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Summary
Um procedimento de duas etapas de perfusão de colagenase modificado para isolamento de hepatócitos humanos é descrita. Este método também pode ser aplicado a outros fígados de mamíferos. Os hepatócitos isolados estão disponíveis em alto rendimento e viabilidade, tornando-os um modelo adequado para a investigação científica em áreas como a regeneração do fígado, farmacocinética e toxicologia.
Abstract
O fígado, um órgão com capacidade de regeneração excepcional, realiza uma ampla gama de funções, como a desintoxicação, metabolismo e homeostase. Como tal, os hepatócitos são um modelo importante para uma grande variedade de questões de pesquisa. Em particular, o uso de hepatócitos humanos é especialmente importante nas áreas de farmacocinética, a toxicologia, a regeneração do fígado e investigação de translação. Assim, este método apresenta uma versão modificada de um procedimento de perfusão com colagenase em dois passos para isolar hepatócitos como descrito por Seglen 1.
Anteriormente, os hepatócitos foram isolados por métodos mecânicos. No entanto, os métodos enzimáticos têm sido mostrados como sendo superior como hepatócitos mantêm a sua integridade estrutural e a função, depois do isolamento. Este método aqui apresentado adapta o método concebido anteriormente para os fígados de ratos aos pedaços de fígado humano e resulta num grande rendimento de hepatócitos com uma viabilidade de 77 ± 10%. A principaldiferença neste processo é o processo de canulação dos vasos sanguíneos. Além disso, o método aqui descrito também pode ser aplicado a partir de fígados de outras espécies com tamanhos do fígado ou dos vasos sanguíneos comparáveis.
Introduction
A suspensão de células de fígado pode ser preparado a partir do fígado por meio de métodos mecânicos ou enzimáticos. Os métodos mecânicos usados para preparar as células do fígado integrais incluem forçando o fígado através de gaze 2, agitando um pedaço de fígado com contas de vidro em uma coqueteleira Kahn 3, utilizando homogeneizadores de vidro com pilões soltas 4,5 etc Ao longo dos anos, os métodos mecânicos caíram fora do favorecem, devido à lesão das membranas das células e a perda da função dos hepatócitos isolados 6,7. Por conseguinte, a utilização de um método enzimático é actualmente o principal método para o isolamento de hepatócitos.
Isolamento de hepatócitos, utilizando um método enzimático aumentou quando Berry e amigo 8 perfusão colagenase e hialuronidase através do fígado através da veia porta em ratos. Este processo de perfusão utilizado vasculatura para permitir que os enzimas a entrar em contacto estreito com a maioria das células, o que leva aum aumento de 6 vezes no rendimento de hepatócitos 8. Além disso, este método produziu células que retinham a sua integridade estrutural, com virtualmente nenhuma transformação do retículo endoplasmático em vesículas isoladas e sem dano mitocondrial 8.
Este método foi modificado por Seglen 1, que foi pioneiro de um procedimento de perfusão de duas etapas para o isolamento das células do fígado. Neste procedimento, o fígado de rato é perfundido com uma Ca2 + livre tampão seguido por perfusão com um tampão de colagenase contendo Ca 2 + 1. A remoção de Ca 2 + no primeiro passo ajuda a romper desmossomas, enquanto a adição de Ca 2 + no segundo passo é necessário para a actividade da colagenase ideal 1,9.
Dado que os trabalhos publicados acima descrito foi realizado em ratos, este artigo destina-se a demonstrar um procedimento modificado, que pode ser usado para isolamento de hepatócitos com alta viabilidade de zumbidoum fígado. O uso de hepatócitos humanos continua a ser importante para a investigação de translação e para a validação de experimentos com modelos animais. Os pedaços de fígado humano utilizados neste estudo foram adquiridos com o consentimento para a governança por meio da Fundação de Pesquisa de Tecidos Humanos e celular, uma fundação sem fins lucrativos controlada pelo Estado 10. Depois de um patologista removido o que era necessário para o diagnóstico, pedaços de fígado foram coletadas a partir do tecido remanescente. O tecido seccionado pelo patologista foi morfologicamente tecido saudável obtida a partir de margens de ressecção após a ressecção hepática.
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Protocol
1. Preparação da perfusão e isolamento Solutions
- Preparar as soluções necessárias para a perfusão do pedaço de fígado e o isolamento de hepatócitos de acordo com a Tabela 1. As soluções podem ser armazenadas a 4 ° C até à sua utilização.
- Filtrar em condições estéreis todas as soluções que utilizam um filtro de 0,22 um.
- Todas as soluções que entram em contato com o fígado deve ser estéril.
2. Preparação de Perfusão Equipamentos e Soluções
- O equipamento para a perfusão do pedaço de fígado deve ser configurado como mostrado na Figura 1.
- O banho de água deve ser ajustado a uma temperatura apropriada, que é diferente em cada um determinado conjunto experimental, de modo a que as soluções são a uma temperatura de 37 ° C quando atingem o pedaço de fígado. Neste caso, o banho de água é ajustado a 41 ° C para aquecer as soluções 1, 2 e 3 e do condensador de vidro encamisado. Solução 4 deve ser aquecido até37 ° C em um banho de água para uso separado para reduzir a perda da actividade da colagenase.
- Pouco antes da perfusão hepática, ligue o regulador do tanque de gás contendo 95% de O 2/5% de CO2 para abastecer o aparelho de oxigenação (Figura 1E).
3. Perfusão do fígado
- Um pedaço do fígado com tanto intacto cápsula de Glisson quanto possível e de preferência com superfície de apenas 1 corte deve ser obtida a partir de um patologista para perfusão.
- Colocar este pedaço de fígado num funil de Buchner que contém um disco de filtro perfurado (Figura 1B).
- O sistema de perfusão que devem ser iniciadas com a solução 1.
- Com uma baixa taxa de fluxo, as cânulas de irrigação curvo com pontas de azeitona deve ser inserido dentro de vasos sanguíneos maiores na superfície de corte do pedaço de fígado. Como o sangue libera fora do fígado, o tecido se torna mais leve em áreas com boa perfusão. O número de cânulas usadas para vários tamanhosde fígados é mostrado na Figura 2A. O tamanho calibre escolhido deve resultar em um ajuste confortável que irá realizar as cânulas no lugar. Os vasos sanguíneos mais pequenos devem ser deixados em aberto para o tampão de perfusão para drenar para fora do pedaço de fígado.
- Aumentar a taxa de fluxo na bomba peristáltica, a entre 110-460 ml / min, dependendo do tamanho do fígado (Figura 2B). Isto resulta numa velocidade de fluxo média de 44 ± 16 ml / min por uma cânula (Figura 2C). A velocidade escolhida depende do pedaço de fígado e deve resultar num ligeiro plumping do pedaço de fígado. Em alguns casos, pode ser necessário a braçadeira fechada uma parte dos vasos abertos com grampos vasculares micro para atingir o ligeiro plumping mencionado acima. Uma boa perfusão pode ser observada quando o pedaço de fígado é uma cor mais clara em toda.
- Mantenha o pedaço de fígado úmido durante a perfusão, cobrindo-o com um pedaço de gaze embebida em solução salina.
- Perfundir com 1 L de Solução 1 para expulsar qualquer remaining sangue no pedaço de fígado.
- Mude o líquido de perfusão para a Solução 2 e perfuse por 10 min.
- Mude o líquido de perfusão para a Solução 3 e aspergir com 0,5 L.
- Alterar o fluido de perfusão à solução 4, que contém de 0,1-0,15% de colagenase (Tabela 2).
- Para esta etapa, a perfusão deve ser levada a cabo de uma forma de recirculação para 9-12 minutos ou até que o fígado está suficientemente digerida, o tecido de fígado deveriam aparecer a separar ligeiramente sob a cápsula de Glisson e sentir amolecida, quando sondada com o lado sem corte de um bisturi.
4. O isolamento de hepatócitos
- Desligue a bomba peristáltica e remover cânulas do pedaço de fígado.
- Coloque o pedaço de fígado em um prato de cristalização, contendo 100-200 mL de solução 5.
- Retire a cápsula de Glisson com cuidado e agite para fora das células. Se há regiões que não são bem perfundidos, um bisturi pode ser utilizada para cortar atravésessas regiões para liberar as células contidas. Adicionar mais Solution 5 conforme for necessário durante o processo.
- Adicionar mais 5 solução até um volume final de 500 ml foi atingido.
- Filtrar a suspensão de célula duas vezes: em primeiro lugar através de uma malha de nylon de 210 mM seguido por uma malha de nylon de 70 ^ m. Em seguida, despeje a suspensão de células em tubos de 200 ml de centrífuga.
- Centrifugar a suspensão de células a 72 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células suavemente suavemente em 200 ml de solução 5.
- Repita o passo número lavagem 4,6 três vezes. Na etapa final centrífuga, Ressuspender as células em solução de armazenamento a frio (ver lista de materiais). As células devem ser de aproximadamente 2-5.000.000 hepatócitos por mililitro de avaliação de rendimento e viabilidade através de um teste de exclusão de azul de tripan baseada em hemocitômetro.
- Para realizar um ensaio de exclusão com azul de tripano, adicionar 0,1 ml de células diluídas de forma apropriada (≈ 2-5.000.000 / ml) para um tubo de microcentrífuga contendo 0,5 ml de solução que tripano azulem (0,4% de azul de tripano dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS)), e 0,4 ml de PBS. Após a mistura da suspensão de células cuidadosamente, carregar um hemocitómetro com a suspensão e examinar ao microscópio a uma ampliação de 100X. Na microscopia, as células mortas será manchada azul, enquanto as células vivas aparecem sem mácula. Contar o número de células vivas e total em cada um dos 1 milímetro 2 grades marcadas no hemocitômetro. Viabilidade (%), rendimento de células vivas (milhões de hepatócitos por ml de solução de armazenamento a frio (CSS) ou milhões de hepatócitos por g de fígado) pode ser calculado através das fórmulas abaixo.
Nota: Neste caso, o factor de diluição do azul de tripano é 10 e o factor de hemocitómetro é 10.000.
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Representative Results
Configuração de Perfusão
Os equipamentos necessários para a perfusão hepática deve ser configurado de acordo com a Figura 1.
Viabilidade e Rendimento de isolado hepatócitos humanos
A viabilidade média de hepatócitos humanos isolados foi de 77 ± 10% eo rendimento médio dos hepatócitos foi de 13 ± 11 milhões de hepatócitos / g de fígado, com valores expressos em média ± desvio padrão. O número de isolamentos de hepatócitos realizado para obter estas médias foi 648 isolamentos realizados a partir de janeiro de 1999 a dezembro de 2012.
Indicado Perfusão Parâmetros
A fim de levar a cabo uma descarga bem sucedida e a perfusão do fígado, o número de cânulas utilizado deverá variar de acordo com o peso do fígado (Figura 2A). Em geral, 4-8 cânulas deve ser usado para os fígados que variam de menos de 20 g ao longo de 80 g. A taxa de perfusão adequada, Que também é dependente do peso do fígado, deve ser escolhido para uma perfusão de sucesso do fígado (Figuras 2B e C). Verificou-se que a uma velocidade média de perfusão de 44 ml / min -1 cânula é ideal através de uma variedade de diferentes pesos de fígado e, por conseguinte, as velocidades de perfusão deve ser ajustada de forma adequada, se mais cânulas são utilizados. Se a perfusão for bem sucedida, o fígado deve ser de cor pálida e ligeiramente plumped up.
Pureza de hepatócitos
Por meio de imunofluorescência, verificou-se que os hepatócitos isolados, que coraram positivamente para a albumina, tinham uma pureza de 94 ± 1% (N = 4 a 5 réplicas de cada) (figuras 3A e B). Figura 3C é uma imagem de contraste de fase representante mostrando as características morfológicas de hepatócitos, tais como o tamanho da célula grande e células em forma poligonal.
Figura 1. Instalação de perfusão. (A) armadilha bolha, (B) parte do fígado com cânulas de irrigação curva com dicas de oliveira inseridos nos vasos sanguíneos em um funil de Büchner, (C) de vidro revestido condensador, (D) banho de água, (E) aparelho de oxigenação, ( F) de 95% de O2 / 5% de CO 2 do tanque de gás e (G) da bomba peristáltica.
Figura 2. (A) O número de cânulas utilizado, (B) taxa de perfusão (ml / min), ou (C) taxa de perfusão (ml / min. Uma Significativamente diferente do 0-20 g condição, P <0,05. ab significativamente diferente da de 20-40 g, 40-60 g e 60-80 g condição, P <0,05.
Figura 3. Imagens de imunofluorescência de células isoladas positivas para (A) albumina (coradas em verde) eo correspondente (B) controle negativo (aumento de 200x). Os núcleos são corados em azul com DAPI. Imagem de contraste (C) Fase de células isoladas (aumento de 100X).
| Solução | Constituinte | Concentração final | |||
| Solução 1 | O cloreto de sódio | 154 mM | |||
| HEPES | 20 mM | ||||
| O cloreto de potássio | 5,6 mM | ||||
| Glicose | 5 mM | ||||
| Hidrogenocarbonato de sódio | 25 mM | ||||
| Solução 2 | O cloreto de sódio | 152,5 mM | |||
| HEPES | 19,8 mM | ||||
| O cloreto de potássio | 5,5 mM | ||||
| Glicose | 5,0 mM | ||||
| Hidrogenocarbonato de sódio | 24,8 mM | ||||
| EGTA | 0,1 mM | ||||
| Para preparar a solução 2, adicione 10 ml de EGTA 100 mM a 990 ml de solução 1. | Solução 3 | O cloreto de sódio | 152,5 mM | ||
| HEPES | 19,8 mM | ||||
| O cloreto de potássio | 5,5 mM | ||||
| Glicose | 5,0 mM | ||||
| Hidrogenocarbonato de sódio | 24,8 mM | ||||
| Di-hidrato de cloreto de cálcio | 0,5 fiM | ||||
| Para preparar a solução 3, adicionar 10 ml de 0,5 M de cloreto de cálcio di-hidratado a 990 ml de solução 1. | |||||
| Solução 4 | O cloreto de sódio | 152,5 mM | |||
| HEPES | 19,8 mM | ||||
| O cloreto de potássio | 5,5 mM | ||||
| Glicose | 5,0 mM | ||||
| Hidr sódiocarbonato ogen | 24,8 mM | ||||
| Di-hidrato de cloreto de cálcio | 0,5 fiM | ||||
| Colagenase | Ver Tabela 2 | ||||
| Para preparar Solução 4, adicionar uma quantidade adequada de colagenase para a Solução 3. | |||||
| Solução 5 | O cloreto de sódio | 120 mM | |||
| HEPES | 10 mM | ||||
| Di-hidrato de cloreto de cálcio | 0,9 mM | ||||
| O cloreto de potássio | 6,2 mM | ||||
| Albumina | 0,1% w / v | ||||
Tabela 1. Perfusão e soluções de isolamento.
| Tamanho do pedaço do fígado (g) | Concentração de colagenase(%) | A actividade da colagenase (U / ml) |
| <25 | 0,10 | 250 |
| 25 - 40 | 0.11 | 300 |
| 41 - 80 | 0,13 | 350 |
| > 80 | 0,15 | 400 |
Tabela 2. As concentrações de colagenase (%) e as actividades (U / ml) a ser utilizado para vários tamanhos de pedaços de fígado (g).
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Discussion
Este protocolo resulta no isolamento de hepatócitos humanos com alta viabilidade e pureza. Para atingir estes resultados, é importante para começar com um pedaço de fígado adequado. O pedaço de fígado deve ter cápsula intacta de Glisson em todas as superfícies, exceto para 1 superfície de corte. Outro fator importante é o lote especial de colagenase utilizada, como lotes diferentes podem resultar em diferenças marcantes em viabilidades de hepatócitos após digestão 11. Portanto, diferentes lotes de colagenase deve ser testada e o lote que produz os hepatócitos com o melhor viabilidade deve ser obtida em grandes quantidades. Finalmente, um tempo de digestão adequada tem de ser escolhido com base no rendimento e na viabilidade das células obtidas. Por exemplo, uma alta viabilidade com baixo rendimento poderia indicar um tempo de digestão insuficiente, e um rendimento elevado com baixa viabilidade pode indicar que o tempo de digestão é muito longo.
Este método pode ser adaptado tO isolamento de células não-parenquimatosas e hepatócitos a partir do mesmo pedaço de fígado. Uma maneira de fazer isto é a utilização do sobrenadante do primeiro passo de centrifugação (passo 4,6) directamente para o isolamento de células não-parenquimatosas 12. Uma segunda maneira consiste em remover a alíquota necessária de suspensão de células após a filtração através de malha de nylon para isolamento de hepatócitos (passo 4.5) e submeter a suspensão de células remanescente a um passo de digestão com pronase adicional antes do isolamento de células não-parenquimatosas, a fim de aumentar o rendimento de as células não-parenquimatosas 13. Para um maior rendimento de células não-parenquimatosas, em detrimento dos hepatócitos, este método pode ser modificado pela substituição de colagenase isoladamente (passo 3.10) para pronase e colagenase e usando a suspensão de células resultante para o isolamento de células não-parenquimatosas 14.
Além de se isolar os hepatócitos humanos, este método apresenta também pode ser adaptado para isolar os hepatócitos a partir de pedaços de fígado recolhidas from outras espécies com tamanhos comparáveis ou tamanhos vasculatura comparáveis. Isso pode ser importante para os pesquisadores que usam modelos alternativos, tais como suínos, caninos ou modelos de primatas.
Isolamentos de hepatócitos humanos geralmente são feitas usando fígados de duas fontes: fígados inteiros considerado impróprio para transplante ou tecido do fígado morfologicamente normais de margens de ressecção. A vantagem desta última fonte usada neste método é que os pedaços de fígado são disponibilizados para o laboratório, mais cedo. Imediatamente após a ressecção, o fígado ressecado é trazido para um patologista, que remove o que é necessária para o diagnóstico. O patologista, em seguida, remover um pedaço adequado de fígado morfologicamente normais para o isolamento de hepatócitos a partir do que está previsto para o descarte. Em geral, um pedaço de fígado chega ao laboratório pronto para perfusão em um tempo médio de 56 ± 29 min (n = 103). Em comparação, os fígados inteiros que não são adequados para transplantação só será relfacilitado ao laboratório entre 13 ± 2 horas e 16 ± 12 hr 15. Além disso, devido a considerações éticas e à escassez de fígados de doadores, o isolamento de hepatócitos de fígados inteiros que não atendem a todos os critérios para transplante é evitado na região Eurotransplant. Isto é porque estas fígados ainda pode ser utilizado para transplante com critérios doadores prolongados. Alguns estudos têm demonstrado que a maximização acesso dos doentes aos resultados de transplante na diminuição da mortalidade lista de espera, com resultados satisfatórios para os destinatários selecionados 16,17. Outra vantagem é que as células obtidas a partir de pedaços de ressecção do fígado são isoladas a partir do fígado morfologicamente saudável, enquanto que os fígados inadequadas para transplante pode ser esteatótica, fibrose ou cirrose. Como tal, o método aqui resulta num rendimento elevado de 13 ± 11 milhões de hepatócitos do fígado por grama em comparação com os 0,7 ± 0,3 milhões ou 3 ± 2.000.000 hepatócitos do fígado por grama obtidos por Baccarani, et al. Utilizando 15 pacientes cirróticos ou esteatose respectivamente. No entanto, as peças de ressecção hepática resultar num rendimento total mais baixa de hepatócitos como o tamanho da peça disponível é geralmente pequena, com um intervalo de 2-250 g, e uma média de 37 ± 29 g (N = 648).
Em comparação com outros grupos, este protocolo evita a utilização de adesivos de cianoacrilato. Alexandre et al. 18 verificaram que o uso de acetato de cianoacrilato, um adesivo para todos os fins de uso geral, para cobrir as superfícies de corte do fígado, resulta num rendimento aumentado de hepatócitos a partir de 3,5 ± 0,7 para 6,0 ± 1,6 milhões de hepatócitos por grama hepática com valores expressos em médias ± erro padrão da média. Em comparação, este protocolo é capaz de alcançar um rendimento de 13,5 ± 0,4 milhão hepatócitos por g de fígado (expressos em média ± erro padrão da média), sem a utilização de adesivos de cianoacrilato. Enquanto os adesivos de cianoacrilato têm sido utilizados para o fechamento da ferida <sup> 19,20, adesivos de cianoacrilato da classe médica, como cianoacrilato e octil butil cianoacrilato pode ser caro em comparação com cianoacrilato de etila. No entanto, os derivados de cadeia curta, tais como acetato de cianoacrilato ter sido encontrado ser mais histotoxic de derivados de cadeia mais longa, 21,22.
Este método é mais simples e mais eficiente do tempo, devido ao uso de cânulas de irrigação curvo com pontas de oliveira. O uso de cânulas de tamanho apropriado irá resultar num ajuste apertado, que mantém a cânula no lugar, sem o uso de cola 18 ou suturas 23. As cânulas utilizadas têm diâmetros que variam de 1-2 mm de diâmetro de ponta de tamanho 1,25-4,5 mm. Uma variedade de diferentes tamanhos de cânula deve ser disponibilizado um pedaço de fígado, quando está pronta para punção, de modo a que a cânula de tamanho apropriado para um vaso sanguíneo em particular pode ser escolhido, conforme mostrado no vídeo acompanhante. Este método utiliza também mais cânulas em geral (Figura2A) em comparação com outros estudos, onde são usados dois 23 ou 2-4 18 cânulas. Isso pode ajudar a conseguir uma melhor perfusão em toda a peça fígado levando a alta viabilidade e produtividade em um período de digestão mais curto.
Em conclusão, este protocolo isola hepatócitos humanos, que são um importante modelo para estudar o metabolismo celular, a farmacocinética e toxicologia de xenobióticos, a regeneração do fígado e pesquisa translacional. Uma pesquisa anterior sobre 150 drogas que causam toxicidade humana mostrou que a concordância entre a toxicidade encontrados em estudos com animais e que o observado na prática clínica é de 70% 24. Assim, os hepatócitos humanos continuam a ser um importante modelo para a validação de pesquisas feitas em modelos animais e para o teste de drogas leva a reacções adversas antes de ir para os ensaios clínicos. Além disso, o uso de hepatócitos humanos isolados a partir de amostras de fígado remanescente ou hepatócitos isolados a partir de animais de matadouro 25 como um modelo éem linha com o quadro ético 3R 26 para substituir o uso de animais sempre que possível pesquisa.
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Disclosures
Otimização deste protocolo foi parcialmente financiado por uma concessão do Hepacult GmbH. Dr. Wolfgang Thasler é um dos fundadores da Hepacult GmbH e continua sendo um dos membros do conselho nesta empresa. O emprego de Maresa Demmel é parcialmente por Hepacult. Maria Hauner é empregado por Hepacult GmbH. Hepacult é um spin-off empresa biotecnológica da Universidade, que oferece hepatócitos humanos com o consentimento e acesso aberto para fins de pesquisa.
Acknowledgments
Este trabalho foi possível graças a Fundação de Pesquisa de células e tecidos humanos, o que torna tecidos humanos disponíveis para a pesquisa. O apoio financeiro para este trabalho foi recebido do Ministério Federal de Educação e Pesquisa (nome concessão: Fígado de Rede Virtual, número de concessão: 0315759) e Hepacult GmbH. Nossos agradecimentos vão também para os assistentes técnicos do Banco de tecidos Grosshadern Hospital para a recolha das amostras do fígado e dos assistentes técnicos do Núcleo instalação de isolamento celular para a realização da perfusão hepática e isolamento dos hepatócitos. Em particular, gostaríamos de agradecer Natalja Löwen para demonstrar este procedimento no vídeo. Finalmente, gostaríamos de agradecer Natalja Löwen e Edeltraud Hanesch para criar as ilustrações para a Figura 1 e as figuras na visão esquemática do vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
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Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016.
Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
| EGTA | 0.1mM |
to:
| EGTA | 1mM |
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
| Calcium chloride dihydrate | 0.5µM |
to:
| Calcium chloride dihydrate | 5mM |
