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Biology

El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos

Published: September 3, 2013 doi: 10.3791/50615
Automatic Translation
1,2, 1, 2,3, 3, 4
1Experimental Surgical Research, Grosshadern Hospital, Munich, 2Center for Liver Cell Research, Grosshadern Hospital, Munich, 3Hepacult LLC, Regensburg, 4Department of Surgery, Grosshadern Hospital, Munich

ERRATUM NOTICE

Summary

Se describe un procedimiento de perfusión con colagenasa de dos etapas modificado para el aislamiento de hepatocitos humanos. Este método también se puede aplicar a otros hígados de mamíferos. Los hepatocitos aislados están disponibles con un alto rendimiento y la viabilidad, por lo que un modelo adecuado para la investigación científica en áreas como la regeneración hepática, farmacocinética y toxicología.

Abstract

El hígado, un órgano con una capacidad de regeneración excepcional, lleva a cabo una amplia gama de funciones, tales como la desintoxicación, el metabolismo y la homeostasis. Como tal, los hepatocitos son un modelo importante para una gran variedad de preguntas de investigación. En particular, el uso de hepatocitos humanos es especialmente importante en los campos de la farmacocinética, la toxicología, la regeneración del hígado y la investigación de translación. Por lo tanto, este método presenta una versión modificada de un procedimiento de perfusión con colagenasa de dos etapas para aislar los hepatocitos como se ha descrito por Seglen 1.

Anteriormente, los hepatocitos han sido aislados por métodos mecánicos. Sin embargo, los métodos enzimáticos han demostrado ser superior como hepatocitos conservan su integridad y función estructural después del aislamiento. Este método que aquí se presenta se adapta el método previamente diseñado para hígados de rata a pedazos de hígado humano y los resultados en un gran rendimiento de hepatocitos con una viabilidad de 77 ± 10%. La principaldiferencia en este procedimiento es el proceso de cannulization de los vasos sanguíneos. Además, el método descrito aquí también se puede aplicar a los hígados de otras especies con tamaños de hígado o de los vasos sanguíneos comparables.

Introduction

Una suspensión de células de hígado puede prepararse a partir del hígado por métodos mecánicos o enzimáticos. Los métodos mecánicos utilizados para preparar las células del hígado enteros incluyen obligar al hígado a través de una gasa 2, agitando un trozo de hígado con perlas de vidrio en un agitador de Kahn 3, utilizando homogeneizadores de vidrio con morteros sueltas 4,5 etc Con los años, los métodos mecánicos han caído en favor debido a los daños a las membranas celulares y la pérdida de función de los hepatocitos aislados 6,7. En consecuencia, el uso de un método enzimático es actualmente el principal método para el aislamiento de hepatocitos.

Aislamiento de hepatocitos utilizando un método enzimático mejoró notablemente cuando Berry y Friend 8 perfundidos colagenasa y hialuronidasa a través del hígado a través de la vena porta en ratas. Este proceso utiliza la perfusión de la vasculatura para permitir que las enzimas entran en estrecho contacto con la mayoría de las células, conduciendo aun aumento de 6 veces en el rendimiento de hepatocitos 8. Además, este método produjo células que conservan su integridad estructural, prácticamente sin transformación del retículo endoplásmico en vesículas aisladas y ningún daño mitocondrial 8.

Este método se modificó por Seglen 1, que fue pionero en un procedimiento de perfusión en dos etapas para el aislamiento de células del hígado. En este procedimiento, el hígado de la rata se perfunde con un tampón de Ca2 + libre seguido de la perfusión con un tampón de colagenasa que contiene Ca 2 + 1. La eliminación de Ca 2 + en la primera etapa ayuda a romper los desmosomas, mientras que se requiere la adición de Ca 2 + en el segundo paso para la actividad de la colagenasa óptimo 1,9.

Dado que el trabajo publicado descrito anteriormente se ha realizado en ratas, este artículo tiene como objetivo demostrar un procedimiento modificado que se puede utilizar para el aislamiento de hepatocitos con alta viabilidad de zumbidoun hígados. El uso de hepatocitos humanos sigue siendo importante para la investigación traslacional y para la validación de los experimentos con modelos animales. Los pedazos de hígado humano utilizados en este estudio fueron obtenidas con el consentimiento de la gobernanza a través de la Fundación Tejido Humano y la investigación con células, una fundación sin fines de lucro controladas por el Estado 10. Después de un patólogo elimina lo que se requiere para el diagnóstico, pedazos de hígado se recogieron a partir del tejido restante. El tejido seccionado por el patólogo era morfológicamente tejido sano obtenido a partir de los márgenes de resección después de la resección hepática.

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Protocol

1. Preparación de la perfusión y el aislamiento Soluciones

  1. Preparar las soluciones necesarias para la perfusión de la pieza hígado y el aislamiento de hepatocitos de acuerdo a la Tabla 1. Las soluciones pueden ser almacenadas a 4 ° C hasta su uso.
  2. Filtro estéril todas las soluciones utilizando un filtro de 0,22 micras.
  3. Todas las soluciones que entran en contacto con el hígado deben ser estériles.

2. Preparación de equipos y soluciones para infusión

  1. Equipamiento para la perfusión de la pieza de hígado debe establecerse como se muestra en la Figura 1.
  2. El baño de agua se establece a una temperatura apropiada, que es diferente en cada particular, experimental, de tal manera que las soluciones están a la temperatura de 37 ° C cuando llegan a la pieza de hígado. En este caso, el baño de agua se fijó en 41 ° C para calentar las soluciones 1, 2 y 3 y el condensador de vidrio con camisa. Solución 4 debe calentarse hasta37 ° C en un baño de agua separada para su uso para reducir la pérdida de actividad de la colagenasa.
  3. Poco antes de la perfusión del hígado, encienda el regulador del tanque de gas que contiene 95% O 2/5% CO 2 a gas del aparato de oxigenación (Figura 1E).

3. Perfusión del Hígado

  1. Un trozo de hígado con tanto cápsula intacta de Glisson posible e idealmente con superficie sólo 1 de corte se debe obtener de un patólogo para perfusión.
  2. Coloque esta pieza de hígado en el embudo Büchner que contiene un disco de filtro perforada (Figura 1B).
  3. El sistema de perfusión debe ser cebado con la solución 1.
  4. Con un caudal bajo, cánulas de irrigación curvo con punta de oliva se debe insertar en los vasos sanguíneos más grandes en la superficie de corte de la pieza de hígado. Cuando la sangre limpia las del hígado, el tejido se vuelve más claro en áreas con buena perfusión. El número de cánulas utilizado para diversos tamañosde hígados se muestra en la Figura 2A. El tamaño relativa elegida debe resultar en un ajuste cómodo que sostendrá la cánula en su lugar. Los vasos sanguíneos más pequeños se deben dejar abiertos para el tampón de perfusión para drenar fuera de la pieza de hígado.
  5. Aumentar la tasa de flujo en la bomba peristáltica a entre 110 a 460 ml / min dependiendo del tamaño del hígado (Figura 2B). Esto se traduce en una tasa media de flujo de 44 ± 16 ml / min por cánula (Figura 2C). La velocidad elegida depende de la pieza de hígado y debe resultar en un plumping ligero de la pieza de hígado. En algunos casos, puede ser necesario para sujetar cerró algunos de los vasos abiertos con pinzas vasculares micro para lograr el ligero voluminizador mencionado anteriormente. Una buena perfusión se puede observar cuando el pedazo de hígado es un color más claro en todo.
  6. Mantenga la pieza de hígado húmedo durante la perfusión cubriéndola con una gasa empapada en solución salina.
  7. Perfundir con 1 l de solución 1 para eliminar cualquier remaining sangre en la pieza de hígado.
  8. Cambiar el fluido de perfusión a la Solución 2 y perfundir durante 10 min.
  9. Cambie el líquido de perfusión a la Solución 3 y perfundir con 0,5 L.
  10. Cambiar el fluido de perfusión a la Solución 4, que contiene 0,1-0,15% de la colagenasa (Tabla 2).
  11. Para este paso, la perfusión debe llevarse a cabo de una manera de recirculación para 9-12 min o hasta que el hígado está lo suficientemente digerido; el tejido hepático debería aparecer a separarse ligeramente debajo de la cápsula de Glisson y sentir ablandado cuando se sondearon con el lado romo de un bisturí.

4. Aislamiento de los hepatocitos

  1. Apague la bomba peristáltica y extraiga las cánulas de la pieza de hígado.
  2. Colocar la pieza de hígado en un plato de cristalización que contiene 100-200 ml de solución 5.
  3. Retire la cápsula de Glisson con cuidado y suavidad sacudir las células. Si hay regiones que no están bien perfundidos, un bisturí se puede utilizar para cortar a travésestas regiones para liberar las células que contiene. Añadir más Solución 5 según sea necesario durante el proceso.
  4. Añadir más solución de 5 hasta que se alcanza un volumen final de 500 ml.
  5. Filtrar la suspensión celular dos veces; primero a través de una malla de 210 micras de nylon seguido de una malla de nylon 70 micras. A continuación, se vierte la suspensión celular en tubos de 200 ml de centrífuga.
  6. Centrifugar la suspensión celular a 72 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular suavemente suavemente en 200 ml de solución 5.
  7. Repita el paso número lavado 4.6 tres veces. En el paso de centrifugación final, volver a suspender las células en una solución de almacenamiento en frío (ver la lista de materiales). Las células deben ser aproximadamente de 2-5 million hepatocitos por mililitro para la evaluación del rendimiento y la viabilidad mediante un ensayo de azul tripán exclusión basada en hemocitómetro.
  8. Para llevar a cabo un ensayo de exclusión con azul de tripano, añadir 0,1 ml de células diluidas adecuadamente (≈ 2-5 million / ml) a un tubo de microcentrífuga que contiene 0,5 ml de azul de tripano solutien (0,4% de azul de tripano disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) y 0,4 ml de PBS. Después de mezclar la suspensión de células a fondo, cargar un hemocitómetro con la suspensión y examinar bajo un microscopio a un aumento de 100X. Al examen microscópico, las células muertas se tiñen azul, mientras que las células vivas aparecen sin teñir. Contar el número de células vivas y totales en cada una de las 1 mm 2 cuadrículas marcadas en el hemocitómetro. Viabilidad (%), el rendimiento de las células vivas (millones de hepatocitos por la solución de almacenamiento en frío ml (CSS) o millones de hepatocitos por g de hígado) puede calcularse utilizando las fórmulas siguientes.

Ecuación 1
Nota: En este caso, el factor de dilución de azul de tripano es 10 y el factor de hemocitómetro es 10.000.

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Representative Results

Configuración de perfusión

El equipo necesario para la perfusión hepática debe establecerse de acuerdo con la figura 1.

Viabilidad y Rentabilidad de hepatocitos aislados de humanos

La viabilidad media de hepatocitos humanos aislados fue de 77 ± 10% y el rendimiento promedio de los hepatocitos fue de 13 ± 11 millones hepatocitos / g de hígado, con los valores expresados ​​como medias ± desviación estándar. El número de aislamientos de hepatocitos lleva a cabo para obtener los promedios fue de 648 aislamientos llevaron a cabo entre enero de 1999 diciembre de 2012.

Parámetros de perfusión Adecuado

Con el fin de llevar a cabo un lavado y la perfusión del hígado con éxito, el número de cánulas utilizado debe variar de acuerdo con el peso del hígado (Figura 2A). En general, 4-8 cánulas se debe utilizar para los hígados que van desde por debajo de 20 g a más de 80 g. Una velocidad adecuada de la perfusión, Que también depende del peso del hígado, se debe elegir para una perfusión éxito del hígado (Figuras 2B y C). Se ha encontrado que una velocidad media de perfusión de 44 ml / min cánula -1 es ideal a través de una gama de diferentes pesos del hígado y por lo tanto las velocidades de perfusión debe ajustarse de manera apropiada si se utilizan más cánulas. Si la perfusión se realiza correctamente, el hígado debe ser de color pálido y ligeramente rellenan.

Pureza de los hepatocitos

Por medio de inmunofluorescencia, se encontró que los hepatocitos aislados, que se tiñen positivamente para la albúmina, tenía una pureza de 94 ± 1% (N = 4 con 5 repeticiones cada uno) (Figuras 3A y B). Figura 3C es una imagen de contraste de fase representante que muestra las características morfológicas de los hepatocitos, tales como el tamaño de células grandes y de células de forma poligonal.


Figura 1. Configuración de perfusión. (A) la trampa de burbujas, (B) el pedazo de hígado con cánulas de irrigación curvo con punta de oliva insertadas en los vasos sanguíneos en un embudo Büchner, (C) de vidrio con camisa de condensador, (D) un baño de agua, (E), (aparato de oxigenación F) 95% O 2/5% CO 2 tanques de gas y (G) de la bomba peristáltica.

Figura 2
Figura 2. (A) el número de cánulas utilizado, (B) la tasa de perfusión (ml / min), o (C) la tasa de perfusión (ml / min. Un significativamente diferente de los 0-20 g condiciones, P <0,05. AB significativamente diferente de la de 20-40 g, 40-60 g y 60-80 g condiciones, P <0,05.

Figura 3
Figura 3. Imágenes de inmunofluorescencia de células aisladas positivas para (A) de albúmina (teñido en verde) y el control negativo correspondiente (B) (200X). Los núcleos se tiñen de azul usando DAPI. Imagen de contraste (C) Fase de células aisladas (100 aumentos).

Solución Constituyente Concentración final
Solución 1 El cloruro de sodio 154 mM
HEPES 20 mM
El cloruro de potasio 5,6 mM
Glucosa 5 mM
Carbonato ácido de sodio 25 mM
Solución 2 El cloruro de sodio 152,5 mM
HEPES 19,8 mM
El cloruro de potasio 5,5 mM
Glucosa 5,0 mM
Carbonato ácido de sodio 24,8 mM
EGTA 0,1 mM
Para preparar la solución 2, añadir 10 ml de 100 mM EGTA a 990 ml de solución 1. Solución 3 El cloruro de sodio 152,5 mM
HEPES 19,8 mM
El cloruro de potasio 5,5 mM
Glucosa 5,0 mM
Carbonato ácido de sodio 24,8 mM
El cloruro de calcio dihidrato 0,5 M
Para preparar la solución de 3, añadir 10 ml de 0,5 M de cloruro de calcio dihidrato en 990 ml de solución 1.
Solución 4 El cloruro de sodio 152,5 mM
HEPES 19,8 mM
El cloruro de potasio 5,5 mM
Glucosa 5,0 mM
Hidr sodioogen carbonato 24,8 mM
El cloruro de calcio dihidrato 0,5 M
La colagenasa Ver Tabla 2
Para preparar la solución de 4, agregue la cantidad apropiada de la colagenasa a la Solución 3.
Solución 5 El cloruro de sodio 120 mM
HEPES 10 mM
El cloruro de calcio dihidrato 0,9 mM
El cloruro de potasio 6,2 mM
Albúmina 0,1% W / V

Tabla 1. De perfusión y soluciones de aislamiento.

Tamaño de la pieza de hígado (g) Concentración de colagenasa(%) La actividad de colagenasa (U / ml)
<25 0.10 250
25 - 40 0.11 300
41-80 0.13 350
> 80 0.15 400

Tabla 2. Concentraciones de colagenasa (%) y actividades (U / ml) que se utilizan para diversos tamaños de piezas de hígado (g).

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Discussion

Este protocolo da como resultado el aislamiento de hepatocitos humanos con una alta viabilidad y pureza. Con el fin de alcanzar estos resultados, es importante comenzar con una pieza adecuada de hígado. El trozo de hígado debe tener la cápsula de Glisson intacta en todas las superficies excepto por 1 superficie de corte. Otro factor importante es el lote particular de colagenasa utilizado, como diferentes lotes pueden dar lugar a marcadas diferencias en viabilidades de los hepatocitos después de la digestión 11. Por lo tanto, diferentes lotes de colagenasa se deben probar y el lote que produce hepatocitos con la mejor viabilidad se deben obtener en grandes cantidades. Finalmente, un tiempo de digestión adecuado tiene que ser elegido basado en el rendimiento y la viabilidad de las células obtenidas. Por ejemplo, una alta viabilidad con bajo rendimiento podría indicar un tiempo de digestión insuficiente, y un alto rendimiento con baja viabilidad podría indicar que el tiempo de digestión es demasiado largo.

Este método se puede adaptar to aislar las células no parenquimatosas y hepatocitos de la misma pieza de hígado. Una forma de hacer esto es utilizar el sobrenadante de la primera etapa de centrifugación (paso 4.6) directamente para el aislamiento de células no parénquima 12. Una segunda manera es eliminar la alícuota requerida de suspensión de células después de la filtración a través de la malla de nylon para el aislamiento de hepatocitos (paso 4.5) y someter a la suspensión celular restante a un paso adicional antes de la digestión de pronasa de aislamiento de células no parenquimatosas con el fin de aumentar el rendimiento de las células no parenquimatosas 13. Para un mayor rendimiento de las células no parenquimatosas, a expensas de los hepatocitos, este método puede ser modificado mediante la sustitución de la colagenasa sola (paso 3,10) para pronasa y colagenasa y el uso de la suspensión de células resultante para el aislamiento de células no parénquima 14.

Además de aislar los hepatocitos humanos, este método presentado también se puede adaptar para aislar los hepatocitos a partir de piezas de hígado recogidas lado a otrom otras especies con tamaños comparables o tamaños vasculatura comparables. Esto puede ser importante para los investigadores que utilizan modelos alternativos, como porcinos, caninos o modelos de primates.

Los aislamientos de hepatocitos humanos se hacen generalmente usando hígados de dos fuentes: hígados enteros consideran no aptos para el trasplante de hígado o tejido morfológicamente normal a partir de los márgenes de resección. La ventaja de esta última fuente utilizada en este método es que las piezas de hígado se ponen a disposición al laboratorio antes. Inmediatamente después de la resección, el hígado resecados se lleva a un patólogo que elimina lo que se requiere para el diagnóstico. El patólogo luego retire una pieza adecuada de hígado morfológicamente normales para el aislamiento de hepatocitos a partir de lo que está previsto para el descarte. En general, un trozo de hígado llega al laboratorio listo para perfusión en un tiempo promedio de 56 ± 29 min (N = 103). En comparación, hígados enteros que no son adecuados para el trasplante sólo serán relaliviado al laboratorio entre 13 ± 2 horas y 16 ± 12 h 15. Además, debido a las consideraciones éticas y la escasez de hígados de donantes, el aislamiento de hepatocitos de hígados enteros que no cumplen todos los criterios para el trasplante se evita en la región Eurotransplant. Esto es porque estos hígados todavía se podrían utilizar para el trasplante de donantes con criterios extendidos. Algunos estudios han demostrado que la maximización de acceso de los pacientes a los resultados de trasplante en la disminución de la mortalidad en lista de espera y los resultados satisfactorios a los destinatarios seleccionados 16,17. Otra ventaja es que las células obtenidas a partir de piezas de resección del hígado son aislados a partir de hígado morfológicamente sanos, mientras que los hígados no aptos para el trasplante puede ser esteatósicos, fibrótica o cirrótico. Como tal, el método aquí resulta en un alto rendimiento de 13 ± 11 millones por gramo hepatocitos del hígado en comparación con los 0,7 ± 0,3 millones o 3 ± de 2 millones de hepatocitos por gramo de hígado obtenidos por Baccarani, y col. 15 usando hígados cirróticos o esteatósicos respectivamente. Sin embargo, las piezas de resección del hígado como resultado una producción total más baja de los hepatocitos como el tamaño de la pieza disponible es generalmente pequeño, con un rango de 2 a 250 g, y un promedio de 37 ± 29 g (n = 648).

En comparación con otros grupos, este protocolo evita el uso de los adhesivos de cianoacrilato. Alexandre, et al 18. Encontraron que el uso de cianoacrilato de etilo, un adhesivo de uso general para todo uso, para cubrir las superficies de corte del hígado, los resultados en un aumento del rendimiento de los hepatocitos de 3,5 ± 0,7 a 6,0 ± 1,6 millones de hepatocitos por gramo hígado con valores expresados ​​en media ± error estándar de la media. En comparación, este protocolo es capaz de lograr un rendimiento de 13,5 ± 0,4 millones hepatocitos por g de hígado (expresado en medias ± error estándar de la media) sin el uso de adhesivos de cianoacrilato. Mientras que los adhesivos de cianoacrilato se han utilizado para el cierre de heridas <sup> 19,20, adhesivos de cianoacrilato de grado médico como cianoacrilato de octilo y cianoacrilato de butilo pueden ser costosos en comparación con cianoacrilato de etilo. Sin embargo, los derivados de cadena más corta, tales como cianoacrilato de etilo se han encontrado para ser más histotóxica de los derivados de cadena más larga 21,22.

Este método es más simple y más eficiente en el tiempo debido a la utilización de cánulas de irrigación curvada con puntas de oliva. El uso de cánulas de un tamaño apropiado resultará en un ajuste apretado que mantiene la cánula en su lugar sin el uso de pegamento 18 o suturas 23. Las cánulas utilizadas tienen diámetros que van de 1-2 mm de diámetro con punta de tamaño 1,25 a 4,5 mm. Un surtido de diferentes tamaños de cánula debe estar disponible cuando un trozo de hígado es preparado para la canulación, de manera que la cánula de tamaño apropiado para un vaso sanguíneo en particular puede ser elegido como se muestra en el vídeo adjunto. Este método también utiliza más cánulas en general (figura2A) en comparación con otros estudios donde se utilizan 2 23 2-4 18 o cánulas. Esto puede ayudar a lograr una mejor perfusión a través del pedazo de hígado que conduce a una alta viabilidad y el rendimiento en un período de digestión más corto.

En conclusión, este protocolo aísla hepatocitos humanos, que son un importante modelo para el estudio del metabolismo celular, farmacocinética y toxicología de los xenobióticos, la regeneración del hígado y la investigación traslacional. Una encuesta anterior sobre 150 drogas que causan toxicidad en humanos demostró que la concordancia entre la toxicidad encontrada en estudios con animales y que la observada en la práctica clínica es del 70% 24. Por lo tanto, los hepatocitos humanos siguen siendo un modelo importante para la validación de la investigación realizada en modelos animales y para las pruebas de drogas conduce a reacciones adversas antes de ir a los ensayos clínicos. Además, el uso de hepatocitos humanos aislados a partir de muestras de hígado remanente o hepatocitos aislados de animales de matadero 25 como un modelo esen línea con el marco ético 3R 26 para reemplazar el uso de animales cuando sea posible investigación.

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Disclosures

La optimización de este protocolo fue parcialmente financiado por una subvención del Hepacult GmbH. Dr. Wolfgang Thasler es uno de los fundadores de Hepacult GmbH y sigue siendo uno de los miembros de la junta directiva de esta empresa. El empleo de Maresa Demmel es parcialmente por Hepacult. Maria Hauner es empleado por Hepacult GmbH. Hepacult es un spin-off de la firma biotecnológica de la Universidad, que ofrece los hepatocitos humanos con el consentimiento y el libre acceso con fines de investigación.

Acknowledgments

Este trabajo ha sido posible gracias a la Fundación de tejidos y células humanas de Investigación, lo que hace que los tejidos humanos disponibles para la investigación. Se recibió apoyo financiero para este trabajo por parte del Ministerio Federal de Educación e Investigación (nombre subvención: Virtual Network hígado, el número de concesión: 0.315.759) y Hepacult GmbH. También damos las gracias a los asistentes técnicos del Banco de tejidos Großhadern hospital para la recogida de las muestras de hígado y los asistentes técnicos del Fondo para el Core aislamiento de células para llevar a cabo la perfusión del hígado y el aislamiento de hepatocitos. En particular, nos gustaría dar las gracias a Natalja Löwen para demostrar este procedimiento en el video. Por último, nos gustaría dar las gracias a Natalja Löwen y Edeltraud Hanesch para la creación de las ilustraciones de la figura 1 y las figuras en el resumen esquemático del video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bubble trap Gaßner Glastechnik  
Glass jacketed condenser Gaßner Glastechnik  
41 °C Water bath Julabo 35723-H24/EG  
37 °C Water bath GFL 1083  
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) Linde  
Gas permeable tubing Neolab 2-4440  
Peristaltic pump Ismatec IP65  
Scalpel Feather 320010  
Forceps Omnilab 5171014  
Conical flasks 1 L Schott Duran 2121654  
Conical flasks 5 L Schott Duran 2121673  
Beakers Schott Duran 2110654  
200 ml centrifuge tubes Becton Dickinson 352075  
Crystallizing dish Omnilab 5144063  
Curved irrigation cannulae with ball tips Ernst Kratz GmbH 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL  
Micro vascular clamps Ernst Kratz GmbH  
Büchner funnel Carl Roth HT38.1  
Nylon mesh 210 μm Neolab 4-1413  
Nylon mesh 70 μm Neolab 4-1419  
0.22 μm sterile filters Peske 99505  
500 ml bottles Schott Duran 2180144  
1 L bottles Schott Duran 2180154  
Hemocytometer Peske 06-0001  
1.5 ml tubes Eppendorf 0030 120,086  
50 ml conical tubes BD Biosciences 352070  
Ice bucket Neolab 1508454  
Sterile Pasteur pipettes Brand 747715  
Motorised pipette filler (Pipette boy acu) Integra 155017  
Refridgerated centrifuge Eppendorf 5810R  
Laminar flow Kendro Hera safe-KS9  
Aspirator (Low-flow surgical suction pump) Atmos C361  
Laboratory Gas Burner Integra Fire Boy eco  
Disposable laboratory coat Paperlynen GmbH MD0202414  
Surgical mask with visor Kimberly-Clark 48247  
Surgical hood Barrier 42072  
Latex gloves Semper Care CE0321  
Collagenase (Batch number NB 4G) Serva 17465  
Calcium chloride dihydrate Merck 2382  
EGTA Sigma E4378  
Sodium chloride Roth 9265.2  
Hepes Roth 9105.3  
Potassium chloride Serva 26868  
Albumin Biomol 01400-2  
Glucose Serva 22700  
Sodium hydrogen carbonate Serva 30180  
0.4% Trypan blue solution Lonza 17-942E  
Cold storage solution Hepacult GmbH  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Medicina Número 79 Biología Celular Ingeniería Biomédica Anatomía Fisiología Cirugía Ciencias de la Vida (General) el aislamiento de hepatocitos humanos de hepatocitos humanos la colagenasa la perfusión la perfusión con colagenasa hepatocitos el hígado humano la célula el aislamiento las aplicaciones clínicas técnicas clínicas

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The changes listed below have been made to Table 1.

1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:

EGTA  0.1mM

to:

EGTA  1mM

2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:

Calcium chloride dihydrate  0.5µM

to:

Calcium chloride dihydrate  5mM
El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos
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Lee, S. M. L., Schelcher, C.,… More

Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J. Vis. Exp. (79), e50615, doi:10.3791/50615 (2013).

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