ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
En modifisert to-trinns kollagenase perfusjon fremgangsmåte for isolering av humane hepatocytter, er beskrevet. Denne metoden kan også brukes til andre pattedyr lever. De isolerte hepatocytter er tilgjengelig i høy yield og levedyktighet, noe som gjør dem en passende modell for vitenskapelig forskning på områder som for eksempel leveren regenerasjon, farmakokinetikk og toksikologi.
Abstract
Leveren, et organ med en eksepsjonell regenerering kapasitet, utfører en rekke funksjoner, slik som avgiftning, metabolisme og homeostase. Som sådan, hepatocytter er en viktig modell for et stort utvalg av forskningsspørsmål. Spesielt er bruken av humane hepatocytter spesielt viktig innen farmakokinetikk, toksikologi, lever regenerering og translasjonsforsking. Således presenterer denne metoden en modifisert versjon av en to-trinns kollagenase perfusjon fremgangsmåte for å isolere hepatocytter som beskrevet av Seglen 1..
Tidligere har hepatocytter blitt isolert ved hjelp av mekaniske metoder. Imidlertid har enzymatiske fremgangsmåter vist seg å være overlegen i hepatocytter beholde sin strukturelle integritet og funksjon etter isolering. Denne metoden er presentert her tilpasser den fremgangsmåten som tidligere utformet for rottelever til humane leverstykker og resulterer i et stort utbytte av hepatocytter med en levedyktighet på 77 ± 10%. HovedForskjellen i denne fremgangsmåten er prosessen cannulization av blodkar. Videre kan fremgangsmåten som beskrives her også brukes på lever fra andre arter med sammenlign lever eller blod fartøystørrelser.
Introduction
En levercellesuspensjonen kan bli fremstilt fra leveren av mekaniske eller enzymatiske fremgangsmåter. Mekaniske metoder som brukes til å forberede hele leverceller inkluderer tvinger leveren gjennom cheesecloth 2, risting en lever stykke med glassperler i en Kahn shaker 3, ved hjelp av glass homogenizers med løse pestles 4,5 osv. Gjennom årene har mekaniske metoder falt ut av fordel på grunn av den skade på cellemembraner, og tap av funksjon av de isolerte hepatocytter 6,7. Følgelig er bruken av en enzymatisk metode i dag den viktigste metoden for isolering av hepatocytter.
Isolering av hepatocytter ved hjelp av en enzymatisk metode økte betraktelig da Berry og Venn 8 perfundert collagenase og Hyaluronidase gjennom leveren via portvenen hos rotter. Denne perfusjon prosess utnyttes i vaskulaturen til å tillate de enzymer for å komme i nær kontakt med de fleste av cellene, noe som fører tilen 6-dobling i yield på hepatocytter åtte. Videre, denne metoden ga celler som beholdt sin strukturelle integritet, med nesten ingen transformasjon av endoplasmatiske retikulum i isolerte vesikler og ingen mitokondriell skade åtte.
Denne metoden ble endret av Seglen en, som pioner en to-trinns perfusjon prosedyre for levercelleisolasjon. I denne prosedyren, er rottelever perfundert med en Ca2 +-fri buffer etterfulgt av perfusjon med en collagenase-buffer inneholdende Ca 2 + 1. Fjerningen av Ca 2 + i det første trinn bidrar til å forstyrre desmosomes, mens tilsetningen av Ca 2 + i det andre trinnet er nødvendig for optimal kollagenaseaktivitet 1,9.
Gitt at det publiserte arbeid som er beskrevet ovenfor er blitt utført på rotter, har som mål denne artikkelen for å demonstrere en modifisert prosedyre som kan anvendes for isolering av hepatocytter med høy levedyktighet fra humen lever. Bruken av humane hepatocytter fortsatt viktig for translasjons forskning og for validering av forsøk under anvendelse av dyremodeller. De humane lever brikker som brukes i denne studien ble kjøpt med samtykke for styring gjennom menneskelig vev og Cell Research Foundation, en statskontrollerte non-profit stiftelse 10. Etter en patolog fjernet det som var nødvendig for å stille diagnosen, ble lever stykker samlet inn fra de gjenværende vev. Vevet delt av ved patologen var morfologisk friskt vev hentet fra reseksjonsrender etter leverreseksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av perfusjon og Isolation Solutions
- Klargjør løsninger som er nødvendige for perfusjon av leveren stykke og isolering av hepatocytter i henhold til tabell 1. Løsninger kan lagres ved 4 ° C før bruk.
- Steril filter alle løsninger ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter.
- Alle løsninger som kommer i kontakt med leveren bør være sterile.
2. Utarbeidelse av Perfusjons utstyr og løsninger
- Utstyr for perfusjon av leveren stykket skal settes opp som vist i figur 1.
- Den vannbadet bør innstilles til en passende temperatur, som er forskjellig i hvert enkelt eksperimentelle oppsett, slik at løsningene er ved en temperatur på 37 ° C når de når leveren stykke. I dette tilfellet blir vannbad innstilt på 41 ° C for å varme de Solutions 1, 2 og 3, og den mantlede glass kondensator. Løsning 4 må varmes opp til37 ° C i en separat vann-bad til bruk for å redusere tap av kollagen-ase-aktivitet.
- Kort tid før leverperfusjon, slå på regulatoren på gasstanken som inneholder 95% O 2/5% CO 2 til gass oksygeneapparat (figur 1E).
Tre. Perfusjon av leveren
- En lever stykke med så mye intakt Glisson sin kapsel som mulig og helst med bare en snittflaten skal innhentes fra en patolog for perfusjon.
- Plasser denne leveren stykke på Buchner-trakt som inneholder et perforert filterplate (figur 1B).
- Perfusjon systemet primes med Løsning 1.
- Med en lav strømningshastighet, bør buet vanning kanyler med oliven tips settes inn i de større blodårer på snittflaten av leveren stykke. Ettersom blod spyler ut fra leveren, blir vevet lettere i områder med god perfusjon. Antallet kanyler benyttes for forskjellige størrelserav lever, er vist i figur 2A. Måleren størrelse velges bør resultere i en tettsittende passform som vil holde kanyler på plass. De mindre blodkar bør stå åpen for perfusjon buffer til å renne ut av leveren stykke.
- Økning av strømningshastigheten på den peristaltiske pumpe, til mellom 110 til 460 ml / min, avhengig av størrelsen av leveren (figur 2B). Dette resulterer i en gjennomsnittlig strømningshastighet på 44 ± 16 ml / min pr kanylen (figur 2C). Hastigheten velges, avhenger av leveren stykket og bør resultere i en svak Fyllende opp av leveren stykke. I noen tilfeller kan det være nødvendig å klemme stenge noen av de åpne fartøy med mikro-vaskulære klemmer for å oppnå den svakt Fyllende er nevnt ovenfor. En god perfusjon kan observeres når leveren stykket er en lysere farge hele.
- Hold leveren stykke fuktig under perfusjon ved å dekke den med et stykke gasbind dynket i saltvann.
- Perfuse med en L av Løsning 1 for å skylle ut eventuelle remaining blodet i leveren stykke.
- Endre perfusjon fluid til løsning 2 og perfuse i 10 min.
- Slå perfusjon væske til Løsning 3 og perfuse med 0,5 L.
- Endre perfusjon fluid til Løsning 4, som inneholder 0,1 til 0,15% av kollagenase (tabell 2).
- For dette trinnet bør perfusjon utføres i en resirkulerende måte som for 9-12 minutter eller inntil leveren er tilstrekkelig fordøyd; levervevet skal se ut til å bryte fra hverandre litt under Glisson sin kapsel og føler myknet ved probing med den butte side av en skalpell.
4. Isolering av hepatocytter
- Slå av den peristaltiske pumpe og fjerne kanyler fra leveren stykke.
- Plasser leveren brikke i et krystalliser fatet inneholder 100-200 ml Solution fem.
- Fjern Glisson sin kapsel nøye og forsiktig riste ut cellene. Hvis det er områder som ikke er godt perfusert, kan en skalpell brukes til å skjære gjennomdisse regionene for å frigjøre cellene finnes. Tilsett mer Løsning 5 etter behov i løpet av prosessen.
- Tilsett mer Løsning 5 inntil et sluttvolum på 500 ml er oppnådd.
- Filter cellesuspensjonen to ganger, først gjennom en 210 pm nylon mesh fulgt av en 70 um nylonnett. Deretter helles cellesuspensjonen i 200 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 72 g i 5 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten og resuspender forsiktig cellepelleten forsiktig i 200 ml løsning 5.
- Gjenta vasketrinn nummer 4.6 tre ganger. På den siste sentrifuge trinnet, resuspender celler i kaldt lagringsløsning (se liste over materialer). Cellene skal være ca 2-5 millioner hepatocytter per milliliter for vurdering av avkastning og levedyktighet ved hjelp av en hemocytometer basert trypanblått utelukkelse analysen.
- For å utføre en trypan blå eksklusjon assay, tilsett 0,1 ml av passende fortynnet celler (≈ 2-5 millioner / ml) til et mikro-sentrifugerør inneholdende 0,5 ml av trypan blå solution (0.4% trypan blått oppløst i fosfat-bufret saltvann (PBS)) og 0,4 ml PBS. Etter blanding cellesuspensjonen grundig, laste et hemocytometer med suspensjonen og undersøke under et mikroskop ved 100X forstørrelse. Under mikroskopi, vil de døde cellene bli farget blå, mens de levende cellene synes unstained. Tell antall levende og totale celler i hver av de 1 mm 2 rutenett merket på hemocytometer. Livskraftig (%), utbytte av levende celler (millioner hepatocytter per ml kaldt lagringsløsning (CSS) eller millioner hepatocytter per g lever) kan beregnes ved hjelp av formlene nedenfor.
Merk: I dette tilfellet er den trypan blå fortynningsfaktor 10 og hemocytometer faktor er 10.000.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Perfusjonsindikator Setup
Utstyret som kreves for leverperfusjon bør settes opp i henhold til figur 1.
Livskraftig og Yield av isolerte humane hepatocytter
Den gjennomsnittlige levedyktigheten til isolerte humane hepatocytter var 77 ± 10% og gjennomsnittlig yield på hepatocytter var 13 ± 11 millioner hepatocytter / g lever, med verdier som kommer til uttrykk som betyr ± standardavvik. Antallet hepatocytter isoleringer utført for å oppnå disse gjennomsnitt var 648 isoleringer utført fra januar 1999 til desember 2012.
Egnet Perfusjons Parametere
For å utføre en vellykket spyling og perfusjon av leveren, bør antallet kanyler benyttes variere i henhold til vekten av leveren (figur 2A). Generelt bør 4-8 kanyler benyttes for lever som strekker seg fra under til over 20 g 80 g. En passende hastighet på perfusjon, Som også er avhengig av levervekt, bør velges for en vellykket perfusjon av leveren (figurene 2B og C). Det har blitt funnet at en gjennomsnittlig perfusjon hastighet på 44 ml / min kanyle -1 er ideelt tvers av en rekke forskjellige levervekt og derfor perfusjon hastigheter bør justeres hensiktsmessig dersom flere kanyler benyttes. Hvis perfusjon er vellykket, bør leveren være blek i fargen og litt fyldige.
Purity av hepatocytter
Ved hjelp av immunfluorescens, ble det funnet at isolerte hepatocytter, som flekker positivt for albumin, hadde en renhet på 94 ± 1% (N = 4 med fem replikater hver) (Figurene 3A og B). Figur 3C er et representativt fasekontrastbilde viser de morfologiske kjennetegn ved hepatocytter som stor celle størrelse og kantformede-celler.
Figur 1. Perfusjon setup. (A) boble felle, (B) lever stykke med buet vanning kanyler med oliven tips satt inn i blodårene på en Büchner trakt, (C) glass Jacketed kondensator, (D) vannbad, (E) oksygene apparat, ( F) 95% O 2/5% CO 2 gass tank og (G) slangepumpe.
Figur 2. (A) Et antall kanyler benyttes, (B) perfusjon hastighet (ml / min), eller (C) perfusjon hastighet (ml / min. Signifikant forskjellig fra 0-20 g tilstand, P <0,05. ab vesentlig forskjellig fra den 20-40 g, 40-60 g og 60-80 g tilstand, P <0,05.
Figur 3. Immunofluorescent bilder av isolerte celler positive for (A) albumin (farget i grønt) og den tilsvarende (B) negativ kontroll (200X forstørrelse). Atomkjerner er farget i blått ved hjelp DAPI. (C) Fase kontrastrikt bilde av isolerte celler (100X forstørrelse).
| Oppløsning | Konstituerende | Endelig konsentrasjon | |||
| Løsning 1 | Natriumklorid | 154 mM | |||
| HEPES | 20 mM | ||||
| Kaliumklorid | 5,6 mM | ||||
| Glukose | 5 mM | ||||
| Natriumhydrogenkarbonat | 25 mM | ||||
| Løsning 2 | Natriumklorid | 152,5 mM | |||
| HEPES | 19,8 mM | ||||
| Kaliumklorid | 5,5 mM | ||||
| Glukose | 5,0 mM | ||||
| Natriumhydrogenkarbonat | 24,8 mM | ||||
| EGTA | 0,1 mM | ||||
| For å fremstille Løsning 2, tilsett 10 ml av 100 mM EGTA til 990 ml Løsning 1.. | Løsning 3 | Natriumklorid | 152,5 mM | ||
| HEPES | 19,8 mM | ||||
| Kaliumklorid | 5,5 mM | ||||
| Glukose | 5,0 mM | ||||
| Natriumhydrogenkarbonat | 24,8 mM | ||||
| Kalsiumklorid dihydrat | 0,5 mikrometer | ||||
| For å fremstille Løsning 3, tilsett 10 ml 0,5 M kalsium-klorid-dihydrat i 990 ml Løsning 1.. | |||||
| Løsning 4 | Natriumklorid | 152,5 mM | |||
| HEPES | 19,8 mM | ||||
| Kaliumklorid | 5,5 mM | ||||
| Glukose | 5,0 mM | ||||
| Sodium hydrogen karbonat | 24,8 mM | ||||
| Kalsiumklorid dihydrat | 0,5 mikrometer | ||||
| Kollagenase | Se tabell 2. | ||||
| For å forberede Løsning 4, tilsett passende mengde collage til Løsning 3. | |||||
| Løsning 5 | Natriumklorid | 120 mM | |||
| HEPES | 10 mM | ||||
| Kalsiumklorid dihydrat | 0,9 mM | ||||
| Kaliumklorid | 6,2 mm | ||||
| Albumin | 0,1% w / v | ||||
Tabell 1. Perfusjon og isolasjonsløsninger.
| Størrelsen på leverstykket (g) | Kollagenase konsentrasjon(%) | Kollagenase-aktivitet (U / ml) |
| <25 | 0,10 | 250 |
| 25 - 40 | 0,11 | 300 |
| 41 - 80 | 0,13 | 350 |
| > 80 | 0,15 | 400 |
Tabell 2. Kollagenase konsentrasjoner (%) og aktiviteter (U / ml) for å brukes for forskjellige størrelser av lever-stykker (g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen resulterer i isoleringen av humane hepatocytter med høy levedyktighet og renhet. For å oppnå disse resultater, er det viktig å starte med et passende stykke av leveren. Den del av leveren bør ha intakt Glisson sin kapsel på alle overflater bortsett fra en snittflaten. En annen viktig faktor er bestemt batch av collagenase brukes, som ulike grupper kan føre til store forskjeller i viabilities av hepatocytter etter fordøyelsen 11. Derfor bør ulike grupper av kollagenase testes og batchen som produserer hepatocytter med den beste levedyktighet kan skaffes i store mengder. Til slutt, har en egnet fordøyelse tid til å bli valgt basert på utbyttet og levedyktighet av cellene oppnådd. For eksempel kan en høy levedyktighet med lavt utbytte indikerer en utilstrekkelig fordøyelse tiden, og et høyt utbytte med lav levedyktighet kunne indikere at fordøyelsen tiden er for lang.
Denne metoden kan være tilpasset to isolere ikke-parenkymale celler og hepatocytter fra samme lever stykke. En måte å gjøre dette på er å bruke supernatanten fra den første sentrifuge trinn (trinn 4.6) direkte for ikke-parenchymal celleisolasjon 12. En andre måte er å fjerne den nødvendige aliquot av cellesuspensjonen etter filtrering gjennom nylonmesh for hepatocytter isolert (trinn 4.5) og underkaste den gjenværende cellesuspensjonen til en ytterligere pronase fordøyelse trinn før ikke-parenkymale celler isolert for å øke utbyttet av non-parenkymceller 13. For et høyere utbytte av ikke-parenkymale celler på bekostning av hepatocyttene, kan denne metoden bli modifisert ved å erstatte kollagenase alene (trinn 3.10) for pronase og kollagenase, og ved hjelp av den resulterende cellesuspensjonen for ikke-parenkymale celler isolert 14.
I tillegg til å isolere humane hepatocytter, kan denne metoden presenteres også være tilpasset for å isolere hepatocytter fra lever stykker samlet from andre arter med sammenlignbare størrelser eller sammenlign blodkar størrelser. Dette kan være viktig for forskere som benytter alternative modeller, slik som svin, hund eller primat modeller.
Isoleringer av humane hepatocytter er generelt gjort ved hjelp av lever fra to kilder: hele lever anses uegnet for transplantasjon eller morfologisk normalt levervev fra reseksjonsrender. Fordelen med den sistnevnte kilde som brukes i denne fremgangsmåten er at leverstykker er gjort tilgjengelig for laboratorier tidligere. Umiddelbart etter reseksjon, er foretatt reseksjon leveren brakt til en patolog som fjerner det som kreves for diagnose. Patologen vil deretter fjerne et passende stykke morfologisk normal lever for hepatocytter isolert fra det som er planlagt for å forkaste. Generelt kommer en lever stykke i laboratoriet klar for perfusjon i en gjennomsnittlig tid på 56 ± 29 min (N = 103). Til sammenligning, vil hel lever som ikke er egnet for transplantasjon bare være rellettet til laboratoriet mellom 13 ± 2 timer og 16 ± 12 t 15. I tillegg, på grunn av etiske hensyn og mangel på donorlever, er isolering av hepatocytter fra hele lever som ikke oppfyller alle kriteriene for transplantasjon unngås i Eurotransplant regionen. Dette er fordi disse lever kunne fremdeles brukes for transplantasjon med utvidede donor kriterier. Noen studier har vist at å maksimere pasientens tilgang til transplantasjons resulterer i redusert ventelisten dødelighet og tilfredsstillende resultater til utvalgte mottakere 16,17. En annen fordel er at cellene oppnådd fra Leverreseksjon stykker er isolert fra morfologisk frisk lever, mens lever uegnet for transplantasjon kan være steatotic, fibrotiske eller cirrhose. Som eksempel, metoden her resulterer i et høyt utbytte av 13 ± 11 millioner per gram lever hepatocytter sammenlignet med 0,7 ± 0,3 millioner eller 3 ± 2 millioner hepatocytter per gram lever fremstilt ved Baccarani, et al. 15 bruker cirrhosepasienter eller steatotic lever hhv. Imidlertid Leverreseksjon stykker resulterer i en lavere totalt utbytte av hepatocytter som størrelsen av stykket er tilgjengelige er vanligvis liten, med et område 2 til 250 g og et gjennomsnitt på 37 ± 29 g (N = 648).
I forhold til andre grupper, unngår denne protokollen bruk av cyanoakrylatlim. Alexandre, et al 18.. Funnet at bruk av etyl-cyanoakrylat, en vanlig universal-klebemiddel, for å dekke de skårne flater av leveren, resulterer i et økt utbytte av hepatocytter fra 3,5 ± 0,7 til 6,0 ± 1,6 millioner hepatocytter per gram lever med verdier som kommer til uttrykk i middel ± standardfeilen for gjennomsnittet. Til sammenligning er denne protokollen i stand til å oppnå en avkastning på 13,5 ± 0,4 millioner hepatocytter per g lever (uttrykt i middel ± standardfeilen for gjennomsnittet) uten bruk av cyanoakrylatlim. Mens cyanoakrylatlim har vært brukt til lukking av sår <sup> kan 19,20, medisinsk karakter cyanoakrylatlim som oktyl cyanoacrylate og butyl cyanoacrylate være dyrt i forhold til Etylcyanakrylat. Imidlertid har kortere kjedederivater, slik som etyl-cyanoakrylat er funnet å være mer Vevstoksiske enn lengre kjedederivater 21,22.
Denne fremgangsmåte er enklere og mer tidseffektiv på grunn av bruk av buede vanning kanyler med oliven tips. Bruken av kanyler av en passende størrelse vil resultere i en tett passform som holder kanyler på plass uten bruk av lim 18 eller suturer 23. Den kanyler brukes har en diameter på mellom 1-2 mm med tip diameter størrelse 1,25 til 4,5 mm. Et utvalg av forskjellige kanyle størrelser bør bli gjort tilgjengelig ved en lever stykke er klar for kanylering, slik at passende størrelse kanyle for en bestemt blodåre kan velges slik det er vist i den medfølgende video. Denne metoden benytter også flere kanyler generelt (fig.2A) sammenlignet med andre studier hvor to 23 eller 2-4 18 kanyler benyttes. Dette kan bidra til å oppnå en bedre perfusjon gjennom leveren stykket som fører til høy levedyktighet og utbytte i en kortere periode fordøyelse.
I konklusjonen, isolerer dette protokollen humane hepatocytter, som er en viktig modell for å studere cellenes stoffskifte, farmakokinetikk og toksikologi av xenobiotics, lever regenerering og translasjonell forskning. En tidligere undersøkelse på 150 stoffer som forårsaker human toksisitet viste at samsvar mellom toksisitet funnet i dyrestudier, og som ble observert i klinisk praksis er 70% 24. Dermed humane hepatocytter forbli en viktig modell for validering av forskning gjort i dyremodeller og for testing av narkotika fører til bivirkninger før du går til kliniske studier. Videre, bruk av humane hepatocytter isolert fra rest leverprøver eller hepatocytter isolert fra slakteri dyr 25 som modell eri tråd med 3R etisk rammeverk 26 for å erstatte bruken av forsøksdyr når mulige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Optimalisering av denne protokollen ble delvis finansiert av et stipend fra Hepacult GmbH. Dr. Wolfgang Thasler er en av grunnleggerne av Hepacult GmbH og er fortsatt en av medlemmene i styret i dette selskapet. Ansettelse av Maresa Demmel er delvis av Hepacult. Maria Hauner er ansatt Hepacult GmbH. Hepacult er en spin-off bioteknologifirmaet fra universitetet, som tilbyr humane hepatocytter med samtykke og åpen tilgang til forskningsformål.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble gjort mulig av menneskelig vev og Cell Research Foundation, som gjør menneskelig vev tilgjengelig for forskning. Økonomisk støtte til dette arbeidet ble mottatt fra den føderale departementet for utdanning og forskning (stipend navn: Virtual Liver Network, stipend Nummer: 0315759) og Hepacult GmbH. Vår takk går også til de tekniske assistenter fra Grosshadern Hospital Tissue bank for innsamling av leverprøver og de tekniske assistenter fra Cell Isolation Kjerne Facility for gjennomføring av leverperfusjon og hepatocytter isolasjon. Spesielt ønsker vi å takke Natalja Löwen for å demonstrere denne prosedyren i videoen. Til slutt vil vi gjerne takke Natalja Löwen og Edeltraud Hanesch for å lage illustrasjonene til figur 1 og tallene i skjematisk oversikt over videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).
- Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells. Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).
- Anderson, N. G. The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver. Science. 117, 627-628 (1953).
- Jacob, S. T., Bhargava, P. M. New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions. Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).
- Berry, M. N. Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver. Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).
- Laws, J. O., Stickland, L. H. Metabolism of Isolated Liver Cells. Nature. 178, 309-310 (1038).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion. Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).
- Thasler, W. E., et al. Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany. Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).
- Smedsrod, B., Pertoft, H. Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence. J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).
- Cantrell, E., Bresnick, E. Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver. Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).
- Weiskirchen, R., Gressner, A. M. Isolation and culture of hepatic stellate cells. Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).
- Baccarani, U., et al. Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation. Transplant P. 33, 664-665 (2001).
- Renz, J. F., et al. Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation. Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).
- Schemmer, P., et al. Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis. Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).
- Alexandre, E., et al. Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes. Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox. Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).
- Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study. Archives of otolaryngology--head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).
- Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review. Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).
- Bhogal, R. H., et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS ONE. 6, e18222 (2011).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).
- Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices. ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen. (1959).
Tags
Medisin cellebiologi Biomedical Engineering anatomi fysiologi kirurgi biovitenskap (generelt) Menneskelig hepatocytter isolasjon menneskelig hepatocytter collagenase perfusjon collagenase perfusjon hepatocytter lever menneske celle isolasjon kliniske applikasjoner kliniske teknikkerErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016.
Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
| EGTA | 0.1mM |
to:
| EGTA | 1mM |
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
| Calcium chloride dihydrate | 0.5µM |
to:
| Calcium chloride dihydrate | 5mM |
