人肝细胞通过一个两步胶原酶灌注过程隔离

Summary

对于人肝细胞的分离的修饰的两步胶原酶灌注过程进行说明。此方法也可应用到其它哺乳动物的肝脏。孤立的肝细胞有很高的产量和活力提供，使他们在诸如肝再生，药代动力学和毒理学领域一个合适的模型进行科学研究。

Abstract

肝脏，具有特殊的再生能力的器官，进行了广泛的功能，如解毒，代谢和内环境稳定。因此，肝细胞的大量的各种研究问题的重要模式。特别是，使用人肝细胞是在药代动力学，毒理学，肝脏再生和转化研究的领域尤其重要。因此，这种方法提出了一个两步胶原酶灌注过程所描述的Seglen ¹分离的肝细胞的修改版本。

先前，肝细胞已被分离用机械的方法。然而，酶的方法已被证明是优良的肝细胞分离后保留其结构完整性和功能。本文提出的方法相适应前面对大鼠肝脏对人体肝片，结果在大产量的肝细胞为77±10％生存力的设计方法。主在此过程中不同的是血管cannulization的过程。此外，这里描述的方法也可以应用于从其它物种具有可比性的肝脏或血管体积的肝脏。

Introduction

的肝细胞悬液可以从肝脏通过机械或酶的方法来制备。用于制备全肝细胞的机械方法包括强迫肝脏通过干酪^2，摇晃了肝片与玻璃珠在卡恩振动筛^3，用玻璃匀浆器搭配宽松杵^4,5 等。多年来，机械方法已经跌出有利于因损坏细胞膜和分离肝细胞^6,7的功能丧失。因此，利用酶法的是目前对肝细胞的分离的主要方法。

采用酶法肝细胞的分离时，Berry和朋友⁸经由大鼠门静脉肝脏灌注胶原酶和透明质酸酶大幅提高。此灌注过程中使用的脉管系统，以允许所述酶接触到的大部分细胞紧密接触，从而导致一个增加6倍于肝细胞⁸的产率。进一步，这种方法产生的细胞保持其结构的完整性，几乎没有变换面内质网中分离成囊泡和无线粒体损伤^8。

此方法是由Seglen ^1，谁开创了一种两步灌注过程肝细胞分离改性。在此过程中，大鼠肝灌注用的Ca ^{2 +}的缓冲液随后灌注含Ca ^{2 +}的¹胶原酶缓冲液中。的Ca ^{2 +}的在第一步骤中除去，可以破坏桥粒，而所需的最佳胶原酶活性^1,9在第二步骤中添加的Ca ^{2 +}的。

鉴于上述公布的工作已在大鼠进行的，本文的目的是证明可用于肝细胞与来自嗡嗡声高生存能力的隔离的变形过程一个肝脏。利用人体肝细胞仍然是转化研究和验证利用动物模型实验非常重要。在这项研究中使用人类肝片通过人体组织和细胞研究基金会，国家控股的非营利基金会¹⁰收购与治理同意。经过病理学家删除什么需要诊断，肝片是从剩余的组织收集。由病理切片关组织形态是肝切除后的切缘获得的健康组织。

Protocol

1。灌注和隔离溶液的制备

1. 制备所需的肝片和肝细胞，根据表1中的隔离的灌注的解决方案。溶液可以贮存于4℃直至使用。
2. 无菌过滤器使用的是0.22微米的过滤器的所有解决方案。
3. 所有的解决方案，它们与肝脏接触应该是无菌的。

2。灌注设备和解决方案的研制

1. 应设置该设备的肝片的灌注， 如图1。
2. 水浴应设置在一个适当的温度，这是不同的每一个特定的实验装置，使得该解决方案是在37℃的温度时，它们到达肝片。在这种情况下，水浴设定为41℃预热的解决方案1，2和3和夹套玻璃冷凝器。溶液4应温热至37℃时在一个单独的水浴中使用，以减少胶原酶活性的丧失。
3. 不久肝脏灌注前，打开含有95％O _2/5％的CO ₂气充氧设备（ 图1E）液化气罐的调节器。

3。肝脏灌注

1. 一种肝片与尽可能多的完整Glisson囊越好，最好只用1切面应该从一个病理学家灌注得到。
2. 将本肝片上的布氏漏斗，其中包含一个穿孔的过滤盘（ 图1B）。
3. 灌注系统应填装与解决方案1。
4. 用低流量，弯曲灌溉套管用橄榄油提示应该被插入到较大血管的肝片的切割面。当血液从肝脏冲出来，在组织中具有良好的灌注区域变得更亮。用于各种尺寸的套管的数量肝脏是如图2A所示。选择的计大小应导致紧密贴合，将举行插管到位。较小的血管应由开放的灌注缓冲区排出肝片。
5. 增加对蠕动泵以取决于肝（ 图2B）之间的大小110-460毫升/分钟的流速。这将导致在44±16平均流速每插管毫升/分钟（ 图2C）。选择的速度取决于肝片，并应导致肝片轻微丰盈。在某些情况下，可能有必要以夹紧关闭一些打开的容器用微血管钳来实现上面提到的轻微丰盈。一个良好的灌注可以在肝脏部分是较亮的颜色在整个观察。
6. 用一块纱布浸泡在盐水覆盖它保持灌注期间肝片湿润。
7. 用1升溶液1灌注冲洗掉任意的remaining血液在肝脏件。
8. 灌注液变则通2和灌注10分钟。
9. 灌注液切换到解决方案3和灌注与0.5 L。
10. 改变灌注液解决方案4，其中包含胶原酶（ 表2）0.1-0.15％。
11. 对于此步骤，灌注应进行的循环方式进行9-12分钟，或直到肝被充分消化，肝组织应该出现相距稍微打破根据Glisson囊和手感变软时，与一个钝边探测手术刀。

4。肝细胞的分离

1. 关闭蠕动泵，并从肝片取出插管。
2. 将肝片含有100〜200毫升的解决方案5的结晶皿。
3. 小心地取出Glisson囊，轻轻地摇出的细胞。如果有未灌注良好的区域，手术刀可以用来切穿这些区域以释放包含在细胞中。添加更多的解决方案5的过程中，如需要。
4. 添加更多的解决方案5，直至500ml的终体积达到。
5. 过滤细胞悬浮液两次，先通过一个210微米的尼龙筛后跟一个70微米尼龙筛。接着，倒入细胞悬液入200ml离心管中。
6. 离心细胞悬浮液在72×g离心5分钟，在4℃下吸上清，轻轻重悬细胞沉淀轻轻地在200毫升溶液5。
7. 重复该洗涤步骤数4.6三次。在最后一步离心，重悬细胞在寒冷的存储解决方案（见材料清单）。细胞应该是使用血球为基础的台盼蓝染色，每毫升约2-5亿元用于肝细胞的产量和可行性评估。
8. 进行锥虫蓝排除测定，加0.1毫升适当稀释细胞（≈2-5百万/毫升）加入含有0.5毫升锥虫蓝SOLUTI的微量离心管（0.4％台盼蓝溶于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中）和0.4毫升的PBS。彻底混合细胞悬液后，装入血球与悬挂，并在显微镜放大100倍下检查。在显微镜下，死细胞会被染成蓝色，而活细胞出现不染。计数活和细胞总数中的每个标记在血细胞计数仪的1mm ²中网格的数量。活力（％），活细胞的产量（每毫升冷存储解决方案（CSS）的百万肝细胞或每克肝亿元肝细胞）可以使用下面的公式计算。

注意：在这种情况下，台盼蓝稀释因子为10，血球因子是10,000。

Representative Results

灌注设置

所需的肝灌注的设备应根据图1进行设定。

生存能力和人离体肝细胞的产量

人离体肝细胞的平均存活率为77±10％和肝细胞的平均收益率为13±11000000肝细胞/克肝，与表达的价值观为平均值±标准偏差。肝细胞隔离的数量进行了获取这些平均值是648隔离开展了1999年1月至2012年12。

适合灌注参数

为了进行成功的潮红和肝脏的灌注，用套管的数量应根据肝脏（ 图2A）的重量而变化。在一般情况下，4-8套管应当用于肝脏范围从低于20克至80克灌注的合适的速率，这也依赖于肝脏的重量，应选择对肝（ 图2B和C）的一个成功的灌注。已经发现，44毫升/分钟的插管^-1的平均灌注速度是通过一系列不同的肝脏重量理想，因此，灌注速度应当适当调整，如果多个套管的使用。如果灌注成功，应该肝脏的颜色是苍白，微微扑通起来。

肝细胞的纯度

通过免疫荧光的手段，人们发现，分离的肝细胞，其中污垢正为白蛋白，具有94±1％的纯度（N = 4与5个重复的每个）（ 图3A和B）。图3C是一个代表相位对比图像表示肝细胞如大细胞大小和形状的多角形细胞的形态特征。

图1。灌注设置（A）泡沫陷阱，（B）肝片采用弧形灌溉套管与布氏漏斗，（C）玻璃夹套冷凝器，（D）水浴，（E）充氧设备插入血管橄榄提示，（ F）95％O _{2/5％CO 2}气体罐和（G）的蠕动泵。

图2套管（A）的数量使用，（B）灌注率（毫升/分钟），或（C）灌注率（毫升/分钟^。 一个显着的不同0-20克条件，P ^<0.05，AB从20-40克,40-60克和60-80克条件，P <0.05显着差异。

图3。分离的细胞为阳性（A）白蛋白（染色为绿色）和相应的（B）的阴性对照（200X放大倍率）的免疫荧光图像。细胞核用DAPI染色为蓝色（C）相衬分离的细胞的图像（放大100倍）。

解	组分	终浓度
解决方案1	氯化钠	154毫米
	HEPES	20毫米
	氯化钾	5.6毫米
	葡萄糖	5毫米
	碳酸氢钠	25毫米
解决方案2	氯化钠	152.5毫米
	HEPES	19.8毫
	氯化钾	5.5毫米
	葡萄糖	5.0毫米
	碳酸氢钠	24.8毫
	EGTA	0.1毫米
要准备解决方案2，加入10毫升100毫米EGTA到990 ml的溶液1。			解决方案3	氯化钠	152.5毫米
	HEPES	19.8毫
	氯化钾	5.5毫米
	葡萄糖	5.0毫米
	碳酸氢钠	24.8毫
	氯化钙二水合物	0.5微米
要准备解决方案3，加入10毫升0.5M的氯化钙二水到990 ml的溶液1。
解决方案4	氯化钠	152.5毫米
	HEPES	19.8毫
	氯化钾	5.5毫米
	葡萄糖	5.0毫米
	钠HYDROGEN碳酸盐	24.8毫
	氯化钙二水合物	0.5微米
	胶原酶	见表2
要准备解决方案4，加入胶原酶适量解决方案3。
解决方案5	氯化钠	120毫
	HEPES	10毫米
	氯化钙二水合物	0.9毫米
	氯化钾	6.2毫米
	白蛋白	0.1％w / v的

表1中。灌注和隔离解决方案。

肝片的规格（g）	胶原酶浓度（％）	胶原酶活性（U / ml的）
<25	0.10	250
25 - 40	0.11	300
41 - 80	0.13	350
> 80	0.15	400

表2。被用于各种大小的肝片（克）胶原酶浓度（％）和活动（U /毫升）。

Discussion

该协议将导致人肝细胞具有较高的可行性和纯度的隔离。为了达到这些效果，它开始与适当的一块肝脏是重要的。这件作品肝应该有完整的Glisson囊在所有表面除1切面。另一个重要的因素是特定批次胶原酶使用，因为不同批次可能导致消化¹¹后在肝细胞的存活率显着差异。因此，胶原酶不同批次应进行测试并产生肝细胞具有最佳活力批次应在大量获得。最后，合适的消化时间具有基于获得的细胞的产率和存活率被选择。例如，高生存力低收益率可能表明消化时间不足，以及高产量，低生存能力可能表明，消化时间太长。

此方法可适应吨Ø隔离同一块肝非实质细胞和肝细胞。这样做的一种方法是使用将上清液从所述第一离心分离步骤（步骤4.6）直接用于非实质细胞的分离^12。第二种方法是，通过尼龙网为肝细胞分离（步骤4.5）过滤后除去细胞悬浮液的等分试样所需的和受到剩余的细胞悬浮液之前非实质细胞的分离的附加的链霉蛋白酶消化步骤，以增加的产率非实质细胞^13。对于较高的产量非实质细胞在肝细胞为代价的，这种方法可以通过单独代胶原酶（步骤3.10），用于链霉蛋白酶和胶原酶和使用所得到的细胞悬浮于非实质细胞分离¹⁴进行修改。

除了分离的人肝细胞，这种方法提出了也可以适用于从往复收集肝片分离的肝细胞M其他品种相媲美的尺寸或类似血管的大小。这可能是研究人员谁使用替代机型，如猪，狗或灵长类动物模型非常重要。

通常做的人肝细胞的隔离使用肝脏有两个来源：全肝被视为不适合移植或形态正常肝组织的切除边缘。在该方法中使用后者源的优点在于，肝片提供给实验室越快。立即切除后，切除的肝脏被带到一个病理学家谁删除什么是需要进​​行诊断。那么病理学家会从什么是定于抛弃移除一块合适形态正常肝脏的肝细胞分离。在一般情况下，肝片到达在实验室准备灌注中的56±29分钟（N = 103）的平均时间。相比较而言，整个肝脏是不适合移植只会是rel回落至13±2小时，16±12小时¹⁵之间的实验室。此外，由于伦理方面的考虑和供肝的短缺，从那些不符合所有的标准移植整个肝脏的肝细胞分离，避免在欧洲移植区。这是因为这些肝脏仍然可以被用于移植与扩展供体的标准。一些研究表明，最大限度地提高患者获得移植的结果减少等待名单死亡率和令人满意的成果向选定的收件人^16,17。另一个优点是，从肝切除件获得的细胞从形态学上健康的肝脏中分离，而肝脏不适合移植可以是脂肪肝，肝纤维化或肝硬化。因此，这里的方法产生高收益率的13±11万架次克肝细胞相比，0.7±0.3万元或3±2万元左右克肝经Baccarani， 等人获得的肝细胞¹⁵使用肝硬化或脂肪肝的分别。然而，肝切除部分导致肝细胞更低的总收益为可用一块的规模普遍较小，变化范围为2-250克，平均37±29克（N = 648）。

相对于其他群体，这个协议避免使用氰基丙烯酸酯粘合剂。亚历山大等人 ¹⁸发现使用氰基丙烯酸乙酯，一种常用的万能胶，以覆盖的肝脏，导致肝细胞的增加的产量为每克3.5±0.7到6.0±1600000肝细胞的切断面肝与表达手段的值±平均值的标准误差。相比较而言，该协议是能够实现的13.5±0400000每克肝（表示为平均值±平均值的标准误差）的肝细胞，而无需使用氰基丙烯酸酯粘合剂的产率。同时氰基丙烯酸酯粘合剂已用于伤口闭合<SUP> 19,20，医用级氰基丙烯酸酯粘合剂，如氰基丙烯酸辛酯和氰基丙烯酸正丁酯相比，可以氰基丙烯酸乙酯是昂贵的。然而，如乙基氰基丙烯酸短链衍生物已被发现是比长链衍生物^21,22更histotoxic。

这种方法更简单，更高效的时间，由于使用的弯曲灌溉套管用橄榄油提示。适当大小的使用插管将导致在保存中发生的套管，而无需使用胶水¹⁸或缝合线²³的紧密配合。所使用的套管的直径范围为1-2毫米，从1.25-4.5毫米大小的尖端直径。各种套管大小的种类应当提供当肝片已准备就绪插管，从而使适当大小的插管用于特定的血管，可以选择如在随附的视频。此方法还利用了普通多个套管（ 图2A）相比，其中2 ²³或2-4 ¹⁸导管用于其他研究。这可有助于实现更好的灌注在整个肝片导致高生存力和在较短的消化期间产率。

总之，这个协议株人肝细胞，这是研究细胞代谢，药代动力学和外源性化学物质的毒性，肝再生和转化研究的重要模式。 150上的药物，造成人体毒性先前的调查显示，在临床实践中观察到的毒性在动物实验中发现之间的一致性为^{70％，24。}因此，人肝细胞仍然是验证研究在动物模型中进行，以测试药物才去临床试验导致不良反应的重要模式。此外，使用人肝细胞的残肝样品或肝细胞中分离的分离屠宰场的动物²⁵作为一种模式是与3R道德框架²⁶线来代替使用实验动物时可能的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bubble trap	Gaßner Glastechnik
Glass jacketed condenser	Gaßner Glastechnik
41 °C Water bath	Julabo	35723-H24/EG
37 °C Water bath	GFL	1083
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)	Linde
Gas permeable tubing	Neolab	2-4440
Peristaltic pump	Ismatec	IP65
Scalpel	Feather	320010
Forceps	Omnilab	5171014
Conical flasks 1 L	Schott Duran	2121654
Conical flasks 5 L	Schott Duran	2121673
Beakers	Schott Duran	2110654
200 ml centrifuge tubes	Becton Dickinson	352075
Crystallizing dish	Omnilab	5144063
Curved irrigation cannulae with ball tips	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Micro vascular clamps	Ernst Kratz GmbH
Büchner funnel	Carl Roth	HT38.1
Nylon mesh 210 μm	Neolab	4-1413
Nylon mesh 70 μm	Neolab	4-1419
0.22 μm sterile filters	Peske	99505
500 ml bottles	Schott Duran	2180144
1 L bottles	Schott Duran	2180154
Hemocytometer	Peske	06-0001
1.5 ml tubes	Eppendorf	0030 120,086
50 ml conical tubes	BD Biosciences	352070
Ice bucket	Neolab	1508454
Sterile Pasteur pipettes	Brand	747715
Motorised pipette filler (Pipette boy acu)	Integra	155017
Refridgerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Laminar flow	Kendro	Hera safe-KS9
Aspirator (Low-flow surgical suction pump)	Atmos	C361
Laboratory Gas Burner	Integra	Fire Boy eco
Disposable laboratory coat	Paperlynen GmbH	MD0202414
Surgical mask with visor	Kimberly-Clark	48247
Surgical hood	Barrier	42072
Latex gloves	Semper Care	CE0321
Collagenase (Batch number NB 4G)	Serva	17465
Calcium chloride dihydrate	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Sodium chloride	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Potassium chloride	Serva	26868
Albumin	Biomol	01400-2
Glucose	Serva	22700
Sodium hydrogen carbonate	Serva	30180
0.4% Trypan blue solution	Lonza	17-942E
Cold storage solution	Hepacult GmbH