Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

Summary

Il miofibroblasti è una cellula stromale influente del tratto gastrointestinale che regola importanti processi fisiologici in stati normali e patologici. Descriviamo una tecnica che consente l'isolamento dei miofibroblasti primarie sia da mouse e tessuti del colon umano, che può essere utilizzato per la sperimentazione in vitro.

Abstract

Il miofibroblasti è una cellula stromale del tratto che sta guadagnando una notevole attenzione per il suo ruolo fondamentale in molte funzioni GI gastrointestinale (GI). Mentre diverse linee cellulari miofibroblasti sono disponibili in commercio per studiare queste cellule in vitro, i risultati della ricerca di una linea di cellule esposte a condizioni di coltura cellulare sperimentali hanno delle limitazioni intrinseche dovute al carattere eccessivamente riduttiva del lavoro. L'uso di miofibroblasti primarie offre un grande vantaggio in termini di conferma risultati sperimentali individuati in una linea cellulare. Isolamento di miofibroblasti primarie da un modello animale consente lo studio dei miofibroblasti in condizioni che imitare maggiormente lo stato di malattia in fase di studio. Isolamento di miofibroblasti primari dal tessuto del colon umano fornisce senza dubbio i dati sperimentali più rilevanti, dal momento che le cellule provengono direttamente dai pazienti con la malattia di base. Descriviamo una tecnica ben consolidata che può essere utilized isolare myofibroblasts primarie sia da mouse e tessuti del colon umano. Queste cellule isolate sono stati caratterizzati per essere alfa-actina del muscolo liscio e vimentina-positive, e desmina-negativo, in linea con miofibroblasti intestinali subepiteliali. Cellule myofibroblast primarie possono essere coltivate in coltura cellulare e utilizzati per scopi sperimentali su un numero limitato di passaggi.

Introduction

La regolazione della funzione gastrointestinale del tratto (GI) comporta complesse, interazioni dinamiche tra lo strato mucoso e il suo mesenchima sottostante. Queste interazioni normalmente servono a mantenere l'omeostasi ma possono anche portare allo sviluppo di stati di malattia in condizioni patologiche ^1. Miofibroblasti sono una sottopopolazione di cellule stromali situati soggiacente allo strato epiteliale che comunicano in modo paracrino con circostante sottopopolazioni di cellule per regolare un numero di processi tratto GI critici che includono rigenerazione della mucosa, riparazione e fibrosi ^2.

La linea cellulare 18Co è un esempio di una linea umana colon miofibroblasti cella che è stato ampiamente utilizzato per studiare la funzione miofibroblasti perché condivide molte delle caratteristiche di primaria in miofibroblasti situ. Questi includono l'espressione della proteina di a-actina muscolare liscia (α-SMA) e vimentina, nonché l'espressione di un numerodei recettori di superficie cellulare, come il recettore del fattore di crescita epidermico, o recettori per ^3,4 acido lysophosphatidic. A causa di queste caratteristiche ultrastrutturali condivisi, nonché similitudini nella funzione biologica ^5, la linea cellulare 18Co è stato ampiamente utilizzato per studiare la funzione miofibroblasti nel contesto di molti stati patologici quali la malattia infiammatoria intestinale o colorettale ^3,6 cancro. Tuttavia, vi sono limitazioni intrinseche e preoccupazioni quando si utilizza una linea cellulare. Questi includono instabilità genotipica nel tempo che differenzia linee cellulari di cellule primarie, alterando il fenotipo e funzione biologica della cellula, compresi tassi di crescita e le interazioni con altre popolazioni cellulari. Linee cellulari mancano anche i normali componenti del microambiente GI (epiteliale, stromale e componenti vascolari), che è un importante limitazione al suo uso. Pertanto, le conclusioni tratte dalla ricerca sperimentale linea cellulare richiede un'ulteriore conferma per ridurre il risk di errori di interpretazione.

Miofibroblasti primari possono essere ottenuti da colon tessuto umano e il mouse per confermare i risultati sperimentali individuati in una linea cellulare ^7. Il metodo è stato originariamente descritto da Mahida, et al. ^8, e il protocollo è una delle molte tecniche ben definite che possono essere utilizzati per isolare miofibroblasti primari di topo e del colon umano ^9. Per ogni modello murino della malattia del colon, questa tecnica può essere utilizzata per isolare myofibroblasts primarie per studiare come interagiscono con le cellule vicine o contribuire sia normale o patologico GI elabora ^10,11. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare come miofibroblasti contribuiscono alla guarigione della mucosa, fibrosi, e lo sviluppo di adenomi e carcinomi colorettali. Miofibroblasti base possono anche essere ottenuti da tessuti del colon umano che è stato asportato al momento della operazione per benigna (malattia infiammatoria intestinale, stenosi, diverticolite) o maligni condizioni. Cellule primarie isolate da tessuti umani colon e mouse possono essere coltivate in coltura cellulare ed utilizzati per un numero limitato di passaggi.

Protocol

1. Ottenere Colon Tissue

Mouse

Un protocollo per eseguire esperimenti su animali, specificando le motivazioni e gli obiettivi della ricerca, è stato presentato e approvato dal nostro ufficio istituzionale di Animal Research Vigilanza.

1. Euthanize il mouse con isoflurano inalato seguita da dislocazione cervicale.
2. Effettuare una incisione mediana ventrale, ritrarre il piccolo intestino di distanza e identificare il colon. Ritrarre la vescica e dell'utero (se presente) lateralmente e identificare l'osso pubico e tagliare con forbici pregiati per esporre il retto.
3. Sezionare il mesentere dorsale del retto off del colon e mobilizzare il colon dall'ano al cieco, e la transezione per scollegare il colon dal piccolo intestino.
4. Porre il campione in tampone fosfato ghiacciata (PBS).
5. Riempire una siringa da 10 ml con PBS freddo e lavare il colon lume diverse volte per cancellare il contenuto, quindi tagliare l'ope colonn senso della lunghezza con le forbici.
6. Posizionare il colon in una provetta conica da 50 ml contenente 20 ml di PBS ghiacciato. I due punti non deve essere collocato in qualsiasi orientamento particolare. Lavare il colon sostituendo il PBS fino a quando il liquido è trasparente senza particolato.

Umano

Un protocollo di ottenere tessuti umani da pazienti chirurgici, specificando l'importanza di ottenere questo tessuto, nonché una valutazione dei potenziali rischi e benefici, è stato presentato e approvato dal nostro Ufficio istituzionale del programma di protezione Human Research.

1. Collaborazione di ricerca con un chirurgo colorettale è necessario essere in grado di ottenere tessuti umani per la ricerca. Un protocollo di ottenere tessuto del colon umano dovrebbe essere presentato e approvato dal comitato istituzionale di revisione.
2. Il consenso informato scritto è ottenuto dal paziente prima della procedura chirurgica.
3. Il chirurgo esegue una resezione del colon in standla moda ard. Una volta che il colon è stato rimosso dal paziente, il campione viene immediatamente portata patologia. 0,5 nella sezione a tutto spessore della parete del colon non necessario per la valutazione patologica è previsto ed è subito posizionato sulla PBS freddo. Questo esemplare non dovrebbe includere il mesentere colon, e appendici premistoppa deve essere rimosso e, dal momento che la presenza di grasso influenzerà il processo di digestione.

2. Denudare Cellule epiteliali

1. Incubare tutto il colon topo in 25 ml di EDTA 5 mM in HBSS (temperatura ambiente) in una provetta conica da 50 ml. Posizionare il tubo conico in C agitazione bagno aria 37 ° (250 rpm) per 15 minuti. Dopo 15 min, versare con cura il liquido e riempire il tubo con 25 ml di EDTA 5 mM, ripetere per un totale di 5 lavaggi. Per colon umano, dopo aver ottenuto una striscia ½ centimetro di parete del colon dal patologo tagliare il colon con le forbici in quattro pezzi uguali dimensioni. Posizionare due dei pezzi in una provetta conica da 50 ml, ecollocare i restanti due pezzi di tessuto del colon in una provetta conica da 50 ml separata. Poi incubare con 25 ml di EDTA 5 mM in HBSS e effettuare lavaggi, come descritto sopra.
2. Sciacquare il colon due volte in 20 ml di PBS freddo.
3. Posizionare il colon tessuto topo in una nuova provetta da 50 ml contenente 20 ml di RPMI-5, 10 U di dispasi, e 2.000 U di collagenasi D (temperatura ambiente). Per il tessuto colon umano, usare il doppio della quantità di dispasi e collagenasi (20 U dispasi, 4.000 U collagenasi D).
4. Porre il tubo in un bagno di aria 37 ° C agitando orientato verticalmente (se posto orizzontalmente, c'è troppa aerazione e danno cellulare). Agitare a 250 rpm per un massimo di 60 min. Dopo l'esposizione al dispasi e collagenasi D, il tessuto colon inizierà a digerire e il tessuto colon inizierà a guardare filante. Questo richiede di solito circa 30 min. Quando il colon ha questo aspetto, rimuovere il colon dagli enzimi.
5. Agitare ogni provetta su e giù 2-4 volte a rompere il tessuto. PEllet tessuto a 200 xg in una centrifuga da tavolo (4 ° C) per 5 min. Versare con cautela il surnatante e gettarlo.

3. Isolamento miofibroblasti e cultura

1. Risospendere ogni pellet aggiungendo 10 ml di tampone di lisi ACK (47 ° C). Centrifugare nuovamente a 200 xg per 5 min (4 ° C), versare fuori e scartare il surnatante.
2. Risospendere ogni pellet aggiungendo 10 ml RPMI-5 con una pipetta.
3. Passare metà della sospensione cellulare (5 ml) attraverso un colino a maglie 70 micron con una pipetta 10 ml in un piatto TC-trattati 100 mm. Quindi aggiungere altri 15 ml di RPMI-5. Ripetere con i rimanenti 5 ml di sospensione cellulare in da 100 mm piatto TC-trattati differente. Un colon mouse quindi produrrà due 100 millimetri piatti TC-trattati. Una striscia di ½ pollice di tessuto del colon umano produrrà un totale di quattro piatti TC-trattata da 100 mm.
4. Porre la cultura piatti di tessuto in un incubatore CO ₂ del 10% a 37 ° C. Le condizioni di coltura sono le stesse fo il mouse e cellule primarie umane.
5. Dopo 3 ore, lavare delicatamente le cellule non aderenti, con due cambi di HBSS. Il galleggiamento detriti dovrebbe essere lavato delicatamente. Cellule aderenti sono composti da cellule epiteliali, macrofagi e miofibroblasti. Una settimana dopo la semina, miofibroblasti solo dividere, macrofagi e cellule epiteliali senesce dopo il primo passaggio. Aggiungere fresco RPMI-5 e crescere le cellule in coltura cellulare.
6. Le cellule sono diversi passaggi per tripsinizzazione per 5 minuti e sono divisi 2:1.

Abbreviazioni

HBSS: soluzione salina bilanciata di Hank; RPMI-5: Roswell Park Memorial Institute media; ACK: ammonio-cloruro-potassio; FCS: siero fetale di vitello; TC-trattati: la cultura tessuto trattato

Soluzioni

Tampone di lisi ACK - (4.15 g di NH ₄ Cl, 0,5 g KHCO _3, 18,6 mg Na ₂ EDTA, 400 ml H ₂ O, aggiustare il pH a 7,2-7,4 con 1 N HCl). Filtro sterilizzabilee attraverso un filtro 0,2 micron e conservare a 4 ° C. RPMI-5 - (per fare 500 ml: 454,5 ml RPMI, 25 ml FCS, 5 ml di 200 mM L-glutammina, 5 ml di 1 M HEPES, pH 7,4, 5 ml 100 mM sodio piruvato, 5 ml 100x Pen-Strep, 500 ml di 50 mM B-ME in PBS).

Representative Results

Una volta isolato, miofibroblasti umani primari possono essere coltivate in coltura cellulare ed utilizzati per un numero limitato di passaggi (fino a passaggio 4). Queste cellule sono caratterizzate come un liscio-actina muscolare e vimentina positivo, e desmin-negativi (Figura 1A), in linea con intestinali myofibroblasts subepiteliali ^5,7. Essi hanno anche una caratteristica stellato morfologia (Figura 1B). Miofibroblasti primari possono poi essere utilizzati per confermare i risultati sperimentali individuate in una linea cellulare. Questo approccio è stato utilizzato per dimostrare che la citochina pro-infiammatoria TNF-α (10 ng / ml) ha indotto la sovraregolazione di espressione del recettore EGF e segnalamento in queste cellule ^7. Espressione del recettore EGF sovraregolati e la segnalazione è stato inizialmente trovato utilizzando il già citato colon linea cellulare umana myofibroblast 18Co (Figura 2). Nella Figura 2A, dimostriamo che l'esposizione di cellule 18Co a TNF-45; portato ad un aumento tempo-dipendente dell'espressione del recettore EGF. Questo correlata con una maggiore COX-2 indotta da EGF e p42/44 fosforilazione di MAPK in queste cellule (Figura 2B). Per convalidare questi risultati sperimentali, gli esperimenti sono stati ripetuti utilizzando miofibroblasti umani primari isolati da colon chirurgicamente asportato dei pazienti con tumore del colon-retto. Come mostrato nella Figura 2C e 2D, miofibroblasti umani primari strettamente imitare le risultanze sperimentali inizialmente identificate nella linea cellulare 18Co ^7.

Figura 1. Miofibroblasti primari possono essere isolati dal tessuto del colon umano ^7. Cellule primarie isolate mostrano un fenotipo myofibroblast-like che sono costantemente a-SMA e vimentina positivo (Figura 1A) e presentano una morfologia stellata (

Figura 2. Risultati sperimentali in una linea cellulare sono avvalorate utilizzando cellule primarie umane myofibroblast ^7. La linea cellulare miofibroblasti colon umano 18Co è stato usato per dimostrare che il TNF-α induce la sovraregolazione di espressione del recettore EGF e segnalazione in queste cellule (Figura 2A). Questo upregulation dell'espressione del recettore EGF è stato associato con segnale del recettore EGF maggiore, mostrato in Figura 2B, in cui una successiva esposizione alla EGF ha portato ad una maggiore p42/44 fosforilazione MAPK e COX-2. Questi effetti sono stati completamente inibita con l'inibitore del recettore EGF AG1478. Miofibroblasti umani primari isolati da colon chirurgicamente asportato dei pazienti con tumore del colon-retto confermano questi risultati sperimentali (Figure 2Ce 2D). Tumor Necrosis Factor-alfa = TNF-α, EGFR = recettore EGF, AG = AG1478, COX-2 = ciclo-ossigenasi-2. Clicca qui per ingrandire la figura.

Figura 3. Miofibroblasti primari possono essere isolati dal colon tessuto mouse. Una vista 10X di cellule myofibroblast topo primarie. Clicca qui per ingrandire la figura.

Discussion

La tecnica generale è simile usando il mouse o colon umano. Questa tecnica può essere utilizzata per isolare miofibroblasti dal piccolo intestino. I dettagli specifici per l'isolamento dei miofibroblasti da 1. mouse e 2. colon umano sono discussi di seguito.

1. Topo Colon

Irrigazione del colon mouse viene facilitata collegando un 4, 16 G Popper ago smussato-end a un'estremità del colon. Questo aiuta anche durante il taglio del colon longitudinalmente. È possibile FISARMONICA il tessuto colon l'ago, poi mettere una punta della forbice con la punta e far scorrere il tessuto del colon oltre il bordo forbice durante il taglio per aprirla longitudinalmente.

Nel passo 2.1, è importante capire che il materiale nucleare da cellule morte può portare alla aggregazione delle cellule. L'aggiunta di DNasi (50 mg / ml) può essere utilizzato per affrontare questo problema.

La fase più critica è passo 2.4. Tenere un caorologio Reful del tessuto colon. Quando il colon comincia a guardare filante, rimuovere il colon dagli enzimi. Non c'è bisogno di incubare il colon per l'intero 60 min. Se il tessuto del colon è esposto al dispasi e collagenasi D per troppo tempo, le cellule muoiono. Questo è un errore comune che si tradurrà in una resa di cellule basso.

La contaminazione delle cellule è un altro problema comune. Una tecnica accurata, lavaggio appropriato e filtraggio ridurrà al minimo il rischio di contaminazione, con tecniche sterili standard utilizzati per il lavoro coltura cellulare.

2. Colon umano

La lunghezza del tempo per incubazione con gli enzimi dipende dalle dimensioni del campione che viene digerito. Noi di solito riceviamo una striscia di spessore pieno ½ centimetro di parete del colon umano. C'è un cambiamento nel passo 2.3 quando isolando miofibroblasti dal tessuto del colon umano. Per la fase 2.3, per colon umano è necessario raddoppiare la quantità di dispasi (20 U) e collagenase D (4000 U) utilizzato. Un segmento ancora più grande del colon richiederà un tempo di incubazione più lungo. Inoltre, tenete a mente che l'attività specifica degli enzimi può variare con un sacco, quindi potrebbe essere necessario regolare il tempo di incubazione di conseguenza.

Per entrambi il mouse primario e miofibroblasti umani, 0nce cresciuti in coltura, le cellule isolate dovrebbero essere valutati per valutare la purezza delle cellule e per confermare che le cellule sono myofibroblast-like. Questo può essere fatto con una varietà di tecniche tra cui la colorazione immunoistochimica (anticorpi miofibroblasti marcatori includono un liscio-actina muscolare e vimentina; anticorpo monoclonale CD68 è specifico di macrofagi, CD31 è specifico alle cellule endoteliali, e CD45 è specifico per le cellule immunitarie; anticorpi anti-E-caderina e varie citocheratine sono specifici per le cellule epiteliali. espressione mRNA può essere valutata mediante RT-PCR ^12. citometria a flusso può essere utilizzato anche per l'analisi delle cellule ^13.

in vitro e co-coltura sperimentazione. Cellule primarie possono anche essere impiantati nel tessuto sottocutaneo di topi per studiare le interazioni cellula-cellula ^14. Le future applicazioni possono riguardare re-impianto di miofibroblasti primari nella parete del colon di un mouse singenico utilizzando il mouse colonscopia seguente manipolazione genetica.

Un certo numero di metodi alternativi per isolare myofibroblasts primarie da uomo e topo colon sono stati anche descritti. Due sono elencati di seguito:

1. Mahida, et al. Am. J. Physiol. 273 G1341-1348, (1997).
2. De Wever, et al. Int. J. Oncol. 39, 393-400, (2011).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Dispase I	Invitrogen/GIBCO	#17105-041
Collagenase D	Roche	#1 088 858
4 in, 16 G Popper blunt-end needle	Fisher	#14-825-16K