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Biology

एक दो कदम Collagenase छिड़काव प्रक्रिया द्वारा मानव hepatocytes का अलगाव

Published: September 3, 2013 doi: 10.3791/50615
Automatic Translation
1,2, 1, 2,3, 3, 4
1Experimental Surgical Research, Grosshadern Hospital, Munich, 2Center for Liver Cell Research, Grosshadern Hospital, Munich, 3Hepacult LLC, Regensburg, 4Department of Surgery, Grosshadern Hospital, Munich

ERRATUM NOTICE

Summary

मानव hepatocytes के अलगाव के लिए एक संशोधित दो कदम collagenase छिड़काव प्रक्रिया में वर्णित है. यह विधि भी अन्य स्तनधारी यकृत के लिए लागू किया जा सकता है. पृथक hepatocytes उन्हें ऐसे जिगर उत्थान, फार्माकोकाइनेटिक्स और विष विज्ञान जैसे क्षेत्रों में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक उपयुक्त मॉडल बनाने, उच्च उपज और व्यवहार्यता में उपलब्ध हैं.

Abstract

जिगर, एक असाधारण उत्थान क्षमता के साथ एक अंग है, इस तरह के detoxification, चयापचय और homeostasis के रूप में कार्य करता है की एक विस्तृत श्रृंखला, बाहर किया जाता है. जैसे, hepatocytes अनुसंधान सवालों की एक विशाल विविधता के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल हैं. विशेष रूप से, मानव hepatocytes के उपयोग फार्माकोकाइनेटिक्स, विष विज्ञान, जिगर उत्थान और शोधों के क्षेत्र में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, इस विधि Seglen 1 द्वारा वर्णित के रूप में hepatocytes अलग करने के लिए एक दो कदम collagenase छिड़काव की प्रक्रिया का एक संशोधित संस्करण प्रस्तुत करता है.

इससे पहले, hepatocytes यांत्रिक विधियों से पृथक किया गया है. हालांकि, एंजाइमी तरीकों hepatocytes अलगाव के बाद उनकी संरचनात्मक अखंडता और समारोह को बनाए रखने के रूप में बेहतर होना दिखाया गया है. यहाँ प्रस्तुत यह विधि 77 ± 10% की व्यवहार्यता के साथ hepatocytes के एक बड़े उपज में मानव जिगर के टुकड़े और परिणाम के लिए चूहा यकृत के लिए पहले से बनाया गया विधि adapts. मुख्यइस प्रक्रिया में अंतर रक्त वाहिकाओं के cannulization की प्रक्रिया है. इसके अलावा, यहां वर्णित विधि भी तुलनीय जिगर या रक्त वाहिका आकार के साथ अन्य प्रजातियों से यकृत के लिए लागू किया जा सकता है.

Introduction

एक जिगर सेल निलंबन यांत्रिक या एंजाइमी तरीकों से जिगर से तैयार किया जा सकता है. पूरे जिगर की कोशिकाओं को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया यांत्रिक विधियों, जाली 2 के माध्यम से जिगर मजबूर एक क्हान प्रकार के बरतन 3 में ग्लास मोतियों के साथ एक जिगर का टुकड़ा मिलाते हुए, इन वर्षों में आदि ढीला pestles 4,5 के साथ कांच homogenizers का उपयोग शामिल है, यांत्रिक विधियों से बाहर गिर गया है कारण कोशिका झिल्ली को नुकसान और पृथक hepatocytes 6,7 के समारोह के नुकसान के लिए एहसान. नतीजतन, एक enzymatic विधि का उपयोग वर्तमान में hepatocytes के अलगाव के लिए मुख्य विधि है.

बेरी और मित्र 8 चूहों में पोर्टल शिरा के माध्यम से जिगर के माध्यम से collagenase और hyaluronidase perfused जब एक enzymatic विधि का उपयोग hepatocytes के अलगाव काफी सुधार किया गया था. यह छिड़काव की प्रक्रिया के लिए अग्रणी, एंजाइमों कोशिकाओं के बहुमत के साथ निकट संपर्क में आने की अनुमति देने के लिए वाहिका संरचना का उपयोग कियाhepatocytes 8 की उपज में 6 गुना वृद्धि हुई है. इसके अलावा, इस पद्धति लगभग पृथक vesicles में जालिका का कोई परिवर्तन नहीं है और कोई mitochondrial क्षति 8 के साथ, उनकी संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखा है कि कोशिकाओं झुकेंगे.

इस विधि जिगर सेल अलगाव के लिए एक दो कदम छिड़काव प्रक्रिया का बीड़ा उठाया है, जो Seglen 1, द्वारा संशोधित किया गया था. इस प्रक्रिया में, चूहा जिगर सीए 2 + 1 युक्त collagenase बफर के साथ छिड़काव के बाद सीए 2 + मुक्त बफर के साथ perfused है. दूसरे चरण में सीए 2 + के अलावा इष्टतम collagenase गतिविधि 1,9 के लिए आवश्यक है, जबकि पहले चरण में सीए 2 + को हटाने, desmosomes को बाधित करने में मदद करता है.

ऊपर वर्णित प्रकाशित काम चूहों में प्रदर्शन किया गया है कि यह देखते हुए, इस लेख गुंजन से उच्च व्यवहार्यता साथ hepatocytes के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक संशोधित प्रक्रिया का प्रदर्शन करना हैएक यकृत. मानव hepatocytes के उपयोग शोधों के लिए और पशु मॉडल का उपयोग कर प्रयोगों मान्य के लिए महत्वपूर्ण बनी हुई है. इस अध्ययन में इस्तेमाल मानव जिगर के टुकड़े मानव ऊतकों और सेल रिसर्च फाउंडेशन, एक राज्य नियंत्रित गैर लाभ नींव 10 के माध्यम से शासन के लिए सहमति से हासिल किया गया. एक रोगविज्ञानी निदान के लिए आवश्यक था क्या हटाया के बाद, जिगर के टुकड़े शेष ऊतक से एकत्र किए गए थे. पैथोलॉजिस्ट ने बंद sectioned ऊतक आकृति विज्ञान जिगर लकीर के बाद लकीर हाशिए से प्राप्त स्वस्थ ऊतकों था.

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Protocol

1. छिड़काव और अलगाव समाधान की तैयारी

  1. जिगर का टुकड़ा और 1 टेबल के अनुसार hepatocytes के अलगाव के छिड़काव के लिए आवश्यक समाधान तैयार करें. समाधान का उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  2. बाँझ फिल्टर 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर का उपयोग सभी समाधान.
  3. जिगर के साथ संपर्क में आते हैं कि सभी समाधान बाँझ होना चाहिए.

2. छिड़काव उपकरण और समाधान की तैयारी

  1. चित्रा 1 में दिखाया गया है जिगर के टुकड़े के छिड़काव के लिए उपकरणों की स्थापना की जानी चाहिए.
  2. पानी स्नान एक विशेष प्रयोगात्मक सेट अप में अलग है जो एक उचित तापमान, पर सेट किया जाना चाहिए कि वे जिगर का टुकड़ा तक पहुँचने जब समाधान 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर हैं कि इस तरह के. इस मामले में, पानी स्नान समाधान 1, 2 और 3 और तख्ताबंदीवाला कांच कंडेनसर गर्म करने के लिए 41 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया जाता है. समाधान 4 गरम किया जाना चाहिएCollagenase गतिविधि के नुकसान को कम करने के लिए इस्तेमाल के लिए एक अलग पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस.
  3. फौरन जिगर छिड़काव से पहले, 95% 2 हे / 5% सीओ 2 oxygenation तंत्र (चित्रा 1E) गैस युक्त गैस टैंक की नियामक पर बारी.

3. जिगर के छिड़काव

  1. केवल 1 कटौती की सतह के साथ आदर्श रूप में संभव है और जितना बरकरार Glisson के कैप्सूल के साथ एक जिगर का टुकड़ा छिड़काव के लिए एक रोगविज्ञानी से प्राप्त किया जाना चाहिए.
  2. एक छिद्रित फिल्टर डिस्क (चित्रा 1 बी) शामिल हैं BUCHNER कीप पर इस जिगर का टुकड़ा रखें.
  3. छिड़काव प्रणाली समाधान 1 के साथ primed किया जाना चाहिए.
  4. एक कम प्रवाह की दर के साथ, जैतून सुझावों के साथ घुमावदार सिंचाई cannulae जिगर का टुकड़ा की कटौती की सतह पर बड़े रक्त वाहिकाओं में डाला जाना चाहिए. रक्त जिगर से बाहर flushes के रूप में, ऊतक अच्छा छिड़काव के साथ क्षेत्रों में हल्का हो जाता है. विभिन्न आकारों के लिए इस्तेमाल किया cannulae की संख्यायकृत की चित्रा 2A में दिखाया गया है. चुना गेज आकार जगह में cannulae का आयोजन करेगा कि एक सुखद फिट में परिणाम चाहिए. छोटे रक्त वाहिकाओं जिगर के टुकड़े के बाहर निकास के लिए छिड़काव बफर के लिए खुला छोड़ दिया जाना चाहिए.
  5. जिगर (चित्रा 2 बी) के आकार के आधार पर मिलीग्राम / मिनट 110-460 के बीच करने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप पर प्रवाह दर में वृद्धि. यह 44 ± 16 के एक औसत प्रवाह दर मिलीग्राम / मिनट प्रवेशनी प्रति (चित्रा -2) में यह परिणाम है. चुना गति जिगर के टुकड़े पर निर्भर करता है और जिगर के टुकड़े के एक मामूली प्लम्पिंग अप में परिणाम चाहिए. कुछ मामलों में, जैसा कि ऊपर उल्लेख मामूली प्लम्पिंग प्राप्त करने के लिए सूक्ष्म संवहनी clamps के साथ खुले वाहिकाओं के कुछ बंद शिकंजा कसने के लिए आवश्यक हो सकता है. जिगर का टुकड़ा भर में एक हल्का रंग है जब एक अच्छा छिड़काव मनाया जा सकता है.
  6. खारा में भिगो धुंध का एक टुकड़ा के साथ इसे कवर द्वारा छिड़काव के दौरान नम जिगर का टुकड़ा रखें.
  7. किसी भी अनुसंधान बाहर निकलवाने के लिए समाधान 1 का 1 एल के साथ छिड़कनाजिगर के टुकड़े में रक्त emaining.
  8. समाधान 2 छिड़काव तरल पदार्थ को बदलें और 10 मिनट के लिए छिड़कना.
  9. समाधान 3 छिड़काव तरल पदार्थ स्विच और 0.5 एल के साथ छिड़कना
  10. Collagenase (तालिका 2) के 0.1-0.15% शामिल हैं जो समाधान 4, छिड़काव तरल पदार्थ बदलें.
  11. जिगर पर्याप्त पच जाता है जब तक इस कदम के लिए, छिड़काव 9-12 मिनट के लिए एक recirculating तरीके से किया जाना चाहिए या; जिगर ऊतक Glisson के कैप्सूल के तहत अलग से थोड़ा तोड़ने के लिए और एक की कुंद पक्ष के साथ जांच जब नरम महसूस करने के लिए प्रकट करना चाहिए स्केलपेल.

4. Hepatocytes का अलगाव

  1. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप बंद करें और जिगर का टुकड़ा से cannulae हटा दें.
  2. समाधान 5 का 100-200 मिलीग्राम से युक्त एक crystallizing पकवान में जिगर का टुकड़ा रखें.
  3. ध्यान से Glisson के कैप्सूल निकालें और धीरे कोशिकाओं को बाहर हिला. अच्छी तरह से perfused नहीं कर रहे हैं क्षेत्रों है कि कर रहे हैं, एक छुरी के माध्यम से कटौती करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैइन क्षेत्रों के भीतर निहित कोशिकाओं को रिलीज करने के लिए. के रूप में इस प्रक्रिया के दौरान जरूरत अधिक समाधान 5 जोड़ें.
  4. 500 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा तक पहुँच जाता है जब तक अधिक समाधान 5 जोड़ें.
  5. दो बार सेल निलंबन फिल्टर, पहले एक 70 माइक्रोन नायलॉन जाल के बाद 210 माइक्रोन नायलॉन जाल के माध्यम से. अगला, 200 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में सेल निलंबन डालना.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 72 जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला Aspirate और धीरे समाधान 5 की 200 मिलीलीटर में धीरे resuspend सेल गोली.
  7. धोने कदम संख्या 4.6 तीन बार दोहराएँ. अंतिम अपकेंद्रित्र कदम पर, कोल्ड स्टोरेज समाधान में Resuspend कोशिकाओं (माल की सूची देखें). कोशिकाओं एक hemocytometer आधारित trypan नीले बहिष्कार परख का उपयोग उपज और व्यवहार्यता के मूल्यांकन के लिए प्रति मिली लीटर लगभग 2-5000000 hepatocytes होना चाहिए.
  8. एक trypan नीले बहिष्कार परख बाहर ले जाने के लिए, trypan नीले soluti के 0.5 मिलीलीटर युक्त एक microfuge ट्यूब (≈ 2-5000000 / एमएल) के उचित पतला कोशिकाओं के 0.1 मिलीलीटर जोड़नेपर (0.4% trypan नीले फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में भंग) और 0.4 पीबीएस के मिलीलीटर. अच्छी तरह से सेल निलंबन मिश्रण के बाद, निलंबन के साथ एक hemocytometer लोड और 100X बढ़ाई पर एक खुर्दबीन के नीचे की जांच. जीवित कोशिकाओं बेदाग प्रकट करते हुए माइक्रोस्कोपी के तहत, मृत कोशिकाओं नीले दाग दिया जाएगा. Hemocytometer पर चिह्नित 1 मिमी 2 ग्रिड में से प्रत्येक में रहते हैं और कुल कोशिकाओं की संख्या की गणना. व्यवहार्यता (%), जीवित कोशिकाओं की उपज (एमएल कोल्ड स्टोरेज समाधान (सीएसएस) के प्रति मिलियन hepatocytes या ग्राम जिगर प्रति मिलियन hepatocytes) से नीचे सूत्रों का उपयोग कर की गणना की जा सकती है.

1 समीकरण
नोट: इस मामले में, trypan नीले कमजोर पड़ने कारक 10 है और hemocytometer कारक 10,000 है.

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Representative Results

छिड़काव सेटअप

जिगर छिड़काव के लिए आवश्यक उपकरण चित्रा 1 के अनुसार स्थापित किया जाना चाहिए.

व्यवहार्यता और अलग मानव hepatocytes की यील्ड

पृथक मानव hepatocytes के औसत व्यवहार्यता 77 ± 10% थी और hepatocytes की औसत उपज ± मानक विचलन का मतलब के रूप में व्यक्त मूल्यों के साथ, 13 ± 11 लाख hepatocytes / जी जिगर था. hepatocyte isolations की संख्या इन मूविंग 648 isolations दिसम्बर 2012 से जनवरी 1999 से बाहर किया गया था प्राप्त करने के लिए किया जाता है.

उपयुक्त छिड़काव पैरामीटर्स

एक सफल निस्तब्धता और जिगर के छिड़काव से बाहर ले जाने के क्रम में इस्तेमाल किया cannulae की संख्या जिगर (2A चित्रा) के वजन के हिसाब से भिन्न चाहिए. सामान्य तौर पर, 4-8 cannulae 20 ग्राम के नीचे से 80 से अधिक ग्राम से लेकर यकृत के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. छिड़काव का एक उपयुक्त दर, भी जिगर वजन पर निर्भर है, जो जिगर (आंकड़े 2 बी और सी) के एक सफल छिड़काव के लिए चुना जाना चाहिए. यह 44 मिलीग्राम / मिनट प्रवेशनी -1 के एक औसत छिड़काव गति अलग जिगर वजन की एक सीमा के पार आदर्श है और अधिक cannulae उपयोग किया जाता है, तो इसलिए छिड़काव गति उचित रूप से समायोजित किया जाना चाहिए कि पाया गया है. छिड़काव सफल होता है, जिगर रंग में पीला हो और ऊपर से थोड़ा plumped चाहिए.

Hepatocytes की पवित्रता

Immunofluorescence के माध्यम से, यह सकारात्मक एल्बुमिन के लिए, 94 ± 1% की शुद्धता था जो दाग पृथक hepatocytes, (5 एन = 4 प्रत्येक replicates) (आंकड़े 3 ए और बी). चित्रा -3 सी एक प्रतिनिधि चरण विपरीत छवि है कि पाया गया था इतनी बड़ी सेल आकार और polygonal आकार का कोशिकाओं के रूप में hepatocytes के लक्षण दिखा.


चित्रा 1. एक BUCHNER कीप, (सी) ग्लास तख्ताबंदीवाला कंडेनसर, (डी) जल स्नान, (ई) oxygenation तंत्र पर रक्त वाहिकाओं में डाला जैतून टिप्स, (साथ घुमावदार सिंचाई cannulae साथ छिड़काव सेटअप. (ए) बुलबुला जाल, (बी) के जिगर का टुकड़ा एफ) 95% 2 हे / 5% सीओ 2 गैस टैंक और (छ) क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप.

चित्रा 2
चित्रा 2. इस्तेमाल किया cannulae की (ए) संख्या, (बी) के छिड़काव की दर (एमएल / मिनट), या (सी) छिड़काव दर (मिलीग्राम / मिनट. एक काफी अलग 0-20 ग्राम हालत, पी 0.05 <. 20-40 ग्राम, 40-60 ग्राम और 60-80 ग्राम हालत, पी <0.05 से काफी अलग एबी.

चित्रा 3
चित्रा 3. (हरे रंग में दाग) (ए) एल्बुमिन के लिए सकारात्मक अलग कक्षों और (बी) इसी नकारात्मक नियंत्रण (200X बढ़ाई) की Immunofluorescent छवियों. नाभिक DAPI का उपयोग नीले रंग में दाग रहे हैं. अलग कक्षों की (सी) चरण विपरीत छवि (100x बढ़ाई).

समाधान घटक अंतिम एकाग्रता
समाधान 1 सोडियम क्लोराइड 154 मिमी
HEPES 20 मिमी
पोटेशियम क्लोराइड 5.6 मिमी
ग्लूकोज 5 मिमी
सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट 25 मिमी
2 समाधान सोडियम क्लोराइड 152.5 मिमी
HEPES 19.8 मिमी
पोटेशियम क्लोराइड 5.5 मिमी
ग्लूकोज 5.0 मिमी
सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट 24.8 मिमी
EGTA 0.1 मिमी
2 समाधान तैयार करने के लिए, 1 समाधान के 990 मिलीलीटर के लिए 100 मिमी EGTA के 10 एमएल जोड़ें. समाधान 3 सोडियम क्लोराइड 152.5 मिमी
HEPES 19.8 मिमी
पोटेशियम क्लोराइड 5.5 मिमी
ग्लूकोज 5.0 मिमी
सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट 24.8 मिमी
कैल्शियम क्लोराइड dihydrate 0.5 माइक्रोन
समाधान 3 तैयार करते हैं, समाधान 1 की 990 मिलीलीटर के लिए 0.5 एम कैल्शियम क्लोराइड dihydrate के 10 एमएल जोड़ें.
समाधान 4 सोडियम क्लोराइड 152.5 मिमी
HEPES 19.8 मिमी
पोटेशियम क्लोराइड 5.5 मिमी
ग्लूकोज 5.0 मिमी
सोडियम hydrogen कार्बोनेट 24.8 मिमी
कैल्शियम क्लोराइड dihydrate 0.5 माइक्रोन
Collagenase तालिका 2 देखें
समाधान 4 तैयार करते हैं, समाधान 3 collagenase की उचित मात्रा में जोड़ें.
समाधान 5 सोडियम क्लोराइड 120 मिमी
HEPES 10 मिमी
कैल्शियम क्लोराइड dihydrate 0.9 मिमी
पोटेशियम क्लोराइड 6.2 मिमी
अन्नसार 0.1% w / ध्

तालिका 1. छिड़काव और अलगाव समाधान.

जिगर के टुकड़े के आकार (G) Collagenase एकाग्रता(%) Collagenase गतिविधि (यू / एमएल)
<25 0.10 250
25-40 0.11 300
41-80 0.13 350
> 80 0.15 400

तालिका 2. Collagenase सांद्रता (%) और गतिविधियों (यू / एमएल) जिगर के टुकड़े (जी) के विभिन्न आकार के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल उच्च व्यवहार्यता और पवित्रता के साथ मानव hepatocytes के अलगाव में यह परिणाम है. इन परिणामों को प्राप्त करने के लिए, यह जिगर का एक उपयुक्त टुकड़े के साथ शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है. जिगर का टुकड़ा 1 कटौती की सतह के अलावा सभी सतहों पर बरकरार Glisson के कैप्सूल होना चाहिए. एक अन्य महत्वपूर्ण कारक विभिन्न बैचों पाचन के बाद 11 hepatocytes के viabilities में चिह्नित मतभेद में परिणाम कर सकते हैं, के रूप में इस्तेमाल किया collagenase के विशेष बैच है. इसलिए, collagenase के विभिन्न बैचों परीक्षण किया जाना चाहिए और सबसे अच्छा व्यवहार्यता के साथ hepatocytes कि उत्पादन बैच बड़ी मात्रा में प्राप्त किया जाना चाहिए. अंत में, एक उपयुक्त पाचन समय प्राप्त कोशिकाओं की उपज और व्यवहार्यता के आधार पर चुना जाना है. उदाहरण के लिए, कम उपज के साथ एक उच्च व्यवहार्यता एक अपर्याप्त पाचन समय का संकेत मिलता है, और कम व्यवहार्यता के साथ एक उच्च उपज पाचन समय बहुत लंबा है कि संकेत मिलता है.

इस विधि टी अनुकूलित किया जा सकताओ एक ही जिगर के टुकड़े से गैर parenchymal कोशिकाओं और hepatocytes अलग. ऐसा करने का एक तरीका गैर parenchymal सेल अलगाव 12 के लिए सीधे (4.6 कदम) पहले centrifugation कदम से सतह पर तैरनेवाला उपयोग करने के लिए है. एक दूसरा तरीका hepatocyte अलगाव (4.5 कदम) के लिए नायलॉन के जाल के माध्यम से छानने के बाद सेल निलंबन की विभाज्य निकालें और की उपज बढ़ाने के लिए गैर parenchymal सेल अलगाव से पहले एक अतिरिक्त pronase पाचन कदम के लिए शेष सेल निलंबन के अधीन करने के लिए है गैर parenchymal कोशिकाओं 13. Hepatocytes की कीमत पर गैर parenchymal कोशिकाओं के एक उच्च उपज के लिए, इस विधि pronase और collagenase के लिए (3.10 कदम) अकेले collagenase प्रतिस्थापन और गैर parenchymal सेल अलगाव 14 के लिए परिणामी सेल निलंबन का उपयोग करके संशोधित किया जा सकता है.

मानव hepatocytes अलग करने के अलावा, इस विधि प्रस्तुत भी fro एकत्र जिगर के टुकड़े से hepatocytes अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकतातुलनीय आकार या तुलनीय वाहिका संरचना आकार के साथ एम अन्य प्रजातियों. इस तरह के सुअर, कुत्ते या रहनुमा मॉडल के रूप में वैकल्पिक मॉडल का उपयोग करने वाले शोधकर्ताओं, के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है.

मानव hepatocytes के ISOLATIONS आम तौर पर दो स्रोतों से यकृत का उपयोग कर रहे हैं: पूरे यकृत लकीर हाशिए से प्रत्यारोपण या आकृति विज्ञान के सामान्य जिगर ऊतक के लिए अनुपयुक्त समझा. इस विधि में इस्तेमाल किया उत्तरार्द्ध स्रोत का लाभ जिगर के टुकड़े के लिए जल्दी ही प्रयोगशाला के लिए उपलब्ध कराया जाता है. इसके तत्काल बाद लकीर के बाद, resected जिगर निदान के लिए आवश्यक है क्या निकालता है, जो एक रोगविज्ञानी के लिए लाया जाता है. रोगविज्ञानी तो discarding के लिए उम्मीद है क्या से hepatocyte अलगाव के लिए आकृति विज्ञान के सामान्य जिगर का एक उपयुक्त टुकड़ा निकाल देंगे. सामान्य तौर पर, एक जिगर का टुकड़ा 56 ± 29 मिनट (एन = 103) के एक औसत समय में छिड़काव के लिए तैयार प्रयोगशाला में आता है. इसकी तुलना में, प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त नहीं हैं कि पूरे यकृत ही रिलायंस एनर्जी होगा13 ± 2 घंटा और 16 ± 12 घंटा 15 के बीच प्रयोगशाला में ढील. इसके अलावा, के कारण नैतिक आधार और दाता यकृत की कमी करने के लिए, प्रत्यारोपण के लिए सभी मापदंडों को पूरा नहीं करते कि पूरे यकृत से hepatocytes के अलगाव Eurotransplant क्षेत्र में बचा है. इन यकृत अभी भी विस्तारित दाता मानदंडों के साथ प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि यह है. कुछ अध्ययनों से चयनित प्राप्तकर्ताओं 16,17 तक की कमी प्रतीक्षा सूची मृत्यु दर और संतोषजनक परिणाम में प्रत्यारोपण के परिणाम के लिए रोगी का उपयोग को अधिकतम दिखाया है. एक और लाभ यह प्रत्यारोपण के लिए अनुपयुक्त यकृत, steatotic तांतव या सूत्रणरोग्रस्त किया जा सकता है, जबकि जिगर लकीर टुकड़े से प्राप्त कोशिकाओं, आकृति विज्ञान स्वस्थ जिगर से अलग कर रहे हैं. जैसे, यहां विधि एट अल Baccarani, द्वारा प्राप्त की ग्राम जिगर प्रति 0.7 ± 0.3 करोड़ डॉलर या 3 ± 2 लाख hepatocytes की तुलना में ग्राम जिगर प्रति 13 ± 11 लाख hepatocytes के एक उच्च उपज में परिणाम. 15 क्रमशः सूत्रणरोग्रस्त या steatotic यकृत का उपयोग कर. हालांकि, जिगर लकीर टुकड़े उपलब्ध टुकड़ा के आकार के रूप में hepatocytes के एक कम कुल उपज में परिणाम 2-250 जी से एक श्रृंखला और 37 ± 29 छ (एन = 648) के एक औसत के साथ आम तौर पर छोटा है.

अन्य समूहों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल cyanoacrylate चिपकने के उपयोग से बचा जाता है. एलेक्जेंडर, एट अल. 18 एथिल cyanoacrylate, आमतौर पर इस्तेमाल किया सब उद्देश्य चिपकने वाला, का उपयोग ग्राम प्रति 3.5 ± 0.7-6.0 ± 1.6 लाख hepatocytes से hepatocytes के एक वृद्धि की उपज में जिगर, परिणाम की कटौती सतहों को कवर करने में पाया गया कि साधन में व्यक्त मूल्यों के साथ जिगर मतलब की मानक त्रुटि ±. इसकी तुलना में, इस प्रोटोकॉल cyanoacrylate चिपकने के उपयोग के बिना (मतलब की मानक त्रुटि ± साधन में व्यक्त) जी जिगर प्रति 13.5 ± 0.4 करोड़ hepatocytes की एक उपज प्राप्त करने में सक्षम है. Cyanoacrylate चिपकने घाव बंद करने के लिए इस्तेमाल किया गया है <समर्थन> ऐसे octyl cyanoacrylate और ब्यूटाइल cyanoacrylate के रूप में 19,20, चिकित्सा ग्रेड cyanoacrylate चिपकने एथिल cyanoacrylate की तुलना में महंगा हो सकता है. हालांकि, इस तरह एथिल cyanoacrylate के रूप में छोटे श्रृंखला डेरिवेटिव अब श्रृंखला डेरिवेटिव 21,22 से अधिक histotoxic होना पाया गया है.

इस विधि के कारण जैतून सुझावों के साथ घुमावदार सिंचाई cannulae का उपयोग करने के लिए समय कुशल सरल और अधिक है. एक उपयुक्त आकार के cannulae का उपयोग गोंद 18 या टांके 23 के उपयोग के बिना जगह में cannulae रखती है कि एक तंग फिट का परिणाम देगा. इस्तेमाल किया cannulae 1.25-4.5 मिमी से आकार टिप व्यास के साथ 1-2 मिमी से लेकर व्यास है. एक जिगर का टुकड़ा केन्युलेशन के लिए तैयार है जब साथ वीडियो में दिखाया गया है एक विशेष रक्त वाहिका के लिए उपयुक्त आकार प्रवेशनी चुना जा सकता है, ताकि विभिन्न प्रवेशनी आकार के एक वर्गीकरण, उपलब्ध कराया जाना चाहिए. इस विधि को भी सामान्य रूप में और अधिक cannulae (चित्रा का इस्तेमाल2A) 2 23 या 2-4 18 cannulae उपयोग किया जाता है, जहां अन्य अध्ययनों की तुलना में. इस उच्च व्यवहार्यता और एक छोटी पाचन अवधि में उपज के लिए अग्रणी जिगर का टुकड़ा भर में एक बेहतर छिड़काव प्राप्त करने के लिए मदद मिल सकती है.

अंत में, इस प्रोटोकॉल सेलुलर चयापचय, फार्माकोकाइनेटिक्स और xenobiotics के विष विज्ञान, जिगर उत्थान और शोधों के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल हैं जो मानव hepatocytes, आइसोलेट्स. मानव विषाक्तता का कारण है कि 150 दवाओं पर पिछले एक सर्वेक्षण नैदानिक ​​अभ्यास में मनाया जानवरों के अध्ययन में पाया विषाक्तता के बीच और कहा कि क़बूल 70% 24 है कि दिखाया. इस प्रकार, मानव hepatocytes नैदानिक ​​परीक्षणों पर जाने से पहले प्रतिकूल प्रतिक्रिया के लिए जाता पशु मॉडल में किए गए शोध मान्य करने के लिए और दवा के परीक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल रहते हैं. एक मॉडल के रूप में आगे, शेष जिगर नमूने या hepatocytes से पृथक मानव hepatocytes के उपयोग कसाईखाना जानवरों 25 से पृथक3R नैतिक ढांचे 26 के साथ लाइन में संभव है जब अनुसंधान पशुओं के उपयोग को बदलने के लिए.

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Disclosures

इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन आंशिक रूप से Hepacult GmbH से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया. डॉ. वोल्फगैंग Thasler Hepacult GmbH के संस्थापकों में से एक है और इस कंपनी में बोर्ड के सदस्यों में से एक बना हुआ है. Maresa Demmel का रोजगार Hepacult द्वारा आंशिक रूप से है. मारिया Hauner Hepacult GmbH द्वारा कार्यरत है. Hepacult सहमति और अनुसंधान प्रयोजनों के लिए खुला पहुँच के साथ मानव hepatocytes प्रदान करता है, जो विश्वविद्यालय से एक स्पिन जैव प्रौद्योगिकी फर्म है.

Acknowledgments

इस काम के अनुसंधान के लिए मानव ऊतकों उपलब्ध बनाता है जो मानव ऊतकों और सेल रिसर्च फाउंडेशन, द्वारा संभव बनाया गया था. और Hepacult GmbH इस काम के लिए वित्तीय सहायता संघीय शिक्षा मंत्रालय और रिसर्च (: वर्चुअल लिवर नेटवर्क, अनुदान संख्या 0315759 अनुदान नाम) से प्राप्त किया गया था. हमारे धन्यवाद भी जिगर छिड़काव और hepatocyte अलगाव से बाहर ले जाने के लिए जिगर के नमूने और सेल अलगाव कोर सुविधा से तकनीकी सहायकों की वसूली के लिए Grosshadern अस्पताल ऊतक बैंक से तकनीकी सहायकों के पास जाओ. विशेष रूप से, हम वीडियो में इस प्रक्रिया के प्रदर्शन के लिए Natalja Löwen धन्यवाद देना चाहूंगा. अंत में, हम वीडियो के योजनाबद्ध सिंहावलोकन में चित्रा 1 के लिए चित्र और आंकड़े बनाने के लिए Natalja Löwen और Edeltraud Hanesch धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bubble trap Gaßner Glastechnik  
Glass jacketed condenser Gaßner Glastechnik  
41 °C Water bath Julabo 35723-H24/EG  
37 °C Water bath GFL 1083  
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) Linde  
Gas permeable tubing Neolab 2-4440  
Peristaltic pump Ismatec IP65  
Scalpel Feather 320010  
Forceps Omnilab 5171014  
Conical flasks 1 L Schott Duran 2121654  
Conical flasks 5 L Schott Duran 2121673  
Beakers Schott Duran 2110654  
200 ml centrifuge tubes Becton Dickinson 352075  
Crystallizing dish Omnilab 5144063  
Curved irrigation cannulae with ball tips Ernst Kratz GmbH 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL  
Micro vascular clamps Ernst Kratz GmbH  
Büchner funnel Carl Roth HT38.1  
Nylon mesh 210 μm Neolab 4-1413  
Nylon mesh 70 μm Neolab 4-1419  
0.22 μm sterile filters Peske 99505  
500 ml bottles Schott Duran 2180144  
1 L bottles Schott Duran 2180154  
Hemocytometer Peske 06-0001  
1.5 ml tubes Eppendorf 0030 120,086  
50 ml conical tubes BD Biosciences 352070  
Ice bucket Neolab 1508454  
Sterile Pasteur pipettes Brand 747715  
Motorised pipette filler (Pipette boy acu) Integra 155017  
Refridgerated centrifuge Eppendorf 5810R  
Laminar flow Kendro Hera safe-KS9  
Aspirator (Low-flow surgical suction pump) Atmos C361  
Laboratory Gas Burner Integra Fire Boy eco  
Disposable laboratory coat Paperlynen GmbH MD0202414  
Surgical mask with visor Kimberly-Clark 48247  
Surgical hood Barrier 42072  
Latex gloves Semper Care CE0321  
Collagenase (Batch number NB 4G) Serva 17465  
Calcium chloride dihydrate Merck 2382  
EGTA Sigma E4378  
Sodium chloride Roth 9265.2  
Hepes Roth 9105.3  
Potassium chloride Serva 26868  
Albumin Biomol 01400-2  
Glucose Serva 22700  
Sodium hydrogen carbonate Serva 30180  
0.4% Trypan blue solution Lonza 17-942E  
Cold storage solution Hepacult GmbH  

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The changes listed below have been made to Table 1.

1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:

EGTA  0.1mM

to:

EGTA  1mM

2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:

Calcium chloride dihydrate  0.5µM

to:

Calcium chloride dihydrate  5mM
एक दो कदम Collagenase छिड़काव प्रक्रिया द्वारा मानव hepatocytes का अलगाव
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Lee, S. M. L., Schelcher, C.,… More

Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J. Vis. Exp. (79), e50615, doi:10.3791/50615 (2013).

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