Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering af humane hepatocytter ved en to-trins collagenaseperfusion Procedure

Published: September 3, 2013 doi: 10.3791/50615
Automatic Translation
1,2, 1, 2,3, 3, 4
1Experimental Surgical Research, Grosshadern Hospital, Munich, 2Center for Liver Cell Research, Grosshadern Hospital, Munich, 3Hepacult LLC, Regensburg, 4Department of Surgery, Grosshadern Hospital, Munich

ERRATUM NOTICE

Summary

En modificeret totrins collagenaseperfusion procedure til isolering af humane hepatocytter beskrevet. Denne metode kan også anvendes til andre pattedyr lever. De isolerede hepatocytter fås i højt udbytte og levedygtighed, hvilket gør dem en passende model for videnskabelig forskning på områder såsom lever regeneration, farmakokinetik og toksikologi.

Abstract

Leveren, et organ med en ekstraordinær regenereringsevne, udfører en række funktioner, såsom afgiftning, metabolisme og homeostase. Som sådan hepatocytter er en vigtig model for en lang række forsknings spørgsmål. I særdeleshed er især vigtigt inden for farmakokinetik, toksikologi, lever regenerering og translationel forskning anvendelse af humane hepatocytter. Således er denne metode viser en modificeret version af en to-trins collagenaseperfusion procedure til at isolere hepatocytter som beskrevet af Seglen 1.

Tidligere har hepatocytter blevet isoleret ved hjælp af mekaniske metoder. Har imidlertid vist enzymatiske metoder at være overlegen hepatocyter bevarer deres strukturelle integritet og funktion, efter isolering. Denne metode præsenteres her tilpasser metode designet til tidligere til rottelevere til humane lever stykker og resultater i et stort udbytte af hepatocytter med en levedygtighed på 77 ± 10%. De vigtigsteforskel i denne procedure er den proces cannulization af blodkarrene. Endvidere kan den her beskrevne fremgangsmåde også anvendes til lever fra andre arter med sammenlignelige lever eller blodkar størrelser.

Introduction

En lever cellesuspension kan fremstilles ud fra leveren ved mekaniske eller enzymatiske metoder. Mekaniske metoder anvendes til at fremstille hele leverceller omfatter tvinger leveren gennem ostelærred 2, ryster en lever stykke med glasperler i en Kahn shaker 3 under anvendelse af glas homogenisatorer med løse pestles 4,5 osv. Gennem årene har mekaniske metoder faldet ud af favorisere på grund af skader på cellemembraner og tab af funktion af de isolerede hepatocytter 6,7. Derfor er anvendelsen af ​​en enzymatisk metode er i øjeblikket den vigtigste metode til isolering af hepatocytter.

Isolering af hepatocytter ved hjælp af en enzymatisk metode blev stærkt forbedret, når Berry og Friend 8 perfunderet collagenase og hyaluronidase gennem leveren via portalen vene i rotter. Denne perfusion proces udnyttes vaskulaturen at tillade enzymerne at komme i tæt kontakt med de fleste af cellerne, hvilket fører tilen 6-dobling i udbyttet af hepatocytter 8. Endvidere er denne metode viste celler, der bevaret deres strukturelle integritet, med næsten ingen transformation af endoplasmatiske reticulum til isolerede vesikler og ingen mitochondriebeskadigelse 8.

Denne metode blev ændret ved Seglen 1, som banebrydende for en to-trins perfusion procedure for levercelle isolation. I denne procedure, er rottelever perfunderet med en Ca2 +-fri buffer efterfulgt af perfusion med en collagenase puffer indeholdende Ca 2 + 1. Fjernelsen af Ca 2 + i det første trin hjælper med at forstyrre desmosomer, mens tilsætning af Ca 2 + i det andet trin er nødvendigt for optimal collagenaseaktivitet 1,9.

Da den offentliggjorte arbejde beskrevet ovenfor, er blevet udført på rotter, denne artikel har til formål at demonstrere en modificeret procedure, der kan bruges til isolering af hepatocytter med høj levedygtighed fra brummenen lever. Brugen af ​​humane hepatocytter fortsat vigtigt for translationel forskning og for validering af forsøg med dyremodeller. De humane lever stykker anvendt i denne undersøgelse blev erhvervet med samtykke til regeringsførelse gennem den humane væv og celler Research Foundation, en statskontrolleret almennyttig fond 10. Efter en patolog fjernet hvad der var nødvendige til diagnosticering, blev leveren stykker indsamlet fra det resterende væv. Vævet tømre ved patologen var morfologisk raske væv opnået fra resektionsmarginer efter leverresektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Udarbejdelse af perfusion og Isolation Solutions

  1. Forbered løsninger, der kræves til perfusion af leveren stykke og isolation af hepatocytter ifølge tabel 1. Løsninger kan opbevares ved 4 ° C indtil brug.
  2. Sterilfilter alle opløsninger under anvendelse af et 0,22 um filter.
  3. Alle opløsninger, der kommer i kontakt med leveren skal være sterile.

2. Udarbejdelse af Perfusion udstyr og løsninger

  1. Udstyret til perfusionen af leveren stykke bør oprettes som vist i figur 1..
  2. Vandbadet skal indstilles på en passende temperatur, som er forskellig i de enkelte eksperimentelle opsætning, således at opløsningerne er ved en temperatur på 37 ° C, når de når leveren stykke. I dette tilfælde er vandbad indstillet på 41 ° C for at opvarme Solutions 1, 2 og 3, og det dobbeltvæggede glas kondensator. Løsning 4 bør være varmet op til37 ° C i en separat vandbad til anvendelse til at reducere tabet af collagenase aktivitet.
  3. Kort før lever perfusion, tænde for tilsynsmyndigheden for gas tank, der indeholder 95% O 2/5% CO 2 til gas iltningen apparat (Figur 1E).

3. Perfusion af leveren

  1. En lever stykke med så meget intakt Glisson kapsel som muligt og helst med kun 1 snitfladen skal hentes fra en patolog til perfusion.
  2. Anbring denne leveren brik på Buchner-tragt, der indeholder en perforeret filter disk (figur 1B).
  3. Perfusionssystemet skal grundes med Løsning 1.
  4. Med en lav flow bør buet kunstvanding kanyler med oliven tips indsættes i de større blodkar på snitfladen af ​​leveren stykke. Blod skyller ud fra leveren bliver vævet lettere i områder med god perfusion. Antallet af kanyler anvendes til forskellige størrelseraf lever er vist i figur 2A. Måleren størrelse valgt skal resultere i en lun pasform, der vil holde kanyler på plads. De mindre blodkar bør stå åben for perfusionsbuffer at løbe ud af leveren stykke.
  5. Øge strømningshastigheden på den peristaltiske pumpe til mellem 110 til 460 ml / min, afhængigt af størrelsen af leveren (figur 2B). Dette resulterer i en gennemsnitlig strømningshastighed på 44 ± 16 ml / min per kanyle (figur 2C). Hastigheden vælges, afhænger leveren stykke og bør resultere i en svag plumping op af leveren stykke. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at fastspænde lukke nogle af de åbne kar med mikro vaskulære klemmer for at opnå den lille plumping nævnt ovenfor. En god perfusion kan observeres når leveren stykke er en lysere farve hele vejen igennem.
  6. Hold leveren stykke fugtig under perfusion ved at dække den med et stykke gaze dyppet i saltvand.
  7. Perfuse med 1 l Løsning 1 for at skylle ud enhver remaining blod i leveren stykke.
  8. Skift perfusionsvæske til Løsning 2 og perfuse i 10 min.
  9. Skift perfusionsvæske til Løsning 3 og perfuse med 0,5 L.
  10. Skift perfusionsvæske til Løsning 4, der indeholder 0,1-0,15% collagenase (tabel 2).
  11. Til dette trin bør perfusion udføres på en recirkulerende måde i 9-12 minutter eller indtil leveren er tilstrækkeligt nedbrudt, levervæv skal vises til at bryde en smule fra hinanden under Glisson kapsel og føler blødgjort når probet med den stumpe side af en skalpel.

4.. Isolering af hepatocytter

  1. Sluk peristaltikpumpen og fjerne kanyler fra leveren stykke.
  2. Placer leveren brik i en krystalliserende skål indeholdende 100-200 ml Løsning 5.
  3. Fjern Glisson kapsel omhyggeligt og forsigtigt ryste ud cellerne. Hvis der er regioner, der ikke er godt perfunderet kan en skalpel anvendes til at skære igennemdisse regioner til at frigive celler indeholdt i. Tilføj flere Løsning 5 efter behov i løbet af processen.
  4. Tilføj flere Løsning 5, indtil et slutvolumen på 500 ml er nået.
  5. Foretage cellesuspensionen to gange, først gennem en 210 um nylonnet, efterfulgt af en 70 um nylon mesh. Dernæst hældes cellesuspensionen i 200 ml centrifugerør.
  6. Centrifugeres cellesuspensionen ved 72 g i 5 minutter ved 4 ° C. Aspirer supernatanten og forsigtigt resuspender cellepelleten forsigtigt i 200 ml Løsning 5.
  7. Gentag vask trin nummer 4.6 tre gange. På den sidste centrifuge skridt, Resuspender cellerne i kølerum opløsning (se liste over materialer). Cellerne skal være ca 2 til 5.000.000 hepatocytter per milliliter til vurdering af udbyttet og levedygtighed ved hjælp af et hæmocytometer-baserede trypanblåteksklusion assay.
  8. For at udføre en trypanblåteksklusion assay tilsættes 0,1 ml passende fortyndet celler (≈ 2-5000000 / ml) til et mikrocentrifugerør indeholdende 0,5 ml trypanblåt soluti(0.4% trypanblåt opløst i phosphatbufret saltvand (PBS)) og 0,4 ml PBS. Efter blanding cellesuspensionen grundigt, indlæse en hemocytometer med suspensionen og undersøges i et mikroskop ved 100X forstørrelse. Under mikroskopi, vil de døde celler farves blåt, mens de levende celler synes uplettet. Tæl antallet af levende og totale celler i hver af de 1 mm 2 gitre markeret på hæmocytometeret. Rentabilitet (%), udbytte af levende celler (mio. hepatocytter per ml kold lagerløsning (CSS) eller millioner hepatocytter per g lever) kan beregnes ved hjælp af nedenstående formler.

Ligning 1
Bemærk: I dette tilfælde trypanblåt fortyndingsfaktoren 10 og hæmocytometer faktor er 10.000.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Perfusion Setup

Det udstyr, der kræves for leveren perfusion bør oprettes i henhold til figur 1.

Levedygtighed og udbyttet af det isolerede humane hepatocytter

Den gennemsnitlige levedygtighed isolerede humane hepatocytter var 77 ± 10%, og det gennemsnitlige udbytte af hepatocytter var 13 ± 11 mio hepatocytter / g lever med værdier udtrykt som middelværdier ± standardafvigelse. Antallet af hepatocyt isolationer udføres for at opnå disse gennemsnit var 648 isolationer gennemført fra januar 1999 til december 2012.

Egnede Perfusion Parametre

For at gennemføre en vellykket skylning og perfusion af leveren, bør antallet af kanyler anvendes variere efter vægten af leveren (figur 2A). Generelt bør 4-8 kanyler anvendes til lever i intervallet fra under 20 g til over 80 g. En passende hastighed perfusion, Som også er afhængig af levervægten, bør vælges for en vellykket perfusion af leveren (fig. 2B og C). Det har vist sig, at en gennemsnitlig perfusion hastighed på 44 ml / min kanyle -1 er ideel tværs af en række forskellige levervægt og derfor perfusion hastigheder bør justeres hensigtsmæssigt, hvis der anvendes flere kanyler. Hvis perfusion er en succes, bør leveren være bleg i farven og lidt bankes let.

Renheden af ​​hepatocytter

Ved hjælp af immunfluorescens, blev det konstateret, at isolerede hepatocytter, som pletten positivt for albumin, havde en renhed på 94 ± 1% (N = 4 med 5 replikater hver) (figur 3A og B). Figur 3C er et repræsentativt fase kontrast billede viser de morfologiske egenskaber af hepatocytter, såsom stor cellestørrelse og polygonale formede-celler.


Figur 1. Perfusion setup. (A) boble fælde, (B) lever stykke med buet kunstvanding kanyler med oliven tips indsat i blodkar på en Büchner tragt (C) glas kappe kondensator, (D) vandbad (E) iltningsapparatur, ( F) 95% O2 / 5% CO 2-gas tank og (G) peristaltisk pumpe.

Figur 2
Figur 2. (A) Antallet af kanyler anvendes, (B) perfusionshastigheden (ml / min), eller (C) perfusionshastigheden (ml / min. En markant forskellig fra 0-20 g tilstand, P <0,05. ab Signifikant forskellig fra 20-40 g, 40-60 g og 60-80 g tilstand, P <0,05.

Figur 3
Figur 3.. Immunofluorescent billeder af isolerede celler positive for (A) albumin (farvet i grønt) og den tilsvarende (B) negativ kontrol (200X forstørrelse). Kerner farves blå hjælp DAPI. (C) Fasekontrast billede af isolerede celler (100X forstørrelse).

Opløsning Grundlovgivende Slutkoncentration
Løsning 1 Natriumchlorid 154 mM
HEPES 20 mM
Kaliumchlorid 5.6 mM
Glukose 5 mM
Natriumhydrogencarbonat 25 mM
Løsning 2 Natriumchlorid 152,5 mM
HEPES 19,8 mM
Kaliumchlorid 5,5 mm
Glukose 5,0 mM
Natriumhydrogencarbonat 24,8 mM
EGTA 0.1 mM
At forberede Løsning 2, tilsættes 10 ml 100 mM EGTA til 990 ml Løsning 1. Opløsning 3 Natriumchlorid 152,5 mM
HEPES 19,8 mM
Kaliumchlorid 5,5 mm
Glukose 5,0 mM
Natriumhydrogencarbonat 24,8 mM
Calciumchloriddihydrat 0,5 uM
At forberede Løsning 3, tilsættes 10 ml 0,5 M calciumchloriddihydrat til 990 ml Løsning 1.
Løsning 4 Natriumchlorid 152,5 mM
HEPES 19,8 mM
Kaliumchlorid 5,5 mm
Glukose 5,0 mM
Natrium hydrogen carbonate 24,8 mM
Calciumchloriddihydrat 0,5 uM
Collagenase Se tabel 2
At forberede Løsning 4, tilsæt passende mængde collagenase til Løsning 3.
Opløsning 5 Natriumchlorid 120 mM
HEPES 10 mM
Calciumchloriddihydrat 0,9 mM
Kaliumchlorid 6.2 mM
Albumin 0,1% w / v

Tabel 1. Perfusion og isolation løsninger.

Størrelse lever stykke (g) Collagenase koncentration(%) Collagenase aktivitet (U / ml)
<25 0.10 250
25-40 0.11 300
41-80 0,13 350
> 80 0.15 400

Tabel 2. Collagenase koncentrationer (%) og aktiviteter (U / ml), der skal anvendes til forskellige størrelser af leveren stykker (g).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol resulterer i isolering af humane hepatocytter med høj levedygtighed og renhed. For at opnå disse resultater er det vigtigt at starte med en passende stykke af leveren. Det stykke leveren skal have intakt Glisson kapsel på alle overflader undtagen for 1 snitfladen. En anden vigtig faktor er bestemt parti collagenase anvendes som forskellige batches kan resultere i markante forskelle i levedygtighed af hepatocytter efter fordøjelse 11. Derfor bør forskellige partier af collagenase skal testes, og det parti, der producerer hepatocytter med den bedste rentabilitet bør indhentes i store mængder. Endelig en passende fordøjelse tid skal vælges på grundlag af udbyttet og levedygtigheden af ​​de celler, der er opnået. For eksempel kan en høj levedygtighed med lavt udbytte indikerer en utilstrækkelig fordøjelse tid, og et højt udbytte med lav levedygtighed kunne indikere, at fordøjelsen er for lang.

Denne fremgangsmåde kan tilpasses to isolere ikke-parenkymale celler og hepatocytter fra samme leveren stykke. Én måde at gøre dette på er at bruge supernatanten fra den første centrifugering trin (trin 4.6) direkte til ikke-parenkyme celleisolering 12. En anden måde er at fjerne den nødvendige portion af cellesuspensionen efter filtrering gennem nylonnet for hepatocyt isolation (trin 4.5) og underkaste den resterende cellesuspension til en yderligere pronase-fordøjelse trin, før ikke-parenkym-celle isolering med henblik på at øge udbyttet af non-parenchymceller 13. For et højere udbytte af ikke-parenkymceller på bekostning af hepatocytter, kan denne metode ændres ved at erstatte collagenase alene (trin 3.10) for pronase og collagenase og ved hjælp af den resulterende celle suspension for ikke-parenkyme celleisolering 14.

Ud over at identificere humane hepatocytter, kan denne metode præsenteres også tilpasses til at isolere hepatocytter fra leveren stykker indsamlet from andre arter med sammenlignelige størrelser eller sammenlignelige vaskulatur størrelser. Det kan være vigtigt for forskere, der anvender alternative modeller, såsom svin, hunde eller primatmodeller.

Isolationer af humane hepatocytter er generelt gøres ved hjælp af lever fra to kilder: hele lever skønnes uegnet til transplantation eller morfologisk normal levervæv fra resektionsmarginer. Fordelen ved sidstnævnte kilde anvendes i denne metode er, at leveren stykker stilles til rådighed til laboratoriet før. Straks efter resektion er resekterede leveren bragt til en patolog, som fjerner hvad der kræves til diagnose. Den patolog vil derefter fjerne et passende stykke af morfologisk normale lever for hepatocyt isolation fra, hvad der er dømt til genudsætning. I almindelighed, en lever stykke ankommer i laboratoriet klar til perfusion i et gennemsnit på 56 ± 29 min (N = 103). Til sammenligning vil hele lever, der ikke er egnet til transplantation kun være rellempet til laboratoriet mellem 13 ± 2 timer og 16 ± 12 timer 15. Hertil kommer, på grund af etiske overvejelser og manglen på donor lever, isolering af hepatocytter fra hele lever, der ikke opfylder alle kriterierne for transplantation undgås i Eurotransplant region. Dette skyldes, at disse lever stadig kan anvendes til transplantation med forlængede donor kriterier. Nogle undersøgelser har vist, at maksimere patientens adgang til transplantation resulterer i nedsat vente liste dødelighed og tilfredsstillende resultater til udvalgte modtagere 16,17. En anden fordel er, at celler opnået fra leverresektion stykker isoleres fra morfologisk sunde lever, mens lever uegnede til transplantation kan være steatotic, fibrotisk eller cirrose. Som sådan fremgangsmåde her resulterer i et højt udbytte på 13 ± 11 mio hepatocytter per gram lever i forhold til 0,7 ± 0,3 millioner eller 3 ± 2 millioner hepatocytter per gram lever opnået ved Baccarani et al. 15. hjælp cirrotiske eller steatotic lever hhv. Men leverresektion stykker resultere i en lavere samlet udbytte af hepatocytter som størrelsen af ​​stykket til rådighed, er generelt små med en række 2-250 g og et gennemsnit på 37 ± 29 g (n = 648).

I sammenligning med andre grupper af denne protokol undgår anvendelsen af ​​cyanoacrylat-klæbemidler. Alexandre et al 18. Fundet, at anvendelsen af ethyl-cyanoacrylat, et almindeligt anvendt til alle formål klæbemiddel, til at dække snitfladerne lever, resulterer i et forøget udbytte af hepatocytter fra 3,5 ± 0,7 til 6,0 ± 1,6 millioner hepatocytter per gram lever med værdier udtrykt i middel ± standardafvigelse på middelværdien. I sammenligning denne protokol er i stand til at opnå et udbytte på 13,5 ± 0,4 mio hepatocytter pr g lever (udtrykt i gennemsnit ± standardfejl på middelværdi) uden brug af cyanoacrylat-klæbestoffer. Mens cyanoacrylat-klæbemidler har været anvendt til sårlukning <sup> 19,20, medicinsk kvalitet cyanoacrylatklæbestoffer såsom octylcyanoacrylat og butyl cyanoacrylat kan være dyre i forhold til ethyl cyanoacrylat. Imidlertid har kortere kæde-derivater, såsom ethyl cyanoakrylat vist sig at være mere histotoxic end langkædede derivater 21,22.

Denne fremgangsmåde er enklere og mere tid effektivt på grund af brugen af ​​krumme vanding kanyler med oliven tips. Anvendelsen af kanyler af en passende størrelse, vil resultere i en stram pasning, der holder kanylen på plads uden brug af lim 18 eller suturer 23. Den kanyler benyttes, har diametre fra 1-2 mm med spids diameter dimensioneret 1,25-4,5 mm. Et udvalg af forskellige kanyle størrelser skal stilles til rådighed, når en lever stykke er klar til kanylering, således at der kan vælges en passende størrelse kanyle til et bestemt blodkar, som vist i den ledsagende video. Denne metode udnytter også mere kanyler i almindelighed (Figur2A) i forhold til andre undersøgelser, hvor der anvendes to 23 eller 2-4 18 kanyler. Dette kan bidrage til at opnå en bedre perfusion gennem leveren stykke fører til høje levedygtighed og udbytte i en kortere fordøjelse periode.

Afslutningsvis denne protokol isolerer humane hepatocytter, som er en vigtig model for at studere cellulær metabolisme, farmakokinetik og toksikologi af miljøfremmede stoffer, lever regenerering og translationel forskning. En tidligere undersøgelse om 150 stoffer, der forårsager human toksicitet viste, at overensstemmelsen mellem toksicitet fundet i dyreforsøg, og der er observeret i klinisk praksis er 70% 24. Således forbliver humane hepatocytter en vigtig model til validering forskning udført i dyremodeller og til at teste medicin fører til bivirkninger før de går til kliniske forsøg. Yderligere anvendelse af humane hepatocytter isoleret fra rest leverprøver eller hepatocytter isoleret fra slagteri 25 som model eri overensstemmelse med 3R etiske rammer 26 til at erstatte brugen af forsøgsdyr når muligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Optimering af denne protokol var delvist finansieret af en bevilling fra Hepacult GmbH. Dr. Wolfgang Thasler er en af ​​grundlæggerne af Hepacult GmbH og er stadig en af ​​de medlemmer af bestyrelsen i dette selskab. Ansættelsen af ​​Maresa Demmel er delvist af Hepacult. Maria Hauner er ansat ved Hepacult GmbH. Hepacult er et spin-off bioteknologiske firma fra universitetet, som tilbyder humane hepatocytter med samtykke og åben adgang til forskningsformål.

Acknowledgments

Dette arbejde blev muliggjort af humane væv og celler Research Foundation, hvilket gør humane væv til rådighed for forskningen. Økonomisk støtte til dette arbejde blev modtaget fra Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (tilskud navn: Virtual Lever Network, tilskud nummer: 0.315.759) og Hepacult GmbH. Vores tak går også til de tekniske assistenter fra Grosshadern Hospital vævsbank til indsamling af leveren prøver og de tekniske assistenter fra Cell Isolation Core Facility for at udføre leveren perfusion og hepatocyt isolation. I særdeleshed vil vi gerne takke Natalja Löwen for at demonstrere denne procedure i videoen. Endelig vil vi gerne takke Natalja Löwen og Edeltraud Hanesch for at skabe de illustrationer til figur 1, og tallene i den skematisk oversigt over videoen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bubble trap Gaßner Glastechnik  
Glass jacketed condenser Gaßner Glastechnik  
41 °C Water bath Julabo 35723-H24/EG  
37 °C Water bath GFL 1083  
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) Linde  
Gas permeable tubing Neolab 2-4440  
Peristaltic pump Ismatec IP65  
Scalpel Feather 320010  
Forceps Omnilab 5171014  
Conical flasks 1 L Schott Duran 2121654  
Conical flasks 5 L Schott Duran 2121673  
Beakers Schott Duran 2110654  
200 ml centrifuge tubes Becton Dickinson 352075  
Crystallizing dish Omnilab 5144063  
Curved irrigation cannulae with ball tips Ernst Kratz GmbH 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL  
Micro vascular clamps Ernst Kratz GmbH  
Büchner funnel Carl Roth HT38.1  
Nylon mesh 210 μm Neolab 4-1413  
Nylon mesh 70 μm Neolab 4-1419  
0.22 μm sterile filters Peske 99505  
500 ml bottles Schott Duran 2180144  
1 L bottles Schott Duran 2180154  
Hemocytometer Peske 06-0001  
1.5 ml tubes Eppendorf 0030 120,086  
50 ml conical tubes BD Biosciences 352070  
Ice bucket Neolab 1508454  
Sterile Pasteur pipettes Brand 747715  
Motorised pipette filler (Pipette boy acu) Integra 155017  
Refridgerated centrifuge Eppendorf 5810R  
Laminar flow Kendro Hera safe-KS9  
Aspirator (Low-flow surgical suction pump) Atmos C361  
Laboratory Gas Burner Integra Fire Boy eco  
Disposable laboratory coat Paperlynen GmbH MD0202414  
Surgical mask with visor Kimberly-Clark 48247  
Surgical hood Barrier 42072  
Latex gloves Semper Care CE0321  
Collagenase (Batch number NB 4G) Serva 17465  
Calcium chloride dihydrate Merck 2382  
EGTA Sigma E4378  
Sodium chloride Roth 9265.2  
Hepes Roth 9105.3  
Potassium chloride Serva 26868  
Albumin Biomol 01400-2  
Glucose Serva 22700  
Sodium hydrogen carbonate Serva 30180  
0.4% Trypan blue solution Lonza 17-942E  
Cold storage solution Hepacult GmbH  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
  2. Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).
  3. Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells. Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).
  4. Anderson, N. G. The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver. Science. 117, 627-628 (1953).
  5. Jacob, S. T., Bhargava, P. M. New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions. Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).
  6. Berry, M. N. Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver. Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).
  7. Laws, J. O., Stickland, L. H. Metabolism of Isolated Liver Cells. Nature. 178, 309-310 (1038).
  8. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
  9. Seglen, P. O. Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion. Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).
  10. Thasler, W. E., et al. Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany. Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).
  11. Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).
  12. Smedsrod, B., Pertoft, H. Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence. J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).
  13. Cantrell, E., Bresnick, E. Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver. Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).
  14. Weiskirchen, R., Gressner, A. M. Isolation and culture of hepatic stellate cells. Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).
  15. Baccarani, U., et al. Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation. Transplant P. 33, 664-665 (2001).
  16. Renz, J. F., et al. Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation. Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).
  17. Schemmer, P., et al. Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis. Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).
  18. Alexandre, E., et al. Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes. Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).
  19. Spotnitz, W. D., Burks, S. State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).
  20. Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox. Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).
  21. Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study. Archives of otolaryngology--head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).
  22. Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review. Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).
  23. Bhogal, R. H., et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS ONE. 6, e18222 (2011).
  24. Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).
  25. Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices. ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).
  26. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen. (1959).

Tags

Medicin cellebiologi Biomedical Engineering anatomi fysiologi kirurgi Life Sciences (General) Human hepatocyt isolation menneskelig hepatocyt collagenase infusion collagenaseperfusion hepatocyt lever human celle isolation kliniske anvendelser kliniske teknikker

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The changes listed below have been made to Table 1.

1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:

EGTA  0.1mM

to:

EGTA  1mM

2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:

Calcium chloride dihydrate  0.5µM

to:

Calcium chloride dihydrate  5mM
Isolering af humane hepatocytter ved en to-trins collagenaseperfusion Procedure
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, S. M. L., Schelcher, C.,… More

Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J. Vis. Exp. (79), e50615, doi:10.3791/50615 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter