ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Модифицированная двухэтапной процедуры коллагеназы перфузии для изоляции гепатоцитов человека описывается. Этот метод может быть также применен к другим печени млекопитающих. Выделенные гепатоциты доступны с высоким выходом и жизнеспособности, что делает их удобной моделью для научных исследований в таких областях, как регенерации печени, фармакокинетики и токсикологии.
Abstract
Печень, орган с исключительной мощностью регенерации, выполняет широкий спектр функций, таких как детоксикации, метаболизма и гомеостаза. Таким образом, гепатоциты являются важной моделью для большого разнообразия исследовательских вопросов. В частности, использование человеческих гепатоцитов особенно важно в области фармакокинетики, токсикологии, регенерации печени и трансляционных исследований. Таким образом, этот способ представляет собой модифицированную версию процедуры коллагеназы перфузии двухступенчатой чтобы изолировать гепатоциты, как описано Seglen 1.
Ранее, гепатоциты были выделены с помощью механических методов. Тем не менее, ферментативные способы, как было показано, чтобы быть выше как гепатоциты сохраняют свою структурную целостность и функцию после выделения. Этот метод представлен здесь адаптирует метод, предназначенный ранее для печени крыс к человеческим кусочки печени и приводит к большим выходом гепатоцитов с жизнеспособностью 77 ± 10%. ОсновнойРазница в этой процедуре является процесс cannulization кровеносных сосудов. Кроме того, способ, описанный здесь, также могут быть применены к печени от других видов с печени или кровеносных сосудов, сравнимых размеров.
Introduction
Суспензию клеток печени могут быть получены из печени с помощью механических или ферментативными методами. Механические методы, используемые для получения целые клетки печени включают заставляя печень через марлю 2, качая кусок печени со стеклянными шариками в шейкере Кан 3, используя стеклянные гомогенизаторы со свободными пестики 4,5 и т.д. На протяжении многих лет, механические методы выпали из пользу в связи с повреждением клеточных мембран и потери функции изолированных гепатоцитов 6,7. Следовательно, использование ферментативного метода в настоящее время является основным методом изоляции гепатоцитов.
Выделение гепатоцитов с использованием способа ферментативной была значительно улучшена, когда Берри и друзья 8 перфузии коллагеназы и гиалуронидазы через печень через портальную вену у крыс. Этот процесс перфузии использовали сосудистую чтобы позволить ферменты входить в тесный контакт с большинством клеток, что приводит кувеличение в 6 раз с выходом гепатоцитов 8. Кроме того, этот метод дает клетки, которые сохранили свои структурную целостность, практически без трансформации эндоплазматической сети в изолированных пузырьков и без повреждений митохондриальной 8.
Этот метод был модифицирован Seglen 1, который впервые процедуру двухэтапного перфузии для выделения клеток печени. В этой процедуре печени крысы перфузии с Ca 2 + свободного буфера с последующим перфузии буфер коллагеназы, содержащего Са 2 + 1. Удаление Ca 2 + на первой стадии помогает разрушить десмосомы, в то время как добавление Ca 2 + на втором этапе требуется для оптимальной активности коллагеназы 1,9.
Учитывая, что опубликованная работа описано выше была выполнена на крысах, эта статья призвана продемонстрировать, модифицированной методики, которую можно использовать для выделения гепатоцитов с высокой жизнеспособностью от гулаА.Н. печень. Использование гепатоцитов человека остается важным для трансляционных исследований и для проверки эксперименты с использованием животных моделей. Человеческие частей печени используемые в этом исследовании были приобретены с согласия для управления через ткани человека и Cell Research Foundation в, контролируемой государством некоммерческого фонда 10. После патологоанатом удалены, что требовалось для диагностики, куски печени были собраны из оставшейся ткани. Ткань секционного патологоанатом был морфологически здоровые ткани получают из резекции после резекции печени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка перфузии и изоляция Решения
- Подготовка растворов, необходимых для перфузии части печени и выделения гепатоцитов соответствии с таблицей 1. Растворы можно хранить при 4 ° С до использования.
- Стерильный фильтр все решения с использованием 0,22 мкм.
- Все растворы, которые вступают в контакт с печени должны быть стерильными.
2. Подготовка перфузии оборудования и решений
- Оборудование для перфузии части печени должны быть созданы, как показано на рисунке 1.
- Водяная баня должна быть установлена при соответствующей температуре, которая отличается в каждом конкретном экспериментальной установки, например, что решения при температуре 37 ° С, когда они достигают кусок печени. В этом случае водяной бани устанавливается на 41 ° С, чтобы нагреть растворов 1, 2 и 3 и рубашкой стекло конденсатора. Решение 4 должны быть прогреты до37 ° C в отдельном водяной бане в течение использования, чтобы уменьшить потери активности коллагеназы.
- Незадолго до перфузии печени, включите регулятора газового резервуара, содержащего 95% O 2/5% CO 2 на газ оксигенации аппарат (рис. 1д).
3. Перфузия печени
- Кусок печени с такой же неповрежденной капсулы Глиссона насколько возможно, а в идеале с только 1 поверхности разреза должно быть получено от патологоанатома для перфузии.
- Поместите этот кусок печени на воронке Бюхнера, который содержит перфорированную фильтра диск (рис. 1В).
- Система перфузии следует загрунтовать Решение 1.
- С низкой скоростью потока, изогнутые орошения канюли с оливковыми советы должны быть вставлены в больших кровеносных сосудов на поверхности разреза куска печени. Как кровь вымывает из печени, ткань становится светлее в местах с хорошей перфузии. Используется для различных размеров количество канюлииз печени показано на рисунке 2А. Размер калибра выбрали должно привести к плотного прилегания, который будет содержать канюли на месте. Меньшие кровеносные сосуды следует оставить открытым для буфера перфузии для слива из куска печени.
- Увеличение скорости потока на перистальтического насоса к между 110-460 мл / мин в зависимости от размера печени (рис. 2В). Это приводит к средней скорости потока 44 ± 16 мл / мин на канюли (рис. 2в). Скорость выбирается в зависимости от куска печени и должно привести к небольшим уплотняет до куска печени. В некоторых случаях это может быть необходимо, чтобы зажать закрыть некоторые из открытых сосудах с микро сосудистых зажимов для достижения небольшое уплотняет упомянутую выше. Хороший перфузии можно наблюдать, когда часть печени является светлый цвет во всем.
- Держите кусок печени влажный во перфузии с помощью покрытия из кусочком марли, смоченной в солевом растворе.
- Заливать 1 л раствора 1, чтобы избавиться от любого гemaining кровь в куске печени.
- Изменение перфузионной жидкости к раствору 2 и заливать в течение 10 мин.
- Переключите перфузии жидкости для решения 3 и заливать 0,5 L.
- Изменение перфузионной жидкости к решению 4, который содержит 0,1-0,15% от коллагеназы (табл. 2).
- На этом этапе, перфузии следует проводить в рециркуляционной образом в течение 9-12 мин или до тех пор, печень не достаточно переваривается; ткани печени должен появиться распадаться слегка под капсулой Глиссона и чувствовать размягчается при зондировании тупой стороной скальпель.
4. Выделение гепатоцитов
- Выключите перистальтического насоса и снимите канюли из куска печени.
- Поместите часть печени в кристаллизатор, содержащей 100-200 мл раствора 5.
- Осторожно снимите капсулу в Глиссона и осторожно вытряхнуть клетки. Если есть регионы, которые недостаточно хорошо перфузии, скальпель может быть использован, чтобы прорезатьэти регионы, чтобы освободить клетки, содержащиеся в. Добавьте больше решение 5, как необходимо в процессе.
- Добавить еще решение 5 до конечного объема 500 мл пока не будет достигнута.
- Фильтр клеточной суспензии дважды: сначала через 210 мкм нейлоновую сетку с последующим нейлоновое сито 70 мкм. Затем залить клеточной суспензии в 200 мл центрифужные пробирки.
- Центрифуга клеточной суспензии в 72 г в течение 5 мин при 4 ° С. Аспирируйте супернатант и осторожно ресуспендируют осадок клеток осторожно в 200 мл раствора 5.
- Повторите стиральную номер шага 4,6 три раза. На последнем шаге центрифуги, ресуспендирования клеток в холодной решение для хранения данных (см. перечень материалов). Клетки должны быть примерно 2-5 млн. гепатоциты на миллилитр для оценки вылова и жизнеспособности с помощью гемоцитометра основе трипановым голубым.
- Для проведения теста с трипановым голубым, добавить 0,1 мл соответственно разбавленных клеток (млн. ≈ 2-5 / мл) в пробирке, содержащей 0,5 мл трипанового синего Solutiна (0,4% трипанового синего растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS)) и 0,4 мл PBS. После перемешивания клеточной суспензии тщательно, загрузить гемоцитометра с подвеской и исследовать под микроскопом при 100-кратном увеличении. Под микроскопом, мертвые клетки будут окрашен в голубой цвет в то время как живые клетки появляются неокрашенными. Подсчитайте количество живых и общего числа клеток в каждом из 1 мм 2 сеток, отмеченных на гемоцитометре. Жизнеспособность (%), выход живых клеток (млн. гепатоциты в мл раствора холодильной (CSS) или миллион гепатоциты в г печени) можно рассчитать, используя приведенные ниже формулы.
Примечание: В этом случае трипанового синего коэффициент разбавления 10 и фактор гемоцитометр составляет 10000.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Перфузии установки
Оборудование, необходимое для перфузии печени должны быть созданы в соответствии с рисунком 1.
Жизнеспособность и Выход выделенного гепатоциты человека
Средняя жизнеспособность изолированных гепатоцитов человека было 77 ± 10% и средняя урожайность гепатоцитов было 13 ± 11 млн. гепатоциты / г печени, со значениями, выраженных в качестве средства ± стандартное отклонение. Количество гепатоцитов выделений осуществляется для получения эти средние было 648 изоляция осуществляется с января 1999 года по декабрь 2012 года.
Подходит перфузии Параметры
Для того, чтобы осуществить успешный смывание и перфузии печени, число канюли используемой должны меняться в зависимости от веса печени (рис. 2а). В общем, 4-8 канюли должны использоваться для печени в пределах от менее 20 г до более чем 80 г. Подходящая скорость перфузии, Который также зависит от веса печени, должны быть выбраны для успешного перфузии печени (фиг. 2B и С). Было установлено, что средняя скорость перфузии 44 мл / мин -1 канюли идеально подходит по целому ряду различных веса печени и, следовательно, скорости перфузии должна быть скорректирована соответствующим образом, если используются дополнительные канюли. Если перфузии успешно, печень должна быть бледного цвета и слегка налетели.
Чистоту гепатоцитов
С помощью иммунофлюоресценции, было установлено, что изолированные гепатоциты, который положительно пятно на альбумин, имел чистоту 94 ± 1% (N = 4 с 5 повторяет каждый) (фиг.3А и В). Фигура 3С является представителем фазовый контраст изображения показывая морфологические характеристики гепатоцитов, клеток большого размера и формы полигональных-клеток.
Рисунок 1. Настройка перфузии. (А) пузырь ловушку, (Б) кусок печени с изогнутым орошения канюли с оливковыми советы вставленных в кровеносных сосудах на воронке Бюхнера, (С) стекло рубашкой конденсатор, (D) на водяной бане, (Е) оксигенации аппарата, ( F) 95% O 2/5% CO 2 газ бак и (G) перистальтический насос.
Рисунок 2. Используется скорость перфузии (мл / мин) (А) Количество канюли, (B), или (С) скорость перфузии (мл / мин. аб Значительно отличается от 20-40 г, 40-60 г и 60-80 г состоянии, Р <0,05.
Рисунок 3. Иммунофлуоресцентный образы изолированных клеток, позитивных по (A) альбумина (окрашенных в зеленый) и соответствующего (В) отрицательного контроля (200-кратное увеличение). Ядра окрашиваются в синий с использованием DAPI. (С) Фаза контраст образ изолированных клеток (увеличение в 100 раз).
| Решение | Составной | Конечная концентрация | |||
| Решение 1 | Хлористый натрий | 154 мм | |||
| HEPES | 20 мМ | ||||
| Хлористый калий | 5,6 мМ | ||||
| Глюкоза | 5 мм | ||||
| Гидрокарбонат натрия | 25 мм | ||||
| Решение 2 | Хлористый натрий | 152,5 мМ | |||
| HEPES | 19.8 мМ | ||||
| Хлористый калий | 5,5 мм | ||||
| Глюкоза | 5,0 мм | ||||
| Гидрокарбонат натрия | 24.8 мМ | ||||
| ЭГТА | 0,1 мм | ||||
| Для подготовки Решение 2, добавить 10 мл 100 мМ EGTA до 990 мл раствора 1. | Решение 3 | Хлористый натрий | 152,5 мМ | ||
| HEPES | 19.8 мМ | ||||
| Хлористый калий | 5,5 мм | ||||
| Глюкоза | 5,0 мм | ||||
| Гидрокарбонат натрия | 24.8 мМ | ||||
| Хлорид кальция дигидрат | 0,5 мкм | ||||
| Чтобы приготовить раствор 3, добавляют 10 мл 0,5 М дигидрата хлорида кальция к 990 мл раствора 1. | |||||
| Решение 4 | Хлористый натрий | 152,5 мМ | |||
| HEPES | 19.8 мМ | ||||
| Хлористый калий | 5,5 мм | ||||
| Глюкоза | 5,0 мм | ||||
| Гидравлическое натрияоген карбонат | 24.8 мМ | ||||
| Хлорид кальция дигидрат | 0,5 мкм | ||||
| Коллагеназа | См. Таблицу 2 | ||||
| Для подготовки решения 4, добавить соответствующее количество коллагеназы в Решение 3. | |||||
| Решение 5 | Хлористый натрий | 120 мм | |||
| HEPES | 10 мМ | ||||
| Хлорид кальция дигидрат | 0,9 мм | ||||
| Хлористый калий | 6,2 мм | ||||
| Альбумин | 0,1% вес / объем | ||||
Таблица 1. Перфузии и изоляции решения.
| Размер куска печени (г) | Концентрация коллагеназы(%) | Активность коллагеназы (U / мл) |
| <25 | 0.10 | 250 |
| 25 - 40 | 0.11 | 300 |
| 41 - 80 | 0.13 | 350 |
| > 80 | 0.15 | 400 |
Таблица 2. Концентрации коллагеназы (%) и деятельность (ед / мл), который будет использоваться для различных размеров кусков печени (G).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол приводит к выделению гепатоцитов человека с высокой жизнеспособности и чистоты. Для достижения этих результатов, важно, чтобы начать с соответствующим кусочком печени. Кусок печени должны иметь капсулу нетронутыми Глиссона в на всех поверхностях в течение 1 поверхности разреза, кроме. Еще одним важным фактором является конкретной партии коллагеназы используется, как разные партии может привести к заметным различиям в жизнеспособность гепатоцитов после пищеварения 11. Таким образом, разные партии коллагеназы должны быть проверены, и эта партия, которая производит гепатоциты с лучшей жизнеспособности должны быть получены в больших количествах. Наконец, подходящее время пищеварение должен быть выбран на основе выхода и жизнеспособность клеток, полученных. Например, высокая жизнеспособность с низким выходом может указывать на недостаточное время пищеварения, и высокая доходность с низким жизнеспособности может означать, что время переваривания слишком длинный.
Этот способ может быть адаптирован то выделения не-паренхиматозные клетки и гепатоциты от того же куска печени. Один из способов сделать это состоит в использовании супернатант с первого шага центрифугирования (шаг 4.6) непосредственно для изоляции без паренхимы клеток 12. Второй способ заключается в удалении требуемого аликвоты клеточной суспензии после фильтрации через нейлоновое сито для выделения гепатоцитов (этап 4.5) и подвергают оставшиеся клеточной суспензии на дополнительной стадии проназа пищеварения перед выделением не-паренхимы клеток с целью повышения выхода не-паренхиматозные клетки 13. Для более высокий выход без паренхимных клеток за счет гепатоцитов, этот способ может быть модифицирован путем замены коллагеназы (шаг 3,10) для проназой и коллагеназы и использование полученной клеточной суспензии для выделения не-клеток паренхимы 14.
В дополнение к изоляции гепатоцитов человека, этот метод представлен также может быть приспособлен, чтобы изолировать гепатоциты из кусочков печени, собранных сюдам другие виды с сопоставимыми размерами или сопоставимых размеров сосудов. Это может быть важно для исследователей, которые используют альтернативные модели, такие, как свиньи, собаки или приматов моделей.
Выделений гепатоцитов человека, как правило, осуществляется с помощью печень из двух источников: целые печень признана непригодной для трансплантации или морфологически нормальной ткани печени от резекции. Преимущество последнего источника, используемого в этом способе является то, что кусочки печени были доступны в лабораторию раньше. Сразу после резекции, резекции печени доводят до патологоанатома, который удаляет то, что требуется для установления диагноза. Патологоанатом затем удалить подходящий участок морфологически нормальной печени для изоляции гепатоцитов от того, что планируется для отказа. В общем, кусок печени поступает в лаборатории, готового к перфузии в среднем времени от 56 мин ± 29 (n = 103). Для сравнения, целые печени, которые не подходят для трансплантации будет только отнснизился до лаборатории между 13 ± 2 часов и 16 ± 12 ч 15. Кроме того, в связи с этических соображений и нехватки доноров печени, изоляция гепатоцитов из целых печени, которые не соответствуют всем критериям для пересадки можно избежать в Евротрансплант регионе. Это потому, что эти печень еще могут быть использованы для трансплантации с расширенными критериев доноров. Некоторые исследования показали, что увеличение доступа пациентов к результатам трансплантации в уменьшенной списка ожидания смертности и удовлетворительные результаты на отдельных получателей 16,17. Еще одним преимуществом является то, что клетки, полученные из печени резекция части изолированы от морфологически здоровой печени, в то время как печень непригодными для трансплантации может быть steatotic, фиброзная или циррозом. Таким образом, метод здесь приводит к высоким выходом 13 ± 11000000 гепатоцитов на грамм печени по сравнению с 0,7 ± 0300000 или 3 ± 2000000 гепатоцитов на грамм печени, полученных Baccarani и др.15. Используя циррозом или steatotic печень соответственно. Тем не менее, печени резекции части приведет к снижению общего выхода гепатоцитов как размер куска доступной как правило, небольшие с диапазоном от 2-250 г и в среднем на 37 ± 29 г (N = 648).
По сравнению с другими группами, этот протокол позволяет избежать использования остатков клея. Александр и др. 18. Обнаружили, что использование Этилцианакрилат, обычно используемый универсальный клей, чтобы покрыть Поверхности срезов в печени, приводит к увеличению доходности гепатоцитов от 3,5 ± 0,7 до 6,0 ± 1,6 млн. гепатоцитов на грамм Печень со значениями, выраженных в средствах ± стандартная ошибка среднего. Для сравнения, этот протокол способен достичь выход 13,5 ± 0,4 млн. гепатоцитов в г печени (выраженная в средствах ± стандартная ошибка среднего) без использования остатков клея. В то время как цианоакрилатные были использованы для закрытия ран <SUP> 19,20, медицинского класса цианоакрилатные такие как октилового цианоакрилата и бутилацетат цианоакрилата может быть дорогим по сравнению с Этилцианакрилат. Тем не менее, более короткие производные цепью, такие как Этилцианакрилат Было обнаружено, что более чем histotoxic длинных цепных производных 21,22.
Этот метод является более простым и эффективным время в связи с использованием изогнутой орошения канюли с оливковых советы. Использование канюли соответствующего размера приведет к плотной посадки, который содержит канюли на месте без использования клея 18 или швов 23. Канюли используется имеют диаметры в диапазоне от 1-2 мм с диаметром кончика размером от 1.25-4.5 мм. Ассортимент различных размеров канюли должна быть доступна, когда часть печени готов к катетеризации, так что соответствующий размера канюли для конкретного кровеносного сосуда может быть выбран, как показано на прилагаемом видео. Этот метод также использует больше канюли в целом (рис.2А) по сравнению с другими исследованиями, в которых используются 2 23 или 2-4 18 канюли. Это может помочь достичь лучшего перфузии всюду по части печени, ведущей к высокой жизнеспособности и доходности в более короткий период пищеварения.
В заключение, этот протокол изолирует человека гепатоциты, которые являются важной моделью для изучения клеточного метаболизма, фармакокинетики и токсикологии ксенобиотиков, регенерацию печени и трансляционные исследования. Предыдущее обследование на 150 препаратов, которые вызывают человеческое токсичность показали, что соответствие между токсичностью найденных в исследованиях на животных, и что наблюдается в клинической практике 70% 24. Таким образом, гепатоциты человека остаются важной моделью для проверки исследований, проведенных на животных моделях и для тестирования препарата приводит к побочных реакций, прежде чем к клиническим испытаниям. Кроме того, использование человеческих гепатоцитов, выделенных из остаточных образцов печени или гепатоциты изолированы от скотобойни животных 25 как модельв соответствии с 3R этических рамках 26 заменить использование подопытных животных при возможных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Оптимизация этого протокола было частично финансируется за счет гранта от Hepacult GmbH. Д-р Вольфганг Thasler является одним из основателей Hepacult GmbH и остается одним из членов совета в этой компании. Применение Maresa Demmel является частично Hepacult. Мария Hauner работает на Hepacult GmbH. Hepacult является спин-офф биотехнологический фирма из университета, который предлагает гепатоциты человека с согласия и открытый доступ для исследовательских целей.
Acknowledgments
Эта работа стала возможной благодаря человеческому тканей и клеток Research Foundation, который делает ткани человека для исследований. Финансовая поддержка для этой работы было получено от Федерального министерства образования и научных исследований (имя грант: Виртуальный печени сети, номер гранта: 0315759) и Hepacult GmbH. Мы также благодарим техническим помощников из ткани банка Гроссхадерн больницы для сбора образцов печени и технических помощников из клетки изоляции основной комплекс для проведения перфузии печени и изоляцию гепатоцитов. В частности, мы хотели бы поблагодарить Наталья Löwen для демонстрации эту процедуру на видео. Наконец, мы хотели бы поблагодарить Наталья Löwen и Edeltraud Hanesch для создания иллюстрации к рис.1 и цифры в схематический обзор видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).
- Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells. Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).
- Anderson, N. G. The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver. Science. 117, 627-628 (1953).
- Jacob, S. T., Bhargava, P. M. New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions. Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).
- Berry, M. N. Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver. Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).
- Laws, J. O., Stickland, L. H. Metabolism of Isolated Liver Cells. Nature. 178, 309-310 (1038).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion. Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).
- Thasler, W. E., et al. Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany. Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).
- Smedsrod, B., Pertoft, H. Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence. J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).
- Cantrell, E., Bresnick, E. Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver. Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).
- Weiskirchen, R., Gressner, A. M. Isolation and culture of hepatic stellate cells. Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).
- Baccarani, U., et al. Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation. Transplant P. 33, 664-665 (2001).
- Renz, J. F., et al. Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation. Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).
- Schemmer, P., et al. Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis. Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).
- Alexandre, E., et al. Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes. Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox. Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).
- Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study. Archives of otolaryngology--head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).
- Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review. Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).
- Bhogal, R. H., et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS ONE. 6, e18222 (2011).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).
- Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices. ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen. (1959).
Tags
Медицина выпуск 79 клеточная биология биомедицинской инженерии анатомии физиологии хирургии науки о жизни (Общие) изоляция человека гепатоцитов человеческий гепатоцитов коллагеназы перфузии коллагеназы перфузии гепатоцитов печень человеком сотовый изоляция клинические приложения клинические методыErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016.
Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
| EGTA | 0.1mM |
to:
| EGTA | 1mM |
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
| Calcium chloride dihydrate | 0.5µM |
to:
| Calcium chloride dihydrate | 5mM |
