Isolering av primära Myofibroblaster från mus och Human Colon Tissue

Summary

Den myofibroblast är en inflytelserik stromal cell i mag-tarmkanalen som reglerar viktiga fysiologiska processer i både normala och sjukdomstillstånd. Vi beskriver en teknik som möjliggör för isolering av primära myofibroblaster från både mus och human kolonvävnad, som kan användas för in vitro-experiment.

Abstract

Den myofibroblast är en stromal cell i gastrointestinala (GI) tarmkanalen som har vunnit stor uppmärksamhet för sin avgörande roll i många GI funktioner. Medan flera myofibroblast cellinjer är kommersiellt tillgängliga för att studera dessa celler in vitro, forskningsresultat från en cellinje utsätts för experimentella cellodlingsförhållanden har inneboende begränsningar på grund av den alltför reduktionistiska arbetets art. Användning av primära myofibroblaster ger en stor fördel när det gäller att bekräfta experimentella upptäckter i en cellinje. Isolering av primära myofibroblaster från en djurmodell möjliggör studiet av myofibroblaster under betingelser som närmare efterliknar sjukdomstillståndet som studeras. Isolering av primära myofibroblaster från human kolonvävnad ger utan tvekan den mest relevanta försöksdata, eftersom cellerna kommer direkt från patienter med den underliggande sjukdomen. Vi beskriver en väletablerad teknik som kan vara utilized att isolera primära myofibroblaster från både mus och human kolonvävnad. Dessa isolerade celler har karakteriserats som alfa-glatt muskulatur aktin och vimentin-positiva, och desmin-negativ, i linje med subepitelial tarm myofibroblaster. Primära myofibroblast celler kan odlas i cellkultur och som används för försöksändamål under ett begränsat antal passager.

Introduction

Regleringen av gastrointestinala (GI) tarmfunktionen innefattar komplexa, dynamiska interaktioner mellan slemhinneskiktet och dess underliggande mesenkym. Dessa interaktioner normalt tjänar till att upprätthålla homeostas, men kan också leda till utveckling av sjukdomstillstånd i patologiska tillstånd ^1. Myofibroblaster är en subpopulation av stromaceller belägna underliggande till epitelskiktet att kommunicera på ett parakrint sätt med omgivande cellpopulationer för att reglera ett antal kritiska GI vägarna processer som inkluderar mucosal regeneration, reparation, och fibros ^2.

Den 18Co cellinje är ett exempel på en människa kolon myofibroblast cellinje som har använts i stor utsträckning för att studera myofibroblast funktion eftersom den delar många av de egenskaper hos primära i situ myofibroblaster. Dessa innefattar det protein expression av a-aktin i glatt muskulatur (α-SMA), och vimentin, såväl som expression av ett antalav cellytreceptorer såsom epidermal tillväxtfaktorreceptor, eller receptorer för lysofosfatidsyra ^3,4. På grund av dessa delade ultrastrukturella egenskaper, såväl som likheter i biologiska funktion ⁵ har 18Co cellinjen använts i stor utsträckning för att studera myofibroblast funktion i samband med många sjukdomstillstånd, såsom inflammatorisk tarmsjukdom eller kolorektal cancer ^3,6. Det finns emellertid inneboende begränsningar och problem vid användning av en cellinje. Dessa inkluderar genotypisk instabilitet över tiden som skiljer cellinjer från primära celler, ändra fenotyp och biologiska funktion i cellen, inklusive tillväxt och interaktioner med andra cellpopulationer. Cellinjer som saknar också de normala komponenterna i GI mikromiljö (epitelial, stromal och vaskulära komponenter), vilket är en stor begränsning för dess användning. Därför är slutsatserna från experimentell cellinje forskning kräver ytterligare validering för att minska risk för feltolkningar.

Primära myofibroblaster kan erhållas från människa och mus kolonvävnad att bekräfta experimentella upptäckter i en cellinje ^7. Förfarandet beskrevs ursprungligen av Mahida et al. ^Åtta, och våra protokoll är en av många väl beskrivna tekniker som kan användas för att isolera primära myofibroblaster från mus och human kolon ^9. För varje musmodell av kolon sjukdom, kan denna teknik användas för att isolera primära myofibroblaster att studera hur de interagerar med angränsande celler eller bidra till både normal eller patologisk GI processer ^10,11. Denna teknik kan användas för att studera hur myofibroblaster bidrar till slemhinneläkning, fibros, och utvecklingen av kolorektala adenom och karcinom. Primära myofibroblaster kan även erhållas från human kolonvävnad som har opererande vid tiden för operation för benign (inflammatorisk tarmsjukdom, strikturer, divertikulit) eller elakartad c.ILLKOR. Isolerade primära celler från människa och mus kolonvävnad kan odlas i cellkultur och utnyttjas under ett begränsat antal passager.

Protocol

1. Erhåll Kolon Vävnad

Mus

Ett protokoll för att utföra djurförsök, med uppgifter om motiv och mål för forskningen, lämnades in och godkänts av vår institutionella Office of Animal Research Oversight.

1. Euthanize musen med inhalerade isofluran följt av halsdislokation.
2. Gör en ventrala mittlinjen snitt, dra tunntarmen bort och identifiera kolon. Dra urinblåsan och livmodern (om den finns) i sidled och identifiera blygdbenet och skär den med fina sax för att exponera ändtarmen.
3. Dissekera rygg tarmkäx av ändtarmen bort av tjocktarmen och mobilisera kolon från anus till blindtarmen, och transekt det att koppla bort tjocktarmen från tunntarmen.
4. Placera provet i iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
5. Fyll en 10 ml spruta med iskall PBS och spola kolon lumen flera gånger för att tömma innehållet, klipp av kolon open på längden med hjälp av en sax.
6. Placera kolon i ett 50 ml koniskt rör innehållande 20 ml iskall PBS. Tjocktarmen behöver inte placeras i någon speciell orientering. Tvätta kolon genom att ersätta PBS tills vätskan är klar utan partikelformigt material.

Humant

Ett protokoll för att få mänsklig vävnad från kirurgiska patienter, med uppgifter om vikten av att få denna vävnad samt en bedömning av potentiella risker och fördelar, lämnades in och godkänts av vår institutionella Kontor av den mänskliga forsknings Protection Program.

1. Forskningssamarbete med en kolorektal kirurg är nödvändigt för att kunna få mänsklig vävnad för din forskning. Ett protokoll för att erhålla human kolonvävnad ska lämnas in och godkännas av din granskningsnämnder.
2. Skriftligt informerat samtycke har erhållits från patienten före det kirurgiska ingreppet.
3. Kirurgen kommer att utföra ett kolon resektion i monternard mode. När tjocktarmen har tagits bort från patienten, är provet omedelbart till patologi. En 0,5 i full tjocklek avsnitt av kolonväggen som inte behövs för den patologiska utvärderingen tillhandahålls och placeras omedelbart i iskall PBS. Detta exemplar får inte innehålla kolon krös, och Stoppningar bihang bör tas bort också, eftersom förekomsten av fett påverkar rötningsprocessen.

2. Beröva epitelceller

1. Inkubera hela musen kolon i 25 ml 5 mM EDTA i HBSS (rumstemperatur) i en 50 ml koniska rör. Placera det koniska röret i ett 37 ° C skakande luftbadet (250 rpm) under 15 min. Efter 15 min, häll försiktigt ut vätskan och fyll röret med 25 ml av 5 mM EDTA, upprepa för totalt fem tvättar. För den mänskliga kolon, efter en ½ tums remsa av kolonväggen från patologen skära tjocktarmen med en sax i fyra lika stora bitar. Placera två av bitarna i ett 50 ml koniskt rör, ochplacera de återstående två bitarna av kolon vävnad in i en separat 50 ml koniska rör. Därefter inkubera med 25 ml av 5 mM EDTA i HBSS och utför tvättningar, såsom beskrivits ovan.
2. Skölj kolon två gånger i 20 ml iskall PBS.
3. Placera musen kolonvävnad i ett nytt 50 ml koniskt rör innehållande 20 ml av RPMI-5, 10 U av dispas, och 2000 U av kollagenas D (rumstemperatur). För den mänskliga kolon vävnad, använder dubbelt så mycket dispas och kollagenas (20 U dispas, 4,000 U kollagenas D).
4. Placera röret i ett 37 ° C skakande luften bad orienterad vertikalt (Om de är placerade horisontellt, det är för mycket luftning och cellskador). Skaka vid 250 varv per minut under upp till 60 min. Efter exponering för den dispas och kollagenas D kommer kolon vävnad börjar att smälta och kolonvävnad kommer att börja titta trådiga. Det tar vanligtvis cirka 30 minuter. När tjocktarmen har detta utseende, ta bort tjocktarmen från enzymerna.
5. Skaka varje rör upp och ned 2-4 gånger för att bryta upp vävnaden. Pellet vävnaden vid 200 x g i en bordscentrifug (4 ° C) under 5 min. Häll försiktigt av vätskan och kasta.

3. Myofibroblast Isolering och kultur

1. Återsuspendera varje pellet genom att tillsätta 10 ml ACK-lyseringsbuffert (47 ° C). Centrifugera igen vid 200 xg under 5 min (4 ° C), häll bort och kassera supernatanten.
2. Resuspendera varje pellet genom att tillsätta 10 ml RPMI-5 med en pipett.
3. Passera halv av cellsuspensionen (5 ml) genom en 70 | am mesh sil med användning av en 10 ml pipett i en 100 mm TC-behandlade skålen. Tillsätt sedan ytterligare 15 ml av RPMI-5. Upprepa med de återstående 5 ml av cellsuspension i en annan 100 mm TC-behandlade skålen. En mus kolon kommer därför att ge två 100 mm TC-behandlad rätter. En ½ inch remsor av human kolonvävnad kommer att ge totalt fyra 100 mm-TC-behandlade rätter.
4. Placera vävnadsodlingsskålar i en 10% _{CO2-inkubator} vid 37 ° C. Odlingsbetingelserna är desamma feller mus och humana primära celler.
5. Efter 3 timmar, försiktigt tvätta bort icke-vidhäftande celler med två byten av HBSS. Skräpet flytande ska försiktigt tvättas bort. Vidhäftande celler är uppbyggda av epitelceller, makrofager och myofibroblaster. En vecka efter sådd, myofibroblasts bara klyftan, makrofager och epitelceller senesce efter första passagen. Lägg färsk RPMI-5 och odla cellerna i cellkultur.
6. Celler passerades genom trypsinering under 5 min och delas 2:01.

Förkortningar

HBSS: Hanks balanserade saltlösning, RPMI-5: Roswell Park Memorial Institute medium; ACK: Ammonium-Klorid-Potassium; FCS: fetalt kalvserum; TC-behandlade: vävnadsodlingsbehandlade

Lösningar

ACK-lyseringsbuffert - (4,15 g _NH4CI, 0,5 g _KHCO3, 18,6 mg _Na2EDTA, 400 ml _H2O, justera pH till 7,2 till 7,4 med 1 N HCl). Filtrera sterilize genom ett 0,2 pm filter och förvara vid 4 ° C. RPMI-5 - (för att göra 500 ml: 454,5 ml RPMI, 25 ml FCS, 5 ml 200 mM L-glutamin, 5 ml 1 M HEPES, pH 7,4, 5 ml 100 mM natriumpyruvat, 5 ml 100x Pen-Strep, 500 ml 50 mM B-ME i PBS).

Representative Results

När den väl isolerats kan primära humana myofibroblaster odlas i cellkultur och användas över ett begränsat antal passager (upp till passage 4). Dessa celler kännetecknas som en-glattmuskelaktin och vimentin positiv, och desmin-negativa (figur 1 A), i överensstämmelse med tarm subepitelial myofibroblaster ^5,7. De har också en karakteristisk stellate morfologi (Figur 1B). Primära myofibroblaster kan sedan användas för att bekräfta experimentella upptäckter i en cellinje. Detta tillvägagångssätt användes för att visa att den pro-inflammatoriska cytokinen TNF-α (10 ng / ml) inducerade uppregleringen av EGF-receptorexpression och signalering i dessa celler ^7. Uppregleras EGF-receptorexpression och signalering ursprungligen hittades med användning av tidigare nämnda humana kolon myofibroblast cellinje 18Co (Figur 2). I figur 2A visar vi att exponering av 18Co-celler till TNF-45, ledde till en tidsberoende ökning av EGF-receptorexpression. Detta korrelerade med förbättrad EGF-inducerad COX-2-uttryck och p42/44 MAPK-fosforylering i dessa celler (figur 2B). För att validera dessa experimentella fynd gjordes experiment upprepas med primära humana myofibroblaster isolerade från kirurgiskt opererande kolon av patienter med kolorektal cancer. Såsom visas i fig. 2C och 2D, primära humana myofibroblaster härma noga de experimentella resultat som först identifierades i 18Co cellinje ^7.

Figur 1. Primära myofibroblaster kan isoleras från human kolonvävnad ^7. Isolerade primära celler visar en myofibroblast-liknande fenotyp som är genomgående en-SMA och vimentin positiva (Figur 1A) och visa en stel morfologi (

Figur 2. Experimentella rön i en cellinje är underbyggda med hjälp av primära humana myofibroblast celler ^7. Den humana kolon myofibroblast cellinje 18Co användes för att visa att TNF-α inducerar uppreglering av EGF-receptorexpression och signalering i dessa celler (figur 2A). Denna uppreglering av EGF-receptorexpression var associerad med ökad EGF-receptorsignalering, som visas i fig. 2B, där efterföljande exponering för EGF ledde till förbättrad p42/44 MAPK-fosforylering och COX-2-uttryck. Dessa effekter var fullständigt inhiberad med EGF-receptorhämmare AG1478. Primära mänskliga myofibroblaster isolerade från kirurgiskt opererande kolon av patienter med kolorektal cancer bekräfta dessa experimentella fynd (figur 2Coch 2D). Tumörnekrosfaktor-alfa = TNF-α, EGFR = EGF-receptorn, AG = AG1478, COX-2 = cyklooxygenas-2. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3. Primära myofibroblaster kan isoleras från mus kolonvävnad. En 10X bild av primära mus myofibroblast celler. Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Den allmänna tekniken är liknande vid användning av antingen mus-eller human kolon. Denna teknik kan också användas för att isolera myofibroblaster från tunntarmen. Specifika detaljer för isolering av myofibroblaster från 1. mus och 2. mänskliga kolon diskuteras nedan.

1. Mouse Colon

Bevattning av mus-kolon underlättas genom att fästa en 4 in, 16 G Popper trubbig ände nålen till en ände av tjocktarmen. Detta hjälper också vid skärning kolon på längden. Du kan dragspel kolon vävnad på nålen, sedan placera en spets sax med spetsen uppåt och skjut kolonvävnad över sax kanten samtidigt minska för att öppna den på längden.

I steg 2.1, är det viktigt att förstå att kärnmaterial från döda celler kan leda till cellklumpning. Tillägget av DNas (50 mg / ml) får användas för att lösa detta problem.

Det mest kritiska steget är steg 2.4. Håll en cadå noga med klockan av kolonvävnaden. När tjocktarmen börjar se trådiga, ta bort tjocktarmen från enzymerna. Du behöver inte inkubera kolon för hela 60 minuter. Om kolon vävnaden utsätts för dispas och kollagenas D för länge, kommer cellerna dör. Detta är ett vanligt misstag som resulterar i en låg cell avkastning.

Kontamination av cellerna är ett annat vanligt problem. Noggrann teknik, lämplig tvättning och filtrering kommer att minimera risken för kontaminering, tillsammans med standardiserade sterila tekniker som används för cellodling arbete.

2. Human Colon

Den tid för inkubering med enzymerna beror på storleken av provet som håller på att smältas. Vi får oftast en ½ tums tjocklek remsa av mänsklig kolonväggen. Det är en modifiering i steg 2.3 när isolera myofibroblaster från human kolonvävnad. För steg 2,3, för human kolon du måste fördubbla mängden dispas (20 U) och collagenase D (4000 U) användas. En ännu större segment av tjocktarmen kommer att kräva en längre inkubationstid. Håll också i minnet att den specifika aktiviteten av enzymerna kan variera med massor, så du kan behöva justera inkubationstiden därefter.

För både primär mus och mänskliga myofibroblaster, 0nce odlas i kultur, de isolerade cellerna bör utvärderas för att bedöma om renhet av cellerna och för att bekräfta att cellerna är myofibroblast liknande. Detta kan göras med en mängd olika teknik inklusive immunohistokemisk färgning (antikroppar till myofibroblast markörer inkluderar a-glattmuskelaktin och vimentin, monoklonal antikropp mot CD68 är specifik för makrofager, är CD31 specifik till endotelceller, och CD45 är specifik för immunceller; antikroppar mot E-cadherin och olika cytokeratiner är specifik för epitelceller. mRNA-uttryck kan också bedömas genom RT-PCR ^12. Flödescytometri kan också användas för cellanalys ^13.

in vitro-och co-kultur experiment. Primära celler kan också implanteras i den subkutana vävnaden av möss för att studera cell-cell interaktioner ^14. Framtida tillämpningar kan innebära åter implantation av primära myofibroblaster i kolon väggen av en syngena mus använder musen koloskopi efter genetisk manipulation.

Ett antal alternativa metoder för att isolera primära myofibroblaster från människa och mus kolon har också beskrivits. Två är listade nedan:

1. Mahida, et al. Am. J. Physiol. 273 G1341-1348, (1997).
2. De Wever, et al. Int. J. Oncol. 39, 393-400, (2011).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Dispase I	Invitrogen/GIBCO	#17105-041
Collagenase D	Roche	#1 088 858
4 in, 16 G Popper blunt-end needle	Fisher	#14-825-16K