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Summary
인간 간세포의 분리를위한 수정 된 두 단계의 콜라게나 제 관류 절차가 설명되어 있습니다. 이 방법은 다른 포유 동물의 간장에 적용될 수있다. 고립 된 간세포는 그 같은 간 재생, 약동학 및 독성 등의 분야에서 과학 연구에 적합한 모델을 만들고, 높은 수율과 생존에서 사용할 수 있습니다.
Abstract
간, 뛰어난 재생 능력을 가진 기관은 이러한 해독, 대사 및 항상성 같은 광범위한 기능을 수행한다. 이와 같이, 간세포 연구 문제의 큰 다양성을위한 중요한 모델이다. 특히, 인간 간세포의 사용은 약물 동력학, 독성, 간 재생 및 병진 연구의 분야에서 특히 중요하다. 따라서,이 방법은 Seglen 한 바와 같이하여 간세포를 분리하는 두 단계의 콜라게나 제 관류 절차의 수정 된 버전을 나타낸다.
이전 간세포 기계적 방법에 의해 고립되었다. 그러나, 효소 방법은 간세포 분리 후 자신의 구조적 안정성과 기능을 유지하기로 우수한 것으로 나타났다. 여기에 제시된이 방법은 77 ± 10 %의 가능성을 가진 간세포의 큰 수율 인간의 간 조각과 결과 쥐의 간을 위해 이전에 설계 방법을 적응시킨다. 주이 절차의 차이는 혈관 cannulization의 과정이다. 또한, 여기에 설명 된 방법은 또한 대등 간 또는 혈관 크기를 가진 다른 종에서의 간 적용될 수있다.
Introduction
간세포 현탁액을 기계적 또는 효소 적 방법에 의해 간장에서 제조 될 수있다. 전체 간 세포를 제조하는 데 사용되는 기계적인 방법은, 투박한 (2)를 통해 간을 강제 칸 통 3 유리 구슬 간 조각을 흔들면서, 수년에 걸쳐 등 느슨한 방앗 공이 4,5 유리 균질를 사용하는 등, 기계적인 방법 중 추락 인해 세포막에 손상 및 절연 6,7 간세포의 기능의 상실로 선호. 따라서, 효소 방법의 사용은 현재 간세포의 분리를위한 주요 방법입니다.
베리와 친구 8 쥐의 문맥을 통해 간을 콜라와 히알루을 관류 할 때 효소의 방법을 사용하여 간세포의 분리는 크게 향상되었다. 이것은 재관류 프로세스에 이르는, 효소는 세포의 대부분에 밀착 할 수 있도록 혈관을 살린간세포 8의 수율이 6 배 증가. 또한,이 방법은 사실상 고립 된 소포에 소포체없이 변환없이 미토콘드리아 손상 8, 구조적 무결성을 유지 세포를 얻었다.
이 방법은 간 세포 분리를위한 두 단계 관류 절차를 개척 Seglen 1에 의해 수정되었다. 이 절차에서는 쥐의 간은 칼슘 2 + 1을 포함하는 콜라게나 버퍼 관류 다음에 칼슘 2 + 무료 버퍼 관류한다. 두 번째 단계에서 칼슘 2 +의 첨가가 최적의 콜라게나 제 활성 1,9 필요하면서 제 1 단계에서 칼슘 2 +의 제거는, 데즈 모섬을 방해하도록 돕는다.
상기 게시 된 작품은 쥐에서 수행 된 점을 감안,이 문서는 콧노래에서 높은 가능성을 가진 간세포의 분리에 사용할 수있는 수정 절차를 설명하는 것을 목표로간. 인간 간세포의 사용은 translational 연구를위한 동물 모델을 사용하여 실험을 검증하기위한 중요한 남아있다. 이 연구에 사용 된 인간의 간 조각은 인간의 조직과 세포 연구 재단, 국영 비영리 재단 (10)를 통해 지배 구조에 대한 동의를 획득했다. 병리학 진단에 필요한 있었는지를 제거 한 후, 간 조각이 남아있는 조직에서 수집되었다. 병리학 자에 의해 떨어져 구분 조직 형태 학적으로 간 절제술 후 절제에서 얻은 건강한 조직이었다.
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Protocol
1. 관류 및 격리 솔루션의 제조
- 간 조각과 표 1에 따라 간세포의 분리의 관류에 필요한 솔루션을 준비합니다. 솔루션을 사용할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 살균 필터 0.22 μm의 필터를 사용하는 모든 솔루션을 제공합니다.
- 간장과 접촉 모든 솔루션은 멸균해야한다.
2. 살포 장비 및 솔루션의 준비
- 도 1에 도시 된 바와 같이 간 매의 관류를위한 장비가 설정되어야한다.
- 수욕은 각 특정 실험 장치에서 다른 적절한 온도, 설정해야 그들이 간 부분에 도달 할 때 용액이 37 ° C의 온도에 있는지 등. 이 경우, 물 욕 해법 1, 2, 3 및 재킷 유리 응축기 따뜻하게 41 °의 C로 설정된다. 해결 방법 4로 예열한다콜라게나 제 활성의 손실을 줄이기 위해 사용하기위한 별도의 물을 욕조에 37 ° C에서.
- 얼마 간 관류하기 전에, 95 %, O2 / 5 % CO 2 산소 장치 (그림 1E)를 가스를 포함하는 가스 탱크의 조절기의 전원을 켭니다.
3. 간 관류
- 단 1 컷 표면에 이상적으로 가능하고 많은 그대로 Glisson의 캡슐 간 조각은 관류에 대한 병리학에서 확인하셔야합니다.
- 천공 필터 디스크 (그림 1B)를 포함하는 뷰 흐너 깔때기에이 간 조각을 놓습니다.
- 관류 시스템 솔루션 1 프라이머해야합니다.
- 낮은 유량, 올리브 팁 만곡 관개 캐 뉼러는 간 매 절단면에 큰 혈관에 삽입되어야한다. 혈액이 간에서 플러시으로, 조직은 좋은 관류와 지역에서 가벼운됩니다. 다양한 크기에 사용되는 캐 뉼러의 수간의 그림 2A에 표시됩니다. 선택 게이지 크기는 장소에 캐 뉼러를 개최한다 아늑한 적합을 초래할 것이다. 작은 혈관이 간 조각 밖으로 배출하는 관류 버퍼 개방해야한다.
- 간 (그림 2B)의 크기에 따라 ㎖ / 분 110-460 사이에 연동 펌프의 유량을 증가시킨다. 이 44 ± 16의 평균 유량 ml / 분 정맥 당 (그림 2C)가 발생합니다. 선택된 속도는 간 조각에 의존하고 간 부분에 약간의 플럼 핑의 최대 발생한다. 경우에 따라서는 상기 소 플럼 핑을 달성하기 위해 미세 혈관 클램프 개방 용기의 일부를 차단 클램핑 할 필요가있다. 간 조각에 걸쳐 밝은 색 때 좋은 관류가 관찰 할 수있다.
- 식염수에 적신 거즈로 덮어 관류 동안 촉촉한 간 조각을 유지합니다.
- 어떤 연구를 플러시 해결 방법 1의 1 L에 Perfuse간 피스에 혈액을 emaining.
- 해결 방법 2로 관류 액을 변경하고 10 분 동안 perfuse.
- 해결 방법 3으로 관류 액을 전환하고 0.5 L.와 perfuse
- 콜라게나 제 (표 2)의 0.1 ~ 0.15 %를 함유 솔루션 4에 관류 액을 변경합니다.
- 간을 충분히 소화 될 때까지이 단계를 들어, 관류는 9-12 분 동안 순환 방식으로 수행하거나되어야한다 간 조직은 Glisson의 캡슐에서 약간 떨어져 휴식과의 무딘면을 탐색 할 때 부드럽게 느낌이 나타납니다 메스.
4. 간세포의 분리
- 연동 펌프를 끄고 간 조각에서 캐 뉼러를 제거합니다.
- 해결책 5의 100 ~ 200 ㎖에 들어있는 결정화 접시에 간 조각을 놓습니다.
- 주의 깊게 Glisson의 캡슐을 제거하고 부드럽게 세포를 흔들어. 잘 관류하지 영역이있을 경우, 메스 극복하는데 사용될 수있다이 지역에 포함 된 세포를 분리합니다. 등의 과정에서 필요한 더 많은 해결책 5를 추가합니다.
- 500 ㎖의 최종 부피에 도달 할 때까지 더 많은 해결책 5를 첨가.
- 두 번 세포 현탁액을 필터, 먼저 70 μm의 나일론 메쉬 다음에 210 μm의 나일론 메쉬를 통해. 다음으로, 200 ML의 원심 분리기 튜브에 세포 현탁액을 붓는다.
- 4 ℃에서 5 분 72 g에서 세포 현탁액을 원심 분리기 기음 뜨는 부드럽게 해결책 5 200 ㎖에 부드럽게에 resuspend 세포 펠렛.
- 세척 단계 번호 4.6 세 번 반복합니다. 최종 원심 분리 단계에서 냉장 솔루션에 resuspend 세포 (물질의 목록 참조). 세포는 혈구 기반 트리 판 블루 배제 분석을 사용하여 수율과 생존 능력의 평가를위한 밀리리터 당 약 2-5000000 간세포해야한다.
- 트리 판 블루 배제 분석을 수행하기 위해, 트리 판 블루 soluti입니다 0.5 ㎖를 포함하는의 미세 관 (≈ 2-5000000 / ml)을 적절하게 희석 세포의 0.1 ML를 추가(0.4 % 트리 판 블루는 인산 완충 식염수 (PBS)에 용해) 및 0.4 ml의 PBS. 철저 세포 현탁액을 혼합 한 후, 현탁액을 혈구로드 100X 배율로 현미경으로 조사한다. 살아있는 세포는 흠이 표시하는 동안 현미경에서 죽은 세포는 파란색 물들 일 것이다. 혈구에 표시된 1mm 2 그리드의 각에 살고있는 전체 세포의 수를 계산합니다. 생존 능력 (%), 살아있는 세포의 수율은 (ML 차가운 스토리지 솔루션 (CSS) 100 만 간세포 또는 G 간 100 만 간세포) 아래의 공식을 사용하여 계산 될 수있다.
주 :이 경우에, 트리 판 블루 희석 계수는 10이며, 혈구 계수는 10000이다.
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Representative Results
관류 설치
간 관류에 필요한 장비는 그림 1에 따라 설정해야합니다.
생존과 고립 된 인간의 간세포의 수익률
고립 된 인간 간세포의 평균 생존율은 77 ± 10 % 였고, 간세포의 평균 수익률은 ± 표준 편차를 의미로 표현 값으로, 13 ± 1100 만 간세포 / g 간이었다. 간세포 아이솔레이션의 수는이 평균 648 아이솔레이션이 1999년 1월에서 2012년 12월까지에서 실시했다 얻기 위해 실시했다.
적당한 관류 매개 변수
성공적인 플러싱 및 간 혈류를 수행하기 위해, 사용되는 캐 뉼러의 개수는 간 (도 2a)의 무게에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 4-8 캐 뉼러는 20g 이하에서 80 G까지 간 사용해야합니다. 관류의 적절한 비율또한, 간 무게에 종속 된, 간 (그림 2B와 C)을 성공적으로 관류 선택해야합니다. 이는 44 ㎖ / 분 캐 뉼러 -1 평균 관류 속도가 상이한 간 무게의 범위에 걸쳐 최적의보다 캐 뉼러를 사용하는 경우, 따라서 관류 속도가 적절하게 조정되어야한다는 것을 발견 하였다. 관류 성공하면 간 색 담색하고 약간 위로 plumped한다.
간세포의 순도
면역에 의해, 그것은 긍정적 인 알부민, 94 ± 1 %의 순도를 갖는다 얼룩 고립 된 간세포 (5와 N = 4 각 복제) (그림 3A와 B). 그림 3C는 대표적인 위상 콘트라스트 이미지입니다 것으로 나타났습니다 대형 셀 크기 및 다각형 모양의 세포로 간세포의 형태 학적 특성을 표시합니다.
그림 1. 부 흐너 깔때기, (C) 유리 외피 콘덴서, (D) 물 목욕, (E) 산소 장치에 혈관에 삽입 올리브 팁, (곡선 된 관개 캐 뉼러와 관류 설정. (A) 버블 트랩, (B) 간 조각 F) 95 %, O2 / 5 % CO 2 가스 탱크 및 (G) 연동 펌프.
도 2. 사용 캐뉼라의 (A) 참조, (B) 관류 속도 (㎖ / 분), 또는 (C) 관류 속도 (㎖ / 분. 나타냅니다.에서 유의 한 차이 0~20g 조건, P <0.05. 20-40그램 40-60 g의 60-80그램 조건, P <0.05에서 유의 한 차이 AB.
그림 3. (녹색으로 염색) (A) 알부민에 대한 긍정적 인 고립 된 세포와 (B)에 대응 음성 대조군 (200X 배율)의 면역 형광 이미지. 핵은 DAPI를 사용하여 파란색으로 염색된다. 고립 된 세포의 (C) 단계 대비 이미지 (100X 배율).
| 해결 | 성분 | 최종 농도 | |||
| 해결 방법 1 | 염화나트륨 | 154 밀리미터 | |||
| HEPES | 20 mM의 | ||||
| 염화칼륨 | 5.6 mM의 | ||||
| 포도당 | 5 mM의 | ||||
| 탄산 수소 나트륨 | 25 mM의 | ||||
| 해결 방법 2 | 염화나트륨 | 152.5 밀리미터 | |||
| HEPES | 19.8 밀리미터 | ||||
| 염화칼륨 | 5.5 mM의 | ||||
| 포도당 | 5.0 mM의 | ||||
| 탄산 수소 나트륨 | 24.8 밀리미터 | ||||
| EGTA | 0.1 ㎜ | ||||
| 해결 방법 2를 준비하려면 해결 방법 1의 990 ml의 100 mM의 EGTA 10 ㎖를 추가합니다. | 해결 방법 3 | 염화나트륨 | 152.5 밀리미터 | ||
| HEPES | 19.8 밀리미터 | ||||
| 염화칼륨 | 5.5 mM의 | ||||
| 포도당 | 5.0 mM의 | ||||
| 탄산 수소 나트륨 | 24.8 밀리미터 | ||||
| 염화칼슘 이수화 | 0.5 μM | ||||
| 해결 방법 3을 준비하려면 해결 방법 1의 990 ml의 0.5 M 염화 칼슘 이수화 물 10 ㎖를 추가합니다. | |||||
| 해결 방법 4 | 염화나트륨 | 152.5 밀리미터 | |||
| HEPES | 19.8 밀리미터 | ||||
| 염화칼륨 | 5.5 mM의 | ||||
| 포도당 | 5.0 mM의 | ||||
| 나트륨 유압ogen 탄산 | 24.8 밀리미터 | ||||
| 염화칼슘 이수화 | 0.5 μM | ||||
| 콜라게나 | 표 2를 참조 | ||||
| 솔루션 4를 준비하려면 솔루션 3 콜라의 적절한 금액을 추가합니다. | |||||
| 해결책 5 | 염화나트륨 | 120 밀리미터 | |||
| HEPES | 10 mM의 | ||||
| 염화칼슘 이수화 | 0.9 mM의 | ||||
| 염화칼륨 | 6.2 mM의 | ||||
| 알부민 | 0.1 % W / V | ||||
표 1. 관류 및 격리 솔루션을 제공합니다.
| 간 조각의 크기 (G) | 콜라게나 농도(%) | 콜라게나 제 활성 (U / ㎖) |
| <25 | 0.10 | (250) |
| 25 - 40 | 0.11 | (300) |
| 41-80 | 0.13 | (350) |
| > (80) | 0.15 | (400) |
표 2. 콜라게나 제의 농도 (%) 및 활동 (U / ㎖) 간 조각 (G)의 다양한 크기를 사용할 수 있습니다.
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Discussion
이 프로토콜은 높은 생존 능력 및 순도 인간 간세포의 분리가 발생합니다. 이러한 결과를 달성하기 위해, 간 적합한 장으로 시작하는 것이 중요하다. 간 조각은 1 절단면을 제외한 모든 표면에 그대로 Glisson의 캡슐이 있어야합니다. 또 다른 중요한 요인은 다른 배치 소화 11 후 간세포의 생존 정도에서 현저한 차이가 발생할 수 있으므로, 사용 콜라의 특정 배치입니다. 따라서, 콜라게나 제의 다른 배치는 테스트해야하고 최고의 가능성과 간세포를 생성하는 일괄 대량으로 얻을 수 있어야합니다. 마지막으로, 적절한 소화 시간은 얻어지는 세포의 수율 및 생존 능력에 기초하여 선택되어야한다. 예를 들어, 낮은 수율과 높은 생존 능력이 불충분 한 소화 시간을 표시 할 수 있고, 낮은 생존율과 높은 수익률은 소화 시간이 너무 긴 것을 나타낼 수 있습니다.
이 방법은 t을 적용 할 수 있습니다O 같은 간 조각에서 비 실질 세포와 간세포를 분리. 이 작업을 수행하는 한 가지 방법은 비 실질 세포 격리 12 직접 (4.6 단계) 첫 번째 원심 분리 단계에서 뜨는을 사용하는 것입니다. 두 번째 방법은 간세포 분리한다 (단계 4.5)에 대한 나일론 메쉬를 통해 여과 한 후 세포 현탁액의 필수 분취 액을 제거하고 수율을 증가시키기 위해 비 실질 세포 격리 전에 추가적인 프로 나제 소화 단계로 나머지 세포 현탁액 대상이다 비 실질 세포 13. 간세포의 비용이 아닌 실질 세포의 높은 수율의 경우,이 방법은 프로 나제 및 콜라게나 위해 (3.10 단계) 혼자 콜라를 대체 비 실질 세포 격리 14 결과 세포 현탁액을 사용하여 수정할 수 있습니다.
인간 간세포를 분리하는 것 외에도,이 제시 방법은 또한 아프로 수집 간 매로부터 간세포를 분리하도록 채택 될 수있다비슷한 크기 나 비교 혈관의 크기가 M 다른 종. 이는 돼지, 개 또는 영장류 모델로 다른 모델을 사용하는 연구자에 대한 중요 할 수있다.
인간 간세포의 아이솔레이션은 일반적으로 두 가지 소스에서 간을 사용하여 수행됩니다 전체 간은 절제에서 이식 또는 형태 학적으로 정상 간 조직에 적합하지 않은 것으로 간주. 이 방법에 사용되는 소스 후자의 장점은 간 매 빨리 실험실로 제공된다는 점이다. 즉시 절제술 후 절제된 간은 진단을 위해 필요한 사항을 제거하는 병리학을하게된다. 병리학은 폐기 될 예정이다 것과 간세포 분리에 대한 형태 학적으로 정상 간의 적절한 조각을 제거합니다. 일반적으로 간 조각은 56 ± 29 분 (N = 103)의 평균 시간에 관류에 대한 준비가 실험실에 도착한다. 이에 비해 이식에 적합하지 않습니다 전체 간은 REL 될 것입니다13 ± 2 시간 16 ± 12 시간 15 사이의 실험실로 완화. 또한, 때문에 윤리적 고려 사항과 기증자의 간의 부족, 이식에 대한 모든 기준을 충족하지 않는 전체의 간에서 간세포의 분리는 Eurotransplant 지역에서 피할 수 있습니다. 이러한 간 여전히 확장 도너 기준에 이식에 사용될 수 있기 때문이다. 일부 연구는 선택받는 사람이 16, 17로 감소 대기 목록 사망하고 만족스러운 결과에 이식 결과에 대한 환자의 접근을 극대화하는 것으로 나타났습니다. 또 다른 장점은 이식에 적합하지 간은 steatotic 섬유화 또는 간경변이 될 수있는 반면 간 절제술의 조각에서 얻은 세포, 형태 학적으로 건강한 간에서 분리되는 것입니다. 따라서, 여기에 방법 등 Baccarani에 의해 얻어진 그램 간 당 0.7 ± 0.3 백만 또는 3 ± 2 백만 간세포에 비해 그램 간 당 13 ± 1100 만 간세포의 높은 수율 결과. 15 각각 간경변 또는 steatotic 간을 사용. 그러나, 간 절제술의 조각이 가능한 조각의 크기와 간세포의 낮은 총 생산량의 원인은 2-2백50그램 범위 및 37 ± 29g (N = 648)의 평균으로 일반적으로 작습니다.
다른 그룹에 비해,이 프로토콜은 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 사용을 피한다. 알렉산더, 등. (18)는 에틸 시아 노 아크릴 레이트, 일반적으로 사용되는 다목적 접착제의 사용은 그램 당 3.5 ± 0.7-6.0 ± 160 만 간세포에서 간세포의 수율 증가에 간 결과의 절단 표면을 커버하는 것을 발견 수단으로 표현 값으로 간 평균의 표준 오차를 ±. 비교하여, 프로토콜은 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하지 않고 (평균의 표준 오차 ± 수단으로 표현) 간 g 당 13.5 ± 0,400,000 간세포의 수율을 달성 할 수있다. 시아 노 아크릴 레이트 접착제는 상처 봉합에 사용되었지만 <SUP> 옥틸 시아 노 아크릴 레이트 및 부틸 시아 노 아크릴 레이트로 19, 20, 의료용 시아 노 아크릴 레이트 접착제는 에틸 시아 노 아크릴 레이트에 비해 비용이 많이들 수 있습니다. 그러나, 에틸 시아 노 아크릴 레이트와 같은 단쇄 유도체는 긴 사슬의 유도체 (21, 22)보다 더 histotoxic 것으로 밝혀졌다.
이 방법으로 인해 올리브 팁 곡선 관개 캐 뉼러의 사용 시간을 효율적으로 간단하고있다. 적절한 크기의 캐 뉼러의 사용은 접착제 (18)이나 봉합사 (23)를 사용하지 않고 장소에 캐 뉼러를 보유 타이트 초래할 것이다. 사용되는 캐 뉼러는 1.25-4.5 mm의 크기의 팁 직경 1~2밀리미터까지 직경이있다. 간 매 삽관 준비 할 때 첨부 된 비디오와 같이 특정 혈관에 대한 적절한 크기의 캐 뉼러가 선택 될 수 있도록 다양한 크기의 캐 뉼러 구색이 가능해야한다. 이 방법은 일반적으로 더 캐 뉼러 (그림을 활용2A) 2 (23) 또는 2 ~ 18 캐 뉼러를 사용하는 다른 연구와 비교. 이것은 높은 가능성과 짧은 소화 기간의 수익률로 이어지는 간 조각을 통해 더 나은 관류를 달성하는 데 도움이 될 수 있습니다.
결론적으로,이 프로토콜은 세포 대사, 약물 동력학 및 생체 이물질의 독성, 간 재생과 번역 연구를 연구하기위한 중요한 모델입니다 인간의 간세포를 분리합니다. 인간 독성의 원인 (150) 약물에 대한 이전의 조사는 임상에서 관찰 된 동물 연구에서 발견 된 독성과 그 일치가 70 % (24)는 것을 보여 주었다. 따라서, 인간의 간세포는 임상 시험에 가기 전에 부작용 리드 동물 모델에서 수행 연구의 유효성을 검사하고 약물 테스트를위한 중요한 모델 남아있다. 모델이기 때문에 또한, 잔여 간 샘플 또는 간세포로부터 분리 인간 간세포의 사용은 도살장 동물 (25)로부터 격리3R 윤리적 틀 (26)과 일치하여 가능한 연구 동물의 사용을 대체한다.
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Disclosures
이 프로토콜의 최적화는 부분적으로 Hepacult GmbH의 교부금에 의해 투자되었다. 박사 볼프강 Thasler는 Hepacult GmbH의의 창시자 중 하나이며,이 회사의 이사회 멤버 중 하나 남아있다. Maresa Demmel의 고용은 Hepacult에 의해 부분적으로. 마리아 Hauner는 Hepacult GmbH에 의해 사용된다. Hepacult 동의 및 연구 목적으로 오픈 액세스와 인간의 간세포를 제공하는 대학에서 스핀 오프 생물 공학 회사입니다.
Acknowledgments
이 작품은 연구를위한 인간의 조직이 사용할 수 있도록 인체 조직 및 세포 연구 재단에 의해 가능하게되었다. 그리고 Hepacult GmbH의이 작품에 대한 재정 지원은 연방 교육 연구부 (: 가상 간 네트워크, 인증 번호 0315759 부여 이름)에서 받았습니다. 우리의 감사는 또한 간 관류 및 간세포 분리를 수행하기 위해 간 샘플 및 세포 격리 코어 시설의 기술 조수의 수집에 대한 Grosshadern 병원 조직 은행의 기술 조수로 이동합니다. 특히, 우리는 비디오에서이 절차를 시연에 Natalja 뢰벤에게 감사의 말씀을 전합니다. 마지막으로, 우리는 비디오의 개략도 그림 1의 그림과 그림을 만들기위한 Natalja 뢰벤 및 Edeltraud Hanesch에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
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의학 제 79 세포 생물학 생명 공학 해부학 생리학 외과 생명 과학 (일반) 인간 간세포의 분리 인간의 간세포 콜라 관류 콜라게나 제 관류 간세포 간 인간 세포 격리 임상 응용 임상 기술Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016.
Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
| EGTA | 0.1mM |
to:
| EGTA | 1mM |
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
| Calcium chloride dihydrate | 0.5µM |
to:
| Calcium chloride dihydrate | 5mM |
