ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Een gewijzigde tweefasige collagenase perfusie procedure voor isolatie van humane hepatocyten is beschreven. Deze methode kan ook worden toegepast op andere zoogdieren levers. De geïsoleerde hepatocyten zijn beschikbaar in hoge opbrengst en haalbaarheid, waardoor ze een geschikt model voor wetenschappelijk onderzoek op gebieden zoals lever regeneratie, farmacokinetiek en toxicologie.
Abstract
De lever, een orgaan met een uitzonderlijk regeneratiecapaciteit, voert een groot aantal functies, zoals ontgifting, metabolisme en homeostase. Als zodanig, hepatocyten zijn een belangrijk model voor een grote verscheidenheid van vraagstellingen. Met name het gebruik van menselijke hepatocyten is bijzonder belangrijk op het gebied van farmacokinetica, toxicologie, leverregeneratie en translationeel onderzoek. Aldus stelt deze werkwijze een gemodificeerde versie van een tweefasige collagenase perfusie procedure hepatocyten te isoleren zoals beschreven door Seglen 1.
Eerder hebben hepatocyten werden geïsoleerd door mechanische methoden. Echter enzymatische werkwijzen aangetoond superieur als hepatocyten behouden hun structurele integriteit en functie na isolatie. De hier gepresenteerde methode past de werkwijze eerder ontworpen rat lever menselijke lever stukken en resulteert in een grote opbrengst van hepatocyten met een levensvatbaarheid van 77 ± 10%. De belangrijksteverschil in deze procedure is het proces van cannulization van de bloedvaten. Verder kan de beschreven werkwijze ook toegepast worden levers van andere soorten met vergelijkbare lever of bloedvat maten.
Introduction
Een lever celsuspensie kan worden bereid uit de lever door mechanische of enzymatische werkwijzen. Mechanische methoden gebruikt om hele levercellen bereiden omvatten waardoor de lever door kaasdoek 2, schudden van een lever stuk met glazen kralen in een Kahn shaker 3, het gebruik van glas homogeniseerders met losse stampers 4,5 etc. In de loop der jaren zijn mechanische methoden van gevallen gunst vanwege de schade aan celmembranen en functieverlies van de geïsoleerde hepatocyten 6,7. Bijgevolg is het gebruik van een enzymatische Tegenwoordig is de belangrijkste methode voor isolatie van de hepatocyten.
Isolatie van hepatocyten met behulp van een enzymatische methode is sterk verbeterd toen Berry en vriend 8 doorbloed collagenase en hyaluronidase door de lever via de poortader in ratten. Dit perfusieproces gebruikt de vasculatuur om de enzymen in nauw contact met de meerderheid van de cellen te komen, waardooreen 6-voudige toename in opbrengst van hepatocyten 8. Verder is deze methode leverde cellen die hun structurele integriteit behouden, met vrijwel geen verandering van endoplasmatisch reticulum in geïsoleerde blaasjes en geen mitochondriale schade 8.
Deze methode werd gewijzigd door Seglen 1, die een twee-staps procedure perfusie pionier voor levercel isolement. In deze procedure wordt de rattenlever geperfuseerd met een Ca2 + vrije buffer gevolgd door perfusie met collagenase buffer die Ca 2 + 1. De verwijdering van Ca2 + in de eerste stap helpt desmosomen verstoren, terwijl de toevoeging van Ca2 + in de tweede stap is vereist voor optimale collagenase activiteit 1,9.
Aangezien het gepubliceerde werk hierboven beschreven uitgevoerd bij ratten dit artikel beoogt een gewijzigde procedure die kan worden gebruikt voor isolatie van hepatocyten met hoge levensvatbaarheid van brom toneneen levers. Het gebruik van menselijke hepatocyten blijft belangrijk voor translationeel onderzoek en voor het valideren van experimenten met diermodellen. De menselijke lever stukken die in deze studie werden met toestemming van het bestuur overgenomen door de Human Tissue en Cell Research Foundation, een door de staat gecontroleerde non-profit stichting 10. Na een patholoog verwijderd wat nodig is voor diagnose, werden lever stukken vanuit het restmateriaal. Het weefsel afgezet door de patholoog was morfologisch gezond weefsel verkregen van resectie marges na leverresectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van perfusie en isolatie oplossingen
- Bereid de voor de perfusie van de lever stuk en isolatie van hepatocyten volgens tabel 1 oplossingen. Oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C tot gebruik.
- Steriele filter alle oplossingen met behulp van een 0,22 pm filter.
- Alle oplossingen die in contact komen met de lever moet steriel zijn.
2. Voorbereiding van de perfusie apparatuur en oplossingen
- Apparatuur voor de perfusie van de lever stuk moeten worden opgezet, zoals weergegeven in figuur 1.
- Het waterbad moet worden vastgesteld op een geschikte temperatuur, die verschillend is in elk afzonderlijk experimentele set-up, zodat de oplossingen bij de temperatuur van 37 ° C, als ze de lever stuk te bereiken. In dit geval wordt het waterbad van 41 ° C voor verwarming van de oplossingen 1, 2 en 3 en het dubbelwandige glazen condensor. Oplossing 4 moet worden opgewarmd tot37 ° C in een afzonderlijke waterbad voor het verlies van collagenase activiteit te verminderen.
- Kort voor leverperfusie, zet de regulator van de gas tank met 95% O 2/5% CO 2 aan de zuurstofvoorziening apparaat (figuur 1E) gas.
3. Perfusie van de lever
- Een lever stuk met zoveel intacte Glisson capsule mogelijk en bij voorkeur met slechts 1 snijvlak moet worden verkregen van een patholoog voor perfusie.
- Plaats deze lever stuk op de Büchner trechter die een geperforeerde filter disc (Figuur 1B) bevat.
- De perfusie systeem moet worden gegrond met Oplossing 1.
- Met een lage stroomsnelheid, moet gebogen irrigatie canules met olijf-tips in de grotere bloedvaten worden ingebracht op het snijvlak van de lever stuk. Zoals bloed spoelt uit de lever, het weefsel wordt lichter in gebieden met een goede doorbloeding. Het aantal canules voor verschillende matenlevers wordt getoond in figuur 2A. De meterformaat gekozen zou moeten resulteren in een goede pasvorm die de canules zijn plaats houdt. De kleinere bloedvaten open moet staan voor de perfusie buffer eruit lopen van de lever stuk worden gelaten.
- Verhoog de stroomsnelheid van de peristaltische pomp tussen 110-460 ml / min afhankelijk van de grootte van de lever (Figuur 2B). Dit resulteert in een gemiddelde stroomsnelheid van 44 ± 16 ml / min per canule (figuur 2C). De gekozen snelheid is afhankelijk van de lever stuk en moet resulteren in een lichte plumping up van de lever stuk. In sommige gevallen kan het nodig zijn om klemmen sluiten enkele open vaten met microvasculaire klemmen de lichte plumping bovengenoemde bereiken. Een goede perfusie kan worden waargenomen wanneer de lever stuk is een lichtere kleur overal.
- Houd de lever stuk vochtig tijdens perfusie door te bedekken met een gaasje gedrenkt in een zoutoplossing.
- Perfuse met 1 L van Oplossing 1 te spoelen elke remaining bloed in de lever stuk.
- Wijzig de perfusievloeistof naar oplossing 2 en perfuseren gedurende 10 minuten.
- Schakel de perfusie vloeistof Oplossing 3 en perfuseren met 0,5 L.
- Wijzig de perfusievloeistof Oplossing 4, die 0,1-0,15% collagenase (tabel 2) bevat.
- Voor deze stap perfusie worden uitgevoerd in een recirculerende wijze uitgevoerd gedurende 9-12 min of totdat de lever voldoende verteerd, het leverweefsel zou lijken enigszins uit elkaar breken onder de Glisson capsule en voelen zacht wanneer onderzocht met de botte kant van een scalpel.
4. Isolatie van Hepatocyten
- Schakel de peristaltische pomp en verwijder cannulae uit de lever stuk.
- Leg de lever stuk in een kristallisatieoplosmiddel schotel met 100-200 ml Oplossing 5.
- Verwijder de Glisson capsule zorgvuldig en schud uit de cellen. Als er gebieden die niet goed doorbloed, kan een scalpel gebruikt doorsnijdendeze regio cellen bevat binnen vrijkomen. Voeg meer Oplossing 5 indien nodig tijdens het proces.
- Voeg meer 5 oplossing tot een eindvolume van 500 ml wordt bereikt.
- Filter celsuspensie tweemaal, eerst door een 210 um nylon mesh, gevolgd door een 70 um nylon mesh. Vervolgens giet de celsuspensie in 200 ml centrifuge buizen.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 72 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zuig supernatant en voorzichtig resuspendeer celpellet voorzichtig in 200 ml oplossing 5.
- Herhaal de wasstap nummer 4.6 drie keer. Op de laatste centrifuge stap, resuspendeer cellen in koude opslag-oplossing (zie de lijst van materialen). De cellen moet ongeveer 2,5 miljoen hepatocyten per milliliter voor de beoordeling van opbrengst en levensvatbaarheid behulp van een hemocytometer gebaseerde trypan blauw exclusietest.
- Voor het uitvoeren van een trypan blauw exclusietest, voeg 0,1 ml geschikt verdunde cellen (≈ 2,5 miljoen / ml) een microcentrifugebuis die 0,5 ml trypan blauw solution (0,4% trypan blauw opgelost in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)) en 0,4 ml PBS. Na het mengen van de celsuspensie grondig, laadt een hemocytometer met de schorsing en onderzoeken onder een microscoop op 100X vergroting. Onder microscopie, zal de dode cellen blauw worden gekleurd, terwijl de levende cellen verschijnen ongekleurd. Tel het aantal levende en de totale cellen in elk van de 1 mm 2 roosters die op de hemocytometer. Levensvatbaarheid (%) opbrengst van levende cellen (hepatocyten miljoen per ml koeloplossing (CSS) of hepatocyten miljoen per g lever) kan worden berekend met de volgende formules.
Opmerking: In dit geval, de trypan blauw verdunningsfactor 10 en de hemocytometer factor 10.000.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Perfusie Setup
De voor leverperfusie apparatuur moet worden ingesteld volgens figuur 1.
Levensvatbaarheid en de opbrengst van geïsoleerde humane hepatocyten
De gemiddelde levensvatbaarheid van geïsoleerde menselijke hepatocyten was 77 ± 10% en de gemiddelde opbrengst van hepatocyten was 13 ± 11 miljoen hepatocyten / g lever, met uitgedrukt als gemiddelden ± standaardafwijking. Het aantal hepatocyt isolaties uitgevoerd om te krijgen deze gemiddelden was 648 isolaties vanaf januari 1999 uitgevoerd tot en met december 2012.
Geschikte perfusieparameters
Voor het uitvoeren van een succesvolle spoelen en perfusie van de lever, dient het aantal canules gebruiken hangt af van het gewicht van de lever (Figuur 2A). In het algemeen moet 4-8 canules worden gebruikt levers vinden onder 20 g tot meer dan 80 g. Een geschikte snelheid van de perfusie, Die ook afhankelijk levergewicht, moet worden gekozen voor een succesvolle perfusie van de lever (figuren 2B en C). Gebleken is dat een gemiddelde perfusie snelheid van 44 ml / min canule -1 ideaal over een scala van verschillende levergewicht en dus de perfusie snelheid moeten dienovereenkomstig worden aangepast als er meer canules worden gebruikt. Als perfusie succesvol is, moet de lever bleek te zijn in kleur en licht opgevuld.
Zuiverheid van hepatocyten
Door middel van immunofluorescentie bleek dat geïsoleerde hepatocyten, die vlek positief voor albumine, had een zuiverheid van 94 ± 1% (N = 4 met 5 replicaten) (Figuren 3A en B). Figuur 3C beeld representatief is fasecontrast die de morfologische kenmerken van hepatocyten zoals grote celgrootte en Polygonale-cellen.
Figuur 1. Perfusie setup. (A) Waterventiel, (B) lever stuk met gebogen irrigatie canules met olijf tips opgenomen in de bloedvaten op een Büchner trechter, (C) glas jacketed condensor, (D) waterbad, (E) oxygenatie apparaten, ( F) 95% O 2/5% CO 2-gas tank en (G) peristaltische pomp.
Figuur 2. (A) Het aantal canules gebruikt, (B) perfusie (ml / min), of (C) perfusie (ml / min. Een significant verschilt van de 0-20 g conditie, P <0,05. ab significant verschillend van de 20-40 gram, 40-60 gram en 60-80 gram staat, P <0,05.
Figuur 3. Immunofluorescente beelden van geïsoleerde cellen positief voor (A) albumine (gekleurd in het groen) en de bijbehorende (B) negatieve controle (200X vergroting). Kernen (C) Fase contrast beeld van geïsoleerde cellen (100X vergroting) gekleurd in het blauw met behulp van DAPI..
| Oplossing | Bestanddeel | Eindconcentratie | |||
| Oplossing 1 | Natriumchloride | 154 mM | |||
| HEPES | 20 mM | ||||
| Kaliumchloride | 5,6 mM | ||||
| Glucose | 5 mM | ||||
| Natriumwaterstofcarbonaat | 25 mM | ||||
| Oplossing 2 | Natriumchloride | 152.5 mM | |||
| HEPES | 19.8 mM | ||||
| Kaliumchloride | 5,5 mM | ||||
| Glucose | 5,0 mM | ||||
| Natriumwaterstofcarbonaat | 24,8 mM | ||||
| EGTA | 0,1 mM | ||||
| Om Oplossing 2 te bereiden, voeg 10 ml 100 mM EGTA tot 990 ml van oplossing 1. | Oplossing 3 | Natriumchloride | 152.5 mM | ||
| HEPES | 19.8 mM | ||||
| Kaliumchloride | 5,5 mM | ||||
| Glucose | 5,0 mM | ||||
| Natriumwaterstofcarbonaat | 24,8 mM | ||||
| Calciumchloridedihydraat | 0,5 uM | ||||
| Oplossing 3 te bereiden, voeg 10 ml 0,5 M calciumchloride dihydraat om 990 ml oplossing 1. | |||||
| Oplossing 4 | Natriumchloride | 152.5 mM | |||
| HEPES | 19.8 mM | ||||
| Kaliumchloride | 5,5 mM | ||||
| Glucose | 5,0 mM | ||||
| Natrium hydrOgen carbonaat | 24,8 mM | ||||
| Calciumchloridedihydraat | 0,5 uM | ||||
| Collagenase | Zie tabel 2 | ||||
| Oplossing 4 te bereiden, voeg juiste hoeveelheid collagenase te Oplossing 3. | |||||
| Oplossing 5 | Natriumchloride | 120 mm | |||
| HEPES | 10 mM | ||||
| Calciumchloridedihydraat | 0.9 mM | ||||
| Kaliumchloride | 6,2 mm | ||||
| Albumine | 0,1% w / v | ||||
Tabel 1. Perfusie en isolatie oplossingen.
| Omvang van de lever stuk (g) | Collagenase concentratie(%) | Collagenase activiteit (U / ml) |
| <25 | 0.10 | 250 |
| 25-40 | 0.11 | 300 |
| 41-80 | 0.13 | 350 |
| > 80 | 0.15 | 400 |
Tabel 2. Collagenase concentraties (%) en activiteiten (U / ml) wordt gebruikt voor verschillende maten lever stukken (g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol resulteert in de isolatie van humane hepatocyten met een hoge levensvatbaarheid en zuiverheid. Om dit te bereiken, is het belangrijk om te beginnen met een geschikt stuk lever. Het stuk van de lever moeten intact Glisson capsule op alle oppervlakken met uitzondering van 1 snijvlak hebben. Een andere belangrijke factor is de bepaalde partij collagenase worden gebruikt als verschillende partijen kan leiden tot grote verschillen in de levensvatbaarheid van hepatocyten na digestie 11. Daarom moeten verschillende batches van collagenase worden getest en de partij die hepatocyten produceert de beste levensvatbaarheid te worden verkregen in grote hoeveelheden. Tenslotte geschikte digestietijd worden gekozen op basis van de opbrengst en levensvatbaarheid van de verkregen cellen. Bijvoorbeeld, zou een hoge rentabiliteit, lage opbrengst onvoldoende vertering tijd geven, en een hoog rendement met een lage levensvatbaarheid zou erop kunnen wijzen dat de spijsvertering te lang is.
Deze methode kan worden aangepast to isoleren niet-parenchymcellen en hepatocyten van dezelfde lever stuk. Een manier om dit te doen is het supernatant te gebruiken van de eerste centrifugatie stap (stap 4.6) direct voor niet-parenchymale cel isolatie 12. Een tweede manier is om de vereiste hoeveelheid celsuspensie verwijderd na filtratie over nylon gaas voor hepatocyt isolatie (stap 4.5) en met de resterende celsuspensie een extra pronase digestiestap vóór niet-parenchymale cel isolatie om de opbrengst aan vergroten niet-parenchymale cellen 13. Voor een hogere opbrengst van niet-parenchymale cellen ten koste van de hepatocyten, kan deze werkwijze worden gemodificeerd door substitutie collagenase alleen (stap 3.10) voor pronase en collagenase en met de verkregen celsuspensie voor niet-parenchymale cel isolatie 14.
Naast het isoleren van humane hepatocyten, kan deze werkwijze gepresenteerd worden aangepast aan hepatocyten te isoleren van lever stukken fro verzameldm andere soorten met vergelijkbare afmetingen of vergelijkbare vaatstelsel maten. Dit kan van belang voor onderzoekers die alternatieve modellen te gebruiken, zoals varkens, honden of primaten modellen.
Isolaties van menselijke hepatocyten zijn over het algemeen gedaan met behulp van levers uit twee bronnen: hele levers ongeschikt voor transplantatie of morfologisch normale leverweefsel van resectie marges geacht. Het voordeel van deze bron in deze werkwijze is dat de lever stukken sneller naar een laboratorium worden gemaakt. Onmiddellijk na resectie, wordt de uitgesneden lever een patholoog die verwijderd wat nodig is voor diagnose gesteld. De patholoog zal dan verwijderen van een geschikt stuk van morfologisch normale lever voor hepatocyt isolatie van wat is gepland voor het teruggooien. In het algemeen, een lever stuk komt in het laboratorium klaar voor perfusie in een gemiddelde tijd van 56 ± 29 min (N = 103). In vergelijking zal geheel levers die niet geschikt zijn voor transplantatie zijn alleen rel zijnversoepeld naar het laboratorium tussen 13 ± 2 uur en 16 ± 12 uur 15. Bovendien vanwege ethische overwegingen en het tekort aan donor levers, isolatie van hepatocyten uit hele levers die niet aan alle criteria voor transplantatie voldoen wordt vermeden Eurotransplant regio. Dit komt omdat deze levers nog kunnen worden gebruikt voor transplantatie met uitgebreide donorcriteria. Sommige studies hebben aangetoond dat patiënten maximale toegang tot transplantatie geeft een vermindering wachtlijst sterfte en bevredigende uitkomsten geselecteerde ontvangers 16,17. Een ander voordeel is dat de verkregen leverresectie stukken cellen geïsoleerd van morfologisch normale lever, terwijl levers ongeschikt voor transplantatie steatotic, fibrotische of cirrose kan zijn. Als zodanig, de werkwijze hier resulteert in een hoge opbrengst van 13 ± 11 miljoen hepatocyten per gram lever tegenover 0,7 ± 0,3 miljoen of 3 ± 2 miljoen hepatocyten per gram lever verkregen Baccarani, c.s.. 15 gebruiken met cirrose of steatotic levers respectievelijk. Echter, leverresectie stukken tot een lagere totale opbrengst van hepatocyten als de grootte van het stuk beschikbare algemeen klein met een bereik 2-250 g en een gemiddelde van 37 ± 29 g (n = 648).
In vergelijking met andere groepen, dit protocol wordt het gebruik van cyanoacrylaat kleefstoffen. Alexandre et al.. 18 vonden dat het gebruik van ethyl-cyanoacrylaat, een veelgebruikte alle doeleinden lijm, aan de snijvlakken van de lever leidt tot een verhoogde opbrengst van hepatocyten van 3,5 ± 0,7-6,0 ± 1,6 miljoen per gram hepatocyten dekking lever met uitgedrukt in gemiddelden ± standaardfout van het gemiddelde. In vergelijking, dit protocol kan met een opbrengst van 13,5 ± 0,4 miljoen hepatocyten per g lever (uitgedrukt in gemiddelden ± standaardfout van het gemiddelde) zonder gebruik van cyanoacrylaat kleefstoffen bereiken. Terwijl cyanoacrylaat kleefstoffen werden gebruikt voor wondsluiting <sup> 19,20, medische kwaliteit cyanoacrylaatlijmen zoals octyl cyanoacrylaat en butylcyanoacrylaat kan duur zijn in vergelijking met methylcyanoacrylaat. Echter kortere keten derivaten zoals ethyl cyanoacrylaat gevonden meer dan histotoxische langere keten derivaten 21,22 zijn.
Deze werkwijze is eenvoudiger en tijdbesparend door het gebruik van gebogen irrigatie canules met olijf tips. Het gebruik van canules van de maat resulteert in een strakke pasvorm die de canules plaats houdt zonder het gebruik van lijm 18 of hechtingen 23. De canules gebruikt hebben diameters variërend 1-2 mm met tip diameters formaat 1,25-4,5 mm. Een assortiment van verschillende canule afmetingen beschikbaar te stellen bij een levertransplantatie stuk gereed voor een canule, zodat de juiste maat canule voor een bepaald bloedvat worden gekozen als aangegeven in de bijgaande video. Deze werkwijze gebruikt ook canules in het algemeen (figuur2A) in vergelijking met andere studies waarbij 2 of 23 2-4 18 canules worden gebruikt. Dit kan helpen om een betere perfusie gehele lever stuk leidt tot hoge levensvatbaarheid en opgevangen in een kortere digestieperiode bereiken.
Kortom: dit protocol isoleert humane hepatocyten, die een belangrijk model voor het bestuderen van cellulaire stofwisseling, farmacokinetiek en toxicologie van xenobiotica, lever regeneratie en translationeel onderzoek zijn. Een eerdere enquête over 150 drugs die humane toxiciteit veroorzaken toonde aan dat de overeenkomst tussen toxiciteit gevonden in dierstudies en dat waargenomen in de klinische praktijk is 70% 24. Zo menselijke hepatocyten blijven een belangrijk model voor het valideren van onderzoek gedaan in diermodellen en voor het testen van drugs leidt op bijwerkingen voordat ze naar klinische proeven. Verder is het gebruik van menselijke hepatocyten geïsoleerd uit de restanten levermonsters of hepatocyten geïsoleerd uit slachtdieren 25 als modelin lijn met de 3R ethisch kader 26 om het gebruik van proefdieren waar mogelijk te vervangen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Optimalisatie van dit protocol werd gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie van Hepacult GmbH. Dr Wolfgang Thasler is een van de oprichters van Hepacult GmbH en blijft een van de leden van de raad van bestuur van deze vennootschap. De tewerkstelling van Maresa Demmel is gedeeltelijk door Hepacult. Maria Hauner is in dienst van Hepacult GmbH. Hepacult is een spin-off biotechnologische onderneming van de Universiteit, die de menselijke hepatocyten biedt met toestemming en open toegang voor onderzoeksdoeleinden.
Acknowledgments
Dit werk werd mogelijk gemaakt door de Human Tissue en Cell Research Foundation, die menselijke weefsels voor onderzoek beschikbaar maakt. Financiële steun voor dit werk werd ontvangen van het ministerie van Onderwijs en Onderzoek (subsidie naam: Virtual Lever Netwerk, subsidie nummer: 0315759) en Hepacult GmbH. Onze dank gaat ook uit naar de technische assistenten van de Grosshadern Ziekenhuis weefselbank voor het verzamelen van de lever monsters en de technische assistenten van de Cell Isolation Core Faciliteit voor het uitvoeren van de lever perfusie en hepatocyten isolement. In het bijzonder willen we Natalja Löwen bedanken voor het aantonen van deze procedure in de video. Tot slot willen we Natalja Löwen en Edeltraud Hanesch bedanken voor het maken van de illustraties voor figuur 1 en de cijfers in het schematisch overzicht van de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).
- Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells. Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).
- Anderson, N. G. The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver. Science. 117, 627-628 (1953).
- Jacob, S. T., Bhargava, P. M. New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions. Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).
- Berry, M. N. Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver. Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).
- Laws, J. O., Stickland, L. H. Metabolism of Isolated Liver Cells. Nature. 178, 309-310 (1038).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion. Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).
- Thasler, W. E., et al. Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany. Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).
- Smedsrod, B., Pertoft, H. Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence. J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).
- Cantrell, E., Bresnick, E. Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver. Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).
- Weiskirchen, R., Gressner, A. M. Isolation and culture of hepatic stellate cells. Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).
- Baccarani, U., et al. Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation. Transplant P. 33, 664-665 (2001).
- Renz, J. F., et al. Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation. Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).
- Schemmer, P., et al. Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis. Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).
- Alexandre, E., et al. Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes. Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox. Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).
- Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study. Archives of otolaryngology--head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).
- Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review. Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).
- Bhogal, R. H., et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS ONE. 6, e18222 (2011).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).
- Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices. ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen. (1959).
Tags
Geneeskunde Cellulaire Biologie Biomedische Technologie Anatomie Fysiologie Chirurgie Life Sciences (Algemeen) Menselijke hepatocyten isolement menselijke hepatocyten collagenase perfusie collagenase perfusie hepatocyten lever menselijk cel isolatie klinische toepassingen klinische techniekenErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016.
Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
| EGTA | 0.1mM |
to:
| EGTA | 1mM |
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
| Calcium chloride dihydrate | 0.5µM |
to:
| Calcium chloride dihydrate | 5mM |
