Isolering av primær myofibroblasts fra Mouse and Human Colon Tissue

Summary

Den myofibroblast er en innflytelsesrik stromal celle i mage-tarmkanalen som regulerer viktige fysiologiske prosesser i både normal og sykdomstilstander. Vi beskriver en teknikk som gjør det mulig for isolering av primære myofibroblasts fra både mus og human colon vev, noe som kan benyttes for in vitro-eksperimenter.

Abstract

Den myofibroblast er et stromal celle i gastrointestinale (GI)-tarmkanalen som er blitt stadig mer betydelig oppmerksomhet for sin kritisk rolle i mange gastrointestinale funksjoner. Mens flere myofibroblast cellelinjer som er kommersielt tilgjengelig for å studere disse cellene in vitro, forskningsresultater fra en cellelinje som utsettes for eksperimentelle cellekulturbetingelser har iboende begrensninger på grunn av den altfor reductionist arbeidets art. Bruk av primær myofibroblasts tilbyr en stor fordel når det gjelder å bekrefte eksperimentelle funn identifisert i en cellelinje. Isolering av primære myofibroblasts fra en dyremodell gjør det mulig for studiet av myofibroblasts under betingelser som nærmere etterligner den sykdomstilstand som blir studert. Isolering av primær myofibroblasts fra menneskets tykktarm vev gir uten tvil de mest relevante eksperimentelle data, siden cellene kommer direkte fra pasienter med underliggende sykdom. Vi beskriver en veletablert teknikk som kan være utilized å isolere primære myofibroblasts fra både mus og menneskets tykktarm vev. Disse isolerte celler har blitt karakterisert til å være alfa-glattmuskel-aktin-og vimentin-positive og desmin-negative, i overensstemmelse med subepithelial tarm myofibroblasts. Primære myofibroblast celler kan dyrkes i cellekultur, og som brukes for eksperimentelle formål enn et begrenset antall passasjer.

Introduction

Reguleringen av gastrointestinal (GI) tarmkanalen funksjon involverer komplekse, dynamiske samspillet mellom slimhinnen og dens underliggende mesenchyme. Disse interaksjonene er normalt å opprettholde homeostase, men kan også føre til utvikling av sykdomstilstander i henhold patologiske tilstander ^en. Myofibroblasts er en undergruppe av stromale celler lokalisert underliggende til epitellaget som kommuniserer på en paracrine mote med omkringliggende cellepopulasjoner for å regulere en rekke kritiske GI veis prosesser som inkluderer slimhinne gjenfødelse, reparasjon, og fibrose ^to.

Den 18Co-cellelinjen er et eksempel på en human colonic myofibroblast cellelinje som har blitt mye brukt for å studere myofibroblast funksjon fordi den deler mange av egenskapene til primær in situ myofibroblasts. Disse inkluderer protein ekspresjon av a-glattmuskel-aktin (α-SMA) og vimentin, så vel som ekspresjon av en rekkeav celleoverflatereseptorer som for eksempel epidermal vekstfaktor-reseptor, eller reseptorer for lysofosfatidisk syre ^3,4. På grunn av disse delte ultrastrukturelle karakteristika, så vel som likheter i biologiske funksjonen ^5, har 18Co-cellelinjen blitt brukt i stor utstrekning for å studere myofibroblast funksjon i sammenheng med mange sykdomstilstander slik som inflammatorisk tarmsykdom eller kolorektal kreft ^3,6. Det er imidlertid iboende begrensninger og problemer ved bruk av en cellelinje. Disse omfatter genotypisk ustabilitet over tid som skiller cellelinjer fra primære celler, forandre fenotypen og biologiske funksjonen av cellen, inkludert vekstrater og interaksjoner med andre cellepopulasjoner. Cellelinjer som mangler også de vanlige komponenter i GI mikromiljøet (epitelial, stromal og vaskulære komponenter), som er en viktig begrensning for bruken. Derfor konklusjonene fra eksperimentelle cellelinje forskning krever ytterligere validering for å redusere risk av feiltolkning.

Primære myofibroblasts kan fås fra mennesker og mus kolon vev for å bekrefte eksperimentelle funn identifisert i en cellelinje ^7. Metoden ble opprinnelig beskrevet av Mahida, et al. ^Åtte, og vår protokoll er en av mange vel-beskrevne teknikker som kan brukes til å isolere primære myofibroblasts fra mus og human tykktarm ^9. For noen mus modell sykdom i kolon, kan denne teknikken brukes til å isolere primære myofibroblasts å studere hvordan de samhandler med nabocellene eller bidra til både normal eller patologisk GI prosesser ^10,11. Denne teknikken kan brukes til å studere hvordan myofibroblasts bidrar til slimhinnetilheling, fibrose, og utvikling av kolorektal adenom og karsinom. Primære myofibroblasts kan også fås fra humant colon vev som er fjernet, ved tidspunktet for operasjonen for godartet (inflammatorisk tarmsykdom, strikturer, divertikulitt) eller ondartet conditions. Isolerte primære celler fra menneske og mus colon vev kan dyrkes i cellekultur og benyttet over et begrenset antall passasjer.

Protocol

En. Skaffe Colon Tissue

Mus

En protokoll for å utføre dyreforsøk, detaljering begrunnelsen og målene for forskning, ble levert og godkjent av vår institusjonelle Office of Animal Forskning Sight.

1. Avlive mus med inhalert isofluran fulgt ved halshugging.
2. Lag en ventral midtlinjesnitt trekke tynntarmen bort og identifisere tykktarmen. Trekk blære og livmor (hvis den finnes) lateralt og identifisere skambenet og skjær den med fine saks for å eksponere endetarmen.
3. Dissekere rygg mesenteriet av endetarmen ut av kolon og mobilisere tykktarmen fra anus til cecum, og transekt det å koble kolon fra tynntarmen.
4. Plasser prøven i iskaldt fosfatbufret saltvann (PBS).
5. Fyll en 10 ml sprøyte med iskald PBS og skylle tarmen lumen flere ganger for å fjerne innholdet, deretter kutte kolon open lengde-messig med saks.
6. Plasser kolon i en 50 ml konisk tube som inneholder 20 ml iskald PBS. Tykktarmen behøver ikke å være plassert i en bestemt retning. Vask kolon ved å erstatte PBS inntil væsken er klar uten partikler.

Menneskelig

En protokoll for å oppnå menneskelig vev fra kirurgiske pasienter, detaljering viktigheten av å innhente denne vev samt en vurdering av potensiell risiko og fordeler, ble levert og godkjent av vår institusjonelle Office of Human Forskning Protection Program.

1. Forskningssamarbeid med en kolorektal kirurg er nødvendig for å kunne oppnå menneskelig vev for din forskning. En protokoll for å få menneskets tykktarm vev skal være levert og godkjent av en institusjonell gjennomgang bord.
2. Skriftlig informert samtykke er innhentet fra pasienten før den kirurgiske prosedyren.
3. Kirurgen vil utføre et kolon reseksjon i stativetard mote. Når tykktarmen er fjernet fra pasienten, blir prøven øyeblikkelig til patologi. En 0,5 i full tykkelse delen av kolon veggen ikke er nødvendig for den patologiske evalueringen er gitt og er umiddelbart plassert på iskald PBS. Dette eksemplaret bør ikke inneholde kolon mesentery, og Kjertel vedheng bør fjernes også, siden tilstedeværelsen av fett vil påvirke fordøyelsen.

2. Denude Epitelceller

1. Inkuber hele muse kolon i 25 ml av 5 mM EDTA i HBSS (romtemperatur) i et 50 ml konisk rør. Plasser konisk rør i en 37 ° C riste luft-bad (250 rpm) i 15 min. Etter 15 minutter, forsiktig helle ut væsken og fylle røret med 25 ml av 5 mM EDTA, gjenta for en total av 5 vaskinger. For menneskets tykktarm, etter å ha innhentet en ½ tommers stripe av kolon veggen fra patologen kuttet i tykktarmen med saks i fire like store biter. Plasser to av bitene i en 50 ml konisk tube, ogplassere de to gjenværende delene av kolon vevet inn i en separat 50 ml konisk rør. Deretter inkuberes med 25 ml av 5 mM EDTA i HBSS og utføre vaskinger, som beskrevet ovenfor.
2. Skyll kolon to ganger i 20 ml iskald PBS.
3. Sett muse colon vev i en ny 50 ml konisk rør inneholdende 20 ml RPMI-5, 10 U av dispase, og 2000 U av kollagenase D (romtemperatur). For human colon vev, bruker dobbelt så mye av dispase og kollagenase (20 U dispase, 4000 U kollagenase D).
4. Plasser røret på en 37 ° C riste luft bad orientert vertikalt (Hvis plassert horisontalt, er det for mye lufting og celleskade). Rist ved 250 rpm i opp til 60 min. Etter eksponering i dispase og kollagenase D, vil tykktarmen vev begynner å fordøye og tykktarmen vev vil begynne å se trevlet. Dette tar vanligvis rundt 30 min. Når tykktarmen har dette utseendet, fjerne tykktarmen fra enzymer.
5. Rist hvert rør opp og ned 2-4 ganger for å bryte opp vevet. Pellet vevet ved 200 xg i en bordsentrifuge (4 ° C) i 5 min. Hell forsiktig av supernatanten og kast.

Tre. Myofibroblast Isolasjon og kultur

1. Resuspender hver pellet ved å tilsette 10 ml ACK lyseringsbuffer (47 ° C). Sentrifuger på nytt ved 200 xg i 5 minutter (4 ° C), helles av og kast supernatant.
2. Resuspender hver pellet ved tilsetning av 10 ml RPMI-5 med en pipette.
3. Passerer halvparten av cellesuspensjonen (5 ml) gjennom en 70 um mesh sil ved hjelp av en 10 ml pipette inn i en 100 mm TC-behandlet form. Deretter legger ytterligere 15 ml RPMI-5. Gjenta med de resterende 5 ml av cellesuspensjonen inn i en annen 100 mm TC-behandlet form. En mus kolon vil derfor kunne levere to 100 mm TC-behandlet retter. Ett? Tommer stripe av human colon vev vil gi en total på fire 100 mm-TC-behandlede retter.
4. Plasser Vevdyrkningsskåler i en 10% _CO2 inkubator ved 37 ° C. Forholdene er de samme kultur feller mus-og humane primære celler.
5. Etter tre timer, forsiktig vaske av ikke-heftende celler med to endringer av HBSS. Den flyvende bør vaskes forsiktig av. Festede celler sammensatt av epitelceller, makrofager og myofibroblasts. En uke etter såing, myofibroblasts bare dele, makrofager og epitelceller senesce etter første passering. Legg frisk RPMI-5 og dyrke cellene i cellekultur.
6. Celler blir passaged ved trypsinering i 5 min, og er splittet 2:01.

Forkortelser

HBSS Hank 's balanserte saltløsning, RPMI-5: Roswell Park Memorial Institute medier; ACK: Ammonium-klorid-kalium; FCS: føtalt kalveserum, TC-behandlet: vevskultur behandlede

Solutions

ACK lysis buffer - (4,15 g _NH4Cl, 0,5 g KHCO _3, 18,6 mg Na ₂ EDTA, 400 ml _H2O, juster pH til 7,2 til 7,4 med 1 N HCl). Filter sterilisering foretase gjennom et 0,2 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C. RPMI-5 - (for å gjøre 500 ml: 454,5 ml RPMI, 25 ml FCS, 5 ml 200 mM L-glutamin, 5 ml 1 M HEPES, pH 7,4, 5 ml 100 mM natrium-pyruvat, 5 ml 100x Pen-Strep, 500 ml 50 mM B-ME i PBS).

Representative Results

Når isolert, kan primære humane myofibroblasts dyrkes i cellekultur, og brukes over et begrenset antall passasjer (opp til passasjen 4). Disse cellene er karakterisert som å være et-glatt muskel aktin og vimentin positive og desmin-negative (figur 1A), i samsvar med intestinal subepithelial myofibroblasts ^5,7. De har også en karakteristisk stel morfologi (Figur 1B). Primære myofibroblasts kan deretter brukes for å bekrefte eksperimentelle funnene som er identifisert i en cellelinje. Denne fremgangsmåten ble anvendt for å demonstrere at den pro-inflammatorisk cytokin TNF-α (10 ng / ml) indusert oppregulering av EGF-reseptor-ekspresjon, og signalering i disse cellene ^7. Oppregulert EGF reseptor ekspresjon og signalene ble opprinnelig funnet å utnytte den tidligere nevnte human colonic myofibroblast 18Co-cellelinjen (Figur 2). I figur 2A, vi viser at eksponering av 18Co celler til TNF-45, førte til en tidsavhengig økning i EGF-reseptor ekspresjon. Dette korrelerte med forbedret EGF-indusert COX-2 ekspresjon og p42/44 MAPK fosforylering i disse cellene (figur 2B). For å validere disse eksperimentelle funnene, ble eksperimenter gjentas med primære humane myofibroblasts isolert fra kirurgisk reseksjon kolon av pasienter med tykktarmskreft. Som vist i figur 2C og 2D, primære humane myofibroblasts tett etterligne de eksperimentelle funn opprinnelig identifisert i 18Co-cellelinjen ^7..

Figur 1. Primære myofibroblasts kan isoleres fra menneskets tykktarm vev ^7. Isolerte primære celler demonstrere en myofibroblast lignende fenotype som er konsekvent a-SMA og vimentin positive (figur 1A) og demonstrere en stel morfologi (

Figur 2. Eksperimentelle funn i en cellelinje er bygges ved primære humane myofibroblast celler ^7. Den human colonic myofibroblast 18Co-cellelinjen ble anvendt for å demonstrere at TNF-α induserer oppregulering av EGF-reseptor ekspresjon og signalene i disse celler (figur 2A). Denne oppregulering av EGF-reseptor-ekspresjon var forbundet med forbedret EGF-reseptor-signalering, er vist i figur 2B, hvor påfølgende eksponering for EGF førte til forbedret p42/44 MAPK fosforylering og COX-2 ekspresjon. Disse effektene ble helt hemmet med EGF reseptor hemmer AG1478. Primære humane myofibroblasts isolert fra kirurgisk reseksjon kolon av pasienter med kolorektal kreft bekrefte disse eksperimentelle funnene (Tall 2Cog 2D). Tumor nekrose faktor-alfa = TNF-α, EGFR = EGF reseptor, AG = AG1478, COX-2 = cyklooksygenase-2. Klikk her for å se større figur.

Figur 3. Primære myofibroblasts kan isoleres fra mus colon vev. En 10X visning av primære muse myofibroblast celler. Klikk her for å se større figur.

Discussion

Den generelle teknikken er lik når du bruker enten mus eller menneskets tykktarm. Denne teknikken kan også brukes til å isolere myofibroblasts fra tynntarmen. Spesifikke detaljer for isolering av myofibroblasts fra en. mus og 2.. menneskets tykktarm er omtalt nedenfor.

En. Mus Colon

Vanning av muse colon lettes ved å feste en 4 i, 16 G Popper butt-ende-nål til den ene enden av tykktarmen. Dette hjelper også når du skjærer tykktarmen på langs. Du kan trekkspill kolon vev på nålen, deretter plassere ett tips av sakse med den spisse enden opp og skyv kolon vev over sakse kanten mens kutte for å åpne den på langs.

I trinn 2.1, er det viktig å forstå at kjernematerialet fra døde celler kan føre til celleklumpdannelse. Tilsetningen av DNase (50 mg / ml) anvendes for å løse dette problem.

Den mest kritiske trinnet er steg 2,4. Hold en caReful watch av kolon vev. Når tykktarmen begynner å se trevlet, fjerne tykktarmen fra enzymer. Du trenger ikke å ruge tykktarmen for hele 60 min. Dersom tykktarmen vevet er utsatt for dispase og kollagenase D for lenge, vil cellene dør. Dette er en vanlig feil som vil resultere i en lav celleutbytte.

Kontaminering av cellene er et annet vanlig problem. Forsiktig teknikk, passende vasking og filtrering vil minimalisere risikoen for forurensning, sammen med vanlige sterile teknikker som benyttes for celledyrking arbeid.

2. Menneskelig Colon

Lengden av tiden for inkubasjon med enzymer er avhengig av størrelsen av prøven som blir fordøyd. Vi får vanligvis en ½ tommers full tykkelse stripe av menneskets tykktarm veggen. Det er en modifikasjon i trinn 2.3 ved å isolere myofibroblasts fra human tykktarm vev. For trinn 2.3, for menneskets tykktarm må du doble mengden av dispase (20 U) og collagenase D (4000 U) som brukes. En enda større segment av kolon vil kreve en lengre inkubasjonstid. Også huske på at den spesifikke aktiviteten til enzymer kan variere med masse, så du må kanskje justere inkubasjonstid tilsvarende.

For både primære mus og menneske myofibroblasts, 0nce dyrket i kultur, de isolerte celler bør evalueres for å vurdere for renhet av cellene og for å bekrefte at cellene er myofibroblast-aktig. Dette kan gjøres med en rekke teknikk inkludert immunhistokjemisk farging (antistoffer mot myofibroblast markører inkluderer a-glattmuskel-aktin-og vimentin, monoklonalt antistoff mot CD68 er spesifikk for makrofager, er CD31 spesifikt til endotelceller, og CD45 er spesifikt for immunceller; antistoff mot E-cadherin og forskjellige cytokeratins er spesifikke for epitelceller. mRNA-ekspresjon kan også bli vurdert ved RT-PCR ^12. Strømningscytometri kan også brukes for celleanalyse ^13..

in vitro og co-kultur eksperimentering. Primære celler kan bli implantert inn i det subkutane vev på mus for å studere celle-celle interaksjoner ^14. Fremtidige søknader kan medføre re-implantasjon av primær myofibroblasts inn i tarmveggen av en syngene mus benytte mus koloskopi etter genetisk manipulasjon.

En rekke alternative fremgangsmåter for å isolere primære myofibroblasts fra menneske og mus colon er også beskrevet. To er listet nedenfor:

1. Mahida, et al. Am. J. Physiol. 273 G1341-1348, (1997).
2. De Wever, et al. Int. J. Oncol. 39, 393-400, (2011).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Dispase I	Invitrogen/GIBCO	#17105-041
Collagenase D	Roche	#1 088 858
4 in, 16 G Popper blunt-end needle	Fisher	#14-825-16K