二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離

Summary

ヒト肝細胞の単離のための修飾された二工程コラゲナーゼ灌流手順が記載されている。この方法はまた、他の哺乳動物の肝臓にも適用することができる。単離された肝細胞は、それらのような肝臓の再生、薬物動態および毒物学などの分野での科学的研究に適したモデル作り、高い収率および生存度で提供されています。

Abstract

肝臓、例外的な再生能力を有する器官は、解毒、代謝及び恒常性などの機能の広い範囲を実行する。このように、肝細胞は、研究課題の多種多様のための重要なモデルである。特に、ヒト肝細胞の使用は、薬物動態、毒性、肝再生および翻訳研究の分野で特に重要である。したがって、この方法は、Seglen ¹によって記載されるように肝細胞を単離するために2段階コラゲナーゼ灌流手順の修正版を提示する。

以前に、肝細胞は、機械的な方法によって単離されている。しかし、酵素法は、肝細胞が分離した後にその構造的完全性と機能を保持するように優れていることが示されている。ここで紹介するこの方法は、77±10％の生存と肝細胞の大規模な収率でヒトの肝臓片と結果に対するラットの肝臓のために以前に設計された方法を適応させる。メインこの手順の違いは、血管のカニューレ挿入するプロセスである。また、ここで説明する方法はまた、匹敵する肝臓または血管サイズを有する他の種由来の肝臓に適用することができる。

Introduction

肝細胞懸濁液を機械的または酵素的方法によって肝臓から調製することができる。全体の肝細胞を調製するために使用される機械的な方法は、チーズクロス²を介して肝臓を強制カーンシェーカー³におけるガラスビーズの肝臓片を振盪、長年にわたりなど緩い乳棒^4,5有するガラスホモジナイザーを用いて、機械的な方法は、外に落ちて含むにより、細胞膜の損傷と単離肝細胞^6,7の機能喪失に有利に働く。したがって、酵素的方法の使用は、現在、肝細胞の単離のための主要な方法である。

ベリーと友達^8は 、ラットにおける門脈経由で肝臓をコラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼを灌流したとき、酵素法を用いて肝細胞の単離は大きく改善されました。この灌流過程を導く、酵素は細胞の大部分に密着できるようにするために血管系を利用した肝細胞⁸の収量の6倍の増加。さらに、この方法は、事実上孤立小胞への小胞体の変換なしなしミトコンドリア損傷⁸で、その構造的完全性を保持された細胞が得られた。

この方法は、肝細胞の単離のために二段階灌流手順を開拓Seglen ¹によって改変した。この手順では、ラットの肝臓のCa ^{2 +を}含有する¹コラゲナーゼ緩衝液で灌流、続いてのCa ^{2 +}を含まない緩衝液で灌流される。第二工程におけるCa ^{2 +}の添加は、最適なコラゲナーゼ活性^1,9に必要とされている間第一工程におけるCa ^{2 +}の除去は、デスモソームを破壊するのに役立つ。

上記の発表された研究は、ラットで行われたことを考えると、この記事では、ハムから高い生存して肝細胞の単離に使用することができます変更された手順を実証することを目的と肝臓。ヒト肝細胞の使用は、トランスレーショナル研究のための動物モデルを用いた実験を検証するための重要なままです。本研究で用いたヒト肝臓片を、ヒト組織および細胞研究基金、国営の非営利財団¹⁰を通じてガバナンスの同意を得て取得した。病理学者は、診断のために必要であったものを除去した後、肝臓片を残りの組織から採取した。病理学者によって区画さ組織は、形態学的に肝切除後の切除縁から得た健康な組織だった。

Protocol

1。灌流および分離された溶液の調製

1. 肝臓片と、表1によると、肝細胞の単離灌流のために必要なソリューションを準備します。溶液は使用時まで4℃で保存することができる。
2. 無菌フィルター0.22μmのフィルターを使用して、すべてのソリューションを提供しています。
3. 肝臓と接触するすべてのソリューションは無菌でなければならない。

2。灌流機器とソリューションの作成

1. 図1に示すように、肝臓片の灌流のための機器は、セットアップする必要があります。
2. 水浴は、それらが肝臓片に到達したときに溶液が37℃の温度であるように、各特定の実験設定で異なる適切な温度に設定されるべきである。この場合には、水浴を溶液1,2および3とジャケット付きガラス凝縮器を温めるために41°Cに設定されている。溶液4に温めべきであるコラゲナーゼ活性の損失を低減するために使用するための別個の水浴中で37℃で。
3. まもなく肝灌流の前に、酸素化装置（ 図1E）をガスに95％のO _{2/5％CO 2を}含むガスのタンクのレギュレータをオンにします。

3。肝臓の灌流

1. 肝臓ピースできるだけ多くそのままグリソン鞘と、理想的には唯一の1切断面には、灌流のための病理学者から入手する必要があります。
2. 有孔フィルターディスク（ 図1B）が含まれてブフナー漏斗上、この肝臓ピースを置きます。
3. 灌流システムは、ソリューション1で下塗りする必要があります。
4. 低流量で、オリーブ先端を有する湾曲灌注カニューレは、肝臓片の切断面に大きな血管内に挿入されるべきである。血液が肝臓から洗い流すように、組織はよい潅流地域で軽くなる。様々なサイズのために使用さカニューレの数肝臓の図2Aに示されている。選択されたゲージのサイズが所定の位置にカニューレを保持するぴったりフィットをもたらすべきである。小さい血管が肝臓片の外に排出する灌流液のためオープンにしてください。
5. 肝臓（ 図2B）のサイズに応じて、ml /分110-460の間に蠕動ポンプでの流量を増加させる。これは、カニューレあたり44±16 ml /分（ 図2C）の平均流量をもたらす。選択した速度は、肝臓片に依存し、肝臓片のわずかにプランピングアップにつながるはずです。いくつかの場合においては、上述したわずかなプランピングを達成するために、微小血管クランプを備えた開放血管の一部を遮断クランプする必要があるかもしれない。肝臓片は全体を通して明るい色である場合に良好な灌流を観察することができる。
6. 生理食塩水に浸したガーゼで覆うことにより、灌流中の湿った肝作品を保管してください。
7. 任意のRを洗い流すためのソリューション1 1Lで灌流肝臓枚で血をemaining。
8. 解決策2に灌流液を変更し、10分間灌流する。
9. 解決策3に潅流液を切り替えて、0.5 Lで灌流
10. コラゲナーゼ（ 表2）の0.1から0.15パーセントを含む溶液4に灌流液を変更します。
11. 肝臓が十分に消化されるまで、このステップでは、灌流は9月12日分の再循環方法で実施あるいはすべきである肝組織はグリソン鞘の下に離れて少し破っての鈍側でプローブ時に軟化感じるように表示されます小刀。

4。肝細胞を単離する

1. 蠕動ポンプの電源を切り、肝臓片からカニューレを取り外します。
2. ソリューション5 100〜200 mlを含む結晶皿で肝ピースを置きます。
3. 慎重にグリソン鞘を外し、静かにセルを横に振る。よく灌流されていない領域がある場合は、外科用メスを介して切断するために使用することができるこれらの領域は、中に含まれる細胞を放出する。プロセス中に必要に応じてより多くのソリューション5を追加します。
4. 500ミリリットルの最終体積に達するまで、より多くのソリューションの追加5。
5. 二回細胞懸濁液をフィルタリング、最初の70ミクロンのナイロンメッシュに続いて210ミクロンのナイロンメッシュ。次に、30mlを200ml遠心管に細胞懸濁液を注ぐ。
6. 4℃で5分間、72 gで細胞懸濁液を遠心分離上清を吸引し、ゆっくりと溶液5の200ミリリットル中に静かに細胞ペレットを再懸濁します。
7. 洗浄工程数4.6 3回繰り返します。最後の遠心分離ステップで、（材料のリストを参照）低温貯蔵溶液中で細胞を再懸濁。細胞は血球計数器ベースのトリパンブルー排除アッセイを用いて収量と生存性の評価のためのミリリットル当たり約2から5000000肝細胞である必要があります。
8. トリパンブルー排除アッセイを実施するために、パンブルーsolutiの0.5ミリリットルを含む微量遠心管に（≈2から5000000 / ml）を適切に希釈した細胞の0.1ミリリットルを追加オン（リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解し、0.4％トリパンブルー）と0.4mlのPBS。完全に細胞懸濁液を混合した後、懸濁液を血球計数器をロードし、100Xの倍率で顕微鏡下で調べる。生きた細胞は染色されていない表示されている間、顕微鏡下では、死んだ細胞が青く染色されます。血球計数器上にマークさ1ミリメートル²のグリッドのそれぞれに住んでいて、全細胞の数を数える。生存率（％）、生細胞（中低温貯蔵溶液あたり百万肝細胞（CSS）又はg肝臓肝細胞あたり百万）の収率は以下の式を用いて計算することができる。

注：この場合には、トリパンブルー希釈係数は10であり、血球計係数は、10,000である。

Representative Results

灌流セットアップ

肝灌流に必要な機器は、 図1に応じて設定する必要があります。

単離されたヒト肝細胞の生存率および収量

単離されたヒト肝細胞の平均生存率は77±10％であった肝細胞の平均収量は、平均値±標準偏差として表される値を使用して、13±1100万肝細胞/ g肝臓であった。肝細胞の単離の数は、648アイソレーションは、1999年1月から2012年12月から実施されたこれらの平均を得るために実施。

適切な灌流パラメータ

成功したフラッシングおよび肝臓の灌流を行うために、使用されるカニューレの数は、肝臓（ 図2A）の重量に応じて変化すべきである。一般的に、4〜8カニューレは20グラム、下から80グラム以上に及ぶ肝臓のために使用されるべきである。潅流の適切な速度また、肝臓重量に依存する、肝臓（ 図2BおよびC）の正常灌流のために選択されるべきである。それは44 ml /分カニューレ^-1の平均灌流速度は、異なる肝臓重量の範囲にわたって理想的であり、よりカニューレが使用される場合、したがって、灌流速度が適切に調整されるべきであることが見出された。灌流が成功した場合、肝臓は色で淡いも少しふっくらする必要があります。

肝細胞の純度

免疫蛍光によって、それが積極的にアルブミン、94±1％の純度を有していた汚れ単離された肝細胞は、（5とN = 4は、それぞれを複製する）（ 図3AおよびB）。図3Cは、代表的な位相差画像であることが見出されたこのような大きなセルサイズおよび多角形細胞のような肝細胞の形態学的特徴を示す。

図1。灌流セットアップ。（A）の気泡トラップ、（B）はブフナー漏斗上の血管内に挿入されたオリーブのヒントを湾曲した灌漑カニューレ肝臓片（C）ガラスジャケット付きコンデンサー、（D）は 、水浴、（E）の酸素化装置、（ F）95％O _{2/5％CO 2}ガスタンク及び（G）蠕動ポンプ。

図2のカニューレを用いる（A）番号、（B）灌流速度（ml /分）、または（C）灌流速度（ml /分^。 AB。

図3。（緑色に染色された）、（A）アルブミン陽性の単離された細胞と、（B）に対応するネガティブコントロール（200倍）の免疫蛍光画像。核はDAPIを用いて青色に染色される。単離された細胞の（C）位相コントラスト画像（100×倍率）。

ソリューション	成分	最終濃度
ソリューション1	塩化ナトリウム	154 mMの
	HEPES	20 mMの
	塩化カリウム	5.6 mMの
	グルコース	5 mMの
	炭酸水素ナトリウム	25 mMの
解決策2	塩化ナトリウム	152.5 mMの
	HEPES	19.8 mMの
	塩化カリウム	5.5 mMの
	グルコース	5.0 mMの
	炭酸水素ナトリウム	24.8 mMの
	EGTA	0.1 mMの
解決策2を調製するには、ソリューション1の990ミリリットルに100のEGTAの10ミリリットルを追加します。			解決策3	塩化ナトリウム	152.5 mMの
	HEPES	19.8 mMの
	塩化カリウム	5.5 mMの
	グルコース	5.0 mMの
	炭酸水素ナトリウム	24.8 mMの
	塩化カルシウム二水和物	0.5μM
解決策3を調製するには、ソリューション1の990ミリリットルに0.5Mの塩化カルシウム二水和物の10ミリリットルを追加します。
ソリューション4	塩化ナトリウム	152.5 mMの
	HEPES	19.8 mMの
	塩化カリウム	5.5 mMの
	グルコース	5.0 mMの
	ナトリウムhydrフィブリノーゲン、炭酸	24.8 mMの
	塩化カルシウム二水和物	0.5μM
	コラゲナーゼ	表2を参照してください
溶液4を準備するために、溶液3にコラゲナーゼの適切な量を追加します。
解決策5	塩化ナトリウム	120 mMの
	HEPES	10 mMの
	塩化カルシウム二水和物	0.9 mMの
	塩化カリウム	6.2 mMの
	アルブミン	0.1％重量/体積

表1。灌流およびアイソレーション·ソリューション。

肝臓片の大きさ（グラム）	コラゲナーゼ濃度（％）	コラゲナーゼ活性（U / ml）を
<25	0.10	250
25から40	0.11	300
41から80	0.13	350
> 80	0.15	400

表2。コラゲナーゼ濃度（％）及び活性（U / ml）を、肝臓片（g）を様々なサイズのために使用される。

Discussion

このプロトコルは、高い生存率および純度のヒト肝細胞を単離することになる。これらの結果を達成するためには、肝臓の適切な個数で開始することが重要である。肝臓の一部は、1切断面を除くすべての表面上でそのままグリソン鞘を持つ必要があります。別の重要な要因は、異なるバッチの消化後¹¹肝細胞の生存率の著しい違いをもたらすことができるように、使用されるコラゲナーゼの特定のバッチである。したがって、コラゲナーゼの異なるバッチを試験されるべきであり、最高の生存率肝細胞を生成するバッチを大量に得られるべきである。最後に、適当な消化時間は、得られた細胞の収率および生存能力に基づいて選択されな​​ければならない。例えば、低利回りの高い生存率が不十分な消化時間を示している可能性があり、低生存能力の高収量は消化時間が長すぎることを示している可能性があります。

この方法では、tは適合させることができるO同じ肝臓片から非実質細胞と肝細胞を分離します。これを行う一つの方法は、非実質細胞の単離¹²に直接最初の遠心分離ステップ（ステップ4.6）からの上清を使用することである。第二の方法は、肝細胞の単離のためのナイロンメッシュ（ステップ4.5）を通して濾過した後、細胞懸濁液の必要な一定分量を取り除き、の収率を増加させるために、非実質細胞の単離の前に付加的なプロナーゼ消化工程に残りの細胞懸濁液をかけることである非実質細胞^13。肝細胞を犠牲にして非実質細胞のより高い収率のために、この方法では、プロナーゼおよびコラゲナーゼ単独コラゲナーゼ（工程3.10）を代入し、非実質細胞単離のために得られた¹⁴の細胞懸濁液を使用して変更することができる。

ヒト肝細胞を単離することに加えて、提示され、この方法はまた、収集された往復肝臓片から肝細胞を単離するために適合させることができる同程度の大きさまたは同等の血管系のサイズがM、他の種。これは、ブタ、イヌ又は霊長類モデルなどの代替モデルを使用する研究者にとって重要であり得る。

ヒト肝細胞の単離は、一般的に2つのソースから肝臓を使用して行われています。全体の肝臓を切除縁から移植または形態学的に正常な肝組織には適さないと考えられる。この方法で使用される後者源の利点は、肝臓片を実験室に早く利用可能になることである。すぐに切除後、切除肝は、診断に必要なものが削除病理学者になる。病理医はその後廃棄が予定されているものから肝細胞を単離するための形態学的に正常な肝臓の適切な部分を削除します。一般に、肝臓片を56±29分（N = 103）の平均時間の灌流の準備実験室に到着する。比較して、移植に適していない、全体肝臓だけRELになります13±2時間後と16±12時間¹⁵間の研究室に緩和。また、原因倫理的配慮とドナーの肝臓の不足のために、移植のための基準のすべてを満たしていない全体の肝臓から肝細胞の単離はEurotransplant領域では回避される。これらの肝臓はまだ拡張ドナー基準に移植のために使用することができるからである。いくつかの研究では、選択した受信者^16,17に減少し、待機リストの死亡率と、満足な結果での移植の結果に対する患者のアクセスを最大化することが示されている。別の利点は、移植に適さない肝臓を、脂肪変性、線維性または硬変することができるが、肝臓切除片から得られた細胞は、形態学的に健康な肝臓から単離されることである。そのため、ここでの方法は、 他 Baccaraniによって得グラム肝臓あたり0.7±0.3百万3±200万肝細胞に比べてグラム肝臓あたり13±1100万肝細胞の高収率をもたらし^図15はそれぞれ、硬変または脂肪変性肝臓を用いて。利用可能なピースの大きさは2〜250 gおよび37±29グラム（N = 648）の平均値の範囲で一般的に小さくしかし、肝切除片は肝細胞のより低い総収量になる。

他の群と比較して、このプロトコルは、シアノアクリレート接着剤の使用を回避する。アレクサンドルは、 ら ¹⁸グラム当たり3.5±0.7百万1.6±6.0に肝細胞からの肝細胞の収量の増加をもたらし、肝臓の切断面を覆うように、エチルシアノアクリレートの使用は、一般的に使用される万能接着剤を発見平均値の平均値±標準誤差で表した値で肝。比較すると、このプロトコルは、シアノアクリレート接着剤を使用せずに（平均の標準誤差±手段で表される）g肝臓あたり13.5±040万肝細胞の収率を達成することができる。シアノアクリレート系接着剤は、創傷閉鎖のために使用されてきたが<> 19,20商標、オクチルシアノアクリレート、ブチルシアノアクリレートのような医療グレードのシアノアクリレート接着剤は、エチルシアノアクリレートと比較して高価であることができる。しかしながら、例えば、エチルシアノアクリレートなどの短鎖誘導体は、より長い鎖の誘導体^21,22よりも組織毒性であることが見出されている。

この方法は、オリーブのヒントと湾曲した灌漑カニューレの簡単に使用でき、より多くの時間が効率的です。適切なサイズのカニューレを使用することは、接着剤¹⁸または縫合糸²³を使用せずに所定の位置にカニューレを保持しているタイトフィットになります。使用カニューレは1.25〜4.5ミリメートルサイズの先端直径が1〜2ミリメートルの範囲の直径を持っている。肝臓片をカニューレ挿入の準備ができているときに、添付のビデオに示すように、特定の血管のための適切なサイズのカニューレを選択することができるように、種々のカニューレサイズの品揃えを利用できるようにすべきである。この方法はまた、一般的な（ 図のその他のカニューレを利用する2A）2 ²³または2〜4 ¹⁸カニューレを使用している他の研究と比較した。これは、高い生存率およびより短い期間で消化収率をもたらす肝臓片全体にわたってより良好な灌流を達成するの​​に役立ち得る。

結論として、このプロトコルは、細胞の代謝、薬物動態および生体異物の毒性学、肝再生およびトランスレーショナルリサーチを研究するための重要なモデルであるヒト肝細胞を、隔離する。人間の毒性を引き起こす150薬に関する以前の調査では、毒性の間の一致の動物実験で発見し、それが臨床で観察されたが^、70％24であることを示した。このように、ヒト肝細胞は、臨床試験に行く前に副作用のためにつながる動物モデルで行われた研究を検証するためと薬をテストするための重要なモデルのまま。さらに、モデルとして屠殺場の動物から単離し残肝サンプルまたは肝細胞から単離されたヒト肝細胞を使用する^25です3R倫理的なフレームワーク²⁶に沿って可能な研究動物の使用を置き換えます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bubble trap	Gaßner Glastechnik
Glass jacketed condenser	Gaßner Glastechnik
41 °C Water bath	Julabo	35723-H24/EG
37 °C Water bath	GFL	1083
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)	Linde
Gas permeable tubing	Neolab	2-4440
Peristaltic pump	Ismatec	IP65
Scalpel	Feather	320010
Forceps	Omnilab	5171014
Conical flasks 1 L	Schott Duran	2121654
Conical flasks 5 L	Schott Duran	2121673
Beakers	Schott Duran	2110654
200 ml centrifuge tubes	Becton Dickinson	352075
Crystallizing dish	Omnilab	5144063
Curved irrigation cannulae with ball tips	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Micro vascular clamps	Ernst Kratz GmbH
Büchner funnel	Carl Roth	HT38.1
Nylon mesh 210 μm	Neolab	4-1413
Nylon mesh 70 μm	Neolab	4-1419
0.22 μm sterile filters	Peske	99505
500 ml bottles	Schott Duran	2180144
1 L bottles	Schott Duran	2180154
Hemocytometer	Peske	06-0001
1.5 ml tubes	Eppendorf	0030 120,086
50 ml conical tubes	BD Biosciences	352070
Ice bucket	Neolab	1508454
Sterile Pasteur pipettes	Brand	747715
Motorised pipette filler (Pipette boy acu)	Integra	155017
Refridgerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Laminar flow	Kendro	Hera safe-KS9
Aspirator (Low-flow surgical suction pump)	Atmos	C361
Laboratory Gas Burner	Integra	Fire Boy eco
Disposable laboratory coat	Paperlynen GmbH	MD0202414
Surgical mask with visor	Kimberly-Clark	48247
Surgical hood	Barrier	42072
Latex gloves	Semper Care	CE0321
Collagenase (Batch number NB 4G)	Serva	17465
Calcium chloride dihydrate	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Sodium chloride	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Potassium chloride	Serva	26868
Albumin	Biomol	01400-2
Glucose	Serva	22700
Sodium hydrogen carbonate	Serva	30180
0.4% Trypan blue solution	Lonza	17-942E
Cold storage solution	Hepacult GmbH