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Biology

Isolierung von humanen Hepatozyten durch eine Zwei-Schritt-Verfahren Collagenase Perfusion

Published: September 3, 2013 doi: 10.3791/50615
Automatic Translation
1,2, 1, 2,3, 3, 4
1Experimental Surgical Research, Grosshadern Hospital, Munich, 2Center for Liver Cell Research, Grosshadern Hospital, Munich, 3Hepacult LLC, Regensburg, 4Department of Surgery, Grosshadern Hospital, Munich

ERRATUM NOTICE

Summary

Eine modifizierte Zwei-Schritt-Kollagenase-Perfusion Verfahren zur Isolierung von humanen Hepatozyten beschrieben. Dieses Verfahren kann auch auf andere Säugetierlebern, angewendet werden. Die isolierten Hepatozyten sind in hoher Ausbeute und Lebensfähigkeit, so dass sie ein geeignetes Modell für die wissenschaftliche Forschung in Bereichen wie der Leberregeneration, Pharmakokinetik und Toxikologie.

Abstract

Die Leber, ein Organ mit einer außergewöhnlichen Regenerationsfähigkeit, führt eine breite Palette von Funktionen, wie zB Entgiftung, Stoffwechsel und Homöostase. Als solche sind Hepatozyten ein wichtiges Modell für eine große Vielfalt von Forschungsfragen. Insbesondere ist die Verwendung von humanen Hepatozyten in den Bereichen Pharmakokinetik, Toxikologie, Leberregeneration und translationale Forschung besonders wichtig. Somit stellt dieses Verfahren eine modifizierte Version einer Zwei-Schritt-Verfahren, um Collagenase-Perfusion isoliert Hepatozyten durch Seglen 1 beschrieben.

Früher wurden Hepatozyten durch mechanische Methoden isoliert. Allerdings haben enzymatischen Methoden wurde gezeigt, überlegen zu sein, wie Hepatozyten nach Isolierung behalten ihre strukturelle Integrität und Funktion. Das hier vorgestellte Verfahren passt sich das Verfahren bisher für Rattenlebern der menschlichen Leber Teile und führt zu einer großen Ausbeute von Hepatozyten mit einer Lebensfähigkeit von 77 ± 10% bestimmt. Der HauptUnterschied in diesem Verfahren ist das Verfahren der cannulization der Blutgefäße. Weiterhin kann das hier beschriebene Verfahren auch auf andere Arten von Lebern mit vergleichbaren Leber-und Blutgefäßgrößen angewendet werden.

Introduction

Eine Leberzellsuspension aus der Leber durch mechanische oder enzymatische Verfahren hergestellt werden. Mechanische Verfahren verwendet werden, um ganze Leberzellen herzustellen, umfassen die Leber zwingt durch Gaze 2, schüttelt ein Leberstück mit Glasperlen in einem Kahn Schüttler 3, mit Glas-Homogenisatoren mit losen Stößel 4,5 usw. Im Laufe der Jahre haben mechanische Methoden aus gefallen begünstigen aufgrund der Schäden an Zellmembranen und der Verlust der Funktion der isolierten Hepatozyten 6,7. Folglich ist die Verwendung eines enzymatischen Verfahrens derzeit die wichtigste Methode zur Isolierung von Hepatozyten.

Isolation von Hepatozyten mit einem enzymatischen Verfahren wurde stark verbessert, wenn Berry und Friend 8 durchströmt Kollagenase und Hyaluronidase durch die Leber über die Pfortader in Ratten. Dieses Verfahren verwendet die Perfusion Gefßsystem zu ermöglichen, dass die Enzyme in engen Kontakt mit der Mehrzahl der Zellen kommen, was zueine 6-fache Zunahme der Ausbeute an Hepatozyten 8. Weiterhin ergab diese Methode Zellen, die ihre strukturelle Integrität beibehalten, praktisch ohne Transformation des endoplasmatischen Reticulum in isolierte Bläschen und ohne mitochondriale Schädigungen 8.

Diese Methode wurde von Seglen 1, die eine Zwei-Schritt-Verfahren für die Durchblutung der Leber Zellisolierung Pionier modifiziert. In diesem Verfahren wird der Rattenleber mit einem Ca 2 +-freien Puffer, gefolgt von einer Perfusion mit Kollagenase-Puffer, enthaltend Ca 2 + 1 perfundiert. Die Entfernung von Ca 2 + in der ersten Stufe hilft dabei, Desmosomen zu stören, während die Zugabe von Ca 2 + in der zweiten Stufe ist für eine optimale Collagenaseaktivität 1,9 erforderlich.

Da die oben beschriebenen veröffentlichte Arbeit wurde bei Ratten durchgeführt wurde, versucht dieser Artikel ein modifiziertes Verfahren, die für die Isolierung von Hepatozyten mit hoher Rentabilität von Summen verwendet werden können, zeigen,Leber ein. Die Verwendung von humanen Hepatozyten bleibt wichtig für die translationale Forschung und für die Validierung von Versuchen mit Tiermodellen. Die menschliche Leber Stücke in dieser Studie verwendet wurden mit Zustimmung der Governance durch das Human Tissue and Cell Research Foundation, einer staatlich kontrollierten Non-Profit-Stiftung 10 erworben. Nach ein Pathologe entfernt, was für die Diagnose erforderlich ist, wurden Leberstücke aus dem verbleibenden Gewebe gesammelt. Die durch den Pathologen geschnittene Gewebe wurde morphologisch nach Leberresektion von Resektionsränder erhalten gesunden Gewebe.

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Protocol

1. Vorbereitung der Perfusion und Isolation Lösungen

  1. Vorbereitung der für die Durchblutung der Leber Stück und die Isolierung von Hepatozyten nach Tabelle 1 erforderlichen Lösungen. Lösungen bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
  2. Sterilfilter alle Lösungen mit einem 0,22 um Filter.
  3. Alle Lösungen, die in Kontakt mit der Leber kommen sollte steril sein.

2. Vorbereitung der Perfusion Geräte und Lösungen

  1. Die Ausrüstung für die Durchblutung der Leber Stück sollte wie in Abbildung 1 gezeigt, eingestellt werden.
  2. Das Wasserbad sollte bei einer geeigneten Temperatur, die in jedem einzelnen Versuchsaufbau unterschiedlich ist, so eingestellt werden, dass die Lösungen bei der Temperatur von 37 ° C, wenn sie die Leber Stück zu erreichen. In diesem Fall wird das Wasserbad auf 41 ° C eingestellt, um die Lösungen 1, 2 und 3 und die ummantelten Glaskühler wärmen. Lösung 4 sollte erwärmt werden37 ° C in einem separaten Wasserbad für den Verlust von Kollagenase-Aktivität zu reduzieren.
  3. Kurz vor Leberperfusion, schalten Sie den Regler der Gastank mit 95% O 2/5% CO 2, um die Sauerstoffgerät (1E) Gas.

3. Perfusion der Leber

  1. Eine Leberstück mit so viel Glisson-Kapsel intakt wie möglich und im Idealfall mit nur 1 Schnittfläche sollte von einem Pathologen zur Perfusion erzielt werden.
  2. Legen Sie diese Leber Stück auf der Büchner-Trichter, die einen perforierten Filterscheibe (Abbildung 1B) enthält.
  3. Die Perfusion System sollte mit der Lösung 1 grundiert werden.
  4. Mit einer niedrigen Flussrate sollte gekrümmte Bewässerung Kanülen mit Oliven-Tipps in die größeren Blutgefäße auf der Schnittfläche der Leber Stück eingesetzt werden. Wie Blut spült aus der Leber wird das Gewebe leichter in Gebieten mit guter Durchblutung. Die Anzahl der Kanülen für verschiedene Größen verwendetder Leber ist in 2A gezeigt. Die Spurgröße gewählt werden sollte in einer Passform, die die Kanülen in Position zu halten die Folge. Die kleineren Blutgefäßen sollte für die Perfusion Puffer aus der Leber Stück abtropfen offen gelassen werden.
  5. Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit an der peristaltischen Pumpe zwischen 110 bis 460 ml / min in Abhängigkeit von der Größe der Leber (Fig. 2B). Dies führt zu einer mittleren Strömungsrate von 44 ± 16 ml / min pro Kanüle (Fig. 2C). Die gewählte Geschwindigkeit hängt von der Leber Stück und sollte in einem leichten Hyalurosmooth Stück der Leber führen. In einigen Fällen kann es notwendig sein, zu klemmen herunter einige der offene Behälter mit Mikrogefäßklemmen, die oben erwähnte leichte Aufpolsterung erzielen. Eine gute Durchblutung beobachtet werden kann, wenn die Leber Stück ist eine hellere Farbe ganz.
  6. Halten Sie das Leberstück feucht während der Perfusion durch Abdecken mit einem Stück Gaze in Kochsalzlösung eingeweicht.
  7. Perfundieren mit 1 l Lösung 1 zu spülen, keine remaining Blut in der Leber Stück.
  8. Ändern Sie den Perfusionsfluid zur Lösung 2 und Perfusion für 10 min.
  9. Schalten Sie das Perfusionsfluid zu Lösung 3 und Perfusion mit 0,5 L.
  10. Ändern Sie den Perfusionsfluid zu Lösung 4, die von 0,1 bis 0,15% Kollagenase (Tabelle 2) enthält.
  11. Für diesen Schritt, Perfusion sollte in einer Umlauf Weise für 9-12 Minuten durchgeführt werden kann oder bis die Leber ausreichend verdaut, das Lebergewebe erscheinen soll unter der Glisson-Kapsel zu leicht auseinander brechen und fühlen sich weich, wenn sie mit der stumpfen Seite einer sondiert Skalpell.

4. Isolierung von Hepatozyten

  1. Schalten Sie die Schlauchpumpe und Kanülen entfernen aus der Leber Stück.
  2. Legen Sie das Stück Leber in eine Kristallisationsschale mit 100-200 ml Lösung 5.
  3. Entfernen der Glisson-Kapsel vorsichtig und sanft schütteln die Zellen. Wenn es Regionen gibt, die nicht gut durchblutet sind, kann ein Skalpell durchtrennt werdendiese Regionen zu den Zellen enthaltenen freizugeben. Fügen Sie weitere Lösung 5 während des Prozesses, wie gebraucht.
  4. Noch Lösung 5 bis ein Endvolumen von 500 ml erreicht ist.
  5. Filter Zellsuspension zweimal, zunächst durch einen 210 um Nylon-Mesh, gefolgt von einer 70 um Nylon-Mesh. Weiter, gießen Sie die Zellsuspension in 200 ml-Zentrifugenröhrchen.
  6. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 72 g für 5 min bei 4 ° C. Überstand wird abgesaugt und vorsichtig resuspendieren Zellpellet vorsichtig in 200 ml Lösung 5.
  7. Wiederholen Sie den Waschschritt Nummer 4.6 dreimal. Am letzten Zentrifugen Schritt resuspendieren Zellen in Kühllösung (siehe Liste der Materialien). Die Zellen sind etwa 2,5 Millionen Leberzellen pro Milliliter für die Bewertung von Ertrag und Rentabilität mit einer Zählkammer-basierte Trypanblau-Ausschluss-Test sein.
  8. Zur Durchführung einer Trypanblau-Ausschluss-Assay, fügen Sie 0,1 ml der entsprechend verdünnten Zellen (≈ 2,5 Millionen / ml) zu einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 0,5 ml Trypanblau Löauf (0,4% Trypanblau in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gelöst) und 0,4 ml PBS. Nach dem Mischen der Zellsuspension gründlich, legen Sie eine Zählkammer mit der Suspension und überprüfen unter dem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Unter Mikroskopie, werden die toten Zellen blau gefärbt werden, während die lebenden Zellen ungefärbt erscheinen. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen und insgesamt in jedem der 1 mm 2 Gitter auf der Hämozytometers markiert. Die Lebensfähigkeit (%), die Ausbeute an lebenden Zellen (Hepatozyten Millionen pro ml kaltem Speicherlösung (CSS) oder Millionen Hepatozyten pro g Leber) können mit den nachfolgenden Formeln berechnet werden.

Gleichung 1
Anmerkung: In diesem Fall ist 10 die Trypanblau-Verdünnungsfaktor und die Zählkammer Faktor beträgt 10.000.

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Representative Results

Perfusion-Setup

Die Leberdurchblutung erforderliche Ausrüstung sollte nach 1 gesetzt werden.

Die Lebensfähigkeit und Rendite von isolierten menschlichen Hepatozyten

Die durchschnittliche Lebensfähigkeit von isolierten humanen Hepatozyten betrug 77 ± 10% und die durchschnittliche Rendite der Hepatozyten war 13 ± 11 Millionen Hepatozyten / g Leber, mit Werten als Mittelwert ± Standardabweichung. Die Zahl der Hepatozyten-Isolierungen durchgeführt, um diese Mittelwerte zu erhalten war 648 Isolierungen durchgeführt von Januar 1999 bis Dezember 2012.

Geeignete Parameter Perfusion

Um die Durchführung einer erfolgreichen Spülen und Perfusion der Leber, sollte die Anzahl der Kanülen verwendet, entsprechend dem Gewicht der Leber (Fig. 2A) variieren. Im allgemeinen sollte 4-8 Kanülen für Lebern von unter 20 g, über 80 g verwendet werden. Eine geeignete Perfusionsrate, Die auch abhängig von Lebergewicht sollte für eine erfolgreiche Perfusion der Leber (Fig. 2B und C) gewählt werden. Es wurde gefunden, daß eine mittlere Geschwindigkeit Perfusion von 44 ml / min -1 Kanüle ist ideal für eine Reihe von verschiedenen Lebergewichte und damit die Perfusion Geschwindigkeiten sollte geeignet eingestellt werden, wenn mehr Kanülen verwendet werden. Wenn Perfusion erfolgreich ist, sollte die Leber blass in der Farbe und leicht aufgepolstert.

Die Reinheit der Hepatozyten

Mittels Immunfluoreszenz wurde festgestellt, daß isolierte Hepatozyten, die Flecken positiv für Albumin, hatte eine Reinheit von 94 ± 1% (jeweils N = 4 mit je 5 Replikate) (3A und B). 3C ist eine repräsentative Phasenkontrastbild welche die morphologischen Eigenschaften der Hepatozyten wie große Zellgröße und-polygonal geformten Zellen.


Fig. 1 ist. Perfusion-Setup. (A) Blasenfalle, (B) Leberstück mit geschwungenen Bewässerungs Kanülen mit Oliven-Tipps in Blutgefäße auf einem Büchner-Trichter, (C) Glas ummantelt Kondensator, (D) Wasserbad, (E) Sauerstoffgerät eingesetzt wird, ( F) 95% O 2/5% CO 2-Gastank und (G) peristaltische Pumpe.

Figur 2
Abbildung 2. (A) Die Anzahl der Kanülen verwendet, (B) Perfusion Rate (ml / min), oder (C) Perfusion Rate (ml / min. Eine signifikant von der 0-20 g Zustand, P <0,05. ab signifikant von den 20-40 g, 40-60 g und 60-80 g Zustand, P <0,05.

Fig. 3
Abbildung 3. Immunfluoreszenz-Bilder der isolierten Zellen positiv für (A) Albumin (grün gefärbt) und der entsprechenden (B) Negativkontrolle (200-facher Vergrößerung). Die Zellkerne sind blau mit DAPI gefärbt. (C) Phasenkontrast-Bild der isolierten Zellen (100-facher Vergrößerung).

Lösung Bestandteil Endgültige Konzentration
Lösung 1 Kochsalz 154 mM
HEPES 20 mM
Kaliumchlorid 5,6 mM
Glucose 5 mM
Natriumhydrogencarbonat 25 mM
Lösung 2 Kochsalz 152,5 mM
HEPES 19,8 mM
Kaliumchlorid 5,5 mM
Glucose 5,0 mM
Natriumhydrogencarbonat 24,8 mM
EGTA 0,1 mM
So bereiten Lösung 2, 10 ml von 100 mM EGTA bis 990 ml Lösung 1. Lösung 3 Kochsalz 152,5 mM
HEPES 19,8 mM
Kaliumchlorid 5,5 mM
Glucose 5,0 mM
Natriumhydrogencarbonat 24,8 mM
Calciumchlorid-Dihydrat 0,5 uM
So bereiten Lösung 3, 10 ml von 0,5 M Calciumchlorid-Dihydrat bis 990 ml Lösung 1.
Lösung 4 Kochsalz 152,5 mM
HEPES 19,8 mM
Kaliumchlorid 5,5 mM
Glucose 5,0 mM
Sodium hydrogen Carbonat 24,8 mM
Calciumchlorid-Dihydrat 0,5 uM
Collagenase Siehe Tabelle 2
So bereiten Lösung 4, fügen Sie entsprechende Menge an Kollagenase Lösung 3.
Lösung 5 Kochsalz 120 mM
HEPES 10 mM
Calciumchlorid-Dihydrat 0,9 mM
Kaliumchlorid 6,2 mM
Albumin 0,1% w / v

Tabelle 1. Perfusion und Isolation Lösungen.

Größe von Leberstück (g) Collagenase-Konzentration(%) Collagenase-Aktivität (U / ml)
<25 0,10 250
25 - 40 0,11 300
41-80 0,13 350
> 80 0,15 400

Tabelle 2. Collagenase-Konzentration (%) und Tätigkeiten (U / ml), die für verschiedene Größen von Leberstücke (g) verwendet werden.

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Discussion

Dieses Protokoll führt zu der Isolierung von humanen Hepatozyten mit hohen Lebensfähigkeit und Reinheit. Um diese Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, mit einem geeigneten Stück Leber starten. Das Stück Leber sollte intakt Glisson-Kapsel auf allen Oberflächen außer ein Schnittfläche haben. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die bestimmte Charge von Collagenase verwendet werden, wie verschiedene Chargen können deutliche Unterschiede in der Lebensfähigkeit von Hepatozyten nach Aufschluss 11 führen. Deshalb sollten verschiedene Chargen von Kollagenase getestet werden und der Ansatz, die Hepatozyten mit dem besten Überlebensfähigkeit erzeugt sollte in großen Mengen erhalten werden. Schließlich ist eine geeignete Kochzeit auf der Grundlage der Ausbeute und Lebensfähigkeit der erhaltenen Zellen gewählt werden. Beispielsweise könnte eine hohe Leistungsfähigkeit mit geringer Ausbeute eine unzureichende Verdauung Zeit anzuzeigen, und eine hohe Ausbeute bei geringen Lebensfähigkeit konnte zeigen, dass die Aufschlusszeit zu lang ist.

Diese Methode kann angepasst werden to isolieren, nicht-parenchymatösen Zellen und Leberzellen aus dem gleichen Stück Leber. Ein Weg, dies zu tun ist, um den Überstand aus dem ersten Zentrifugationsschritt verwenden (Schritt 4.6) direkt für nicht-Parenchymzelle Isolierung 12. Eine zweite Möglichkeit ist es, die erforderlichen Aliquot der Zellsuspension nach der Filtration durch die Nylon-Mesh für Hepatozyten-Isolierung (Schritt 4.5) zu entfernen und unterziehen die restliche Zellsuspension auf eine zusätzliche Pronaseverdauung Schritt vor nicht-Parenchymzelle Isolation, um die Ausbeute zu erhöhen, von Nicht-Parenchymzellen 13. Für eine höhere Ausbeute an nicht-parenchymalen Zellen auf Kosten der Hepatozyten kann dieses Verfahren durch Ersetzen Kollagenase allein (Schritt 3.10) und Kollagenase und Pronase Verwendung der resultierenden Zellsuspension für nicht-parenchymalen Zellisolierung 14 modifiziert werden.

Zusätzlich zum Isolieren von humanen Hepatozyten, kann dieses Verfahren auch geeignet ist, vorgestellt Leberzellen aus Leberstücke her gesammelt isolierenm anderen Arten mit vergleichbaren Größen oder vergleichbare Gefäßgrößen. Dies kann wichtig für Forscher, die alternative Modelle zu verwenden, wie Schweine-, Hunde-oder Primatenmodelle sein.

Isolierungen von humanen Hepatozyten werden in der Regel mit Leber aus zwei Quellen getan: ganze Leber zur Transplantation oder morphologisch normalen Lebergewebe aus Resektionsränder ungeeignet erachtet. Der Vorteil des in diesem Verfahren verwendeten letztere Quelle ist, dass die Leberstücke werden an das Laboratorium früher gemacht. Unmittelbar nach der Resektion wird die Leber reseziert zu einem Pathologen, was für Diagnose entfernt gebracht. Der Pathologe entfernt dann ein passendes Stück morphologisch normalen Leber für Isolation von Hepatozyten, was zum Verwerfen geplant. Im allgemeinen kommt ein Stück Leber im Labor bereit zur Perfusion in einer mittleren Zeit von 56 ± 29 min (N = 103). Im Vergleich dazu werden ganze Lebern, die nicht zur Transplantation geeignet sind nur rel seinvereinfacht werden, um das Labor zwischen 13 ± 2 Stunden und 16 ± 12 h 15. Darüber hinaus aufgrund ethischer Überlegungen und den Mangel an Spenderlebern, Isolierung von Hepatozyten aus ganzen Lebern, die nicht alle Kriterien für eine Transplantation nicht erfüllen, wird in der Eurotransplant-Region vermieden. Denn diese Lebern konnte immer noch für eine Transplantation mit erweiterten Spenderkriterien verwendet werden. Einige Studien haben gezeigt, dass Patienten den Zugang zu Transplantation führt zu einer verringerten Sterblichkeit Warteliste und zufriedenstellende Ergebnisse an ausgewählte Empfänger 16,17 maximieren. Ein weiterer Vorteil ist, dass die aus Leber-Resektion Stücke erhaltenen Zellen werden aus morphologisch gesunden Leber isoliert, während die Leber zur Transplantation ungeeignet kann steatotic, fibrotische oder Leberzirrhose sein. Als solches führt das Verfahren hier in einer hohen Ausbeute von 13 ± 11 Millionen Hepatocyten pro Gramm Leber im Vergleich zu den 0,7 ± 0,3 Mio. oder 3 ± 2 Millionen Hepatocyten pro Gramm Leber durch Baccarani et al. 15. mit Leberzirrhose oder Leber steatotic sind. Jedoch führen Leberresektion Stücke in einer niedrigeren Gesamtausbeute von Hepatozyten, wie die Größe des zur Verfügung stehenden Stück ist in der Regel klein, mit einem Bereich von 2 bis 250 g und einem Durchschnitt von 37 ± 29 g (N = 648).

Im Vergleich zu anderen Gruppen, dieses Protokoll vermeidet die Verwendung von Cyanoacrylat-Klebstoffen. Alexandre et al 18. Gefunden, dass die Verwendung von Ethyl-Cyanacrylat, einem üblicherweise verwendeten Alleskleber, die Schnittflächen der Leber, führt zu einer erhöhten Ausbeute an Hepatozyten von 3,5 ± 0,7 bis 6,0 ± 1,6 Millionen Hepatocyten pro Gramm abzudecken Leber mit Werten im Mittel ausgedrückt ± Standardfehler des Mittelwerts. Im Vergleich dazu ist das Protokoll in der Lage, eine Ausbeute von 13,5 ± 0,4 Mio. Hepatozyten pro g Leber (im Mittel ± Standardfehler des Mittelwerts ausgedrückt) ohne die Verwendung von Cyanoacrylat-Klebstoffen zu erzielen. Während Cyanacrylat-Klebstoffe für den Wundverschluss verwendet <sup> 19,20 medizinischer Qualität Cyanacrylatklebstoffen wie Octylcyanoacrylat und Butylcyanoacrylat kann teuer werden, im Vergleich zu Ethylcyanoacrylat. Jedoch kürzerkettige Derivate, wie Ethyl-Cyanacrylat gefunden zu sein histotoxic als längerkettige Derivate 21,22.

Dieses Verfahren ist einfacher und zeitsparend durch die Verwendung von gekrümmten Bewässerungs Kanülen mit Oliven Spitzen. Die Verwendung von Kanülen mit einer geeigneten Größe wird in einer engen Passform, die die Kanülen in Position hält, ohne die Verwendung von Klebstoff 18 oder 23 Fäden führen. Das verwendete Kanülen Durchmesser im Bereich von 1 bis 2 mm mit Spitzendurchmessern von 1,25 bis 4,5 mm bemessen. Eine Zusammenstellung der verschiedenen Kanülengrößen verfügbar gemacht, wenn ein Stück Leber ist bereit für Kanülen werden, so dass die entsprechende Größe Kanüle für einen bestimmten Blutgefäß wie in der beiliegenden Video gezeigt gewählt werden. Dieses Verfahren verwendet auch Kanülen im Allgemeinen (Abbildung2A) Vergleich zu anderen Studien, bei denen 2 23 2-4 18 oder Kanülen verwendet werden. Dies kann helfen, eine bessere Durchblutung im ganzen Stück Leber, was zu hohen Rentabilität und Ertrag in einem kürzeren Zeitraum zu erreichen Verdauung.

Im Ergebnis trennt dieses Protokoll humanen Hepatozyten, die ein wichtiges Modell für die Untersuchung zellulären Metabolismus, Pharmakokinetik und Toxikologie von Xenobiotika, der Leberregeneration und translationale Forschung sind. Eine frühere Umfrage über 150 Medikamente, die Humantoxizität verursachen zeigte, dass die Übereinstimmung zwischen Toxizität im Tierversuch gefunden, und dass in der klinischen Praxis beobachtet wird, ist 70% 24. So bleiben humanen Hepatozyten ein wichtiges Modell für die Validierung von Forschung an Tiermodellen durchgeführt und für die Prüfung Droge führt zu Nebenwirkungen, bevor Sie zu klinischen Studien. Ferner ist die Verwendung von humanen Hepatozyten aus Rest Leberproben oder Hepatozyten isoliert aus Schlachttieren 25 isoliert, wie ein Modellim Einklang mit dem 3R ethischen Rahmen 26, um die Nutzung von Forschungs Tiere, wenn möglich, zu ersetzen.

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Disclosures

Optimierung des Protokolls wurde teilweise durch einen Zuschuss aus hepacult GmbH finanziert. Dr. Wolfgang Thasler ist einer der Gründer der hepacult GmbH und bleibt eines der Mitglieder des Vorstandes in dieser Gesellschaft. Die Beschäftigung von Maresa Demmel ist teilweise durch hepacult. Maria Hauner wird durch hepacult GmbH beschäftigt. Hepacult ist ein Spin-off biotechnologische Firma aus der Universität, der humanen Hepatozyten mit Zustimmung und offenen Zugang zu Forschungszwecken bietet.

Acknowledgments

Diese Arbeit von der Human Tissue and Cell Research Foundation, die menschliche Gewebe für die Forschung macht möglich gemacht. Und hepacult GmbH Finanzielle Unterstützung für diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (: Virtual Liver Network, Förderkennzeichen 0315759 Zuschuss Name) erhalten. Unser Dank gilt auch den technischen Assistenten aus dem Klinikum Großhadern Gewebebank für die Sammlung der Leberproben und die technischen Assistenten aus der Zellisolierung Core Facility für die Durchführung der Leberdurchblutung und Hepatozyten Isolation zu gehen. Insbesondere möchten wir Natalja Löwen für den Nachweis dieses Verfahren in dem Video zu danken. Schließlich möchten wir Natalja Löwen und Edeltraud Hanesch für die Erstellung der Illustrationen für Abbildung 1 und die Zahlen in der schematischen Überblick über die Video danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bubble trap Gaßner Glastechnik  
Glass jacketed condenser Gaßner Glastechnik  
41 °C Water bath Julabo 35723-H24/EG  
37 °C Water bath GFL 1083  
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) Linde  
Gas permeable tubing Neolab 2-4440  
Peristaltic pump Ismatec IP65  
Scalpel Feather 320010  
Forceps Omnilab 5171014  
Conical flasks 1 L Schott Duran 2121654  
Conical flasks 5 L Schott Duran 2121673  
Beakers Schott Duran 2110654  
200 ml centrifuge tubes Becton Dickinson 352075  
Crystallizing dish Omnilab 5144063  
Curved irrigation cannulae with ball tips Ernst Kratz GmbH 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL  
Micro vascular clamps Ernst Kratz GmbH  
Büchner funnel Carl Roth HT38.1  
Nylon mesh 210 μm Neolab 4-1413  
Nylon mesh 70 μm Neolab 4-1419  
0.22 μm sterile filters Peske 99505  
500 ml bottles Schott Duran 2180144  
1 L bottles Schott Duran 2180154  
Hemocytometer Peske 06-0001  
1.5 ml tubes Eppendorf 0030 120,086  
50 ml conical tubes BD Biosciences 352070  
Ice bucket Neolab 1508454  
Sterile Pasteur pipettes Brand 747715  
Motorised pipette filler (Pipette boy acu) Integra 155017  
Refridgerated centrifuge Eppendorf 5810R  
Laminar flow Kendro Hera safe-KS9  
Aspirator (Low-flow surgical suction pump) Atmos C361  
Laboratory Gas Burner Integra Fire Boy eco  
Disposable laboratory coat Paperlynen GmbH MD0202414  
Surgical mask with visor Kimberly-Clark 48247  
Surgical hood Barrier 42072  
Latex gloves Semper Care CE0321  
Collagenase (Batch number NB 4G) Serva 17465  
Calcium chloride dihydrate Merck 2382  
EGTA Sigma E4378  
Sodium chloride Roth 9265.2  
Hepes Roth 9105.3  
Potassium chloride Serva 26868  
Albumin Biomol 01400-2  
Glucose Serva 22700  
Sodium hydrogen carbonate Serva 30180  
0.4% Trypan blue solution Lonza 17-942E  
Cold storage solution Hepacult GmbH  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Medizin Cellular Biology Biomedical Engineering Anatomie Physiologie Chirurgie Life Sciences (General) Human Hepatozyten-Isolation menschlichen Hepatozyten Collagenase Perfusion Collagenase-Perfusion Hepatozyten- Leber- Human- Zell- Isolation klinische Anwendungen klinischen Techniken

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The changes listed below have been made to Table 1.

1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:

EGTA  0.1mM

to:

EGTA  1mM

2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:

Calcium chloride dihydrate  0.5µM

to:

Calcium chloride dihydrate  5mM
Isolierung von humanen Hepatozyten durch eine Zwei-Schritt-Verfahren Collagenase Perfusion
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Lee, S. M. L., Schelcher, C.,… More

Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J. Vis. Exp. (79), e50615, doi:10.3791/50615 (2013).

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