Summary
Миофибробластов является влиятельным стромальных клеток из желудочно-кишечного тракта, который регулирует важные физиологические процессы в нормальных и болезненных состояний. Опишем метод, который позволяет для выделения первичных миофибробластами с обеих мышиных и человеческих толстой кишки ткани, которая может быть использована для экспериментов в пробирке.
Abstract
Миофибробластов является стромальных клеток из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), которая набирает большое внимание своей важной роли в многих функций ЖКТ. В то время как несколько миофибробластов клеточные линии имеются в продаже изучать эти клетки в пробирке, результаты исследований из клеточной линии, подверженных воздействию экспериментальных условиях культуры клеток присущи ограничения из-за чрезмерно редукционистской характера работы. Использование первичных миофибробластов предлагает большое преимущество с точки зрения подтверждения экспериментальные результаты, отмеченные в клеточной линии. Выделение первичных миофибробластами из животной модели позволяет для изучения миофибробластами в условиях, которые более точно имитировать болезненное состояние изучается. Выделение первичных миофибробластов от человеческого ткани двоеточия предоставляет возможно наиболее релевантные экспериментальные данные, так как клетки поступают непосредственно от пациентов с основного заболевания. Мы описываем устоявшихся метод, который можно уtilized изолировать первичные миофибробластов и от мыши и человека толстой кишки ткани. Эти изолированные клетки были охарактеризованы быть альфа-гладких мышц актин и виментин-положительных, и десмин-отрицательных, в соответствии с субэпителиальных кишечных миофибробластов. Первичные элементы миофибробластного могут быть выращены в культуре клеток и использовали для экспериментальных целей более ограниченным числом пассажей.
Introduction
Регулирование желудочно-кишечного (GI) функции тракта включает в себя комплекс, динамические взаимодействия между слоя слизистой оболочки и ее основной мезенхимы. Эти взаимодействия обычно служат для поддержания гомеостаза, но также может привести к развитию болезненных состояний, при патологических состояниях 1. Миофибробласты являются субпопуляции стромальных клеток, расположенных нижележащих к эпителиального слоя, что общаться на паракринного моды с прилегающими клеточные субпопуляции регулировать ряд процессов критических ЖКТ, которые включают слизистой регенерацию, ремонт и фиброз 2.
Клеточная линия 18Co является примером человеческого толстой линии миофибробластов клеток, которая была широко используется для изучения функции миофибробластов, потому что разделяет многие из характеристик первичного на месте миофибробластов. Они включают в себя экспрессию белка а-актин гладких мышц (α-SMA) и виментин, а также экспрессию рядарецепторов клеточной поверхности, таких как рецептор эпидермального фактора роста или рецепторами 3,4 лизофосфатидной кислоты. Из-за этих общих ультраструктурные характеристики, а также сходства в биологической функции 5, линия клеток 18Co широко используется для изучения функции миофибробластов в контексте многих болезненных состояний, таких как воспалительные заболевания кишечника или прямой кишки 3,6 рака. Тем не менее, есть ряд ограничений и проблем при использовании клеточной линии. К ним относятся генотипический нестабильность во времени, что отличает клеточных линий из первичных клеток, изменяя фенотип и биологической функции клетки, в том числе темпы роста и взаимодействия с другими клеточных популяций. Клеточные линии также не имеют нормальных составляющих желудочно-кишечного микроокружения (эпителиальных, стромальных и сосудистых компонентов), который является основным ограничением его использования. Таким образом, выводы из экспериментальных исследований клеточной линии нуждается в дополнительном подтверждении, чтобы уменьшить риSK неправильного толкования.
Первичные миофибробласты может быть получен из человека и мыши толстой кишки ткани, чтобы подтвердить экспериментальные данные, указанные в клеточной линии 7. Способ первоначально был описан Mahida и соавт. 8, и наш протокол является одним из многих хорошо описанных методов, которые могут быть использованы для выделения первичных миофибробластов от мыши и толстой кишке человека 9. Для любого мышиной модели кишечной болезни, этот метод может использоваться, чтобы изолировать первичные миофибробластов изучение того, как они взаимодействуют с соседними клетками или способствовать как нормальный или патологический GI обрабатывает 10,11. Этот метод может быть использован для изучения, как миофибробласты способствовать слизистой исцеление, фиброз и развитие колоректального аденомы и карциномы. Первичные миофибробласты также может быть получен из человеческой толстой кишки тканей, которые были резекции во время операции по поводу доброкачественной (воспалительное заболевание кишечника, стриктуры, дивертикулит) или злокачественной Conditions. Изолированные первичные клетки человека и мыши, толстой кишки ткани могут быть выращены в культуре клеток и использовали в течение ограниченного числа проходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получить ткань толстой кишки
Мышь
Протокол для выполнения экспериментов на животных, в котором подробно обоснование и задачи исследования, был представлен и одобрен нашей институциональной Управления животных исследовательского надзору.
- Усыпить мышь с вдыхаемым изофлураном последующим смещением шейных позвонков.
- Сделайте вентральной средней линии разрез, убрать тонкой кишки в сторону и определить толстой кишки. Уберите мочевого пузыря и матки (если есть) в поперечном направлении и определить лобковой кости и нарезать его тонкими ножницами, чтобы выставить прямую кишку.
- Проанализируйте спинной брыжейки прямой кишки от толстой кишки и мобилизовать двоеточие из ануса к слепой кишки, и секут его отключить двоеточие из тонкой кишки.
- Поместите образец в ледяной фосфатным буферным солевым раствором (PBS).
- Заполните 10 мл шприц с ледяной PBS и промывки толстой кишки просвета несколько раз, чтобы очистить его содержимое, а затем вырезать толстой кишки ОПЕн в продольном направлении с помощью ножниц.
- Поместите двоеточие в 50 мл коническую трубку с 20 мл ледяной PBS. Толстой кишки не должен быть помещен в любой конкретной ориентации. Вымойте двоеточие, заменив PBS, пока жидкость не является прозрачным, без твердых частиц.
Человек
Протокол для получения ткани человека от хирургических больных, в котором подробно важность получения этой ткани, а также оценку потенциальных рисков и преимуществ, был представлен и одобрен нашей институциональной Управления программу по защите Исследования человека.
- Исследования сотрудничество с колоректальным хирургом необходимо иметь возможность получить человеческую ткань для вашего исследования. Протокол для получения толстой кишки человека ткани должны быть представлены и утверждены вашего биомедицинской этике.
- Письменное информированное согласие получают от пациента до хирургической операции.
- Хирург будет выполнять резекции толстой кишки на стендеARD моды. После того, как толстой кишки была удалена из пациента, образец немедленно доставлен в патологии. 0.5 в полную толщину секции толстой кишки стены не требуется для патологического оценки обеспечивается и сразу же помещают на ледяную PBS. Этот образец не должен включать в себя толстой кишки брыжейки и сальниковые придатки должны быть удалены, а, так как присутствие жиров повлияет на процесс пищеварения.
2. Оголять эпителиальных клеток
- Выдержите всей толстой кишки мыши в 25 мл 5 мМ ЭДТА в HBSS (комнатная температура) в 50 мл коническую трубку. Поместите коническую трубку в 37 ° C встряхивания воздуха бане (250 оборотов в минуту) в течение 15 мин. Через 15 мин, тщательно слейте жидкость и залить трубку с 25 мл 5 мМ ЭДТА, повторите в общей сложности 5 стирок. Для толстой кишке человека, после получения ½-дюймовую полоску толстой кишки стены от патологоанатома сократить двоеточие с ножницами на четыре равные части размера. Поместите два из кусков в один 50 мл коническую трубку, иразместить оставшиеся два куска ткани двоеточия в отдельную 50 мл коническую трубку. Затем инкубируют с 25 мл 5 мМ ЭДТА в HBSS и выполнять моет, как описано выше.
- Промойте двоеточие два раза в 20 мл ледяной PBS.
- Поместите мыши толстой кишки ткани в новом 50 мл коническую пробирку, содержащую 20 мл среды RPMI-5, 10 ЕД диспазы и 2000 U коллагеназы D (комнатная температура). Для человеческого толстой кишки ткани, используют в два раза больше диспазы и коллагеназы (20 U диспаза, 4000 U коллагеназы D).
- Поместите пробирку в воздушной ванны 37 ° С дрожащей ориентированной вертикально (Если располагаться горизонтально, есть слишком много аэрация, повреждение клеток). Взболтать при 250 оборотах в минуту в течение до 60 мин. После контакта с диспазы и коллагеназы D, ткань толстой кишки начнет переваривать и ткань толстой кишки начнут смотреть тягучий. Это обычно занимает около 30 мин. Когда толстая кишка имеет этот вид, удалить толстую кишку от ферментов.
- Встряхнуть каждую пробирку вверх и вниз 2-4 раза, чтобы разбить ткани. РEllet ткани при 200 х г в настольной центрифуге (4 ° C) в течение 5 мин. Тщательно слейте супернатант и выбросьте.
3. Миофибробластов Выделение и Культура
- Ресуспендируют каждый шарик путем добавления 10 мл ACK лизирующего буфера (47 ° C). Центрифуга снова при 200 мкг в течение 5 мин (4 ° C), слейте и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют каждый шарик добавлением 10 мл RPMI-5 с помощью пипетки.
- Pass половина клеточной суспензии (5 мл) через сито меш 70 мкм с помощью 10 мл пипетки в 100 мм TC-обработанных блюдо. Затем добавить еще 15 мл RPMI-5. Повторите с оставшимися 5 мл клеточной суспензии в другом 100 мм TC обращению блюдо. Поэтому каждый толстой кишки мыши даст два 100 мм TC обработанных блюд. Один ½ дюйма полоска ткани ободочной кишки человека даст в общей сложности четыре 100-мм TC-обработанных блюд.
- Поместите чашках для культуры ткани в 10% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С. Условия культивирования такие же, еили мышь и первичные клетки человека.
- Через 3 часа, осторожно смойте с неприкрепленных клеток и две перемены HBSS. Обломки плавающей должны быть аккуратно смывается. Прилипшие клетки состоят из эпителиальных клеток, макрофагов и миофибробластов. Неделю после посева, только Миофибробласты разрыва, макрофаги и эпителиальные клетки стареют после первого прохода. Добавить свежий RPMI-5 и расти клетки в клеточной культуре.
- Клетки пассируют обработкой трипсином в течение 5 мин и разделены 2:01.
Сокращения
HBSS: сбалансированный солевой раствор Хэнка; RPMI-5: Memorial Institute Roswell Park информации; ACK: Аммоний-хлорид калия; FCS: фетальной телячьей сыворотки; TC-лечение: культура ткани обрабатывают
Решения
ACK буфера для лизиса - (4,15 г NH 4 Cl, 0,5 г КНСО3, 18,6 мг Na 2 ЭДТА, 400 мл H 2 O, довести рН до 7,2-7,4 с 1 N HCl). Фильтр стерилизующихе через 0,2 мкм фильтр и хранят при температуре 4 ° C. RPMI-5 - (сделать 500 мл: 454,5 мл RPMI, 25 мл FCS, 5 мл 200 мМ L-глутамина, 5 мл 1 М HEPES, рН 7,4, 5 мл 100 мМ пирувата натрия, 5 мл 100x Пен-Strep, 500 мл 50 мМ B-ME в PBS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После выделения первичных человеческих миофибробласты могут быть выращены в культуре клеток и использовали в течение ограниченного числа проходов (до канала 4). Эти клетки характеризуются как-актин гладких мышц и виментин положительным, и десмин-отрицательным (рис. 1А), в соответствии с кишечными субэпителиальных миофибробластов 5,7. Они также имеют характерный звездчатый морфологии (рис. 1В). Первичные миофибробласты затем могут быть использованы для подтверждения экспериментальные данные, указанные в клеточной линии. Этот подход был использован, чтобы продемонстрировать, что провоспалительного цитокина TNF-α (10 нг / мл) индуцирует повышение экспрессии рецептора EGF и сигнализации в этих клетках 7. Экспрессии рецептора активируется ЭФР и сигнализация была первоначально нашли использованием ранее упомянутый человеческий толстой линии миофибробластов клеток 18Co (рис. 2). В рисунке 2А, мы демонстрируем, что воздействие 18Co клеток к TNF-45; привело к зависимому от времени увеличение экспрессии рецептора EGF. Это коррелирует с повышенной EGF-индуцированной СОХ-2 экспрессии и фосфорилирования p42/44 MAPK в этих клетках (фигура 2В). Для подтверждения этих экспериментальных данных, эксперименты были повторены с использованием первичных человека миофибробластов выделенные из хирургически удаленных толстой кишки у пациентов с колоректальным раком. Как показано на рисунке 2В и 2Г, первичные человека миофибробласты точно имитировать результаты экспериментов первоначально выявленных в клеточной линии 18Co 7.
Рисунок 1. Первичные миофибробласты могут быть выделены из человеческой толстой кишки ткани 7. Изолированные первичные клетки демонстрируют миофибробластов, как фенотип, который последовательно-SMA и виментин положительным (рис. 1А) и продемонстрировать звездчатый морфологию ( 
Рисунок 2. Экспериментальные данные в клеточной линии обоснованы с использованием первичных человека миофибробластов клетки 7. Толстой линии миофибробластов клеток человека 18Co был использован, чтобы продемонстрировать, что TNF-α индуцирует повышение экспрессии рецепторов ЭФР и сигнализации в этих клетках (рис. 2A). Это повышение экспрессии рецепторов EGF была связана с повышенной сигнализации EGF рецептора, показано на рисунке 2В, где последующее воздействие EGF привело к повышенной p42/44 МАРК фосфорилирования и ЦОГ-2 выражения. Эти эффекты были полностью подавляется с рецепторов ингибитора EGF AG1478. Первичные человеческие миофибробласты выделенные из хирургически удаленных толстой кишки у пациентов с колоректальным раком подтвердить эти экспериментальные данные (рис. 2Cи 2D). Фактор некроза опухоли-альфа = ФНО-α, EGFR = рецептор ЭФР, А. = AG1478, ЦОГ-2 = циклооксигеназы-2. Щелкните здесь, чтобы увеличить рисунок. 
Рисунок 3. Первичные миофибробласты может быть выделен из кишки мыши ткани. 10X вид первичных мышиных миофибробластов клеток. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Общий метод похож, когда, используя либо мышь или толстой кишки человека. Этот метод также может быть использован для изоляции миофибробластов из тонкого кишечника. Конкретные детали для изоляции миофибробластов от 1. мышь и 2. толстой кишки человека, обсуждаются ниже.
1. Мышь Колон
Орошение толстой кишки мыши облегчается путем присоединения 4 в 16 г Поппера иглу с тупым концом к одному концу толстой кишки. Это также помогает при резке толстой кишки продольно. Вы можете аккордеон ткань толстой кишки на иглу, затем поместите одну кончик ножниц с резким концом вверх и сдвиньте толстой кишки ткани над ножницами края во время резки, чтобы открыть его длине.
На этапе 2.1, важно понять, что ядерный материал от мертвых клеток может привести к клеточной слипания. Добавление ДНКазы (50 мг / мл) могут быть использованы для решения этой проблемы.
Наиболее важным шагом является шагом 2,4. Держите окreful часы из ткани двоеточия. Когда толстая кишка начинает выглядеть тягучий, удалить толстую кишку от ферментов. Вам не нужно для инкубации двоеточие для всего 60 мин. Если ткань толстой кишки подвергается диспаза и коллагеназы D слишком долго, клетки умрут. Это распространенная ошибка, что приведет к выходу низкой клеток.
Загрязнение клеток является другой общей проблемой. Тщательное метод, соответствующий промывки и фильтрации позволит свести к минимуму риск загрязнения, а также стандартные стерильные методы, используемые для культивирования клеток работы.
2. Толстой кишки человека
Продолжительность времени для инкубацией с ферментами зависит от размера образца, который переваривается. Мы обычно получают ½ дюймовый полный толщины полосы человеческой толстой кишки стены. Существует модификация в шаге 2.3 при выделении миофибробластов от человеческого толстой кишки ткани. Для шагом 2.3 для толстой кишке человека необходимо удвоить количество диспазы (20 U) и сотрудничестваllagenase D (4000 U) используется. Еще большее сегмент толстой кишки потребует больше времени инкубации. Кроме того, имейте в виду, что удельная активность ферментов могут быть с большим, так что вы, возможно, придется регулировать время инкубации соответственно.
Для обоих первичного мыши и человека миофибробластов, 0nce выращивают в культуре, изолированные клетки должны быть оценены на предмет чистоты клеток и подтвердить, что клетки миофибробластов-как. Это может быть сделано с различными способом, включая иммуногистохимического окрашивания (антитела к миофибробластного маркеры включают-актин гладких мышц и виментин; моноклональное антитело к CD68 является специфическим для макрофагов, CD31 является специфичным для эндотелиальных клеток, и CD45 является специфическим для иммунных клеток; антитела к Е-кадгерина и различных цитокератины являются специфическими для эпителиальных клеток. Экспрессия мРНК также можно оценить с помощью RT-PCR 12. Проточная цитометрия также могут быть использованы для анализа клеточной 13.
в пробирке и сокультуры экспериментов. Первичные элементы также могут быть имплантированы в подкожную ткань мышей для изучения межклеточных взаимодействий 14. Будущие приложения могут включать повторное вживление первичных миофибробластов в толстой кишки стене сингенной мыши с использованием мыши колоноскопию следующие генетических манипуляций.
Ряд альтернативных методов изолировать первичные миофибробластов человека и мыши, толстой кишки, также были описаны. Два из них перечислены ниже:
- Mahida, и др.. Am. Дж. Физиология. 273 G1341-1348, (1997).
- Де Вевер, и др.. Int. Дж. Oncol. 39, 393-400, (2011).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья Грант 5KO8DK085136-02 до JY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
References
- Armaka, M., et al. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).
- Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).
- Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).
- Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line. Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).
- Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).
- Yoo, J., et al. TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- De Wever, O., et al. Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts. Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).
- Edwards, R. A., Smock, A. Z. Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts. Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).
- Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).
- Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis. J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Lahar, N., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 6, e26898 (2011).
