As células primárias também podem ser implantados no tecido subcutâneo de ratos para o estudo das interacções célula-célula ^14. As aplicações futuras podem envolver reimplante de miofibroblastos primários na parede do cólon de um rato singênico utilizando o rato colonoscopia após a manipulação genética.

Uma série de métodos alternativos para isolar miofibroblastos primárias de humano e rato cólon também têm sido descritos. Dois estão listados abaixo:

1. Mahida et al. Am. J. Physiol. 273 G1341-1348, (1997).
2. De Wever, et al. Int. J. Oncol. 39, 393-400, (2011).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Dispase I	Invitrogen/GIBCO	#17105-041
Collagenase D	Roche	#1 088 858
4 in, 16 G Popper blunt-end needle	Fisher	#14-825-16K