Permeabilization של תאים דבקו שימוש בגז אינרטי Jet

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לpermeabilization הזמני של תאים חסיד באמצעות סילון גז אינרטי. טכניקה זו מאפשרת ההעברה של חומר וביומולקולות גנטיים לתאי יונקים חסיד על ידי הניצול של כוחות מכאניים כדי לשבש את קרום הפלזמה.

Abstract

טכניקות transfection התא שונות קיימות ואלה יכולים להיות מחולקים לשלוש קטגוריות רחבות: ויראלי, כימי ומכאני. פרוטוקול זה מתאר שיטה מכאנית לpermeabilize temporally תאים חסיד באמצעות סילון גז אינרטי שיכול להקל על העברת בדרך כלל מקרומולקולות שאינן חדירות לתאים. אנו מאמינים כי טכניקה זו עובדת על ידי הקניית כוחות גזירה על קרום הפלזמה של תאים חסיד, וכתוצאה מכך היווצרות הזמנית של micropores. ברגע שהנקבוביות הללו נוצרו, התאים ולאחר מכן חדירים לחומר גנטי וביומולקולות אחרת. הכוחות מכאניים המעורבים אין להפעיל את הסיכון של תאים באופן קבוע מזיקים או ניתוק מהמצע שלהם. יש, אם כן, טווח צר של דינמיקת גז אינרטי בי הטכניקה היא יעילה. סילון גז אינרטי הוכיח יעיל בpermeabilizing שורות תאים חסיד שונות, כולל הלה, HEK293 ותאי האנדותל של אב העורקים בבטן אנושי. פרוטוקול זה הוא מתאים לעמermeabilization של תאים חסיד הן במבחנה, כפי שכבר הוכיחו, in vivo, מראה שהוא עשוי לשמש למחקר ופוטנציאלי ביישומים קליניים בעתיד. כמו כן, יש את היתרון של permeabilizing תאים בצורה מרחבית מגבילה, אשר יכול להוכיח להיות כלי מחקר חשוב.

Introduction

עם ההתפתחות של ביו וההבנה של מכניקת תא, המשלוח של ביומולקולות לתוך תאים הפך להיות חיוני לתחומי מחקר רבים וטיפולים רפואיים. טכניקות שונות פותחו כדי להציג את המולקולות זרות דרך קרום הפלזמה ולתוך cytosol התא. יכולים בדרך כלל להיות מסווגים אלה כמו גם: טכניקות ויראלי, כימיים או מכאניות. טכניקות ויראלי יכולות transfect חומר גנטי כמו רנ"א ודנ"א באמצעות וקטורים ויראליים ^1. טכניקות ויראלי נוטות להיות בעלי יעילות גבוהה בשורות תאים מסוימות, עם זאת יש להם את הפוטנציאל לתגובות חיסוניים ודלקתיות ² הם. שיטות transfection הכימי נפוצות כוללות משקעים סידן פוספט ^3, exotoxins חיידקי ⁴ וlipofection ^5. טכניקות אלו הוכחו כיעילים, אך בעיות מסוימות מתעוררות כגון רעיל לתא ושאינו ספציפי. יתר על כן, בטכניקות כגון פוספט סידןממטרים דואר כבר נמצאו יעילות transfection עד 70% אלא רק בשורות תאים מסוימות, רק לעתים נדירות בתאים ראשוניים ^6. זה ראוי לציון כמו מאמצי מחקר הגדלת מתבצעים הכניסו לתוך תאים ראשוניים, במיוחד במקרה של עיצוב טיפולים שונים לשימוש קליני והמחקר של תפקוד ה-DNA.

שיבוש זמני של קרום התא באמצעות גירויים מכאניים הוא חלופי להחדרת מולקולות זרות לתוך תאים. טכניקות כוללות: microinjection של מולקולות ^7, electroporation באמצעות שדה חשמלי כדי לשבש את הקרום ^8,9, sonoporation באמצעות גלי אולטרסאונד כדי לשבש את קרום התא ^10-12, הפצצת חלקיקים כפי שהודגם על ידי "אקדח הגן", שיורה בחלקיקים קשורים עם גנים לתוך התא ^13, ולאחרונה, את היישום של מתח גזירה נוזל שהוכח permeabilize temporally תאי יונקים ^14,15. למרות שמכונאישיטות אל חלק מהנושאים הנ"ל להימנע, הם מלווים בדרך כלל על ידי יעילות והגדרות מאוד מורכבות ומיוחדות יותר. לפיד אטמוספרי הפרשות זוהרים לחץ (APGD-t) פותח במקגיל עם המטרה הראשונית של functionalizing משטחים וניתוק תאים חסיד במבחנה ^16. דרך מקרה, התגלה כי כתם חי / מת בשימוש היה איכשהו שנלקח על ידי תאים מבלי שהוסיף סוכן permeabilizing. יתר על כן, זה נראה שהתרחש רק באזורים המוגבלים של הבארות שקרתה לי להתאים את נתיב הלפיד. חקירת יכולות permeabilization של APGD-t המשיכה במחקרים בקרה, נמצא כי סילון גז אינרטי הספק של הפלזמה ללא עירור היה גם מסוגל permeabilize תאים. זאת בניגוד להשערה הראשונית כי המינים תגובתי נוצרו על ידי סילון הפלזמה באופן זמני לקוי תפקוד הקרום והציעה שפשוט mechaniכוחות קאל היו מספיקים כדי לגרום permeabilization תא. מכאן, המשך לימודים במעבדה שלנו כדי לנסות ולכמת ולאפיין את יעילות permeabilization של סילון גז אינרטי, כמו גם מבט על יכולות transfection ^16.

באמצעות מחקרים אלה, זה כבר גילה כי micropores לעשות בצורת עובדה בקרום הפלזמה, ונקבובי אלה נוטים לאטום בתוך כ 5 שניות ^15. אנחנו הוכיחו התועלת של הטכניקה במבחנה in vivo בקרום chorioallantoic של עובר אפרוח.

Protocol

1. פיתוח של תכנית LabView

1. זרימה המונית בקר (MKS M100B Mass-Flo Controller) מחובר לקו גז הליום כדי להבטיח זרימת גז שיעור מדויק. יחידה זו נשלטת על ידי מתח הזנה, הנעה בין 0 ל 5 V. לולאת שליטה בתכנית LabView קובעת את המתח הנדרש בכל זמן נתון. ממשק בין המחשב ואת הזרימה ההמונית בקר מבוצע על ידי מכשיר רכישת נתונים (USB-6009 NI), ו12 V אספקת חשמל מספקת חשמל לזרימה ההמונית בקר.
2. שתי שקופיות ליניארי המיצוב משמשות כדי לשלוט על התנועה של צלחת 6 היטב, אחד לכל כיוון. כל מכלול מורכב מעצרת Unislide Velmex MA15-סדרה יחד עם מנוע דריכה ושני המכלולים נשלטים על ידי Velmex VXM אחד דורך מוטורי Controller. הבקר מאפשר ריצה ידנית של כל מנוע או מקבל מחרוזת של פקודות סידוריים חיצוניות, השילוב של אשר מאפשר עבור p תנועה הספציפיatterns. כמה דפוסים ניתן לתכנת לתכנית LabView, המחייבים את המשתמש על מנת לספק רק את מהירות לפיד הרצויה, כמו גם את ממדי הנתיב.

2. הכנת הציוד

1. פתח את שני הצילינדרים הליום והרגולטור.
2. הפעל את בקר המנוע.
3. פתח את תכנית LabView ולאמת את כל התנאים.
4. ודא שהפלטפורמה היא מרוכזת. כדי לבדוק זאת, נראה בכל שלב מוטורי ולוודא שכל קרון הוא לא ליד כל קצה במה. או שיש לי מרכז תכנית הכרכרות או להתאים באופן ידני על ידי שימוש בפקדי הריצה על החלק הקדמי של בקר המנוע.
5. אם זה הריצה הראשונה של היום, מומלץ להפעיל את התכנית פעם אחת ללא תאים, כדי להבטיח את ההתקנה הוא עובדת בצורה נכונה.

3. הכנת גובה גז Jet נימי Nozzle

1. הסר את נימי מבעל ולהתמקד בחיוג הגובה.
2. הנח את o צלחת 6 היטבn הפלטפורמה.
3. להחליף ולהקטין את נימי סילון גז לתחתית הבאר עד שהוא פוגע להחליק את המכסה. אבטח את הנימים בבעל.
4. שימוש בחיוג הגובה, להעלות את נימי מ"מ 3. סמן גובה זה על בסיס הנימים.
5. להעלות את הנימים לגובה בטוח ולאחר מכן להסיר את צלחת 6 באר.

4. תא permeabilization פרוטוקול

1. שורת תאים חסיד תרבות למפגש בכיסוי זכוכית מחליקה בצלחת 6 היטב תוך שימוש בטכניקות culturing סטנדרטיים. לתאי הלה, 6 צלחות היטב זרע עם 2 x 10 ⁵ תאים לכל היטב דגירה ל48 ​​שעות לפני הטיפול.
2. הכן את הנפח מתאים של תמיסה המכילה את הווקטור הרצוי. לhrGFPII-1, ריכוז של 50 ng / μl ב 1x PBS מספק אות ניאון חזקה בתאי הלה 24 שעות לאחר transfection. ללימודים dextran, 80 מיקרוגרם / מיליליטר של 10 dextran פלואורסצנטי הירוק kDa מומלץ. מכאן ואילך, פתרון זה יכונהשל "פתרון וקטור".
3. הסר תקשורת תרבית תאים מהיטב ולשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS.
4. פיפטה 1,370 μl של פתרון וקטור מוכן בשלב 4.2 לטוב. זה אמור לגרום לעומק נוזל של כ 1.3 מ"מ.
5. הנח גם מכיל את פתרון הווקטור במרכז הבמה. מנמיכים את נחיר סילון גז לרמה המסומן בעבר שמעיד על גובה פייה של 3 מ"מ מעל השקופית.
6. הגדר קצב זרימת הליום בתכנית LabVIEW ובחר את דפוס תנועה הרצויה לשימוש. בחר "הפעלה" כאשר מוכן להתחיל את פרוטוקול permeabilization. יהיה תקופת פיגור ראשונית שבמהלכו הזרימה ההמונית בקר נערך לספק את קצב הזרימה הנדרש. ברגע שכבר הגיע לקצב הזרימה המתאים, התכנית LabVIEW תפעיל מנועים stepper לנוע גם בדפוס permeabilization הרצוי. ברגע שהפלטפורמה הפסיקה, לחכות כ 30 שניות ולהסיר את פתרון הווקטור.הערה: permeabilization האופטימלי מתרחש ליד לחץ דינמי של 100-200 אבא ביציאת הזרבובית, תלוי בקוטר הנימים.
7. לשטוף היטב שלוש פעמים עם 1X PBS.
8. מלא גם עם תקשורת ותרבות טריות.
9. חזור על שלבים 4.3-4.6 למספר רצוי של ניסויים. הערה: הקפד לכלול דגימות בקרה אשר מורכבת של בארות שמלאות בפתרון הווקטור בלי סילון הגז שנדרס. השאר את הפתרון בבארות שליטה לכ 1 דקות ולאחר מכן להמשיך לצעדים 4.5 ו4.6.
10. אם מפעיל ניסוי transfection hrGFP, לחזור צלחת 6 היטב לחממה ל24 שעות כדי לאפשר לחומרי transfected להיות עיבד ידי התאים. אם מפעיל ניסוי permeabilization dextran, לחזור צלחת 6 היטב לחממה ל15 דקות.

5. תא הדמיה

1. אם תרצה, מייד לפני הדמיה, counterstain עם כתם חי / מת מתאים כדי להעריך את המוות של תאים.
2. תאי תמונה עם appropמיקרוסקופ riate לחקור יעילות transfection / permeabilization.

Representative Results

Permeabilization של תאי הלה עם 10 dextran פלואורסצנטי הירוק kDa באמצעות סילון גז הליום עם 0.86 מ"מ נימי קוטר פנימיים מוצג באיור 1. תאים היו counterstained מייד לאחר permeabilization עם פתרון 2 μl / מיליליטר EthD-1 (LIVE / DEAD הכדאיות / Cytotoxicity Kit) כדי לחזות מוות של תאים. מייד לאחר counterstaining, מכסה מחליק היו רכובים וצלם. נתון זה מראה את תוצאות של הפעלת סילון גז הליום בשלושת לחצים לשקע שונים בהשוואה למדגם שליטה. שים לב שרוחב מסלול permeabilization וההתייעלות עם לחץ דינמי גבוהה יותר ומוות של תאים הראה עלייה קלה (A ו-B). עם זאת, ברגע שהושג בלחץ דינמי גבוה, תאי הלה הופשטו מהתלושים לכסות וpermeabilization ההיקפי מעט מאוד התרחש. ניתוח מפורט יותר של הפשטת תא ויעילות transfection נערך בעבר על ידי Chouinard-פלטייה et al. ¹⁵

באמצעות מחקרי מיקרוסקופיית אלקטרונים, micropores נצפה בקרום התא (איור 2). Permeabilization של תאי הלה בוצע באמצעות סילון גז הליום עם נימי קוטר פנימיות 0.86 מ"מ בלחץ יציאה של 300 אבא בעקבות פרוטוקול permeabilization, התאים היו קבועים באופן מיידי עם פתרון paraformaldehyde 1% ב 1x PBS.

איור 1. Permeabilization של תאי הלה עם 10 dextran פלואורסצנטי הירוק kDa באמצעות סילון גז הליום עם קוטר פנימי זרבובית נימים של 0.86 מ"מ. Dextran מאיר תאים ירוקים ומתים לזרוח אדום.) לחץ דינמי של 100 אבא, ב) 135 אבא, ו-C בקרה) של 175 אבא ד ') עם dextran הוסיפה בut אין חשיפה לסילון גז הליום.

איור 2. SEM תמונות בהגדלה של 50,000 X של פני השטח של תאי הלה הבא permeabilization סילון גז ב300 אבא) מדגם בקרה מציג תא שטח חלק. פני שטח של תא permeabilized מציג נקבובית בקוטר 84 ננומטר ב '). לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.

Discussion

permeabilization סילון גז אינרטי הוא טכניקה שימושית עבור transfection תא חסיד. הוא מספק את היכולת להעביר ביומולקולות לתוך תאים תוך השימוש בכוחות מכאניים, שמבטל את הצורך בכימיקלים מזיקים או וקטורים ויראליים. הטכניקה שעלול לתת לחוקרים וקלינאים דרך יעילה ופשוטה יחסית לtransfect בדיוק תאים. הסלקטיביות של permeabilization היא גם ייחודית ומאפשר לחוקרים לטיפול רק תאים מסוימים במושבה אחת אשר יכול להיות שימושי ביישומים מרובים.

מספר פרמטרים יכולים להיות מותאמים לניסויים בודדים כגון קוטר נחיר נימים וזווית, גז קצב זרימה, נוזל וגובה נימים, קו סלולרי, biomolecule היעד לשמש, וסוג של גז אינרטי. רמת נוזל סט וגובה נימים תוארו בהליך וערכים אלה נבחרו כדי לצמצם את מספר המשתנים המעורבים בexperimeNTS. נכון לעכשיו, אנחנו דוגמה ומופת למערכת באמצעות זרימת הדמיה ניסיונית ודינמיקה של נוזלים. זה ייתן לנו הבנה טובה יותר של הכוחות הנחילה בתאים, מה שמאפשר לנו לקבוע את התלות של permeabilization במשתנים כגון מאפיינים נוזליים.

חשוב לשים לב ללחץ הדינמי מקסימלית במסגרתה התאים יכולים לשרוד. נמצא כי לחצים פעם אחת דינמיים התקרבו 200 אבא לגובה פיית סילון גז של 3 מ"מ, הפשטת תא הלה הפכה סבירה. זה מתאים לממצאי מחקרים אחרים, כגון Lu et al. שנצפה ניתוק תא פיברובלסטים WT NR6 ב200-265 אבא ^17. אם כמויות גדולות של הפשטה מתרחשות, זרימת גז שיעור נמוך צריך להקל על בעיה זו. באופן דומה, ספיקה גבוהה לגרום למוות של תאים ותוצאות permeabilization חיוביים שגויות. ברגע שתאים מתים הם יהפכו חדירים למולקולות ולכן תאים מתים יכולים להיות בטעות תאי חיים permeabilized. זהלכן מומלץ לבצע assay חי / מת, כדי להבטיח שתאי permeabilized הם למעשה עדיין בחיים. עליות מוות עם לחץ הולך וגובר, והמעבדה שלנו מצאו כי ב390 אבא רוב תאי הלה permeabilized היו מתים ^15. תא כדאיות על פני תקופה ממושכת של זמן גם נחקרה, עם ביטוי hrGFPII-1 שנצפה עד 72 פוסט permeabilization שעה (מידע לא מוצג). מחקרים נוספים נמצאים כרגע בעיצומו לחקור את הכדאיות בנקודות זמן רבות עוד יותר.

ההשערה שלנו היא שלחצי נוזל גזירה על התאים, שנוצרו על ידי הסילון של גז ועקירתם של אמצעי התקשורת, לגרום להפסקה זמנית של קרום הפלזמה תא. זהה אותו המנגנון המוצע לשיטות פיזיות מורכבות יותר האחרות כגון קריסת microbubble וsonoporation ^18. תנאי ההפעלה בשיטה זו תלויים בסוג של תאים, קובץ מצורף למצע, התכונות מכאניות של התאיםותא קיר, מולקולה של עניין, מאפיינים של הנוזל והגז, ואת הממדים הפיזיים של ההתקנה. באמצעות מחקרי הרחקת גודל, מצאנו כי מולקולות dextran גדולות מ40 kDa להראות יעילות permeabilization נמוכה מאוד ושגודל dextran אופטימלי הוא 10 kDa לניסויים ^15. זה חשוב כמו שהוא מגביל את הגודל של מולקולות שניתן permeabilized לתוך תאים תוך שימוש בפרוטוקול זה. עד כה, יש לנו רק חקרתי את מאפייני transfection של פלסמידים. מחקרים נוספים יהיו לברר אם חתיכות גדולות יותר של חומר גנטי הן מסוגלים להיות transfected שימוש בטכניקה זו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vitality hrGFPII-1	Agilent Technologies Canada	240143-57	Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells
Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable	Life Technologies Inc.	D22910	dextran for permeabilization experiments
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Life Technologies Inc.	L3224	for counterstaining of mammalian cells
Prolong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930	for mounting slides when imaging
Ultra High Purity Helium	Praxair Canada Inc.	HE 5.0UH-T
Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml	Thermo Scientific	SH30022.01	for HeLa cells
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	26140079	For DMEM media
Penicillin-Streptomycin, liquid	Invitrogen	15140-122	For DMEM media
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x			Produced in lab
			Table 1. List of required reagents
6-Well Clear TC-Treated Microplates	Corning	3506
#1 22 x 22 Coverslips	Fisher	12-542B
Glass Capillaries	World Precision Instruments		WPI Sizing Information
ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Mass-Flo Controller	MKS	M100B01314CS1BV	Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply
USB-6009 DAQ Device	National Instruments	779026-01
UniSlide Assembly with stepping motor and controller	Velmex		Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller
			Table 2. List of required equipment