Summary
이 프로토콜은 불활성 가스 제트를 이용한 부착 세포의 임시 permeabilization위한 방법을 설명한다. 이 방법은 세포막을 방해하는 기계적 힘의 이용에 의한 부착 성 포유 동물 세포에 유전 물질과 생체 분자의 전달을 용이하게한다.
Abstract
다양한 세포 형질 전환 기술이 존재하고 이러한 세 가지 범주로 나눌 수 있습니다 바이러스, 화학, 기계. 이 프로토콜은 시간적으로 세포 내로 일반적으로 비 투과성 거대 분자의 전달을 용이하게 할 수있는 불활성 가스 제트를 사용하여 접착 세포를 투과하는 기계적 방법을 설명한다. 우리는이 기술의 미세 임시 형성의 결과로, 부착 세포의 원형질막에 전단력을 부여하여 작동 믿는다. 이러한 기공이 생성되면, 세포는 유전 물질 및 기타 생체 분자 투과성이다. 관련된 기계적 힘은 기판에서 영구적으로 손상 또는 분리 세포의 위험을 실행 않습니다. 기술이 효과가 불활성 기체 역학의 좁은 범위, 따라서이있다. 불활성 가스 제트는 헬라, HEK293 인간의 복부 대동맥 내피 세포를 포함한 다양한 자기편 세포 라인을 permeabilizing에 효율적으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 P에 적합한우리가 미래의 임상 응용 프로그램에서 잠재적으로 연구에 사용될 수있다 표시, 생체 내에서 증명하고있다으로 관내에는 양쪽 모두에서 부착 세포의 ermeabilization. 또한 가치있는 연구 도구가 될 증명할 수있는, 공간적으로 제한적인 방법으로 세포를 permeabilizing의 장점이 있습니다.
Introduction
생물 의약의 발전과 세포 역학의 이해, 세포로 생체 분자의 전달은 많은 연구 분야 및 의료 치료에 중요한되고있다. 다른 기술은 세포막을 통해 세포의 세포질에 외래 분자를 도입하기 위해 개발되었다. 바이러스, 화학 또는 기계적 방법 : 이들은 일반적으로 분류 될 수있다. 바이러스 성 기술은 바이러스 벡터를 사용하여 RNA 및 DNA로 유전 물질을 형질있다. 바이러스 성 기술은 그러나 그들은 면역 및 염증 반응 2에 대한 가능성을 가지고 할, 특정 세포 라인에 높은 효율을 가지고하는 경향이있다. 일반 화학 형질 전환 방법은 인산 칼슘 3, 세균 외독소 4 리포 펙 (5)과 강수량 (가) 있습니다. 이러한 기법은 효과적 일 수있다, 그러나, 특정 문제는 세포 독성 및 비 특이성으로 발생한다. 또한, 칼슘 인산염 같은 기법전자 강수량은 거의 일차 전지 6에서 최대 70 %에 있지만, 특정 세포주에 형질 전환 효율이 발견되었습니다. 증가하는 연구 노력은 특히 임상과 DNA의 기능에 대한 연구를위한 다양한 치료를 설계하는 경우, 일차 전지에 투입되는 등이 주입니다.
기계적 자극을 통해 세포막의 일시적인 중단이 세포로 외래 분자를 도입하기위한 대안이다. 기술은 다음을 포함한다 : 분자 (7)의 미세 주입, 막 8,9을 방해하는 전기장을 사용하여 일렉트로, sonoporation와 결합 입자를 촬영 "유전자 총"에 의해 설명되는 것과 같이 세포막 10-12, 입자 충격을 방해하기 위해 초음파를 사용하여 셀 (13) 내로의 유전자, 및 더 최근에, 시간적으로 포유 동물 세포에게 14,15 투과 표시되었습니다 유체 전단 응력의 적용. 하지만 정비공알 방법은 앞서 언급 한 몇 가지 문제를 방지, 그들은 일반적으로 낮은 효율성과 매우 복잡하고 전문적인 설정 함께 제공됩니다. 대기압 글로우 방전 토치 (APGD-t)는 표면 기능화 및 생체 외 (16)에 부착 세포를 분리의 초기 목표로 맥길로 개발되었다. Serendipitously, 사용되는 라이브 / 죽은 얼룩은 어떻게 든 permeabilizing 에이전트가 첨가하지 않고 세포에 의해 촬영되고 있음을 발견했다. 또한,이 단지 토치 경로와 일치하는 일이 우물의 제한 지역에서 발생한 것 같았다. APGD-T의 permeabilization 기능의 조사는 계속 제어 연구에서, 그것은 여자가없는 플라즈마의 캐리어 불활성 가스 제트는 또한 세포를 투과 할 수 있었다 것으로 나타났습니다. 이것은 플라즈마 제트에 의해 생성 된 반응 종 일시적 막의 기능을 손상 초기 가설 모순 및 제안 단순히 기계적 것을칼의 힘은 세포 permeabilization의 원인이하기에 충분했다. 여기에서 연구를 시도하고 정량화 permeabilization의 불활성 가스 제트의 효율성뿐만 아니라 형질 전환 기능 (16)에 의해 모양의 특징을 우리의 실험실에서 계속했다.
이러한 연구를 통해, 그 미세 기공은 세포막에 팩트 형태로 수행하는 것이 발견되었으며, 이러한 기공은 약 5 초 이내에 15 봉인하는 경향이있다. 우리는 병아리 태아의 융모 막 생체 외 및 생체 내에서 기술의 유틸리티를 증명하고있다.
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Protocol
1. LabVIEW 프로그램의 개발
- 유량 제어기 (MKS M100B 매스 플로 컨트롤러) 정확한 가스 유량을 보장하기 위해 헬륨 가스 라인에 부착된다. 이 장치는 0과 5 V. LabVIEW 프로그램의 제어 루프는 임의의 주어진 시간에 필요한 전압을 결정 사이의 범위, 입력 전압에 의해 제어된다. 컴퓨터와의 사이에 인터페이싱 유량 제어기는 데이터 수집 장치 (NI의 USB-6009)에 의해 수행되고, 12 V 전원 공급 유량 제어기에 전원을 제공한다.
- 두 개의 위치 선형 슬라이드는 6 - 웰 플레이트, 각 방향에 대해 하나의 움직임을 제어하기 위해 사용된다. 각 어셈블리는 스테핑 모터와 결합 된 MA15 시리즈 Velmex Unislide 어셈블리로 구성, 두 어셈블리는 모터 컨트롤러 스테핑 하나 Velmex VXM에 의해 제어된다. 제어기는 각각의 모터의 설명서 조깅 허용 또는 외부 시리얼 명령 문자열을 사용할 수의 조합은 특정 움직임을 허용 Patterns. 여러 패턴만을 원하는 토치 속도뿐만 아니라 경로 치수를 제공하기 위해 사용자가 요구하는 LabVIEW 프로그램으로 프로그래밍 될 수있다.
2. 장비의 제조
- 헬륨 실린더와 레귤레이터를 모두 엽니 다.
- 모터 컨트롤러의 전원을 켭니다.
- LabVIEW 프로그램을 열고 모든 조건을 확인합니다.
- 플랫폼이 중심이되어 있는지 확인합니다. 확인 각 모터의 단계에서 보면 각 캐리지가 무대 한쪽 끝 근처에 있지 않은지 확인합니다. 프로그램 중심 캐리지 있고 또는 수동으로 모터 제어기의 전면에 조깅 컨트롤을 사용하여 조정하거나.
- 이 날의 첫 번째 실행 인 경우에는 설치 프로그램이 제대로 작동 할 수 있도록, 세포없이 한 번 프로그램을 실행하는 것이 좋습니다.
3. 가스 제트 모세관 노즐 높이의 준비
- 홀더에서 모세 혈관을 제거하고 높이 다이얼을 제로.
- 6 잘 플레이트 (을)를 배치N 플랫폼.
- 교체하여 커버 슬립을 돌 때까지 우물의 바닥에 가스 제트 모세관을 낮 춥니 다. 홀더에 모세관을 고정합니다.
- 높이 다이얼을 사용하여 모세관 3mm를 올립니다. 모세관베이스에서이 높이를 표시합니다.
- 안전한 높이로 모세 혈관을 마련하고 6 잘 플레이트를 제거합니다.
4. 셀 Permeabilization 프로토콜
- 커버 유리에 합류하는 농경 점착성 세포주는 표준 배양 기술을 사용하여 6 - 웰 플레이트에 미끄러진다. HeLa 세포의 경우, 씨앗 6 - 웰 웰 당 2 × 10 5 세포와 접시와는 치료 전 48 시간 동안 배양한다.
- 원하는 벡터를 함유 용액의 적절한 볼륨을 준비합니다. hrGFPII-1, 1X PBS에서 50 NG / μL의 농도는 HeLa 세포에서 강한 형광 신호 형질 전환 후 24 시간을 제공하십시오. 덱스 트란 연구의 경우, 10 kDa의 녹색 형광 덱스 트란 80 ㎍ / ml를 추천합니다. 금후,이 용액을 칭한다의 "벡터 솔루션".
- 우물에서 세포 배양 배지를 제거하고 1X PBS로 3 회 씻어.
- 우물에 4.2 단계에서 제조 된 벡터 솔루션의 1,370 μl를 피펫. 이 약 1.3 mm의 액체 깊이에서 발생한다.
- 플랫폼의 중심에있는 벡터를 함유하는 용액을 잘 배치. 슬라이드 위에 3mm의 노즐 높이를 나타내는 이전에 표시된 수준으로 가스 분사 노즐을 낮추.
- LabVIEW 프로그램에서 헬륨 유량을 설정하고 사용하기 원하는 움직임 패턴을 선택한다. 때 permeabilization 프로토콜을 시작할 준비가 "실행"을 선택합니다. 유량 제어기는 필요한 유량을 제공하기 위해 준비하는 동안 초기 지연 기간이있을 것이다. 적절한 유동 속도에 도달하면, LabVIEW 프로그램은 원하는 permeabilization 패턴에 잘 이동할 스테퍼 모터를 활성화 할 것이다. 플랫폼이 정지되면, 약 30 초를 기다려 벡터 솔루션을 제거합니다.참고 : 최적 permeabilization는 모세관의 직경에 따라, 노즐 출구에서 100 ~ 200 ㎩하에 동압 근처에 발생한다.
- 1X PBS로 잘 세 번 씻으십시오.
- 신선한 문화 매체와 잘 기입하십시오.
- 실험의 원하는 번호를 4.6 - 반복 4.3 단계를 반복합니다. 참고 : 그들을 통해 실행되는 가스 제트없이 벡터 솔루션을 충만 우물로 구성 제어 샘플을 포함해야합니다. 다음 단계를 4.5과 4.6로 진행 약 1 분간 제어 우물에 솔루션을 둡니다.
- hrGFP 형질 전환 실험을 실행하는 경우, 형질 전환 물질이 세포에 의해 복사 할 수 있도록 24 시간 동안 인큐베이터 6 - 웰 플레이트를 반환합니다. 덱스 트란 permeabilization 실험을 실행하면, 15 분 동안 인큐베이터 6 잘 플레이트를 반환합니다.
5. 셀 이미징
- 원하는 경우, 직전 이미징, 세포 죽음을 평가하는 적절한 죽은 / 라이브 얼룩 counterstain.
- approp와 이미지 세포형질 전환 / permeabilization 효능을 조사하기 riate 현미경.
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Representative Results
0.86 mm의 내경을 가진 모세관 헬륨 가스 제트를 사용하여 10 kDa의 녹색 형광 덱스 트란과 함께 HeLa 세포의 Permeabilization도 1에 도시된다. 세포는 즉시 세포 죽음을 시각화하는 2 μL / ㎖의 EthD-1 솔루션 (LIVE / DEAD 생존 / 세포 독성 키트)와 permeabilization 후 대조되었다. 즉시 counterstaining 다음, 커버 전표를 장착하고 몇 군데 있었다. 이 그림은 대조 시료에 비해 세 가지 다른 출구 압력에서 헬륨 가스 제트를 실행의 결과를 보여줍니다. permeabilization 트랙 폭과 효율성은 약간 증가 (A와 B)를 보여 높은 동적 압력과 세포 죽음으로 증가합니다. 높은 동적 압력에 도달했다 그러나, 일단, 헬라 세포는 커버 전표에서 제거하고 약간의 주변 permeabilization가 발생했다. 세포 형질 감염 및 스트리핑 효율의 더 상세한 분석 기계 추이 나드 의해 실시되었다펠레 등. 15
주사 전자 현미경 연구를 통해, 미세 공은 세포막 (도 2)에서 관찰되었다. HeLa 세포의 Permeabilization가 permeabilization 프로토콜에 따라 300 펜실베니아의 출구 압력에서 0.86 mm 내경 모세관와 헬륨 가스 제트를 사용하여 수행하고, 세포는 즉시 1X PBS에 1 % 파라 포름 알데히드 용액으로 고정 하였다.
그림 1. 0.86 mm의 모세관 노즐 내경 헬륨 가스 제트를 사용하여 10 kDa의 녹색 형광 덱스 트란과 함께 HeLa 세포의 Permeabilization는. 덱스 트란은 녹색 및 사균이 100 ㎩하에 빨간. A) 동적 압력, B) 135 ㎩하에, 및 C를 형광 형광 덱스 트란과) 175 아빠의 D의) 제어는 B를 추가헬륨 가스 제트에 더 노출 유타 없습니다.
그림 2. 300 아빠) 부드러운 세포 표면을 나타내는 컨트롤 샘플. B) 84 나노 미터 직경의 기공을 전시 permeabilized 세포의 표면에 가스 제트 permeabilization 다음 HeLa 세포의 표면의 50,000 X의 배율 SEM 이미지. 을하려면 여기를 클릭하십시오 큰 그림을 보려면 .
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Discussion
불활성 가스 제트 permeabilization은 자기편 세포의 형질 전환을위한 유용한 기술이다. 그것은 잠재적으로 유해한 화학 물질이나 바이러스 벡터에 대한 필요성을 없애 기계적 힘의 용도로 세포에 생물 분자를 전송하는 기능을 제공한다. 이 기술은 잠재적으로 연구자와 임상의에게 정확하게 세포를 형질 효율적이고 비교적 간단한 방법을 제공 할 수 있습니다. permeabilization의 선택은 또한 연구자는 여러 응용 프로그램에 유용 할 수있는 하나의 식민지에있는 특정 세포를 취급 할 수 있도록 고유합니다.
몇개의 파라미터는 모세관 노즐 직경 및 각도, 가스 유량, 액체 및 모세관 신장 세포주, 사용되는 표적 생체 분자와 불활성 가스의 종류 등의 개별 실험을 위해 조정될 수있다. 세트 액위 모세관 높이는 절차에 설명되어 있고이 값은 우리 experime에 관련된 변수의 개수를 최소화하기 위해 선택되었다국세청. 현재, 우리는 실험적인 유동 가시화 및 전산 유체 역학을 사용하여 시스템을 모델링 할 수 있습니다. 이것은 우리가 같은 액체 속성과 같은 변수에 permeabilization의 종속성을 확인 할 수 있도록, 우리에게 세포에 부여 된 힘의 더 나은 이해를 제공 할 것입니다.
그것은 세포가 생존 할 수있는 아래의 최대 동적 압력의 주를 가지고하는 것이 중요합니다. 그것은 한 번 동적 압력이 3mm의 가스 분사 노즐의 높이 (200) 파에 이르렀 던 것으로 나타났습니다, 헬라 세포의 박리 가능성이되었다. 이는 루 등 다른 연구에 동의한다. 200-265 파 17에 WT NR6 섬유 아세포의 세포 분리를 관찰 사람. 스트리핑 다량이 발생하면, 낮은 가스 유속이 문제를 완화한다. 마찬가지로, 높은 유량은 세포의 죽음과 거짓 양성 permeabilization 결과를 초래한다. 세포가 죽은 후 그들은 분자 투과 될 것입니다 때문에 죽은 세포는 permeabilized 살아있는 세포에 대한 오해 될 수 있습니다. 그것따라서 permeabilized 세포가 실제로 살아 있는지 확인하기 위해 라이브 / 죽은 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 압력이 증가하고 실험실 죽음의 증가는 390에서 아빠가 permeabilized 헬라 세포의 대부분이 15 죽은 것으로 나타났다. 오랜 기간 동안 세포 생존율은 72 시간 포스트 permeabilization (데이터가 표시되지 않음)까지 관찰되고 hrGFPII-1 식으로 조사되었다. 추가 연구가 더 긴 시점에서 가능성을 조사하기 위해 현재 진행되고있다.
우리의 가설은 가스 제트와 미디어의 변위에 의해 생성 세포에 유체 전단 응력은, 세포 원형질막의 일시적인 중단을 야기한다는 것이다. 이는 마이크로 버블의 붕괴와 sonoporation 18 같은 다른 더 복잡한 물리적 방법에 대해 제안 된 같은 메커니즘이다. 이 방법에 대한 작동 조건은 기판, 전지의 기계적 특성에 대한 세포 부착의 타입에 의존세포 벽, 그 분자, 액체와 기체의 특성 및 설치의 실제 크기. 크기 배제 연구를 통해, 우리는 40 kDa의보다 큰 덱스 트란 분자가 최적의 덱스 트란 크기가 실험 15 10 kDa의 것을 매우 낮은 permeabilization 효율을 표시하고있는 것으로 나타났습니다. 그것은이 프로토콜을 이용하여 세포 내로 permeabilized 수있는 분자의 크기를 제한으로서 중요하다. 지금까지, 우리는 플라스미드의 형질 특성을 조사 하였다. 추가 연구는 유전 물질의 큰 조각은이 기술을 사용하여 형질 감염 될 수있는 지 여부를 확인한다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해가없는 선언합니다.
Acknowledgments
건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR), 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) : 저자는 다음과 같은 자금 조달에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
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