Summary
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for midlertidig permeabilization av adherente celler ved hjelp av en inert gass-stråle. Denne teknikk muliggjør overføring av genetisk materiale og biomolekyler i adherente pattedyrceller ved anvendelse av mekaniske krefter for å forstyrre plasmamembranen.
Abstract
Ulike celle transfeksjonsteknikker eksisterer, og disse kan bli brutt ned til tre hovedkategorier: viral, kjemiske og mekaniske. Denne protokollen beskriver en mekanisk metode for å temporært permeabilize adherente celler ved hjelp av en inert gass-stråle som kan lette overføringen av normalt ikke-gjennomtrengelige makromolekyler inn i cellene. Vi tror at denne teknikken virker ved formidling av skjærkrefter på plasma membran av adherente celler, som resulterer i den midlertidige dannelse av mikroporer. Når disse porene er opprettet, cellene blir deretter gjennomtrengelig for genetisk materiale og andre biomolekyler. De mekaniske krefter involvert kjører risikoen for permanent skade eller demonterer celler fra deres substrat. Det er derfor et smalt spekter av inerte gassdynamikk hvor teknikken er effektiv. En inert gass jet har vist seg effektiv på permeabilizing ulike heftcellelinjer inkludert HeLa, HEK293 og menneske abdominale endotelceller. Denne protokollen er hensiktsmessig for permeabilization av adherente celler både in vitro og, som vi har demonstrert in vivo, viser det kan benyttes for forskning og potensielt i fremtidige kliniske anvendelser. Den har også fordelen av å permeabilizing celler i en romlig restriktiv måte, noe som kan vise seg å være et verdifullt forskningsverktøy.
Introduction
Med utviklingen av biomedisin og forståelse av celle mekanikk, har levering av biomolekyler i celler blir avgjørende for mange forskningsfelt og medisinske terapier. Forskjellige teknikker har blitt utviklet for å innføre fremmede molekyler gjennom plasmamembranen og inn i cellens cytosol. Disse kan generelt klassifiseres som enten: viral, kjemiske eller mekaniske teknikker. Virale teknikker kan transfektere genetisk materiale, slik som RNA-og DNA ved hjelp av virale vektorer en. Virale teknikker har en tendens til å ha høy effektivitet i visse cellelinjer, men de har potensiale for immun-og inflammatoriske reaksjoner to. Vanlige kjemiske transfeksjonsmetoder inkluderer nedbør med kalsiumfosfat 3, bakterielle exotoxins 4 og lipofection fem. Disse teknikker har vist seg å være effektivt, men det oppstår visse problemer, slik som celletoksisitet og ikke-spesifisitet. Videre teknikker som kalsium fosfate ventet har blitt funnet å ha transfeksjon virkningsgrader opp til 70%, men bare i visse cellelinjer, sjelden i primærceller 6. Det er verdt å merke som øker forskningsinnsats blir satt inn i primærceller, spesielt i tilfellet med utforming av forskjellige behandlinger for klinisk bruk, og studiet av DNA-funksjon.
Temporal forstyrrelse av cellemembranen via mekaniske stimuli er et alternativ for innføring av fremmede molekyler inn i celler. Teknikker omfatter: mikroinjeksjon av molekyler 7, elektroporering ved å bruke et elektrisk felt for å bryte membranen 8,9, sonoporation ved hjelp av ultralydbølger for å forstyrre cellemembranen 10-12, partikkel bombardement som demonstrert ved "genet gun", som skyter partikler bundet med gener inn i cellen 13, og mer nylig, påføring av fluidskjærspenning som har vist seg å temporært permeabilize pattedyrceller 14,15. Selv mekanikeral metoder unngå noen av de nevnte problemene, de er vanligvis ledsaget av lavere effektivitet og svært komplekse og spesialiserte oppsett. En atmosfærisk trykk glød utslipp lommelykt (APGD-t) ble utviklet ved McGill med den opprinnelige målet av funksjon overflater og løsne heftende celler in vitro 16. Serendipitously, ble det oppdaget at en levende / død flekken blir brukt var liksom å bli tatt av celler uten permeabilizing middel tilsettes. Videre, dette syntes å ha skjedd bare i begrensede områder av brønnene som skjedde for å matche opp med fakkelen banen. Undersøkelse av de permeabilization egenskapene til APGD-t fortsatte og i kontrollstudier ble det funnet at bæreren inert gasstråle av plasma uten magnetisering var også i stand til å permeabilize celler. Dette motsies den første hypotesen om at de reaktive skapt av plasma jet midlertidig svekket membranen funksjon og foreslo at bare de mekaniskecal styrker var tilstrekkelig til å forårsake celle permeabilization. Herfra studier fortsatte i vår lab for å prøve og kvantifisere og karakterisere permeabilization effektiviteten av en inert gass jet samt se på sine transfeksjon evner 16.
Ved disse studier har man funnet at mikroporer gjør faktisk form i plasmamembranen, og disse porer har en tendens til å forsegle innen ca 5 sek 15. Vi har vist at teknikken er verktøyet in vitro og in vivo i chorioallantoic membran av en chick embryo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utvikling av LabView Program
- En massestrømningsregulatoren (MKS M100B Mass-Flo Controller) er festet til heliumgassledningen for å sikre en nøyaktig gass-strømningshastighet. Denne enheten styres av en inngangsspenning, som varierer mellom 0 og 5 V. En styresløyfe i LabView programmet bestemmer den nødvendige spenning til enhver tid. Grensesnitt mellom datamaskinen og massestrømningsregulatoren er utført av en datainnsamlingsanordning (NI USB-6009), og en 12 V forsyningen gir strøm til massestrømningsstyreenhet.
- To posisjonering lineære lysbilder brukes til å kontrollere bevegelsen av seks-brønns plate, ett for hver retning. Hver forsamlingen består av en MA15-serie Velmex UniSlide Assembly kombinert med en stepping motor, og begge samlinger er kontrollert av en enkelt Velmex VXM Stepping Motor Controller. Regulatoren tillater manuell jogging av hver motor eller godtar en streng med eksterne seriell kommandoer, en kombinasjon som gir mulighet for spesifikk bevegelses patterns. Flere mønstre kan programmeres inn i LabView program, som krever at brukeren gir bare ønsket fakkelen hastighet samt bane dimensjoner.
2. Klargjøring av utstyr
- Åpner både helium sylinder og regulator.
- Slå på motorkontrolleren.
- Åpne LabView programmet og kontrollere alle forhold.
- Sørg for at plattformen er sentrert. For å sjekke, se på hver motor scenen og kontrollere at hver vogn er ikke i nærheten av en scene slutten. Enten har den programsenter vogner eller manuelt justere ved hjelp av jogge kontrollene på forsiden av motorstyreren.
- Hvis dette er første løp av dagen, er det anbefalt å kjøre programmet en gang uten celler, for å sikre at oppsettet fungerer som den skal.
Tre. Utarbeidelse av gass Jet kapil dysehøyde
- Fjern kapillær fra holderen og null høyden hjulet.
- Plasser 6-brønns plate on plattformen.
- Sett og senke gasstråle kapillær til bunnen av brønnen til den treffer dekkglass. Fest kapillær i holderen.
- Bruke høyden dial, heve kapillær 3 mm. Markere denne høyden på kapillær basen.
- Hev kapillær til sikker høyde og deretter fjerne den seks-brønns plate.
4. Cell Permeabilization Protocol
- Kultur vedheftende cellelinje til konfluens på glassplate glir i en 6-brønn plate ved anvendelse av standard dyrkningsteknikker. For HeLa celler, frø 6-brønn plater med 2 x 10 5 celler per brønn og inkuber i 48 timer før behandling.
- Forbered passende volum av løsning som inneholdt den ønskede vektor. For hrGFPII-1, en konsentrasjon på 50 ng / pl i 1 x PBS gir en sterkt fluoriserende signal i HeLa-celler 24 timer etter transfeksjon. For dekstran-studier, er 80 ug / ml 10 kDa grønt fluorescerende dekstran anbefalt. Heretter vil denne løsningen bli henvist til ens "vektor-løsning".
- Fjern celledyrkningsmedier fra godt og skyll tre ganger med 1x PBS.
- Pipetter 1370 mL av vektor løsning utarbeidet i trinn 4.2 i tillegg. Dette skulle resultere i et flytende dybde på omtrent 1,3 mm.
- Sett brønn som inneholder vektoren oppløsning i sentrum av plattformen. Senk gasstråledyse til den tidligere merket nivå indikerer en dyse høyde på 3 mm over objektglasset.
- Sett helium strømningshastigheten i LabView program og velger det ønskede bevegelsesmønster som skal brukes. Velg "Kjør" når du er klar til å begynne permeabilization protokollen. Det vil være en innledende etterslep periode hvor masse kontrolleren forbereder seg på å gi den nødvendige strømningshastighet. Når riktig strømningshastighet er nådd, vil den LabView programmet aktivere steppermotorer å flytte godt i ønsket permeabilization mønster. Når plattformen er stanset, vent ca 30 sek og ta ut vektor løsning.Merk: Optimal permeabilization oppstår i nærheten av et dynamisk trykk på 100 til 200 Pa ved dyseutløpet, avhengig av diameteren kapillarrøret.
- Vask godt tre ganger med 1x PBS.
- Fyll godt med frisk kultur media.
- Gjenta trinn 4.3 til 4.6 for ønsket antall eksperimenter. Merk: Sørg for å inkludere kontrollprøver som består av brønnene blir fylt med vektoren løsning uten gasstråle å kjøre over dem. La oppløsningen i kontrollbrønnene i ca 1 min og deretter gå videre til trinn 4,5 og 4,6.
- Ved å kjøre et hrGFP transfeksjon eksperiment, returnere til 6-brønns plate i inkubator i 24 timer for å tillate transfektert materialet som skal transkriberes i cellene. Ved å kjøre et dekstran permeabilization eksperiment, returnere til 6-brønns plate i inkubator i 15 min.
5. Cell Imaging
- Hvis ønskelig, umiddelbart før bildebehandling, counterstain med passende levende / død flekken for å evaluere celledød.
- Bilde celler med hensiktsmessig mikroskop for å undersøke transfeksjon / permeabilization effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Permeabilization av HeLa-celler med 10 kDa grønt fluorescerende dextran ved hjelp av en heliumgasstråle med et 0,86 mm indre diameter kapillær er vist i figur 1.. Celler ble kontra umiddelbart etter permeabilization med 2 mL / ml EthD-ett-løsning (LIVE / DEAD Livskraftig / Cytotoksisitet Kit) for å visualisere celledød. Umiddelbart etter kontra, ble dekkglass montert og avbildes. Denne figuren viser resultatet av å drive heliumgass jet ved tre forskjellige utløpstrykk, sammenlignet med en kontrollprøve. Legg merke til at permeabilization sporbredde og effektivitet øker med høyere dynamisk trykk og celledød bare viste en liten økning (A og B). Imidlertid, når et høyt dynamisk trykk var nådd, ble HeLa-cellene strippet fra dekkglass og svært lite omkrets permeabilization oppstått. En mer detaljert analyse av celle stripping og transfeksjon effektivitet ble tidligere utført av Chouinard-Pelletier et al. 15
Ved scanning elektronmikroskopi-undersøkelser, ble det observert mikroporer i cellemembranen (figur 2). Permeabilization av HeLa-celler ble utført ved hjelp av en heliumgasstråle med et 0,86 mm indre diameter kapillær ved et utløpstrykk på 300 Pa Etter permeabilization protokollen, ble cellene øyeblikkelig fiksert med 1% paraformaldehyd løsning i 1 x PBS.
Figur 1. Permeabilization av HeLa-celler med 10 kDa grønt fluorescerende dextran ved hjelp av en heliumgasstråle med et kapillær dyse indre diameter på 0,86 mm. Dextran fluorescerer grønne og døde celler fluorescerer rødt. A) Dynamisk trykk på 100 Pa, B) av 135 Pa, og C ) av 175 Pa D) Kontroll med dekstran lagt bUT Ingen eksponering for helium gass jet.
Figur 2. SEM-bilder med en forstørrelse på 50 000 X av overflaten av HeLa-celler etter gasstråle permeabilization ved 300 Pa A) Kontrollprøve oppviser en jevn celleoverflate. B) Overflate av permeabilized celle som oppviser en pore med en 84 nm diameter. klikk her se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inert gasstråle permeabilization er en nyttig teknikk for vedheftende celle transfeksjon. Den gir mulighet til å overføre biomolekyler inn i celler ved bruk av mekaniske krefter, noe som eliminerer behovet for potensielt skadelige kjemikalier eller virale vektorer. Teknikken kan potensielt gi forskere og klinikere en effektiv og relativt enkel måte å nøyaktig transfektere celler. Selektiviteten av permeabilization er også unik slik at forskere bare behandle visse celler i en enkelt koloni som kan være nyttig i mange anvendelser.
Flere parametre kan justeres for individuell eksperimentering som kapillær dyse diameter og vinkel-, gass-strømningshastighet, væske-og kapillær høyde, cellelinje, målbiomolekyl som skal benyttes, og typen av inert gass. Et sett væskenivå og kapillær høyde er blitt beskrevet i fremgangsmåten, og disse verdier ble valgt for å minimere antall variabler som er involvert i vårt experimeNTS. Foreløpig er vi modellere systemet ved hjelp av eksperimentelle flyt visualisering og computational fluid dynamics. Dette vil gi oss en bedre forståelse av hvilke krefter formidles på cellene, slik at vi kan bestemme permeabilization avhengighet av variabler som væskeegenskapene.
Det er viktig å legge merke til det maksimale dynamiske trykket der cellene kan overleve. Det ble funnet at når dynamiske trykk nærmet 200 Pa en gasstråledyse høyde på 3 mm, ble HeLa celle stripping sannsynlig. Dette stemmer med andre studier som Lu et al. Som observerte WT NR6 fibroblastcellelinje avløsning på 200-265 Pa 17. Hvis det oppstår store mengder stripping, bør en lavere gassmengde lindre dette problemet. Tilsvarende høye strømningshastigheter resulterer i celledød og falsk-positive resultater permeabilization. Når cellene er døde de vil bli gjennomtrengelig for molekyler og derfor døde celler kan forveksles permeabilized levende celler. Denanbefales derfor å gjennomføre en live / død analyse for å sikre at de permeabilized cellene er faktisk fortsatt i live. Død øker med økende trykk og vår lab fant at ved 390 Pa de fleste permeabilized HeLa cellene døde 15. Celleviabilitet over en lengre tidsperiode er også blitt undersøkt, med hrGFPII-1-ekspresjon ble observert opp til 72 timer post-permeabilization (data ikke vist). Videre studier er nå i gang for å undersøke levedyktigheten på enda lengre tidspoeng.
Hypotesen er at fluidskjærspenninger på de celler, som er opprettet av strålen av gass og forskyvningen av de medier, forårsake midlertidig forstyrrelse av celleplasmamembranen. Dette er den samme mekanisme foreslått for andre mer kompliserte fysikalske metoder slik som mikroboblekollaps og sonoporation 18.. Driftsbetingelsene for denne fremgangsmåte er avhengig av type av celler, feste til underlaget, mekaniske egenskaper av cellenog celle-veggen, molekyl av interesse, egenskaper av væsken og gassen, og de fysiske dimensjoner av oppsettet. Gjennom størrelseseksklusjons studier, har vi funnet at dekstran-molekyler som er større enn 40 kDa viser svært lav permeabilization virkningsgrad, og at en optimal dekstran størrelse er 10 kDa for eksperimentering 15.. Dette er viktig fordi det begrenser størrelsen av molekyler som kan permeabilized inn i celler ved bruk av denne protokoll. Så langt har vi bare undersøkt transfeksjon egenskaper plasmider. Videre studier vil avklare om større biter av genetisk materiale er i stand til å bli tilført ved hjelp av denne teknikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke følgende finansieringskilder: kanadiske Institutes of Health Research (CIHR), naturvitenskap og Engineering Research Council (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
