Summary
末梢神経系（PNS）は、損傷後の大幅な修理が可能ですが、少しは、この現象を支配する細胞および分子メカニズムについてはほとんど知られていない。ライブ、トランスジェニックゼブラフィッシュと再現神経切断アッセイを使用して、我々は、神経変性と再生の間ダイナミックグリア細胞の挙動を学ぶことができます。
Abstract
神経系は、しばしば、それが信じられないほどの柔軟性と可塑性を維持しつつ、一貫した、ステレオタイプの方法で外部刺激に反応する流体かなり臓器系であっても、本体のハードワイヤード成分として記載されている。中枢神経系とは違って（CNS）、末梢神経系（PNS）が重要な修理が可能ですが、私たちはようやく、この現象を支配する細胞および分子メカニズムを理解し始めている。モデル系としてゼブラフィッシュを用いて、in vivoイメージングと遺伝子操作でと夫婦再生の研究に前例のない機会を持っている。末梢神経膠細胞とは結合組織の層に囲まれた軸索で構成されている。軸索は神経周膜と呼ばれる細胞のシースによって束に包まれた順番にあるシュワン細胞、髄鞘形成または非ミエリンによってensheathedされています。損傷後、成人末梢神経は、サンレモに顕著な能力を持っているVE軸索の破片や再支配目標を破損。 PNS再生における全ての周辺グリアの役割を調べるために、我々はここに住んでトランスジェニックゼブラフィッシュの運動神経をaxotomize市販の窒素励起色素レーザーを使用して軸索横断アッセイを説明します。私たちは、さらに負傷者や制御神経のタイムラプスイメージングに結合するように、これらの実験の方法を説明します。この実験的なパラダイムは、グリア細胞は神経再生で再生するだけでなく、神経系の修復を支配する分子メカニズムを解明するためのプラットフォームとなることができます。という役割を評価しないために使用することができます
Introduction
ゼブラフィッシュがあるため、その光学透明の神経系の発達を研究し、遺伝子導入のしやすさ、その結合されたときに、生きている胚の動的細胞挙動の壮大なイメージングを可能にするために広く使用されてきた。ゼブラフィッシュと哺乳類は、ほぼすべての神経系の形成、このモデル生物で収集細胞および分子情報に必要な遺伝子の共有しているため、さらに、他の脊椎動物種に直接話すことのできるある。神経発達研究のための信じられないほど強力なものの、ゼブラフィッシュとそのユニークな属性も損傷後の神経系を維持し、再構築のメカニズムを解明する可能性を秘めている。ゼブラフィッシュの幼虫は、後期幼生期に彼らの半透明性を維持し、色素沈着を効果的にメラニン生成や色素細胞を欠いている遺伝的変異体の薬理学的阻害剤の使用のいずれかをブロックすることができます。このように、けがやregeneratを勉強するために、このモデル生物を用いた高齢動物でイオンが可能であり、直接神経系を再構築する細胞および分子メカニズムを調査するためのユニークな機会を提供しています。本稿では、効率的かつ再現ゼブラフィッシュ幼生のPNSの神経を傷つける方法を説明します。この傷害パラダイムは退化しないだけの勉強に向いてだけでなく、周辺グリアと免疫細胞の応答と同様に、再生時のこれらの集団間の相互作用。
PNSは、生物がその環境と相互作用し、生き残るできるように、中枢神経系（CNS）および皮膚、臓器や身体の筋肉間で情報を渡す必要がある運動感覚神経の複雑なネットワークである。髄鞘形成と非ミエリンシュワン細胞と神経鞘グリアならびに結合組織、軸索包む、最終的に成熟した神経を形成するなど、これらの神経に沿って、周辺グリア、。これらの神経の損傷は、プロセスkを開始するウォーラー変性10としてノウン。軸索の断片化、免疫募集、破片クリアランスと再生のこのメカニズムは1非常に紋切り型と遺伝的に規制されています。哺乳動物系における以前の研究では、神経変性および再生1、2、6、8時のシュワン細胞の役割を記載している。固定組織または細胞培養のこれらの研究では、シュワン細胞だけでなく、デブリクリアランスを助けるために、損傷部位へのマクロファージを採用し、また、ミエリン貪食自体が支援。これらの研究は非常に有益であったが、我々はリアルタイムでin vivoでの末梢軸索損傷に可視化グリア応答前に決して持っていないし、他の研究では、これらのイベントの間に周辺グリアの異なるクラス間の関係を調査していない。
最近では、いくつかのラボは、我々がここで説明するものと同様のゼブラフィッシュとレーザー媒介軸索損傷を使っウォーラー変性を検討してきた
これを行うには、我々は（DPF）6と7日後の受精で運動神経を横断する幼虫と負傷軸索に沿ってこれらの集団の間の相互作用を調査するだけでなく、個々のグリア細胞集団の反応を可視化する。ダブル、トリプルTRAを使用そのシュワン細胞と神経鞘グリアならびに軸索のマーカーを含むラベル周辺グリア、nsgenicラインは、我々は成る市販のレーザーアブレーションシステム使用スピニングディスク共焦点システムに接続されている色素レーザーは、（波長435 nm）を窒素励起軸索transectionsを作成します。これは実験のセットアップ私たちはお互いに軸索損傷とそれらの関係を特定の末梢運動軸索路とタイムラプス画像異なるグリア集団の応答を傷つけ、ライブ、幼虫のゼブラフィッシュを視覚化することができます。このプロトコルは、さらに別の科学的な疑問を解決するために別のトランスジェニック系統や遺伝的変異と、異なる年齢のゼブラフィッシュの神経傷害を作成するために適応させることができる。
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Protocol
1。アブレーションとライブイメージングのためのゼブラフィッシュ胚の作製と取り付け
- 卵水に0.8％低融点アガロースの株式を準備します。 4で13X 100ミリメートル使い捨て培養管や店舗°Cに分注し、必要になるまで。
- 蛍光運動ニューロンと関心のグリア細胞型にラベルを安定的に統合された導入遺伝子を含む大人のゼブラフィッシュを渡り。正しいステージングのため℃インキュベーター後3 28.5に卵、水と場所でゼブラフィッシュ胚を収集します。
- 約24時間後に受精（HPF）で、卵の水を除去し、卵の水に1 - フェニル-2 - チオ尿素（PTU）0.002％を追加します。インキュベーターに胚を戻します。
- 24および96 HPF間、胚は蛍光解剖スコープ上の目的の導入遺伝子の存在についてスクリーニングされるべきである。新鮮PTU卵水で選択した胚を置き、インキュベーターに戻す。
- 幼虫は6日後に受精（DPF）（または望ましい年齢）に達したとき、インキュベーターからそれらを削除する、取り付けのためのいくつかの幼虫を選択して、小さいお皿に移す。
- 皿から水を取り出し、直ちにPTU卵の水で約0.02％Tricaneと交換してください。幼虫は約5分で麻酔に座ることができます。
- 30秒間水道水と電子レンジ付きのビーカーに0.8％低融点アガロースのアリコートを置き、またはアガロースを溶融されるまで。培養管でアガロースタッチ（熱くない）にぬるい感じまでビーカーを冷却することができます。
- 麻酔幼虫を選択し、シングルまたはマルチウェル35ミリメートルのガラスボトムディッシュに転送します。幼虫で転送されたすべての水を除去し、その後すぐにお皿のガラス底の部分を埋めるために十分に暖かいアガロースで幼虫をカバーするが、大きなドームを作成しない。
- アガロースが硬化したように、その背中にわずかに幼虫を傾けた後、皿の底にその側に幼虫を配置するために解剖針を使用しています。それは、怪我とその後のイメージングのために不可欠であるマウントされた幼虫は、皿の底にガラスに触れること。アガロースが固化され、幼虫が固定されるまで、この位置で幼虫を維持するために解剖針を使用します。
- アガロースが完全に硬化した後、徐々に完全にアガロースと幼虫をカバーするために皿に十分なTricane水（これは麻酔のために使用したのと同じTricaneすることができます）ピペット。
2。レーザーキャリブレーションとテスト
- すべての共焦点顕微鏡計測、エキサイティングゼブラ導入遺伝子に適したダイオードレーザー、窒素励起色素レーザーをオンにします。 "空白"ビームスプリッタが所定の位置にあることを確認して、レーザーアッテネータは完全に開放されており、435 nmのクマリン色素セルは所定の位置にある。コンピュータでは、イメージングソフトウェアを開きます。
- 位置に63X 1.2NA水浸対物レンズを移動して、客観的に水の目的のための液浸媒体の小滴を適用します。 63X目的は、良好なレーザーアブレーション精度を可能にし、水iのでしょうmmersionは6-7 DPFのゼブラフィッシュの幼虫で作業するとき必要となる大規模な作業距離を可能にします。
- レーザの較正に使用する1つミラーリング側にスライドガラスを得る。顕微鏡ステージ上に、スライド、ミラー側を下にして置きます。
- 明視野照明下で接眼レンズを使用して、見つけて、鏡の中の傷やエッチに焦点を当てる。明視野光がスライドガラス上にダウンして輝いていますが、唯一のミラーは接眼レンズを通して黒く見えることを引き起こして、ミラーが離れて傷やエッチングされた場所での目標に通過し、斑点のように見えるようにエッチングまたは光のライン。
- イメージングソフトウェアを使用して、コンピュータの画面上にエッチングを表示して、焦点を当てています。レーザーキャリブレーションと電力設定を制御ウィンドウを開きます。 "3"％の透過率を "1"と減衰板のパルス数を設定する。パルスの数は、レーザは、関心の各領域（RO内に発射する回数を表すI）および％伝送はレーザパワーを表す。正しいキャリブレーション設定が63X 1.2NA水浸対物レンズを選択していることを確認してください。
- メインツールバーから楕円ツールを選択し、単一の円形のROIを作成するには、パソコンの画面で画像をクリックしてください。画像の上にランダムに間隔4円形のROIがあるまで、この3回以上行う。
- 一部のシステムでは、接眼レンズの光路が開いている場合、レーザーが発射することはできません安全機能を含んでいてもよい。この場合は、手動で、この時点で接眼レンズへの光路を閉じる。
- レーザーを発射。これは、各円形のROI内に4つの小さなスポットエッチング、1が作成されます。レーザーが発射されない場合は、レーザーがオンになって、正しく接続され、接眼レンズへの光路が閉じていることをされていることを確認してください。レーザー火災なくないエッチングが見られた場合は、 "空白"ビームスプリッタが所定の位置にあることを確認してください。すべてが所定の位置にある場合は、エッチングARまでレーザパワーと "FRAP"を増やす目に見える電子。 10を超える設定レーザパワーはガラスをエッチングする必要がある場合、これはレーザープラズマカートリッジを交換する必要がある示すことができる。
- エッチングされたスポットを選択したROI内の中央に表示された場合、キャリブレーションは、（2.12に進んで）必要ありません。スポットが中心にされていない場合は、キャリブレーション設定を更新する必要がある。
- キャリブレーションを行うには、更新キャリブレーション設定をクリックします。レーザーが発射され、画像は、単一のエッチングされた点を含むが表示されます。ポイントが表示されない場合は、キャリブレーションをキャンセルレーザパワーを増加させ、再度キャリブレーションを開始する。
- スポットの中心をクリックします。レーザーが再び発射され、別のポイントが表示されます。そのポイントをクリックして、キャリブレーションが完了し、9スポットはグリッド形式で表示されるまで、このプロセスを繰り返します。キャリブレーションが成功したことを確認するための手順2.6から2.9を繰り返します。
- 顕微鏡ステージからスライドガラスを削除し、目的を清掃してください。 OCUへの光路を開くラースと、 "100％ILL"ビームスプリッタで "空白"ビームスプリッタを交換してください。
3。レーザーアブレーションとグリア細胞の挙動のタイムラプス共焦点イメージングを用いた神経切断
- スライドガラスを保持し、35ミリのガラス底皿を保持するのに適したステージを置き換えるために使用する段階を削除します。 63X 1.2NA水浸対物レンズを使用し続ける。
- 客観的に水浸媒体の小滴を適用して、ステージ上に取り付け幼虫と皿を置きます。クリップでお皿を安定させる。
- 接眼レンズと広視野照明を使用して、幼虫を集中し、運動神経を見つけます。 hemisegments 10-20に神経をスキャンし、離断のための運動神経を選択します。
- イメージングソフトウェアを使用して、コンピュータの画面上で神経のライブビューを起動します。 Zプレーンを選択し、無傷の神経の軸索とグリア細胞の画像を取得する。
- キャプチャするイメージングソフトウェアでタイムラプスイメージングの設定を準備します実験に応じて5〜30分間隔内の全ての細胞型のZ-凸。それは、アブレーションを実行する前に時間経過のために必要なすべての設定を作成するのが最善の方法ですので、怪我が完了すると、時間経過を始めるには遅延がありません。
- "100％ILL"ビームスプリッタを外し、 "空白"に置き換える。接眼レンズに光パスを閉じます。
- 神経のライブビューに戻ります。離断される軸索を表示するには、適切な蛍光チャンネルを使用してください。
- 楕円ツールを使用して、アブレーションする領域に細い楕円ROIを作成し、選択された領域内に小さいのROIを作成します。
- レーザの設定を制御するウィンドウで、 "2"のパルス数を設定し、減衰板 "18"％透過する。選択したROI内のレーザーを発射。蛍光のROI内に留まる場合は、レーザーパワーを上げる、約10秒待ってから再度レーザーを発射。あなたはfluorescenを起こす設定に到達するまで、この操作を行うCEは、ROIの内に消えます。
- 10秒以上待ってから、蛍光のために再びアブレーションエリアを確認してください。 ROIは、最初、それが実際に退色とき、アブレーション表示されることがありますことに注意してください。蛍光を返した場合は、レーザパワーを増加させ、再びレーザーを発射する。蛍光は、ROIの内消え、10秒以内に戻ることなくなるまでこれを繰り返します。低いレーザパワーと必要な電力の増加で開始するのが最善です。必要なレーザパワーは、個々の顕微鏡システムでは、クマリン色素の年齢、試料取付、幼虫の年齢、組織の厚さに基づいて変化し得る。理想的なレーザパワーが確立されると、この電力設定は、同じ実験において、後続の神経に再度使用することができる。
- アブレーションが完了すると、タイムラプスイメージングを開始します。
- タイムラプスが完了すると、データをコンパイルし、各時点の色複合Z-投影を作成するイメージングソフトウェアを使用してください。行動を分析するためのQuickTimeムービーを作成同時に軸索とグリア細胞の。
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Representative Results
ここに記載されたアッセイは、in vivoでの軸索損傷に対するグリア細胞および他の神経関連細胞集団の反応を評価するために使用することができる。 ムービー1は、この方法およびグリア細胞周囲の応答を使用して作成された神経損傷の一例を示す図である。 Tgは（olig2：DsRedを）;：この実験は、Tgが（megfp nkx2.2a）で行われた神経鞘グリア細胞がEGFPターゲット膜を表現したゼブラフィッシュ、そして運動ニューロン急行細胞質はDsRedの。損傷は6 DPFライブゼブラフィッシュにおけるトランク運動神経の吻側投影に沿って作られた、と神経はその後タイムラプスEGFPとDsRedのチャネルの両方で画像化した。これは、軸索と直ちに損傷後グリア細胞挙動の同時可視化を可能にした。
図1は、依然としてムービー1から採取した静電気の時点の画像を示している。点線の楕円は、レーザーを用いて切除されたROIを示しています。 1分ポスト離断（MPT）、アブレーション領域は、蛍光欠けや怪我ゾーンは、近位から遠位断端まで約3.5 UMを測定した。離断の成功は、イメージングによって遠位神経断端を確認し、遠位軸索の断片化と迅速な通関を含めウォーラー変性の徴候を探しすることができます。 120 MPTで図1の遠位断端に沿って軸索の蛍光の欠如は、これらの軸索は確かウォーラー変性を受けたし、離断に成功したことを示します。
レーザアブレーション実験を行う際に理想的な設定にレーザーパワーを調整することが重要である。理想的なレーザパワー設定が正常に選択されたROI内でのみ神経を切除し、低すぎるか高すぎるレーザパワーの設定は次善の結果をもたらす。 図2aは低すぎたレーザパワーで実行された損傷を示している。蛍光は、レーザーを発射した後、ROI内であった不完全な横断をもたらす。 図2bは、非常に大きな焼灼をもたらす、高すぎるレーザパワーで実行された損傷を示している。
ムービー1。モーター神経切断や神経鞘グリア細胞の挙動の共焦点タイムラプスイメージング。映画は190分の合計10分ごと1 MPT、および画像を撮影した画像に続いてトランク運動神経損傷前を示しています。 Tgは（olig2：DsRedを）;：傷害は、ライブ6 DPF のTg（megfp nkx2.2a）で行った。左と上に背側の前方に搭載したゼブラフィッシュ幼生のムービーを表示するには、ここをクリック 。
図1。運動神経切断や静止画グリア細胞の挙動の。パネルは、まだムービー1から撮影した画像です。点線の楕円形の領域は、点線で示される横断損傷を作成し、アブレーションされたROIを表しています。矢じりは縮退遠位軸索を示す、10 MPTではなく、120 MPTで存在している軸索の蛍光を指す。スケールバーは10μm。
図2。次善のレーザパワーの設定は、望ましくない結果をもたらす。 （a）は、試行されたアブレーションが低すぎるレーザパワーで行った。点線の楕円は、選択されたROIを表す。 1領域がわずかに退色し（矢印）切開しないであったMPT（b）にアブレーションが高すぎるとレーザパワーで行った。点線の楕円は、選択されたROIを表す。 1 MPTアブレーションされた領域は、選択ROI（点線）よりもはるかに大きい。 Tgは（olig2：DsRedの）左側に前部と上部に背を持つゼブラフィッシュ幼生;：すべての画像はライブ6 DPF のTg（megfp nkx2.2a）から取得されます。スケールバーは10μm。
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Discussion
この実験的なデザインの中で最も重要なステップは次のとおりである：1） 生体内イメージングと2 の怪我とその後のために適切に取り付け幼虫）クリーン神経切断を作成するために、レーザーを校正し、正しい電源設定を選択することを最小限の余分な組織の損傷につながる。 in vivoイメージングとその後の分析で成功するための軸索切断を確保するために、個々のガラスボトムディッシュのいずれかで、または仕切りのガラスボトムディッシュに複数の幼虫をマウントします。レーザーを校正した後、我々は神経切断のための最適なパラメータを識別するために、テストの幼虫で異なる電源設定をテストすることをお勧めします。 1））の幼虫は、適切に2マウントされていない）は、異なる年齢の幼虫が使用されている、3）レーザーは、正しく4キャリブレーションされていません）レーザーは、メンテナンスや5を必要とします：これらの設定は、通常の実験の間はかなり一貫していますが、変更することができる場合神経をもたらす非常に異なる前方 - 後方位置に配置されている場合組織の厚さの差である。最適な神経切断は2〜5μmで、隣接する組織を妨げない神経に沿って損傷を作成します。
神経系損傷の任意の細胞型の応答を分析する際に、我々は、コントロールのうちの少なくとも2種類の導電性を示唆している。最初はすぐに興味のある神経の隣つまり傷つけるする領域を選択しているが、任意の神経組織に触れていない。これは、あなたが見ること細胞応答は一般的に損傷、または軸索の損傷によるものであるかどうかを判断することができます。第二制御、画像には怪我を作成したのと同じ魚で無傷の神経です。このタイプの制御は、撮像のための共焦点露光時間、等を含む、ステージングと撮像パラメータの設定によって、幼虫の変動に幼虫を排除する
このプロトコルでは、我々はまた、我々の特定の研究のために小さすぎたり大きすぎたりである傷害を作成するシナリオについて説明します。依実験的な問題について丁、傷害これらのタイプの分析のために使用することができる。手順のこのタイプの主な制限は、傷害とその後のタイムラプスイメージングを作成するために利用できる目標であろう。あなたが使用する古い幼虫、必要に長い作動距離目標。
我々はここで説明するプロトコルは、ユーザーが成熟した幼虫の深い神経に沿って焦点神経transectionsを作成することができます。我々はカップル、in vivoで 、この技術には、タイムラプスイメージングと再現フォーカル軸索損傷を作成し、市販のレーザーアブレーションシステムを使用しています。この技術は、損傷後の神経系を再構築するメカニズムについては別の仮説をテストするために別のトランスジェニック系統や変異体の幼虫を使用するように変更することができる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は見事な技術サポートのための貴重な議論とクォーラム·テクノロジーズ·インクのためKucenasラボに感謝したいと思います。仕事は、科学技術の卓越性のためのUVA基金（FEST）（SK）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G | |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G | |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 | |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 | |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS | |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
References
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