Summary
परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) चोट के बाद महत्वपूर्ण मरम्मत करने में सक्षम है, थोड़ा इस घटना है कि सरकार सेलुलर और आणविक तंत्र के बारे में जाना जाता है. जीना, ट्रांसजेनिक zebrafish और एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तंत्रिका transection परख का उपयोग करना, हम तंत्रिका अध: पतन और उत्थान के दौरान गतिशील glial सेल व्यवहार का अध्ययन कर सकते हैं.
Abstract
अविश्वसनीय लचीलापन और plasticity को बनाए रखते हुए यह एक सुसंगत, टकसाली ढंग से बाहरी उत्तेजनाओं के प्रति प्रतिक्रिया करता है कि एक काफी तरल पदार्थ अंग प्रणाली है कि भले ही तंत्रिका तंत्र को अक्सर शरीर की एक हार्ड तार घटक के रूप में वर्णित है. केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विपरीत (सीएनएस), परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) महत्वपूर्ण मरम्मत करने में सक्षम है, लेकिन हम सिर्फ इस घटना है कि सरकार सेलुलर और आणविक तंत्र को समझने के लिए शुरू कर दिया है. एक मॉडल प्रणाली के रूप में zebrafish का प्रयोग, हम vivo इमेजिंग और आनुवंशिक हेरफेर में साथ जोड़ी पुनर्जन्म का अध्ययन करने के लिए अभूतपूर्व अवसर है. परिधीय नसों glia और संयोजी ऊतक की परतों से घिरा एक्सोन से बना रहे हैं. Axons perineurium नामक एक सेलुलर म्यान से एक गुच्छा में लिपटे बारी में हैं जो श्वान कोशिकाओं, myelinating या गैर myelinating द्वारा ensheathed रहे हैं. एक चोट के बाद, वयस्क परिधीय नसों रेमो को उल्लेखनीय क्षमता हैve के axonal मलबे और फिर से अंदर आना लक्ष्य क्षतिग्रस्त. पीएन उत्थान में सभी परिधीय glia की भूमिका की जांच करने के लिए, हम यहाँ रहते ट्रांसजेनिक zebrafish में मोटर तंत्रिकाओं axotomize को एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नाइट्रोजन पंप डाई लेजर का उपयोग करता है कि एक अक्षतंतु transection परख का वर्णन है. हम आगे घायल और नियंत्रण नसों के समय चूक इमेजिंग के लिए इन प्रयोगों के जोड़े के लिए विधियों का वर्णन. इस प्रयोगात्मक प्रतिमान केवल glia तंत्रिका उत्थान में खेलते हैं, लेकिन यह भी तंत्रिका तंत्र की मरम्मत कि सरकार आणविक तंत्र elucidating के लिए मंच हो सकता है कि भूमिका का आकलन नहीं किया जा सकता है.
Introduction
Zebrafish क्योंकि उनके ऑप्टिकल transparence के तंत्रिका तंत्र के विकास का अध्ययन करने और transgenesis में आसानी, जो युग्मित, जब एक जीवित भ्रूण में गतिशील सेल व्यवहार के शानदार इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. Zebrafish और स्तनधारियों लगभग सभी तंत्रिका तंत्र के गठन, इस मॉडल जीव में एकत्र सेलुलर और आणविक जानकारी के लिए आवश्यक जीन की साझा क्योंकि इसके अलावा, अन्य हड्डीवाला प्रजातियों के लिए सीधे सम्बद्ध है. तंत्रिका विकास अध्ययन के लिए अविश्वसनीय रूप से शक्तिशाली है, zebrafish और अपनी अद्वितीय गुण भी चोट के बाद तंत्रिका तंत्र को बनाए रखने और पुनर्निर्माण कि तंत्र को स्पष्ट करने की क्षमता है. Zebrafish लार्वा देर लार्वा चरणों में अपने पारभासकता बनाए रखने और रंजकता प्रभावी ढंग से मेलेनिन उत्पादन या वर्णक कोशिकाओं की कमी है कि आनुवंशिक म्यूटेंट के औषधीय inhibitors का उपयोग के साथ या तो अवरुद्ध किया जा सकता है. इस प्रकार, इस मॉडल जीव का उपयोग कर चोट और regenerat अध्ययन करने के लिएबड़े जानवरों में आयन संभव है और सीधे तंत्रिका तंत्र के पुनर्निर्माण कि सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है. इस पांडुलिपि में, हम कुशलतापूर्वक और reproducibly zebrafish लार्वा की पीएन में तंत्रिकाओं को घायल करने का वर्णन कैसे. इस चोट प्रतिमान परिधीय glia और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं के साथ ही उत्थान के दौरान इन आबादियों के बीच बातचीत भी अध: पतन न केवल अध्ययन करने के लिए उधार देता है, लेकिन.
पीएन एक जीव अपने पर्यावरण के साथ बातचीत और जीवित रहने के लिए अनुमति देता है, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) और त्वचा, अंगों और शरीर की मांसपेशियों के बीच जानकारी पारित करने के लिए आवश्यक है कि मोटर और संवेदी तंत्रिकाओं की एक जटिल नेटवर्क है. इन नसों के साथ, myelinating और गैर myelinating श्वान कोशिकाओं और perineurial glia, साथ ही संयोजी ऊतक, एक्सोन डिब्बे में बंद है और अंत में परिपक्व तंत्रिका फार्म सहित परिधीय glia,. इन नसों की चोट एक प्रक्रिया कश्मीर आरंभ करता हैWallerian अध: पतन के रूप में 10 nown. Axonal विखंडन, प्रतिरक्षा भर्ती, मलबे निकासी और उत्थान का यह तंत्र बहुत टकसाली और आनुवंशिक रूप से 1 विनियमित है. स्तनधारी प्रणालियों में पिछले अध्ययनों तंत्रिका अध: पतन और उत्थान 1, 2, 6, 8 के दौरान श्वान कोशिकाओं की भूमिका का वर्णन किया है. निश्चित ऊतक या सेल संस्कृति के इन अध्ययनों में, श्वान कोशिकाओं को न केवल मलबे निकासी में सहायता करने के लिए चोट साइट से मैक्रोफेज की भर्ती की, लेकिन यह भी माइलिन phagocytosis अपने आप में सहायता प्राप्त. इन अध्ययनों अविश्वसनीय जानकारीपूर्ण किया गया है, हम वास्तविक समय में vivo में परिधीय अक्षतंतु चोट करने के लिए कल्पना glial प्रतिक्रियाओं से पहले कभी नहीं किया है, और कोई अन्य अध्ययनों से इन घटनाओं के दौरान परिधीय glia की विभिन्न वर्गों के बीच संबंध की जांच की है.
हाल ही में, कई प्रयोगशालाओं हम यहाँ क्या वर्णन के समान zebrafish और लेजर की मध्यस्थता अक्षतंतु चोट का उपयोग कर Wallerian अध: पतन की जांच की है
ऐसा करने के लिए, हम अच्छी तरह से घायल axons के साथ इन आबादियों के बीच बातचीत की जांच के रूप में 6 में मोटर तंत्रिकाओं और 7 दिन बाद निषेचन (DPF) लार्वा आड़ा काट और व्यक्तिगत glial आबादी की प्रतिक्रियाओं कल्पना. डबल और ट्रिपल टीआरए का प्रयोगउस श्वान कोशिकाओं और perineurial glia, साथ ही axons के लिए एक मार्कर सहित लेबल परिधीय glia, nsgenic लाइनों, हम से मिलकर एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेजर पृथक प्रणाली का उपयोग एक नाइट्रोजन पंप एक कताई डिस्क confocal प्रणाली से जुड़ी डाई लेजर (तरंग दैर्ध्य 435 एनएम) अक्षतंतु लेनदेन बनाने के लिए. इस प्रयोगात्मक सेट अप हमें एक दूसरे से अक्षतंतु चोट और उनके रिश्ते के लिए विशिष्ट परिधीय मोटर अक्षतंतु इलाकों और समय चूक छवि अलग glial आबादी की प्रतिक्रियाओं को चोट पहुंचाना, जीना, लार्वा zebrafish कल्पना करने के लिए अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल के आगे विभिन्न वैज्ञानिक सवालों का पता करने के लिए विभिन्न ट्रांसजेनिक लाइनों या आनुवंशिक म्यूटेंट के साथ, अलग अलग उम्र के zebrafish में तंत्रिका चोट बनाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
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Protocol
1. पृथक और लाइव इमेजिंग के लिए तैयार करना और Zebrafish भ्रूण के बढ़ते
- अंडा पानी में 0.8% कम पिघल agarose के एक शेयर को तैयार है. जरूरत डिग्री सेल्सियस तक 4 में 13X 100 मिमी डिस्पोजेबल संस्कृति ट्यूब और दुकान में विभाज्य.
- Fluorescently मोटर न्यूरॉन्स और ब्याज की glial सेल प्रकार लेबल करने स्थिरतापूर्वक एकीकृत transgenes युक्त क्रॉस वयस्क zebrafish. सही मंचन के लिए डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर बाद 3 28.5 में अंडे का पानी और जगह में zebrafish भ्रूण लीजिए.
- लगभग 24 घंटे बाद निषेचन (HPF) पर, अंडा पानी निकालने और अंडे पानी में 1-फिनाइल 2 Thiourea (पी टी यू) 0.002% जोड़ें. इनक्यूबेटर भ्रूण लौटें.
- 24 और 96 HPF के बीच, भ्रूण एक फ्लोरोसेंट विदारक गुंजाइश पर वांछित transgenes की उपस्थिति के लिए जांच की जानी चाहिए. ताजा पी टी यू अंडा पानी में चयनित भ्रूण प्लेस और इनक्यूबेटर पर लौटने.
- लार्वा 6 दिनों के बाद निषेचन (DPF) (या वांछित उम्र) तक पहुँच चुके हैं, इनक्यूबेटर से हटा, बढ़ते के लिए कुछ लार्वा का चयन करें, और एक छोटे पकवान को हस्तांतरण.
- पकवान से पानी निकालें और तुरंत पी टी यू अंडा पानी में लगभग 0.02% Tricane के साथ बदलें. लार्वा लगभग 5 मिनट संवेदनाहारी में बैठने की अनुमति दें.
- 30 सेकंड के लिए पानी के नल और माइक्रोवेव के साथ एक बीकर में 0.8% कम पिघल agarose के एक विभाज्य, जगह या agarose पिघल रहा है जब तक. संस्कृति ट्यूब में agarose स्पर्श नहीं है (गर्म) को गुनगुने महसूस करता है जब तक बीकर शांत करने की अनुमति दें.
- एक anesthetized लार्वा का चयन करें और एक एकल या बहु अच्छी तरह से 35 मिमी गिलास नीचे डिश को हस्तांतरण. लार्वा के साथ स्थानांतरित किया गया था कि किसी भी पानी निकालें, तो तुरंत पकवान के गिलास तली हिस्से को भरने के लिए पर्याप्त गर्म agarose के साथ लार्वा को कवर किया है, लेकिन एक बड़ा गुंबद का निर्माण नहीं किया.
- Agarose मज़बूत बनाता है के रूप में, डिश के तल पर अपने पक्ष में लार्वा की स्थिति के लिए एक विदारक सुई का उपयोग करें, तो अपनी पीठ पर बस थोड़ा लार्वा झुकाव. यह चोट और बाद इमेजिंग के लिए जरूरी है किघुड़सवार लार्वा डिश के तल पर कांच छू हो. Agarose जम जाता है और लार्वा स्थिर है जब तक इस स्थिति में लार्वा बनाए रखने के लिए विदारक सुई का प्रयोग करें.
- Agarose पूरी तरह से कठोर हो जाने के बाद धीरे - धीरे पूरी तरह से agarose और लार्वा को कवर करने के लिए डिश में पर्याप्त Tricane पानी (इस संज्ञाहरण के लिए इस्तेमाल किया ही Tricane किया जा सकता है) विंदुक.
2. लेजर अंशांकन और परीक्षण
- सभी confocal खुर्दबीन इंस्ट्रूमेंटेशन, रोमांचक zebrafish transgenes के लिए उपयुक्त लेजर डायोड, और नाइट्रोजन पंप डाई लेजर पर मुड़ें. "खाली" बीम फाड़नेवाला जगह में है सुनिश्चित करें, लेजर attenuator पूरी तरह से खुला है, और 435 एनएम Coumarin डाई सेल जगह में है. कंप्यूटर पर, इमेजिंग सॉफ्टवेयर खुला.
- स्थिति में एक 63x 1.2NA पानी विसर्जन उद्देश्य ले जाएँ और उद्देश्य पर पानी उद्देश्यों के लिए विसर्जन के माध्यम की एक छोटी सी बूंद लागू होते हैं. एक 63x उद्देश्य अच्छा लेजर पृथक सटीकता, और पानी के लिए अनुमति देगा मैंmmersion 6-7 DPF zebrafish लार्वा के साथ काम करना आवश्यक है जो एक बड़ा काम दूरी, के लिए अनुमति देता है.
- लेजर की जांच के लिए उपयोग करने के लिए एक स्पष्ट रूप से देखने पक्ष के साथ एक गिलास स्लाइड प्राप्त करते हैं. खुर्दबीन मंच पर, स्लाइड, दर्पण नीचे की ओर रखें.
- Brightfield रोशनी के तहत ऐपिस का उपयोग नहीं कर पाते और आईने में एक खरोंच या खोदना पर ध्यान देते हैं. brightfield प्रकाश गिलास स्लाइड पर नीचे चमक रहा होगा, लेकिन केवल दर्पण खरोंच या दूर etched गया है स्थानों में जहां उद्देश्य से गुजरना होगा, ऐपिस के माध्यम से काला देखने के लिए दर्पण के कारण, और etchings के धब्बे की तरह लग रहे है या करने के लिए प्रकाश की तर्ज.
- इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कंप्यूटर स्क्रीन पर etchings देखें और ध्यान केंद्रित. लेजर अंशांकन और सत्ता सेटिंग्स को नियंत्रित करता है कि विंडो खोलें. "1" के लिए दालों की संख्या और "3"% संचरण के लिए क्षीणन थाली सेट. दालों की संख्या लेजर ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र (आरओ भीतर आग जाएगा बार की संख्या का प्रतिनिधित्व करता हैमैं) और% प्रसारण लेजर शक्ति का प्रतिनिधित्व करता है. सही अंशांकन सेटिंग 63x 1.2NA पानी विसर्जन उद्देश्य के लिए चयन किया जाता है सुनिश्चित करें.
- मुख्य उपकरण पट्टी से अंडाकार उपकरण का चयन करें, और एक परिपत्र रॉय बनाने के लिए कंप्यूटर स्क्रीन पर छवि क्लिक करें. छवि पर बेतरतीब ढंग से स्थान दिया गया है 4 परिपत्र ROIs कर रहे हैं जब तक यह 3 अधिक बार करो.
- कुछ प्रणालियों oculars के लिए प्रकाश रास्ता खुला है, तो लेजर आग की अनुमति नहीं होगी कि एक सुरक्षा सुविधा शामिल हो सकते हैं. यदि यह मामला है, मैन्युअल रूप से इस समय oculars के लिए प्रकाश पथ बंद करें.
- लेजर आग. यह एक परिपत्र रॉय के भीतर 4 छोटी सी जगह etchings, 1 पैदा करेगा. लेजर आग नहीं करता है, लेजर चालू है और ठीक से जुड़ा हुआ है, और oculars के लिए प्रकाश रास्ता बंद हो गया है कि है यह अवश्य जांच लें. लेजर आग लेकिन कोई नक़्क़ाशी देखा जाता है, "खाली" बीम फाड़नेवाला जगह में है यह अवश्य जांच लें. सब कुछ जगह में है, तो etchings गिरफ्तारी तक लेजर शक्ति और "कसना" वृद्धिदिखाई ई. 10 से अधिक स्थापित करने के लिए एक लेजर बिजली खोदना गिलास करने के लिए आवश्यक है, यह लेजर प्लाज्मा कारतूस जगह की जरूरत का संकेत हो सकता.
- Etched के धब्बे चयनित ROIs के भीतर केंद्रित दिखाई देते हैं, कोई अंशांकन (2.12 के लिए आगे बढ़ना) आवश्यक है. स्पॉट केंद्रित नहीं कर रहे हैं, अंशांकन सेटिंग को अपडेट करने की आवश्यकता है.
- जांच करने के लिए, अद्यतन अंशांकन सेटिंग क्लिक करें. लेजर आग जाएगा और एक छवि एक एकल etched के बिंदु युक्त दिखाई देगा. बिंदु दिखाई नहीं देता है,, अंशांकन रद्द लेजर शक्ति बढ़ाने के लिए, और फिर अंशांकन शुरू.
- घटनास्थल के केंद्र में क्लिक करें. लेजर फिर आग जाएगा, और एक अन्य बिंदु दिखाई देगा. उस बिंदु पर क्लिक करें और अंशांकन पूरा हो गया है और 9 स्पॉट एक ग्रिड फैशन में दिखाई देते हैं जब तक इस प्रक्रिया को दोहराएँ. अंशांकन सफल रहा था कि जांच करने के लिए कदम 2.6-2.9 दोहराएँ.
- खुर्दबीन मंच से गिलास स्लाइड निकालें और उद्देश्य साफ है. OCU को प्रकाश पथ खोलेंलार्स, और "100% बीमार" बीम फाड़नेवाला के साथ "रिक्त" बीम फाड़नेवाला जगह.
3. लेजर पृथक और Glial सेल व्यवहार के समय चूक confocal इमेजिंग का उपयोग तंत्रिका transection
- कांच स्लाइड पकड़ और 35 मिमी गिलास तली व्यंजन के आयोजन के लिए उपयुक्त मंच के साथ की जगह इस्तेमाल चरण निकालें. 63x 1.2NA पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करने के लिए आगे बढ़ें.
- उद्देश्य के लिए पानी विसर्जन माध्यम की एक छोटी सी बूंद लागू करें, और मंच पर घुड़सवार लार्वा के साथ पकवान जगह है. क्लिप के साथ पकवान स्थिर.
- ऐपिस और widefield रोशनी का उपयोग करना, लार्वा ध्यान केंद्रित करने और मोटर तंत्रिकाओं खोजें. Hemisegments 10-20 में नसों स्कैन और transection के लिए एक मोटर तंत्रिका का चयन करें.
- इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कंप्यूटर स्क्रीन पर तंत्रिका की एक जीवित देखने को लाओ. जेड विमानों का चयन करें और axons और रिहाई तंत्रिका के glial कोशिकाओं की एक छवि प्राप्त.
- कब्जा करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर में समय चूक इमेजिंग सेटिंग तैयारप्रयोग के आधार पर 5-30 मिनट के अंतराल में सभी प्रकार की कोशिकाओं के z-अनुमानों. यह पृथक प्रदर्शन से पहले समय चूक के लिए सभी आवश्यक रूपरेखा बनाने के लिए सबसे अच्छा है, तो चोट पूरा हो गया है एक बार समय व्यतीत शुरू करने में कोई देरी नहीं है.
- "100% बीमार" बीम फाड़नेवाला निकालें और "रिक्त" के साथ बदलें. Oculars के लिए प्रकाश पथ बंद करें.
- तंत्रिका के रहते देखने के लिए लौटें. Transected जाएगा कि एक्सोन देखने के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनल का प्रयोग करें.
- दीर्घवृत्त उपकरण का उपयोग, ablated होने के लिए क्षेत्र में एक पतली अंडाकार रॉय बनाते हैं, तो चयनित क्षेत्र के भीतर छोटे ROIs बना.
- लेजर सेटिंग्स है कि नियंत्रण विंडो में, "2" के लिए दालों की संख्या सेट और क्षीणन थाली "18"% संचरण के लिए. चयनित ROIs के भीतर लेजर आग. ROIs के भीतर प्रतिदीप्ति रहता है, लेजर शक्ति में वृद्धि, तो लगभग 10 मिनट रुको, और फिर लेजर आग. आप fluorescen का कारण बनता है एक सेटिंग है कि जब तक यह करोCE के ROIs के भीतर गायब करने के लिए.
- 10 या अधिक सेकंड रुको और प्रतिदीप्ति के लिए फिर से ablated क्षेत्र की जाँच करें. यह वास्तव में photobleached है जब एक रॉय शुरू में, ablated प्रकट हो सकता है कि खबरदार. प्रतिदीप्ति रिटर्न, तो लेजर शक्ति बढ़ाने के लिए और फिर लेजर आग. पुष्पन ROIs के भीतर गायब हो जाता है और 10 सेकंड के भीतर वापस नहीं करता है जब तक इस दोहराएँ. यह एक कम लेजर शक्ति के साथ शुरू करने और आवश्यक शक्ति को बढ़ाने के लिए सबसे अच्छा है. आवश्यक लेजर शक्ति व्यक्ति माइक्रोस्कोपी प्रणाली, Coumarin डाई की उम्र, नमूना बढ़ते, लार्वा की उम्र, और ऊतकों की मोटाई के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. एक आदर्श लेजर सत्ता स्थापित किया गया है, इस शक्ति का गठन ही प्रयोग में बाद में तंत्रिकाओं को फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है.
- पृथक पूरा होने पर, समय चूक इमेजिंग शुरू करते हैं.
- समय व्यतीत हो जाने के पूरा होने पर, डेटा संकलन और जेड के अनुमानों हर समय बिंदु के लिए रंग समग्र बनाने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें. व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक QuickTime फिल्म बनाएँएक साथ axons और glial कोशिकाओं की.
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Representative Results
यहाँ वर्णित परख विवो में axonal चोट के glial कोशिकाओं और अन्य तंत्रिका जुड़े सेल आबादी के जवाब का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मूवी 1 इस विधि और glial कोशिकाओं के आसपास की प्रतिक्रिया का उपयोग कर बनाया एक तंत्रिका चोट का एक उदाहरण दिखाता है. इस प्रयोग (nkx2.2a: megfp) टीजी में प्रदर्शन किया था, टीजी (olig2: dsRed) zebrafish, perineurial glia EGFP और मोटर न्यूरॉन्स व्यक्त साइटोसोलिक dsRed लक्षित एक झिल्ली व्यक्त जिसमें. चोट एक 6 DPF रहते zebrafish में एक ट्रंक मोटर तंत्रिका की विजय - स्तम्भ प्रक्षेपण के साथ बनाया है, और तंत्रिका बाद EGFP और dsRed चैनल दोनों में imaged समय चूक गया था. अक्षतंतु और glial सेल व्यवहार का यह अनुमति एक साथ दृश्य तुरंत चोट के बाद.
चित्रा 1 अभी मूवी 1 से लिया स्थिर समय अंक की छवियों से पता चलता है. बिंदीदार अंडाकार लेजर का उपयोग ablated था कि रॉय को दर्शाता है. एक मिनटपोस्ट transection (एमपीटी), ablated क्षेत्र प्रतिदीप्ति का अभाव है और चोट के क्षेत्र बाहर का स्टंप करने के लिए समीपस्थ से लगभग 3.5 उम मापा. एक transection की सफलता इमेजिंग से बाहर का तंत्रिका स्टंप की पुष्टि की है और बाहर का अक्षतंतु विखंडन और तेजी से निकासी सहित Wallerian अध: पतन के संकेत के लिए देख जा सकता है. 120 एमपीटी में चित्र 1 में बाहर का स्टंप साथ axonal प्रतिदीप्ति के अभाव इन axons वास्तव Wallerian अध: पतन आया है और transection सफल रहा था इंगित करता है.
लेजर पृथक प्रयोगों प्रदर्शन जब एक आदर्श स्थापित करने के लिए लेजर शक्ति समायोजन महत्वपूर्ण है. आदर्श लेजर शक्ति सेटिंग्स सफाई से ही चयनित रॉय भीतर तंत्रिका काटकर अलग करना होगा, और या तो बहुत कम या बहुत अधिक हैं कि लेजर शक्ति सेटिंग्स suboptimal परिणाम निकलेगा. चित्रा 2a भी कम था कि एक लेजर शक्ति के साथ प्रदर्शन किया गया था कि एक चोट से पता चलता है. प्रतिदीप्ति लेजर फायरिंग के बाद रॉय के भीतर बने, एक अधूरा transection. चित्रा 2b में जिसके परिणामस्वरूप एक बहुत बड़ी पृथक है, जिसके परिणामस्वरूप बहुत अधिक थी कि एक लेजर शक्ति के साथ प्रदर्शन किया गया था कि एक चोट से पता चलता है.
मूवी 1. मोटर तंत्रिका transection और perineurial glial सेल व्यवहार के confocal समय चूक इमेजिंग. मूवी 1 एमपीटी, और छवियों को 190 मिनट की कुल के लिए हर 10 मिनट लिया एक छवि के बाद एक ट्रंक मोटर तंत्रिका पूर्व चोट से पता चलता है. टीजी (olig2: dsRed): चोट एक जीवित 6 DPF टीजी (megfp nkx2.2a) में प्रदर्शन किया गया था. के लिए पूर्वकाल के साथ घुड़सवार zebrafish लार्वा बाएं और ऊपर से पृष्ठीय फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 1. मोटर तंत्रिका transection और अभी भी छवियोंglial सेल व्यवहार की. पैनलों अभी मूवी 1 से ली गई तस्वीरें हैं. बिंदीदार अंडाकार क्षेत्र बिंदीदार रेखा से चिह्नित एक transection चोट बनाने, ablated था कि रॉय का प्रतिनिधित्व करता है. Arrowheads 10 एमपीटी पर मौजूद है कि axonal प्रतिदीप्ति के लिए बात नहीं, बल्कि 120 एमपीटी में, बाहर का एक्सोन degenerated का संकेत है. स्केल बार, 10 माइक्रोन.
चित्रा 2. Suboptimal लेजर शक्ति सेटिंग्स अवांछित परिणाम होता है. (एक) एक कोशिश के पृथक बहुत कम है कि एक लेजर शक्ति के साथ प्रदर्शन किया. बिंदीदार अंडाकार चयनित रॉय अर्थ. 1 क्षेत्र थोड़ा photobleached और (नोक) transected नहीं किया गया है एमपीटी. (ख) एक पृथक उच्च भी है कि एक लेजर शक्ति के साथ प्रदर्शन किया. बिंदीदार अंडाकार चयनित रॉय चिह्नित. 1 एमपीटीablated क्षेत्र चयनित रॉय (बिंदीदार रेखा) से भी बड़ा है. टीजी (olig2: dsRed);: सभी छवियों रहते 6 DPF टीजी (megfp nkx2.2a) से लिया जाता है के लिए पूर्वकाल के साथ zebrafish लार्वा बाएं और ऊपर से पृष्ठीय. स्केल बार, 10 माइक्रोन.
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Discussion
इस प्रयोगात्मक डिजाइन का सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) vivo इमेजिंग और 2 में चोट और बाद के लिए ठीक से बढ़ते लार्वा) एक स्वच्छ तंत्रिका transection बनाने के लिए लेजर औजार और सही शक्ति सेटिंग्स का चयन है कि कम से कम अतिरिक्त ऊतकों को नुकसान में परिणाम . Vivo इमेजिंग और बाद के विश्लेषण के लिए एक सफल axotomy सुनिश्चित करने में मदद करने के लिए, व्यक्तिगत गिलास नीचे बर्तन में या तो या डिवाइडर के साथ एक गिलास नीचे पकवान में कई लार्वा माउंट. लेजर औजार के बाद, हम तंत्रिका transection के लिए इष्टतम मापदंडों की पहचान करने के लिए एक परीक्षण के लार्वा पर विभिन्न शक्ति सेटिंग्स का परीक्षण करने की सलाह देते हैं. लेजर लेजर) रखरखाव या 5 की आवश्यकता है), सही ढंग से 4 calibrated नहीं है) 3, अलग अलग उम्र के 1) लार्वा), ठीक से 2 मुहिम शुरू नहीं कर रहे हैं लार्वा इस्तेमाल कर रहे हैं: इन सेटिंग्स आमतौर पर प्रयोगों के बीच काफी संगत कर रहे हैं, लेकिन अगर बदल सकते हैं नसों नतीजा होगा जो बहुत अलग पूर्वकाल पीछे पदों में स्थित हैंऊतक मोटाई में एक अंतर में. एक इष्टतम तंत्रिका transection के बीच 2 और 5 माइक्रोन है और पड़ोसी ऊतक को परेशान नहीं करता है कि एक तंत्रिका के साथ एक चोट पैदा करेगा.
तंत्रिका तंत्र की चोट के किसी भी कोशिका प्रकार की प्रतिक्रिया का विश्लेषण करते हैं, हम नियंत्रण के कम से कम 2 प्रकार के आयोजन करने का सुझाव देते हैं. पहला तुरंत ब्याज की तंत्रिका के बगल में है कि घायल करने के एक क्षेत्र का चयन किया जाता है, लेकिन किसी भी तंत्रिका ऊतक छू नहीं है. यह आपको देखना सेलुलर प्रतिक्रियाओं सामान्य में नुकसान, या axons की चोट की वजह से कर रहे हैं अगर आप यह निर्धारित करने की अनुमति देगा. दूसरे नियंत्रण आप एक चोट पैदा की है कि एक ही मछली में छवि एक रिहाई का तंत्रिका है. नियंत्रण के इस प्रकार इमेजिंग के लिए confocal जोखिम बार, आदि सहित मचान और इमेजिंग मापदंडों के कारण लार्वा परिवर्तनशीलता को लार्वा समाप्त
इस प्रोटोकॉल में हम भी अपने विशेष अध्ययन के लिए बहुत छोटा या बहुत बड़े हैं कि चोटों बनाने कि परिदृश्यों का वर्णन है. निर्भरताप्रयोगात्मक सवाल पर डिंग, चोटों के इन प्रकार के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रक्रिया के इस प्रकार के मुख्य सीमाओं चोट और बाद के समय चूक इमेजिंग बनाने के लिए उपलब्ध उद्देश्यों के लिए किया जाएगा. पुराने आप उपयोग लार्वा, लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्य की आवश्यकता है.
हम यहाँ वर्णन प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता परिपक्व लार्वा में गहरी नसों के साथ फोकल तंत्रिका लेनदेन बनाने के लिए अनुमति देता है. हम युगल vivo में इस तकनीक को, समय चूक इमेजिंग और reproducibly फोकल अक्षतंतु चोटों बनाता है कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेजर पृथक प्रणाली का उपयोग करें. इस तकनीक की चोट के बाद तंत्रिका तंत्र के पुनर्निर्माण कि तंत्र के बारे में अलग परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए विभिन्न ट्रांसजेनिक लाइनों या उत्परिवर्ती लार्वा का उपयोग करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों शानदार तकनीकी समर्थन के लिए मूल्यवान चर्चाओं और कोरम टेक्नोलॉजीज, Inc के लिए Kucenas लैब को धन्यवाद देना चाहूंगा. काम विज्ञान और प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में उत्कृष्टता के लिए यूवीए फंड (उत्सव) (एस) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G | |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G | |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 | |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 | |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS | |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
References
- Geuna, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).
- Hirata, K., Kawabuchi, M. Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration. Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137, 3985-3994 (2010).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143, 145-155 (2010).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).
- Stoll, G., Muller, H. W. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).
- Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Development. 7, 19 (2012).
- Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres. Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).
