Summary
Selvom det perifere nervesystem (PNS), er i stand til væsentlig reparation efter skade, er lidt om de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer dette fænomen. Ved hjælp af levende, transgene zebrafisk og en reproducerbar nerve transection assay, kan vi studere dynamiske glialcellelinjer adfærd under nerve degeneration og regeneration.
Abstract
Nervesystemet ofte beskrevet som et hard-wired del af kroppen, selv om det er et væsentligt flydende organsystem, der reagerer på eksterne stimuli på en konsekvent, stereotyp måde, samtidig med at utrolig fleksibilitet og plasticitet. I modsætning til centralnervesystemet (CNS), det perifere nervesystem (PNS) er i stand til væsentlig reparation, men vi har kun lige begyndt at forstå de cellulære og molekylære mekanismer, som regulerer dette fænomen. Brug zebrafisk som model-system, har vi hidtil uset mulighed for at par regenerative undersøgelser med in vivo imaging og genetisk manipulation. Perifere nerver er sammensat af axoner omgivet af lag af glia og bindevæv. Axoner ensheathed ved myelinerende eller ikke-myelinerende Schwann-celler, der igen er pakket ind i en fascicle af en cellulær kappe kaldet perineurium. Efter en skade, har voksne perifere nerver den bemærkelsesværdige evne til at remove beskadiget axonal snavs og re-innerverer mål. At undersøge roller alle perifere glia i PNS regeneration, vi beskriver her en Axon transection assay, der bruger en kommercielt tilgængelig kvælstof-pumpet dye laser til axotomize motoriske nerver i live-transgene zebrafisk. Vi beskriver yderligere metoder til at parret disse eksperimenter til time-lapse imaging af sårede og kontrol nerver. Denne eksperimentelle paradigme kan anvendes til ikke blot at vurdere den rolle, glia spiller i nerveregenerering, men også kan være platform for at belyse de molekylære mekanismer, som regulerer nervesystemet reparation.
Introduction
Zebrafisk er blevet brugt i udstrakt grad til at studere udviklingen af nervesystemet på grund af deres optiske transparens og lethed af transgenese, som når den kobles, tillader spektakulær billeddannelse af dynamiske celle adfærd hos et levende foster. Derudover, fordi zebrafisk og pattedyr deler næsten alle de gener, der er nødvendige for nervesystemet dannelse, cellulær og molekylær information indsamlet i denne model organisme er direkte relateres til andre hvirveldyr. Selvom utrolig kraftfuld for neurale udviklingsmæssige undersøgelser, har zebrafisk og dets unikke egenskaber potentiale til også belyse de mekanismer, der opretholder og genopbygge nervesystemet efter skade. Zebrafisk larver opretholde deres gennemskinnelighed i sene larvestadier og pigmentering effektivt kan blokeres med enten brug af farmakologisk inhibitorer af melanin produktion eller genetiske mutanter, der mangler pigment celler. Således at bruge denne model organisme studere skade og GENERATORISKion i ældre dyr er mulig og giver en unik mulighed for direkte at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, der genopbygge nervesystemet. I dette manuskript, beskriver vi, hvordan man effektivt og reproducerbart skade nerverne i PNS af zebrafisk larver. Denne skade paradigme egner sig til at studere ikke blot degeneration, men også svarene fra perifere glia og immunceller samt samspillet mellem disse populationer under regenerering.
PNS er et komplekst netværk af motoriske og sensoriske nerver, der er nødvendig for at passere oplysninger mellem det centrale nervesystem (CNS) og huden, organer og muskler i kroppen, så en organisme til at interagere med sine omgivelser og overleve. Langs disse nerver. Perifer glia, herunder myelinerende og ikke-myelinerende Schwann-celler og perineurial glia samt bindevæv, omslutter axoner og i sidste ende danner modne nerve Skade af disse nerver indleder en proces known som Wallerian degeneration 10.. Denne mekanisme axonal fragmentering, immun rekruttering, vragrester clearance og regenerering er meget stereotypt og genetisk reguleret 1.. Tidligere undersøgelser i mammale systemer har beskrevet roller Schwann-celler under nerve degeneration og regeneration 1, 2, 6, 8. I disse studier af fast væv eller cellekultur, ikke kun Schwann celler rekrutteret makrofager til skaden site for at hjælpe med vragdele clearance, men også hjulpet i myelin fagocytose selv. Mens disse undersøgelser har været utrolig informativ, vi har aldrig før visualiserede gliale reaktioner på perifer Axon skade in vivo i realtid, og ingen andre studier har undersøgt sammenhængen mellem de forskellige klasser af perifer glia i disse begivenheder.
Senest er flere laboratorier undersøgt Wallerian degeneration ved hjælp zebrafisk og laser-medieret Axon skade svarer til, hvad vi beskriver her
For at gøre dette, vi transektere motoriske nerver i 6 og 7 dag efter befrugtning (DPF) larver og visualisere svarene enkelte gliale befolkninger samt undersøge samspillet mellem disse populationer langs tilskadekomne axoner. Brug dobbelt og tredobbelt transgenic linjer, etiket perifer glia, herunder Schwann-celler og perineurial glia, samt en markør for axoner, bruger vi en kommercielt tilgængelig laser ablation system bestående af en nitrogen-pumpet farvelaser (bølgelængde 435 nm) fastgjort til en roterende skive konfokalt systemet at skabe Axon transections. Denne eksperimentelle set-up giver os mulighed for at visualisere levende, larve zebrafisk, såre specifikke perifere motoriske Axon skrifter og time-lapse billede svarene fra forskellige gliaceller befolkninger til Axon skade og deres forhold til hinanden. Denne protokol kan tilpasses yderligere til at skabe nerve skader i zebrafisk af forskellige aldre, med forskellige transgene linier eller genetiske mutanter til at løse forskellige videnskabelige spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse og Montering af Zebrafisk embryoner til ablation og live Imaging
- Forbered en bestand på 0,8% lavtsmeltende agarose i æg vand. Alikvot ind 13X 100 mm engangs podningsrør og opbevares ved 4 ° C indtil de skal bruges.
- Cross voksen zebrafisk indeholdende stabilt integreret transgener til fluorescens mærke motoriske neuroner og glia celletyper af interesse. Saml zebrafisk embryoner æg vand og plads i 28,5 ° C inkubator for korrekt iscenesættelse senere 3..
- På cirka 24 timer efter befrugtning (HPF), fjerne æg vand og tilsættes 0,002% 1-phenyl 2-thiourinstof (PTU) i æg vand. Retur embryoner til inkubatoren.
- Mellem 24 og 96 HPF bør embryoner screenet for tilstedeværelsen af ønskede transgener på en fluorescerende dissektionsmikroskop. Placer udvalgte embryoner i frisk PTU æg vand og vende tilbage til inkubatoren.
- Når larverne har nået 6 dage efter befrugtning (DPF) (eller ønsket alder), fjerne dem fra inkubatorenVælg et par larver for montering, og overføre dem til et mindre fad.
- Fjerne vandet fra fadet og straks erstatte med ca 0,02% Tricane i PTU æg vand. Tillad larver at sidde i narkose ca 5 min.
- Placer en portion af 0,8% lavtsmeltende agarose i et bæger med vand fra hanen og mikroovn i 30 sek, eller indtil agarose er smeltet. Lad bægeret til at afkøle, indtil agarose i kulturen røret føles lunken at røre (ikke varmt).
- Vælg en bedøvet larve og overføre det til en enkelt eller multi-og 35 mm glasbund fad. Fjern eventuelle vand, der blev overført med larve, derefter straks dække larve med nok varme agarose at fylde glas-bund del af skålen, men ikke skabe et stort kuppel.
- Som agarosen hærder, bruge en dissektionsnål at placere larve på sin side i bunden af skålen, så vippe larve bare lidt på ryggen. Det er bydende nødvendigt for skade og efterfølgende billedbehandling, atmonteret larve være røre glasset på bunden af skålen. Brug dissektionsnål at opretholde larve i denne stilling, indtil agarosen er størknet, og larven er immobiliseret.
- Når agarosen er fuldt hærdet, langsomt pipette nok Tricane vand (dette kan være den samme Tricane anvendes til anæstesi) i skålen til helt at dække agarosen og larve.
2.. Laser kalibrering og prøvning
- Tænd alle konfokal mikroskop instrumentering, passende diode lasere til spændende zebrafisk transgener og kvælstof-pumpet dye laser. Vær sikker på "blank" beam splitter er på plads, laser dæmperen er helt åben, og 435 nm coumarin farvestof celle er på plads. På computeren skal du åbne imaging software.
- Flyt en 63x 1.2NA vand immersionsobjektivet i position og anvende en lille dråbe fordybelse medium for vandmålsætninger på mål. En 63x mål vil give mulighed for god laserablation nøjagtighed, og vand immersion giver mulighed for en større arbejdsbredde afstand, som er nødvendig, når der arbejdes med 6-7 dpf zebrafisk larver.
- Opnå en glasplade med en spejlet side til brug for kalibrering af laseren. Placer slide, spejl nedad på mikroskopbordet.
- Brug af okularet under brightfield belysning, finde og fokusere på en ridse eller ætse i spejlet. Den brightfield lys vil blive skinner ned på glasset diaset, men vil kun passere igennem til målet på steder, hvor spejlet er blevet ridset eller ætset væk, hvilket får spejlet til at se sort gennem okularet, og raderinger at ligne pletter eller linjer af lys.
- Se og fokusere raderinger på computerskærmen ved hjælp imaging software. Åbn vinduet, der styrer laseren kalibrering og effektindstillinger. Indstil antallet af impulser til "1" og dæmpningen pladen til "3"% transmission. Antallet af impulser repræsenterer antallet af gange laseren vil fyre i hver region af interesse (ROI), og% transmission repræsenterer lasereffekten. Vær sikker den korrekte kalibrering er valgt til 63x 1.2NA nedsænkning i vand mål.
- Vælg ellipseværktøjet fra de vigtigste værktøjslinjen og klik på billedet på computerskærmen for at oprette en enkelt cirkulær ROI. Gør dette 3 flere gange, indtil der er 4 cirkulære ROIs fordelt tilfældigt over billedet.
- Nogle systemer kan indbefatte en sikkerhedsanordning, der ikke vil tillade laser til at blive udløst, hvis den strålegangen til okularerne er åben. Hvis dette er tilfældet, manuelt lukke strålegangen til okularerne på dette tidspunkt.
- Affyr laser. Dette vil skabe 4 små spot raderinger, 1 inden for hver cirkulære ROI. Hvis laseren ikke brand, check for at være sikker på at laseren er tændt og tilsluttet korrekt, og at lyset sti til okularer er lukket. Hvis laser brande men ingen ætsning ses, check for at være sikker på "blank" beam splitter er på plads. Hvis alt er på plads, øger laser magt og "FRAP", indtil raderinger are synlig. Hvis en laser varmetrin større end 10 er nødvendigt at ætse glasset, kan dette betyde laser plasma patronen skal udskiftes.
- Hvis de ætsede pletter centreret i det valgte ROIs, ingen kalibrering er nødvendig (fortsæt til 2.12). Hvis pletterne ikke er centreret, kalibreringen indstillingen skal opdateres.
- For at kalibrere, skal du klikke på opdateringen kalibreringen indstilling. Laseren vil fyre og et billede vil blive vist indeholder en enkelt ætset point. Hvis punktet ikke vises, skal du annullere kalibreringen øge laser magt, og starte kalibreringen igen.
- Klik i midten af pletten. Laseren vil fyre igen, og et andet punkt vises. Klik på dette punkt, og gentag denne proces, indtil kalibreringen er færdig, og 9 pletter i et gitter mode. Gentag trin 2.6-2.9 for at kontrollere, at kalibreringen var vellykket.
- Fjern objektglasset fra mikroskopbordet og rense målet. Åbn lyset sti til OCUlars og erstatte "blank" beam splitter med "100% ILL" beam splitter.
3.. Nerve transection Brug laserablation og Time-lapse konfokal Imaging af gliacelle Behaviors
- Tag den fase bruges til at holde objektglas og erstatte med en scene er egnet til at holde 35 mm glas bund retter. Fortsæt med at bruge 63x 1.2NA nedsænkning i vand mål.
- Påfør en lille dråbe vand nedsænkning medium til målet, og placer fadet med monteret larve på scenen. Stabilisere fad med clips.
- Brug af okularet og Widefield belysning, fokus larve og find motoriske nerver. Scan nerverne i hemisegments 10-20 og vælg en motor nerve for transection.
- Opdrage et levende billede af nerve på computerskærmen ved hjælp imaging software. Vælg Z-fly og erhverve et billede af axoner og gliaceller i den skadede nerve.
- Forbered time-lapse imaging indstillinger i imaging software til at fangeZ-projektioner af alle celletyper i 5-30 minutters intervaller, afhængigt af forsøget. Det er bedst at oprette alle de nødvendige indstillinger for time-lapse, før du udfører ablation, så der er ingen forsinkelse i start af time-lapse når skaden er færdig.
- Fjern "100% ILL" beam splitter og erstat med "blank". Luk lyset sti til okularer.
- Tilbage til live-visning af nerve. Brug det korrekte fluorescerende kanal at se axoner, der vil blive transected.
- Brug ellipseværktøjet, en tynd elliptisk ROI i området, der skal poleres oprette, derefter oprette mindre ROIs i det valgte område.
- I det vindue, der styrer laser indstillingerne skal du indstille antallet af impulser til "2" og dæmpningen pladen til "18"% transmission. Affyr laseren inden den valgte rois. Hvis fluorescens forbliver inden for ROIs, øger laser magt, vent ca 10 sek, og fyre laseren igen. Gør dette indtil du når en indstilling, der forårsager fluorescence at forsvinde i ROI'er.
- Vent 10 sekunder eller mere og tjek ablateret området igen for fluorescens. Vær opmærksom på at et investeringsafkast i første omgang kan synes ablated, når det er faktisk Lysbleget. Hvis fluorescens afkast, øger laser magt og fyre laseren igen. Gentag dette, indtil fluorescens forsvinder inden for ROIs og ikke vender tilbage inden for 10 sek. Det er bedst at starte med en mindre laser magt og øge den nødvendige strøm. Den nødvendige laser magt kan variere baseret på individuelle mikroskopi-systemer, alder coumarin farvestof, eksemplar montering, alder af larver, og tykkelsen af vævet. Når en ideel laser strømmen er blevet etableret, kan denne magt indstilling bruges igen på efterfølgende nerverne i det samme eksperiment.
- Når ablation fuldført, begynder time-lapse billeddannelse.
- Når time-lapse er færdig, kan du bruge imaging software til at indsamle data og oprette farve komposit Z-fremskrivninger for hvert tidspunkt. Opret en QuickTime-film til at analysere adfærdenaf axoner og gliaceller samtidigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assayet beskrevet her kan anvendes til at vurdere respons af gliaceller og andre nerve-associerede cellepopulationer til aksonal skade in vivo. Movie 1 viser et eksempel på en nerveskade oprettet ved hjælp af denne metode, og svaret fra omgivende gliaceller. Dette eksperiment blev udført i Tg (nkx2.2a: megfp), Tg (olig2: DsRed) zebrafisk, hvor perineurial glia udtrykke en målrettet membran EGFP og motoriske neuroner udtrykker cytosolisk DsRed. Skaden blev foretaget langs rostral projektion af en kuffert motor nerve i en 6 dpf levende zebrafisk, og nerven blev efterfølgende time-lapse afbildet i både EGFP og DsRed kanaler. Dette tillod samtidig visualisering af axon og glialcellelinjer adfærd umiddelbart efter skaden.
Figur 1 viser stillbilleder af statiske tid-point taget fra Movie 1. Den stiplede ellipse viser ROI der blev ablated hjælp af laseren. Et minutefter overskæring (MPT), det ablaterede område manglede fluorescens og skaden zone målte omkring 3,5 um fra den proximale til den distale stump. Succesen med en transection kan bekræftes ved imaging den distale nerve stump og leder efter tegn på Wallerian degeneration, herunder distal Axon fragmentering og hurtige clearance. Fraværet af axonal fluorescens langs den distale stump i figur 1 ved 120 MPT indikerer disse axoner har faktisk gennemgået Wallerian degeneration og transection var vellykket.
Justering af laser strøm til en ideel ramme er kritisk, når du udfører laser ablation eksperimenter. Ideel laser strømindstillinger vil rent ablate nerven kun inden det valgte ROI, og laser strømindstillinger, der enten for lavt eller for højt vil give suboptimale resultater. 2a viser en skade, der blev udført med en laser magt, der var for lavt. Fluorescens forblev inden ROI efter affyring af laseren, Hvilket resulterer i en ufuldstændig overskæring. 2b viser en skade, der blev udført med en laser magt, der var for høj, hvilket resulterer i et meget stort ablation.
Movie 1.. Motor nerve transection og konfokal time-lapse billeddannelse af perineurial glialcelle adfærd. Filmen viser en kuffert motorisk nerve før skaden, efterfulgt af et billede taget 1 MPT, og billeder hver 10 min i alt 190 min. Skaden blev udført i en live 6 dpf Tg (nkx2.2a: megfp), Tg (olig2: DsRed). Zebrafisk larve monteres med anterior til venstre og dorsale til toppen Klik her for at se filmen .
Figur 1. Motor nerve transection og stillbillederaf glialcelle adfærd. Paneler er stillbilleder taget fra Movie 1. Den stiplede elliptiske område repræsenterer ROI der blev poleres, hvilket skaber en overskæring skade betegnet med den stiplede linie. Pilespidser peger på axon fluorescens, som er til stede ved 10 MPT, men ikke ved 120 MPT, angiver de distale axoner degenereret. Scale bar, 10 um.
Figur 2. Suboptimale laser strømindstillinger fører til uønskede resultater. (A) et forsøg ablation udført med en laser magt der er for lav. Den stiplede ellipse angiver den valgte ROI. 1. MPT området har været lidt Lysbleget og ikke transected (pilespids). (B) En ablation udføres med en laser magt, der er for høj. Den stiplede ellipse betegnede den valgte ROI. 1. MPT denablateret område er meget større end den valgte ROI (stiplet linie). Alle billeder er taget fra levende 6 dpf Tg (nkx2.2a: megfp), Tg (olig2: DsRed) zebrafisk larver med forreste til venstre og dorsale til toppen. Scale bar, 10 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trin i denne eksperimentelle design er: 1) korrekt montering larver for skader og efterfølgende in vivo imaging og 2) kalibrere laseren og vælge de korrekte strømindstillinger for at skabe et rent nerve transection, der resulterer i minimal ekstra vævsskader . For at sikre en vellykket axotomi til in vivo billeddannelse og efterfølgende analyse, montere flere larver enten på individuelle glasbund retter eller i en glasbund skål med delere. Når du har kalibreret laser, anbefaler vi tester forskellige strømindstillinger på en test larve til at identificere de optimale parametre for nerve transection. Disse indstillinger er normalt relativt konsistent mellem eksperimenter, men kan ændre sig, hvis: 1) larver ikke er monteret korrekt, 2) larver af forskellige aldre er brugt, 3) laseren ikke er kalibreret korrekt, 4) laseren trænger til vedligeholdelse eller 5) hvis nerver er placeret i meget forskellige anterior-posteriore holdninger, der ville følgeen forskel i væv tykkelse. En optimal nerve transection vil skabe en skade langs en nerve, der er mellem 2 og 5 um og ikke forstyrrer tilstødende væv.
Ved analyse af respons helst celletype til nervesystemet skade, foreslår vi at gennemføre mindst 2 typer af kontroller. Den første er at vælge et område til at skade, der er umiddelbart ved siden af nerve af interesse, men er ikke rører nogen nervevæv. Dette vil give dig mulighed for at bestemme, om de cellulære svar, du ser, er på grund af skader i almindelighed eller til skade axoner. Den anden kontrol er at billedet en skadede nerve i den samme fisk, som du har oprettet en skade. Denne form for kontrol eliminerer larve til larve variabilitet grundet mellemstationer og billedbehandling parametre, herunder konfokal eksponeringstider til billedhåndtering, osv.
I denne protokol beskriver vi også scenarier, der skaber skader, der er for lille eller for stor for vores særlige undersøgelser. Afhænding på den eksperimentelle spørgsmål, kan disse typer af skader kan anvendes til analyse. De vigtigste begrænsninger af denne type procedure ville være de mål tilgængelige til oprettelse af skade og efterfølgende time-lapse billeddannelse. Den ældre larve, du bruger, jo længere arbejdstid distance mål kræves.
Protokollen vi beskriver her, gør det muligt for brugeren at oprette focal nerve transections langs dybe nerver i moden larver. Vi parret denne teknologi til in vivo, time-lapse imaging og bruge en kommercielt tilgængelig laserablation system, der reproducerbart skaber fokale Axon skader. Denne teknologi kan ændres til at bruge forskellige transgene linjer eller mutant larver til at teste forskellige hypoteser om de mekanismer, der genopbygge nervesystemet efter skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Kucenas Lab for værdifulde diskussioner og Quorum Technologies, Inc. enestående teknisk support. Arbejdet blev støttet af UVa Fund for Excellence i Videnskab og Teknologi (FEST) (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G | |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G | |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 | |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 | |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS | |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
References
- Geuna, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).
- Hirata, K., Kawabuchi, M. Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration. Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137, 3985-3994 (2010).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143, 145-155 (2010).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).
- Stoll, G., Muller, H. W. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).
- Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Development. 7, 19 (2012).
- Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres. Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).
