Summary
Несмотря на то, периферической нервной системы (ПНС) способна значительным ремонт после травмы, мало известно о клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют этим явлением. Использование живых трансгенных данио и воспроизводимые анализа перерезки нерва, мы можем изучать поведение динамических глиальных клеток во время дегенерации и регенерации нервов.
Abstract
Нервная система часто описывается как проводных компонентов тела, хотя это значительно жидкости системы органов, которая реагирует на внешние раздражители, в последовательном, стереотипно, сохраняя невероятную гибкость и пластичность. В отличие от центральной нервной системы (ЦНС), периферической нервной системы (ПНС) способна значительным ремонта, но мы только начали понимать, клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют этим явлением. Использование данио в качестве модельной системы, у нас есть беспрецедентная возможность пару регенеративной исследования с прижизненного изображения и генетических манипуляций. Периферических нервов состоят из аксонов, окруженные слоями глии и соединительной ткани. Аксоны ensheathed по миелинизирующих или не миелинизирующих Шванн клетки, которые в свою очередь завернуты в пучок по сотовому оболочка называется периневрии. После травмы, взрослые периферических нервов имеют замечательную способность Ремове повреждены аксональное мусора и повторного Озарение целей. Для исследования роли всех периферийных глии в регенерации ПНС, мы опишем здесь анализа перерезки аксона, который использует коммерчески доступного азота накачкой лазером на красителе для axotomize двигательных нервов в живых трансгенных данио. Мы также описать методы, чтобы соединить эти эксперименты, чтобы покадровой съемки потерпевшего и контроля нервы. Эта экспериментальная парадигма может быть использована не только для оценки той роли, которую играют в глии регенерации нервов, но также может быть платформой для выяснения молекулярных механизмов, которые регулируют нервные системы ремонта.
Introduction
Данио рерио широко используются для изучения развития нервной системы, потому что их оптических прозрачность и легкость трансгенеза, что в сочетании, позволяют захватывающий визуализации динамических характеристик ячейки в живом эмбриона. Кроме того, поскольку данио рерио и млекопитающих делать почти все гены, необходимые для формирования нервной системы, клеточные и молекулярные информация, собранная в этой модели организм непосредственно Relatable других видов позвоночных. Несмотря на невероятно мощный для нейронных исследований развития, данио а его уникальные свойства имеют потенциал, чтобы также лучше понять механизмы, которые поддерживают и восстановлению нервной системы после травмы. Данио личинки сохраняют свою прозрачность в конце личиночной стадии и пигментация может быть эффективно блокируют или использование фармакологических ингибиторов производства меланина или генетических мутантов, которые не имеют пигментных клеток. Таким образом, используя эту модель организма для изучения травм и Regeneratиона в старых животных можно и предлагает уникальную возможность непосредственно исследовать клеточные и молекулярные механизмы, которые восстановлению нервной системы. В этой рукописи, мы опишем, как эффективно и воспроизводимо повредить нервы в ПНС личинки данио. Это повреждение парадигма поддается изучению не только дегенерации, но и ответов периферической глии и иммунных клеток, а также взаимодействие между этими группами населения в процессе регенерации.
ПНС представляет собой сложную сеть моторных и сенсорных нервов, которые необходимо передавать информацию между центральной нервной системы (ЦНС) и кожи, органов и мышцы тела, что позволяет организму взаимодействовать с окружающей средой и выжить. Вдоль этих нервов, периферических глии, в том числе миелинизирующих и не миелинизирующих шванновских клеток и периневральной глии, а также соединительную ткань, упаковывают аксонов и в конечном счете образуют зрелый нерва. Повреждение этих нервов инициирует процесс KNown как Wallerian дегенерации 10. Этот механизм аксонов фрагментации, иммунные набора, оформления и мусора регенерации очень стереотипно и генетически регулируется 1. Предыдущие исследования в системах млекопитающих описали роль шванновских клеток в процессе дегенерации нерва и 1 регенерации, 2, 6, 8. В этих исследованиях основных тканей или клеточных культур, Шванн клетки не только работу макрофагов в месте повреждения, чтобы помочь в зазор мусора, но и помогают в себя фагоцитоза миелина. Хотя эти исследования были невероятно информативным, мы никогда раньше не визуализированы глиальных ответов на повреждение периферического аксона в естественных условиях в реальном времени, и никакие другие исследования не исследовали взаимосвязь между различными классами периферической глии во время этих событий.
В последнее время несколько лабораторий исследовали Wallerian дегенерации использованием данио и лазерно-опосредованной травмы аксона подобно тому, что мы описываем здесь
Чтобы сделать это, мы секут двигательных нервов в 6 и 7 день после оплодотворения (DPF), личинок и визуализировать ответов отдельных глиальных населения, а также исследовать взаимодействие между этими группами населения по поврежденных аксонов. Использование двойных и тройных траnsgenic линий, которые этикетке периферийных глии, в том числе Шванн клетки и периневральной глии, а также в качестве маркера для аксонов, мы используем имеющиеся в продаже системы лазерной абляции состоящей из атома азота накачкой лазером на красителе (длина волны 435 нм), прикрепленный к вращающемуся диску конфокальной системы создать transections аксона. Это экспериментальная установка позволяет визуализировать живые, личиночной данио, ранить конкретных периферийными Мотор аксонов путей и покадровой изображения ответов различных групп населения к глиальных травмы аксонов и их связь друг с другом. Этот протокол может быть дополнительно адаптирована для создания повреждений нерва у рыбок данио разных возрастов, с разными трансгенных линий или генетических мутантов для решения различных научных вопросов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка и монтаж Эмбрионы рыбок данио для абляции и живых изображений
- Готовят на 0,8% с низкой температурой плавления агарозы в воде яйцо. Алиготе в 13Х 100 мм одноразовые пробирки культуры и хранят при температуре 4 ° С до использования.
- Крест взрослых данио стабильно интегрированный содержащие трансгены флуоресцентной маркировать моторных нейронов и глиальных типов клеток, представляющих интерес. Сбор эмбрионов данио рерио в воде яйцо и место в 28,5 ° C инкубатор для правильной постановки позже 3.
- Примерно в 24 часа после оплодотворения (HPF), снимите яйца водой и добавить 0,002% 1-фенил 2-тиомочевины (ПТУ) в яйце воду. Вернуться эмбрионов в инкубаторе.
- Между 24 и 96 часов после оплодотворения, эмбрионы должны быть обследованы на наличие трансгенов на желаемый люминесцентные рассекает сферу. Местом эмбрионов в пресной воде яйцо ПТУ и вернуться в инкубаторе.
- Когда личинки достигли 6 дней после оплодотворения (DPF) (или желаемый возраст), удалите их из инкубатора, Выбрать несколько личинок для монтажа, и передавать их на меньшие блюдо.
- Удалить воду из чашки и сразу же заменить около 0,02% Tricane в воде яйцо ПТУ. Разрешить личинки сидеть в анестетик около 5 мин.
- Наведите аликвоты 0,8% с низкой температурой плавления агарозы в стакан с водопроводной водой и микроволновой печи в течение 30 секунд, или пока агарозном не расплавится. Дайте стакан, чтобы охладить до агарозы в пробирку не чувствует теплой на ощупь (не горячей).
- Выберите наркозом личинки и передать его на одной или нескольких скважин 35 мм блюдо со стеклянным дном. Удаления воды, которая была переведена с личинкой, то сразу охватывают личинка с достаточно теплой агарозном наполнить стакан дном часть блюда, но не создают большой купол.
- Как агарозном затвердевает, используйте рассекает иглы в положение личинки на боку на дне чашки, а затем наклонить личинка чуть на спине. Крайне важно, чтобы травмы и последующих изображений, которыеустановлены личинка касаться стекла на дне чашки. Используйте препаровальная игла для поддержания личинки в этом положении, пока агарозном затвердевает и личинка обездвижен.
- После агарозном полностью затвердеет, медленно пипетки достаточно воды Tricane (это может быть то же Tricane используемые для анестезии) в блюдо, чтобы полностью покрыть агарозы и личинки.
2. Лазерная калибровка и тестирование
- Включите все приборы конфокальной микроскопии, соответствующих диодных лазеров для возбуждения трансгенов данио и азота накачкой лазером на красителе. Убедитесь, что "пустые" светоделителе на месте, лазерные аттенюатора полностью открыт, и 435 нм Кумарин красителем клетки на месте. На компьютере откройте обработки изображений.
- Перемещение 63x 1.2NA цель погружения в воду в нужное положение и нанесите небольшое каплю иммерсионного среды для систем водоснабжения цели на цель. 63x цели позволит хорошей точностью лазерной абляции, и вода, которую яmmersion обеспечивает большее рабочее расстояние, которое необходимо для работы с 6-7 личинки данио денье.
- Получение стекло с одной стороны зеркального использовать для калибровки лазера. Поместите слайд, зеркало стороной вниз, на столик микроскопа.
- С помощью окуляра при освещении светлое, найти и сосредоточиться на царапину или травление в зеркале. Свет светлого будет светить вниз на стекло, но только пройти к цели в местах, где зеркало была поцарапана или вытравливаютс, вследствие чего зеркало выглядят черными через окуляр, и офорты, чтобы выглядеть как пятна или линии света.
- Зрения и фокус офортов на экране компьютера с использованием программы. Открыть окно, которое управляет калибровки лазера и настройки мощности. Установить количество импульсов на "1" и затухание пластины на "3"% передачи. Число импульсов представляет число раз лазер будет срабатывать в каждой области, представляющей интерес (ROI) и% пропускания представляет мощности лазера. Будьте уверены, что правильная настройка калибровки выбран для 63x 1.2NA цель погружения в воду.
- Выберите Ellipse Tool на главной панели инструментов и нажмите на изображение на экране компьютера для создания единого кругового ROI. Сделайте это еще 3 раза, пока есть 4 круговых трансформирования расположенных случайным курсор на изображение.
- Некоторые системы могут включать в себя функции безопасности, которые не позволят лазерных уволить, если свет путь к окуляров открыт. В этом случае вручную закрыть оптический путь окуляра в это время.
- Пожарная лазера. Это создаст 4 малых офорты месте, 1 в каждой круговой ROI. Если лазер не срабатывает, убедитесь в том, что лазер включен и подключен должным образом, и что свет, путь к окуляров закрыт. Если лазер пожары, но не видел травления, убедитесь в том, "пустой" светоделителе на месте. Если все в порядке, не увеличить мощность лазера и "FRAP", пока офорты ARэлектронной видно. Если настройка мощности лазера больше 10 необходимо для травления стекла, это может указывать на лазерной плазмы картридж должен быть заменен.
- Если травления пятна появляются по центру в пределах выбранной области трансформирования, никакая калибровка не требуется (Перейдите к 2.12). Если пятна не в центре экрана, настройка калибровки должна быть обновлена.
- Для калибровки, нажмите кнопку обновления калибровки настройки. Лазер будет огнем и изображение появится, содержащие один травления точки. Если точка не появляется, отмены калибровки, увеличить мощность лазера, и начать калибровку снова.
- Щелкните в центре пятна. Лазер будет стрелять снова, и другая точка появится. Нажмите на эту точку, и повторить этот процесс, пока калибровка не является полным и 9 пятна появляются в сетке моды. Повторите шаги 2.6-2.9 проверить, что калибровка прошла успешно.
- Снимите стекло от столик микроскопа и чистой цели. Открытый оптический путь OCUЛарс, и заменить "пробел" светоделителе с "100% заболела" светоделителе.
3. Пересечения нерва с помощью лазерной абляции и покадровой конфокальной микроскопии глиальных клеточных поведений
- Снимите этапе используется для хранения предметного стекла и заменить на этапе подходит для проведения 35 мм со стеклянным дном блюда. Продолжайте использовать 63x 1.2NA цель погружения в воду.
- Нанесите небольшое падение водной среды погружения к цели, и поместите блюдо с установленными личинки на сцене. Стабилизировать блюдо с клипами.
- Используя широкоугольный окуляр и освещения, сосредоточиться личинки и найдите двигательных нервов. Сканирование нервы в hemisegments 10-20 и выбрать двигатель для перерезки нерва.
- Вызовите живой вид на нерв на экране компьютера с использованием программы. Выберите Z-самолеты и получить изображение из аксонов и глиальных клетках неповрежденного нерва.
- Подготовьте покадровой настройки изображения в изображения программное обеспечение для захватаZ-проекции всех типов клеток в 5-30 минутные интервалы, в зависимости от эксперимента. Лучше всего, чтобы создать все необходимые настройки для покадровой перед выполнением абляции, так что нет никакой задержки в запуске покадровой После травмы завершена.
- Удалить "100% заболела" светоделителе и заменить "пробел". Закрыть свет путь к окуляров.
- Вернуться на живой вид на нерв. Используйте соответствующий флуоресцентный канал для просмотра аксонов, которые будут перерезаны.
- Используя Ellipse Tool, создайте тонкие эллиптической ROI в области, которая будет удалена, а затем создать меньшие трансформирования в выбранном регионе.
- В окне, которое управляет лазерным настройки, установить количество импульсов на "2" и затухание пластины "18"% передачи. Пожарная лазерных пределах выбранной области трансформирования. Если флуоресценции остается в трансформирования, увеличить мощность лазера, подождите примерно 10 секунд, и огонь лазерных снова. Сделайте это, пока вы не достигнете установку, которая вызывает fluorescenCE, чтобы исчезнуть в течение трансформирования.
- Подождите 10 или более секунд и проверьте удаленной области снова для флуоресценции. Помните, что ROI может сначала удалена, если она действительно photobleached. Если флуоресценции возвращается, увеличить мощность лазера и стрелять лазерным снова. Повторите это, пока цветения не исчезает в течение трансформирования и не возвращается в течение 10 секунд. Лучше всего начать с меньшей мощности лазера и увеличить до необходимой мощности. Необходимая мощность лазера может меняться в зависимости от индивидуальных систем микроскопии, возраста Кумарин краситель, образец монтажа, возраста личинок, и толщины ткани. После идеальной мощности лазера была установлена, для этого параметра питания может быть использован и при следующих нервов в том же эксперименте.
- После удаления завершен, начинается в заданный промежуток времени.
- При покадровой завершена, использовать программы для сбора данных и создания цветных композитных Z-прогнозы на каждый момент времени. Создать фильм QuickTime для анализа поведенияаксонов и глиальных клеток одновременно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализа, описанного здесь, могут быть использованы для оценки реакции глиальных клеток и других нервов связанных клеточных популяций на аксонального повреждения в естественных условиях. Фильм 1 показан пример повреждения нерва созданный с помощью этого метода и реакции окружающих глиальных клеток. Этот эксперимент был выполнен в Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) данио, в котором периневральной глии выразить мембраны целевых EGFP и моторных нейронов экспресс цитозольные DsRed. Травма была сделана по ростральные проекции двигательных нервов в стволе 6 DPF живых рыбок данио и нервов было впоследствии покадровой отображается в обоих EGFP и DsRed каналов. Это позволило одновременной визуализации аксонов и глиальных клеточных поведений сразу после травмы.
На рисунке 1 показаны неподвижные изображения статических временных точках взяты из фильма 1. Пунктирная эллипс показывает ROI, которая была удалена использованием лазера. Одна минутасообщение перерезки (МЦЛ), абляцированную область хватало флуоресценция и травмы зону размером примерно 3,5 мкм от проксимального к дистальной культи. Успех рассечения может быть подтверждена путем визуализации дистальной культи нерва и искали признаки Wallerian дегенерации, в том числе дистальной фрагментации аксонов и быструю очистку. Отсутствие флуоресценции аксонов вдоль дистальной культи на рисунке 1 при 120 MPT указывает Эти аксоны действительно претерпела Wallerian дегенерации и рассечение было успешным.
Регулировка мощности лазера в идеальном месте имеет решающее значение при выполнении эксперимента лазерной абляции. Идеально настройки мощности лазера будет чисто удалять нерв только в пределах выбранной ROI, и мощность лазера параметры, которые являются либо слишком низкий или слишком высокий дадут оптимальным результатам. Рисунке 2а травмы, которая была выполнена с помощью лазера силой, которая была слишком низкой. Флуоресценции оставались в пределах ROI после выстрела лазерный, В результате неполного рассечения. На фиг.2b показывает повреждение, которое проводили с помощью лазерной мощности, которая была слишком высокой, что приводит к чрезвычайно большим абляции.
Фильм 1. Motor перерезки нерва и конфокальной покадровой съемки из периневральной глиальных поведение клетки. Фильм показывает нервного ствола двигателя до травмы, после чего изображение, снятое т.пл. 1, и изображения каждые 10 мин в течение в общей сложности 190 мин. Травма была проведена в прямом эфире 6 DPF Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed). Личинки данио с установленными впереди слева и спинной к началу Щелкните здесь для просмотра фильма .
Рисунок 1. Мотор перерезки нерва и неподвижных изображенийглиальных поведение клетки. Панели для снимков, сделанных из фильма 1. Пунктирная эллиптическую область представляет ROI, которая была удалена, создавая рассечения травмы обозначены пунктирной линией. Стрелки указывают на аксонального флуоресценции, которое присутствует на т.пл. 10, но не на т.пл. 120, что указывает на дистальных аксонов вырожденным. Шкала бар, 10 мкм.
Рисунок 2. Субоптимальное настройки мощности лазера приводит к нежелательным результатам. (А) попытка абляции проводится с мощностью лазера, что является слишком низким. Пунктирная эллипс обозначает выбранный ROI. 1 MPT область была немного photobleached, а не перерезанным (стрелка). (Б) абляции проводится с мощностью лазера, который слишком высок. Пунктирная эллипса обозначается выбранная ROI. 1 MPTабляцированную область значительно больше, чем выбранный ROI (пунктирная линия). Все изображения взяты из живых 6 DPF Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) личинки данио с передним влево и спинной к вершине. Шкала бар, 10 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важных шагов этого эксперимента являются: 1) правильно монтажа личинки за травмы и последующей визуализации in vivo и 2) калибровка лазера и выборе правильных параметров питания для того, чтобы создать чистую перерезки нерва, что приводит к минимальным экстра-повреждение тканей . Чтобы обеспечить успешную аксотомии для прижизненного изображения и последующего анализа, смонтировать несколько личинок либо отдельные блюда со стеклянным дном или в блюдо со стеклянным дном с перегородками. После калибровки лазерных, мы рекомендуем тестирования различных параметров питания на испытательном личинки определить оптимальные параметры для пересечения нерва. Эти параметры, как правило, довольно последовательно между экспериментами, но может измениться, если: 1) личинки не установлены должным образом, 2) личинки разных возрастов используются, 3) лазер откалиброван неправильно, 4) лазерный нуждается в обслуживании или 5) Если нервы находятся в очень разных передне-заднюю позицию, которая может привести кна разницу в толщине ткани. Оптимальный рассечения нерва создаст повреждение вдоль нерва, который находится между 2 и 5 мкм и не мешает соседних тканей.
При анализе реакция любого типа клеток нервной системы травмы, мы предлагаем проведение по крайней мере, 2 типа элементов управления. Первый заключается в выборе области, чтобы ранить, который непосредственно рядом с нервом интерес, но не прикасаться к нервной ткани. Это позволит вам определить, если клеточных ответов вы видите, из-за повреждения в целом, или к травме аксонов. Второй элемент управления является изображение неповрежденной нерва в ту же самую рыбу, которую вы создали травмы. Этот тип управления исключает личинки личинки изменчивости в связи с постановкой и визуализации параметров, в том числе конфокальной время экспозиции для работы с изображениями и т.д.
В этом протоколе мы также описать сценарии, которые создают травмы, которые слишком малы или слишком велики для нашего конкретного исследования. DepenДин на экспериментальных вопрос, эти типы травмы могут быть использованы для анализа. Основные ограничения для такого рода процедуры были бы доступны для целей создания травмы и последующей покадровой съемки. Чем старше личинка вы используете, тем больше рабочего расстояния цели требуется.
Протокол мы описываем здесь позволяет пользователю создать координационный transections нерва вдоль глубоких нервов у взрослых личинок. Мы пару эту технологию, чтобы в естественных условиях, покадровой съемки и использовать имеющиеся в продаже системы лазерной абляции, что воспроизводимое создает координационный травм аксона. Эта технология может быть изменена, чтобы использовать различные трансгенных линий или мутантные личинки для проверки различных гипотез о механизмах, которые восстановлению нервной системы после травмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Лаборатории Kucenas за ценные обсуждения и кворум Technologies, Inc для превосходной технической поддержкой. Работа выполнена при поддержке Фонда UVA, за выдающиеся достижения в науке и технике (FEST) (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G | |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G | |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 | |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 | |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS | |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
References
- Geuna, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).
- Hirata, K., Kawabuchi, M. Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration. Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137, 3985-3994 (2010).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143, 145-155 (2010).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).
- Stoll, G., Muller, H. W. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).
- Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Development. 7, 19 (2012).
- Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres. Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).
