Abstract
Generering og analyse af vaskulære læsioner i egnede dyremodeller er en hjørnesten i forskning i hjertekarsygdomme, genererer vigtige oplysninger om patogenesen af læsion dannelse og virkningen af nye behandlingsformer. Anvendelse af åreforkalkning-tilbøjelige mus, kirurgiske metoder til læsion induktion, og kosten modifikation har dramatisk forbedret forståelse af de mekanismer, der bidrager til udviklingen sygdom og potentialet for nye behandlinger.
Klassisk, er analyse af læsioner udført ex vivo under anvendelse af 2-dimensionale histologiske teknikker. Denne artikel beskriver anvendelsen af optisk projektion tomografi (OPT) til 3-dimensional kvantitering af arterielle læsioner. Da denne teknik er ikke-destruktiv, kan den bruges som et supplement til standard histologiske og immunhistokemiske analyser.
Neointimale læsioner blev induceret af wire-indsættelse eller ligation af musen femorale kunstery mens atherosklerotiske læsioner blev frembragt ved indgivelse af en atherogene diæt til apoE-deficiente mus.
Læsioner blev undersøgt ved anvendelse af OPT billeddannelse af autofluorescerende emission efterfulgt af komplementær histologisk og immunhistokemisk analyse. OPT klart fornemme læsioner fra den underliggende vaskulære væg. Læsionsstørrelsen blev beregnet i 2-dimensionale sektioner ved hjælp planimetri, muliggør beregning af læsionsvolumen og maksimal tværsnitsareal. Data genereret ved hjælp af OPT var i overensstemmelse med målinger foretaget ved hjælp af histologi, der bekræfter rigtigheden af teknikken og dens potentiale som et supplement (snarere end alternative) til traditionelle analysemetoder.
Dette arbejde viser potentialet i OPT for billeddannelse aterosklerotiske og neointimal læsioner. Det giver en hurtig, meget nødvendige ex vivo teknik til rutinen 3-dimensionel kvantificering af vaskulær remodellering.
Introduction
Dannelsen af arterielle læsioner er centralt for høj sygelighed og dødelighed i forbindelse med hjerte-kar-sygdom 1. Læsiondannelse anses for at være forårsaget af en uhæmmet inflammatorisk reaktion på arterielæsion 2. Atherosklerotiske læsioner dannes langsomt som reaktion på kronisk skade på arterievæggen henviser restenotiske læsioner udvikle sig hurtigt efter akut mekaniske skader (for eksempel efter stent implantering). De mekanismer, der bidrager til udviklingen af arterielle læsioner er blevet præciseret væsentligt ved anvendelse af passende dyremodeller, ofte i kombination med relevante genetiske manipulationer 1.
Analyse af læsion størrelse og sammensætning har klassisk afhang tungt på ex vivo, 2-dimensional histologi (selv om dette er under forandring med udviklingen af forbedrede fremgangsmåder til in vivo og ex vivo detektion og analyse af læsioner i små dyr <sup> 3). Histologiske analyser af arterielle læsioner er arbejdskrævende, tidskrævende og giver begrænset information af 3-dimensionale struktur. For eksempel er læsion byrde almindeligvis bedømmes ved måling af tværsnitsarealet af en læsion (enten på tilfældigt udvalgte steder eller på stedet for maksimal okklusion). Dette giver en ufuldstændig analyse af den samlede læsion byrde. Whole-mount 3-dimensional imaging teknologi giver en mulig løsning på dette problem, men overraskende få egnede fremgangsmåder er blevet beskrevet. Dette kan skyldes overvejende til størrelsen af muse arterier som er for store til enkelt-foton konfokal mikroskopi men for lille til magnetisk resonans billeddannelse (MRI) 4 og røntgen computertomografi (CT) 5. Anvendelse af ex vivo MRI og mikro CT til studiet af atherosklerotiske læsioner i mus tyder de tilbyder begrænset opløsning, selv i relativt store arterier. Hertil kommer, at de relativt lange erhvervelse gange krævesbegrænse gennemløb (og øge scanning omkostninger) 4,6.
Udvikling af nye optiske billeddiagnostiske metoder (såsom optisk kohærens tomografi 3,7 og foto-akustisk tomografi 8) byder på meget potentiale for at forbedre billeddannelse af læsioner i murine arterier. Tilsvarende potentiale er vist ved optisk projektion tomografi (OPT), som blev udviklet for at muliggøre analyse af musefostre. OPT er designet til at afbilde prøver, der spænder fra ~ 0,3-10 mm i diameter 9. Transmission billeddannelse registrerer opaciteten af et halvgennemsigtigt prøve og polykromatiske synligt lys og kan anvendes til identifikation af anatomiske strukturer. Emission billeddannende optegnelser emission af lys efter excitation ved specifikke bølgelængder fra endogent (f.eks, collagen, elastin) og eksogene fluoroforer i prøven. Dette kan også give anatomiske oplysninger (da forskellige vævskomponenter kan variere i type og tæthed af autofluorescerende arterstede). Endvidere kan fordelingen af immunreaktivitet eller genekspression bestemmes med anvendelse af passende fluorescerende prober 10. For enten imaging mode (transmission eller emission) er lys fokuseret på et ladningskoblet enhed til at tillade iterative billedoptagelse som prøven roterer (normalt 400 billeder på 0,9 ° trin). Disse kan bruges til beregning af volumen ved standard tomografiske genopbygning metoder (såsom filtreret back-projektion (ved hjælp af en kegle algoritme) eller iterativ rekonstruktion).
Denne video viser vores nye anvendelse af OPT til hurtig, kvantificerbare og omkostningseffektiv 3-dimensionel analyse af aterosklerotiske og neointimal læsioner, som tidligere beskrevet i Kirkby et al. 11. Teknikken blev vist at være egnet til kvantificering læsionsstørrelse i tre almindeligt anvendte modeller: (i) femoral arterie wire-skade; (Ii) femorale arterie ligering, og (iii) kost-induceret atherosklerose i apolipoprotein E mangelfuld (apoE - / -) mus.
Protocol
1. Kirurgisk Induktion af Neointimal Læsioner i Mouse lårarterie
- Forsøg med dyr bør udføres i overensstemmelse med nationale og institutionelle etiske krav. Alle operation skal udføres ved hjælp af passende aseptisk teknik. Induktion af neointimal læsioner opnås ved anvendelse af en modifikation af teknikken beskrevet af Roque et al. 12 og Sata et al. 13.
- Mandlige C57BL6 / J-mus afvejes (Alder 10-12 uger vægt 25-30 g) derefter bedøve ved at levere 4-5% isofluran i en induktion kammer. Når bedøvelsen er blevet induceret, overføre musen til en opvarmet måtten til at opretholde kroppens temperatur ved 37 ° C. Fortsæt administration af isofluran (2-3%) via en maske.
- Når et passende niveau af anæstesi er blevet fremkaldt (manglende respons til tå knivspids), give smertestillende dækning ved administration af buprenorphin (0,1 mg / kg -1). Derefter placere musen i rygleje end barbere den ventrale overflade af den venstre bagben.
- Lave et snit for at blotlægge musklerne i øvre bagben og mellem forgreningen med poplitaeaarterien og bugvæggen, brug stump dissektion for at isolere den femorale arterie og vene fra den femorale nerve. Overrisle såret efter behov under anvendelse af 1% w / v lidocain.
- Placere proximal (tæt på bugvæggen) og distal (umiddelbart under gren med poplitaeaarterien) midlertidige ligaturer (6/0 Mersilk) omkring den femorale arterie og vene for at styre blodstrømmen. Derefter isolere poplitaeaarterien (ca. 2-5 mm distalt for gren med den femorale arterie) og liger distalt. Placer en anden, ubunden ligatur under popliteale arterie.
- Lave et lille snit (arteriotomi) i poplitaeaarterien, umiddelbart distalt for gren med den femorale arterie, hvilket forhindrer blødning ved at påføre tryk til den proximale midlertidige ligatur. Advance en straight, affjedrede 0,014 "guidewire1-1,5 cm langs den femorale arterie i retning af den abdominale væg og efterlade på plads i 30 sekunder (figur 1A).
- Fjern ledetråden og liger poplitaeaarterien ovenfor arteriotomien, ved hjælp af ligatur placeret til dette formål, og pas på ikke at okkludere den femorale arterie.
BEMÆRK: ligation-induceret skade. Neointimal remodeling uden intraluminal skade kan induceres ved ligering femorale eller popliteale arterier (figur 1B og 1C). For at opnå dette følger trin 1,1-1,5. Du skal dog ikke gøre arteriotomien men (undgå trin 1.6) enten (i) ligere poplitaeaarterien umiddelbart distalt for lårarterien eller (ii) ligere den fælles femoralarterie ved forgreningspunktet med knæhaselymfeknuderne arterie. Fortsæt derefter med trin 1.8. - Fjern midlertidige ligaturer, lukke såret med diskontinuert ekstern sutur (5/0 Mersilk) og anvende EMLA creme (2,5% lidocain, 2,5% prilocain). At dyrene kan re få bevidsthed (normalt 5-10 min), og sikre, at de bevæger sig frit omkring deres bur (let halthed kan være tydelig i de berørte ben men dette bør løse i løbet af de første 2-3 dage efter operationen), før han vendte tilbage til at holde værelser. Mus behøver ikke at anbringes alene efter operationen.
- At dyrene kan komme sig i op til 3 måneder. Små læsioner vil begynde at dukke ~ 7 dage efter wire skade og vil nå et stabilt maksimal størrelse efter ~ 21-28 dage.
2. Induktion af atherosklerotiske læsioner i apolipoprotein E - / - mus
- Administrer vestlige kost (0,2% kolesterol, Research Diets, USA) til mandlige, 6 uger gamle ApoE-null mus (opdrættet i huset) i 12 uger.
- Atherosklerotiske læsioner er ofte synlige på grov inspektion af aortabuen og dens store grene (figur 2).
3. Analyse Arteriel Læsioner hjælp Optisk Projection Tomography (OPT)
nt "> BEMÆRK: OPT billeder af læsioner i murine femorale arterier og aortabuen prøver blev opnået ved hjælp af en optisk projektion tomograf.- Aflive mus ved transcardiac perfusion fiksering og forblødning under terminal anæstesi (80 mg / kg natriumpentobarbital), under anvendelse af hepariniseret (10 U / ml) phosphatbufret saltvand (PBS) efterfulgt af 10% neutral pufret formalin.
- Isoler femorale arterier eller aortabuen og dens store grene (venstre carotis arterie, venstre subclavia arterie, brachiocephale trunk), hvad der er relevant, og fjern uvedkommende peri-adventitial materiale. Post-fix i 10% bufret formalin O / N, inden opbevaring i 70% ethanol indtil brug.
- Indkapsle arterier i 1,5% agarose med lavt smeltepunkt, præ-filtreret gennem Whatman 113 V papir. Vedhæft hver prøve til en magnetisk OPT mount med cyanoacrylatklæbestof med aksen fartøjet i overensstemmelse med den af holderen. Trim overskydende agarose til en konisk form. Dehydrere i 100% methanol i mindst 12 timer.
- CLear skibe nedsænkning (for 12-24 timer) i en blanding af benzylalkohol og benzylbenzoat (1: 2 v / v).
- Placer clearede prøver i en kalibreret tomograf. Indstil beslutning til 1.024 x 1.024, og bestemme en optisk forstørrelse, der giver hele området af interesse at blive set. OPT volumen er isotrop z-aksen er rekonstrueret til den samme opløsning (dvs. 1.024 x 1.024 x 1.024), voxelstørrelse ~ 200 um. Dette kan udgøre en overvurdering af opløsning, da der sandsynligvis vil være genopbygning artefakter. Juster prøve position, således at den roterer om sin egen akse i centrum af synsfeltet i den lyse-field, transmissionskanal.
- I emissionen kanal GFP1 filter (excitationsfilter 425 nm med 40 nm band-pass; emission filter: 475 nm lang pasning), fokus prøven og justere eksponeringstid for at maksimere det dynamiske område for det resulterende billede (undgå overmætning). Scan skibet i emissionen eneste kanal GFP1, med en 0,9 ° rotation skridt. </ Li>
- Ved afslutning, bekræfter kvaliteten af dataopsamling ved hjælp DataViewer software. Fjern prøven fra scanneren.
- For at tillade efterfølgende histologisk analyse sted prøve i 100% methanol i> 24 timer før behandling for at paraffin som normalt.
4. Billede Genopbygning og analyse
Tomografisk re-konstruktion af filtreret back-projektion udføres ved hjælp NRecon software eller lignende. Rekonstruktioner kan udføres uden opsyn, i partier.
- Forbedre billedkvaliteten ved at kompensere for forskydning og justering billede intensitet niveauer.
- Kontrollere kvaliteten af billedet genopbygning hjælp DataViewer software.
- Identificer det relevante afsnit af prøven til analyse. Hold denne længde konsistent mellem fartøjer, hvis luminale dimensioner registreres.
- Definer omridset af læsioner ved manuelt at spore den passende grænse for 1 ud af hver 50 re-konstrueret tværsnit.
- Kontroller hver interleaved tværsnit for at sikre computergenererede interpolationer er korrekte. Manuelt justere grænsen, hvor det er nødvendigt.
- Indstil tærsklen den grå-niveau, så kun læsionen er valgt, og eksportere måledata.
- For hver scanning, definerer en lodret område af interesse indeholder læsionen og spore grænsen mellem medier og neointima (dvs.., Positionen af den interne elastiske lamina) for hver 50-scan-line. Interpolere intima / medie grænser for de sammenflettede scan linjer i software, og verificere og korrigere pasform hvor det er nødvendigt. Yderligere segment dette definerede tredimensionelle volumen til en manuelt defineret intensitet tærskel for at producere et binært billede sæt, hvor hvide pixels repræsenterer neointima og sorte pixels repræsenterer patent lumen.
- Målinger omfatter: total læsion volumen (objekt volumen), luminal volumen (lydstyrke alt - objekt volumen) og fordelingen af læsionen og lumen cross-sektional område langs den aksiale længde af den undersøgte beholder.
Representative Results
Indledende scanning af sunde (unlesioned) murine femorale arterier (n = 5) viste, at transmission billeddannelse ikke give nyttige billeder. Dette var en følge af de ryddede arterier bliver for (i stedet for uigennemsigtige) til transmission imaging.However gennemsigtig, dette er gavnligt for emission billeddannelse som der er ingen absorbans / spredning af det udsendte signal. I modsætning hertil femorale arterier autofluoresce kraftigt i emissionen kanal, med den største signal efter excitation ved 405 til 445 nm (i overensstemmelse med en 410 nm excitation top for elastin 14). 2-dimensionelle skiver rekonstrueret fra disse billeder tydeligt adskiller medierne fra lumen og adventitia og lumen.
I murine lårarterier høstet 28 dage efter wire- (n = 6) eller ligation- (n = 5) induceret beskadigelse neointimal fortykkelse var tydelig i ikke-tomografiske emissionsfremskrivninger (figur 3A). I rekonstruerede 2-Dimensional skiver, kunne koncentriske neointimale læsioner skelnes fra medierne ved deres svagere emission (figur 3B og figur S1).
OPT emission billeder af hele mount prøver af aortabuen og dets vigtigste grene fra aterosklerotisk mus (n = 8) identificerede læsioner med den forventede anatomiske fordeling (dvs.., I mindre krumning af aortabuen, den brachiocephale arterie, og oprindelsen Den venstre carotis og venstre subclavia arterier (figur 4A). tværsnitsbilleder viste, at disse var typisk excentriske læsioner og var tydeligt kunne skelnes fra medierne og lumen (figur 4B, fig S2 og S3).
Processing arterier til histologisk analyse efter OPT bekræftede den ikke-destruktive natur OPT, med sektioner med succes farvet ved hjælp af histologiske (USA Trichrome, Picrosirius rød) og immunhistokemisk (α-SMA, Mac-2) teknikker (figur 3C og 4C).
Måling af læsionens størrelse under anvendelse OPT har vist sig at være i overensstemmelse med målinger opnået under anvendelse af billedanalyse af histologiske snit taget fra den samme arterie 11.
Planimetrisk målinger af læsionsområde opnået ved OPT og histologi tæt korreleret ved lineær regression for wire- (R2 = 0,92) og ligering-induceret (R2 = 0,89) neointimal læsioner og aterosklerotiske plakker (R2 = 0,85). En vigtig fordel ved OPT er dets evne til at aktivere 3-dimensional analyse. Ved at udvikle volumetrisk kvantificering af læsioner med denne teknik, var vi i stand til at registrere læsioner mængder i trådløse (0,1100 ± 0,0091 mm 3, n = 6) og ligerings--såret femorale arterier (0,0200 ± 0,0089 mm 3, n = 5), og også i atherosklerotiske brachiocephale arterier (0.180 ± 0,018 mm 3; n = 8). Målinger blev meget reproducerbare (variationskoefficienter 5,4%, 11,4% og 4,8%, henholdsvis, n = 4) for alle typer af læsion. Neointimale læsioner i wire-skadede skibe var større (p <0,0001) end dem, der produceres ved ligering, i overensstemmelse med den større grad af skade påført af den tidligere.
De data, der genereres kan også udtrykkes som læsion profiler (Figur 5) og gengives til dynamisk, kvalitativ evaluering (se figur S1 - S3). Denne fremgangsmåde viste klart omfanget af læsion dannelse i respons på forskellige skade procedurer og fremhævede den ulige fordeling af læsion dannelse i skadede skibe.
Figur 1: Metoder til at indlede læsion dannelse i murine femoralarterie & #.160; (A) Retrograd indsættelse af en angioplastisk ledetråd i den femorale arterie ved hjælp af en arteriotomi i poplitaeaarterien stimulerer læsion dannelse i respons til at strække skade og fjernelse af endotel. Blodgennemstrømningen genetableret over skadede del af fartøjet. (B) Neointimal proliferation i fravær af intraluminale strækning, blotlægning eller afbrydelse til blodgennemstrømning kan induceres ved ligering enten den femorale eller poplitaeaarterien umiddelbart distalt til den femorale arterie bifurkationen. (C) En mere alvorlig ikke-fratagelsen skade / proliferation respons kan induceres ved ligering både de femorale og popliteale arterier tværs forgreningspunktet af den fælles femorale arterie. Denne teknik vil også blokere blodstrømmen i den distale del af den femorale arterie.
Figur 2:. Karakteristisk aflejring af atheroma i musen aortabuen Aterosklerose tilbøjelige (Apolipopotein E deficiente mus), der tilføres et højt kolesterol vestlige kost i 12 uger udvikler en karakteristisk mønster af læsion aflejring i aortabuen og dens store grene. Som påvist, læsioner er synlige (pile), ved grov inspektion under et dissektionsmikroskop, i aortabuen, den brachiocephale arterie, og i ostia af den venstre carotidarterie og venstre subclavia arterie.
Figur 3:. Læsion dannelse efter ligering af den venstre femoral arterie (A) Ikke-tomografiske fluorescens emission billeder (omvendt at øge klarheden - mørke områder svarer til stærkere emission) tillade identifikation af intimafortykkelse (rød arrowheannoncer). (B) Særskilte vaskulære regioner og lumen kan skelnes i tomografiske rekonstruktioner. (C) Histologisk analyse (USA trichrom) fremhæver den klare lighed med billeder opnået ved hjælp af OPT. Scale barer i (AC) er 200 mm. Tilpasset fra Kirkby et al. 11 Scale barer i (AC) er 200 um.
Figur 4:. Imaging af atheroma i aortabuen af aterosklerose tilbøjelige mus (A) atheroma (røde pilespidser) er indlysende i ikke-tomografiske billeder (omvendt, således at mørkere områder angiver stærkere emission og dermed forbedre klarhed), i aortabuen, i steder forudsagt som atheroma bærende ved inspektion i henhold til lysmikroskopi (se figur 2). (B) Dette mønster af fordeling bekræftes tomografisk cros-sektioner. (C) Histologisk (USA trikrom) farvning viser tæt lighed med tomografiske sektioner, og immunhistokemi ved hjælp af flere forskellige antistoffer understreger den komplementære karakter af OPT med traditionelle tilgange til læsion analyse. Scale barer i (A-B), er 1 mm; Scale bar i (C) er 250 um. RSA, højre subclavia arterie; RCA, højre halspulsåre; LCA, venstre halspulsåre; LSA, venstre subclavia arterie; BCA, brachiocephale arterie; AAo opstigende aorta; Dao, faldende aorta. Tilpasset fra Kirkby et al. 11
Figur 5: Analyse af læsion og lumen profiler indikerer varierende grad af neointimal proliferation som respons på forskellige metoder til arteriel skade Optisk projektion tomografi giver læsion og lumen tværsnit measuremen.ts, der skal afbildes mod afstand langs den femorale arterie. Dette viser klart, at sammenlignet med en uskadt arterie (A), delvis ligatur (B) producerer små, relativt diskrete læsioner, mens total ligation (C) producerer komplet okklusion på det sted, ligation, men læsionen ikke strækker sig langt langs arterien . Intraluminale wire skade (D) frembringer en læsion, der næsten fuldstændigt okkluderer den distale del af prøven og strækker sig langs hele længden af det scannede afsnit af arterien. Tilpasset fra Kirkby et al. 11
Figur S1. Animation rekonstruktion af tværsnitsbilleder opnået fra en mus femorale arterie efter ligering skade. Denne type animeret billede er nyttigt til både kvalitativ og kvantitativ analyse. Som animationen bevæger sig fra den proximale til den distale afsnit af arterien gradvis udvikling af en okklusiv neointima, discernible fra hulrummet og medierne, er umiddelbart indlysende. Sidegrene kan let identificeres, og der er indlysende luminale okklusion og passiv remodellering af arterien som læsion størrelse forøges. Komplet okklusion af karret sker når stedet for ligering er nået. Tilpasset fra Kirkby et al. 11
.. Figur S2 Animeret rekonstruktion af tværsnitsundersøgelser billeder af en aorta bue fra en åreforkalkning-tilbøjelige mus Animationen begynder med tværsnit af opstigende (venstre - som synes først) og faldende (til højre) aorta. Små læsioner forekommer i aorta ascendens som scanningen bevæger sig i retning af aortabuen. Billederne derefter flytte gennem buen for at vise den stærkt beskadigede ostia af brachiocephale (til venstre), venstre carotis (i midten) og venstre subclavia (højre) arterier. Da scanningen bevæger distalt langs disse grene læsionerne gradvist at reducere og forsvinde, først i SubCLavian arterie, så i carotis og endelig i brachiocephale arterie. Interessant læsionen i brachiocephale arterie bevæger onto strømningsadskilleren da dette fartøj deler sig i højre carotis og højre subclavia arterier. Tilpasset fra Kirkby et al. 11
Figur S3. Animated, volumen-renderet billede af en aortabuen fra en åreforkalkning-tilbøjelige mus. Optisk projektion tomografi tillader generation af 3-dimensionelle billeder, i dette tilfælde demonstrere læsion distribution i aortabuen af et apolipoprotein E mangelfuld mus. (A) Atheroma er til stede i de forventede steder (hele brachiocephale arterie, i ostia af de venstre carotis og subclavia arterier og i mindre krumning af aortabuen). (B) Segmentering og gengivelse af læsion (vist med rødt), der bærer tværsnit understreger fordelingen af plaques når overlejret på det oprindelige billede.Tilpasset fra Kirkby et al. 11
Discussion
3-dimensionel analyse har et stort potentiale til at erstatte eller tilføje til de 2-dimensionelle histologiske teknikker, der stadig understøtter de fleste undersøgelser af arteriel læsion dannelse. Her OPT er vist i små murine arterier (med murine femorale arterier sandsynligvis repræsenterer de mindste fartøjer, der kan analyseres med succes ved hjælp af denne teknik). Det er dog også egnet til brug med arterier (og læsioner) fra andre arter, herunder små-til-mellemstore menneskelige fartøjer; vores gruppe har med succes brugt den teknik til at analysere læsioner i kaninaorta (Bezuidenhout et al;. upubliceret). OPT lover hurtigere analyse og øget strukturel information sammenlignet med traditionel histologi og har den fordel ikke at forhindre efterfølgende analyse af prøven ved hjælp af både histologiske og immunohistokemiske teknikker.
De producerede hjælp OPT billeder gav anatomiske detaljer, der viser steder af læsion dannelseog størrelsen af læsioner i disse områder. Arterierne, der anvendes i disse undersøgelser er formentlig tæt på grænsen af opløsning for teknikken og billedkvalitet derfor forringes til en vis grad af artefakter (sandsynligvis som følge af rotation forskydning, ufuldstændige clearing, refleksion / brydning ved agarose knuder og fokus problemer) . På trods af dette, de oplysninger, der kræves (dvs. lag af karvæggen) forbliver mærkbar, og derfor teknikken er særdeles nyttige til kvantificering af de enkelte lag. Faktisk kunne billederne kvantificeres hurtigt og reproducerbart at give målinger af læsion og luminale volumen i plaque-bærende dele af skibet, samt tværsnitsarealer af læsionen og lumen på udvalgte steder i prøven. Store (aorta) og mellemstore (femoral, carotis, subclavia) murine arterier - dem, der generelt anvendes til analyse af aterosklerotisk og neotintimal læsion dannelse i mus - blev med succesanalyseret ved anvendelse af denne metode. Faktisk har vi nu brugt OPT at demonstrere effekten af farmakologiske interventioner og genmanipulation på aterosklerotisk og neointimal læsion størrelse. F.eks endothelin receptorblokade ændret neointimal læsion dannelse henviser selektiv deletion af endothelin B-receptor fra det vaskulære endotel ikke 15. Ved atherosklerose tilbøjelige mus, blev genetisk deletion af enzymerne 11β-HSD1 16 eller galectin 3 17 vist at reducere størrelsen af aterosklerotiske læsioner.
Kvantificering af læsion volumen er en indlysende fordel ved OPT. Det giver en mere informativ indikation af den samlede læsion belastning i en arterie 4 end normalt opnås med histologiske metoder. Analysere hele læsionen mindsker selektionsbias og fejl, der uundgåeligt vil opstå, når diskrete sektioner af et fartøj er valgt til analyse. Produktion af langsgående læsion profiler er en yderligere styrke i OPT, Understreges af sammenligning af læsioner induceret af forskellige typer af skader 13,16 (figur 5). For eksempel har både komplet ligering og wire-insertion inducerede næsten total okklusion tæt på femero-popliteale bifurkation. Wire skade, producerede dog læsioner, som strækker sig langs hele længden af det scannede sektion, mens læsioner induceret af arteriel ligering hurtigt formindsket i størrelse og forsvinde. Dette mønster er i overensstemmelse med højere grad af skade forårsaget af insertion af angioplastik guidewiren. Generering lignende resultater ved brug histologiske snit er dyrt, tidskrævende og arbejdskrævende.
Fordelene ved OPT omfatter kvaliteten af de billeder, den producerer, og dens relative hastighed og enkelhed (vi har rutinemæssigt scannet 20 fartøjer om dagen). Billedkvalitet synes overlegen, eller i det mindste sammenlignelige, til andre metoder til generering 3-dimensionelle billeder ex vivo (såsom MRI og mikro- CT), yet OPT kræver kortere scanning gange (integration tid for vores studier var typisk 1-2sec / billede), og er billigere. Prøveforberedelse strækker sig over flere dage, men kræver lidt arbejde, kan fartøjerne være forberedt i partier, og data kan erhverves i en session. Følgelig gennemløb er høj og ikke kræver udvidet brug af scanneren. Vigtigere, ikke-destruktiv karakter OPT betyder at den kan anvendes til at identificere steder af interesse til immunhistokemisk undersøgelse; dermed reducere mængden af opskæring og farvning påkrævet. Det er muligt, at udvikling af høj opløsning ultralyd vil give en alternativ metode til volumetrisk kvantificering af læsioner i arterierne denne størrelse, men forfatterne er uvidende om eventuelle publikationer, der viser denne ansøgning.
Måske ikke overraskende, billedkvalitet i OPT er ringere end mikroskopiske teknikker (der kan selvfølgelig kun udføres på mindre prøver). Foreslåede forbedringer til reconstruction af data, kan rette denne begrænsning ved at tillade fremtidig forbedring af billedkvaliteten 19,20. En anden metodisk bekymring er, at vævsbehandling ændrer prøvens egenskaber. For eksempel den lipofile karakter af klarende middel, benzylalkohol / benzylbenzoat (Babb), vil sandsynligvis fjerne lipid fra atherosklerotiske læsioner, mens forudgående dehydrering kan forårsage krympning (selvom naturligvis er dehydrering og lipid fjernelsestrinene også en funktion af prøve forberedelse til indlejring i paraffinvoks). Babb blev brugt i denne undersøgelse som i sammenligning med hydrofile clearing agenter (f.eks glycerol 21) det forårsager kun små ændringer i morfologi.
Der er flere muligheder for yderligere udvikling og forbedring af OPT, især med hensyn til sporing af 3-dimensionelle arrangement af centrale celler og signaler faktorer involveret i arterielt remodeling. Den stærke autofluorescens af arterievæv, som er sådan enn fordel i genereringen af anatomiske billeder, ikke udslukkes ved eksisterende metoder til blegning 22 og kan begrænse anvendelsen af fluorescerende prober til at vurdere RNA og protein fordelingsmønster. Anvendelsen af kolorimetriske prober (fx β-galactosidase) visualiseret ved transmission billeddiagnostik kan overvinde denne begrænsning.
Afslutningsvis OPT har et stort potentiale for 3-dimensionel afbildning af læsioner i intima af murine arterier. Den repræsenterer et betydeligt fremskridt på 2-dimensionelle metoder, som generelt arbejdskrævende og ikke effektivt repræsenterer total læsion volumen. OPT er relativt hurtigt, bekvemt og ikke-destruktiv. Nye udviklinger i billedanalyse lover at øge styrken og nytte af teknikken.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af stipendier fra University of Edinburgh (NSK) og Carnegie Trust (LL, Henry Dryerre ordning) og finansiering fra British Heart Foundation (PWFH, BRW, PMS, RG / 05/008, PG / 05/007; PG / 08/068/25461) og Wellcome Trust (JRS, BRW, PMS, 08314 / Z / 07 / Z). Forfatterne er taknemmelige for at støtte for deres arbejde, som den BHF-finansierede Center for Forskning Excellence prisen til Center for Cardiovascular Science.
Forfatterne er især taknemmelig for rådgivning fra professor Masataka Sata (University of Tokushima) og Dr. Igor Chersehnev (i Dr. Ernane Reis 'gruppe på Mount Sinai School of Medicine) om etablering af de kirurgiske modeller af neointimal læsion produktion. Videoen er produceret og stillet til rådighed af Sata et al. (Http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) var særlig nyttig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating Microscope | Zeiss, Germany | OPMI Pico i | |
| Anesthetic Machine | Vet Tech, UK | ||
| Fluovac | Harvard Apparatus UK | 340387 | |
| Fluosorber | Harvard Apparatus UK | 340415 | |
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools, UK | 1800-45 | |
| Heated Mat | Fine Sceince Tools, UK | 21061-10 | |
| Balance | Mettler Toledo | MS1602S | PB1502 or equivalent |
| Sutures | Ethicon, UK | 5/0 Mersilk | |
| Guidewire | Cook Inc, USA | C-PMS-251 | 0.014” |
| Suture Silk | Fine Science Tools, UK | 18020-60 | 6/0 Mersilk |
| Surgical Tools | Fine Science Tools, UK | 14058-09 | Toughcut Iris scissors |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, UK | 15000-01 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools, UK | 11251-35 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools, UK | 11370-31 | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools, UK | 13008-12 | |
| Bulldog clips | Fine Science Tools, UK | 18050-35 | |
| Bioptonics 3001 Tomograph | Bioptonics, UK | ||
| Magnetic OPT Mount | Bioptonics, UK | ||
| Computer | Dell Inc, UK | ||
| Peristaltic pump | Gilson | F117606 | Minipuls 3 |
| DataViewer software | Skyscan, Belgium | v.1.4.4 | |
| NRecon software | Skyscan, Belgium | v.1.6.8 | |
| CTan software | Skyscan, Belgium | v.1.12 | |
| Isoflurane | Merial Animal Health Ltd, UK | AP/Drugs/220/96 | 100% Inhalation vapor, liquid |
| Medical Oxygen | BOC Medical, UK | UN1072 | |
| Vetergesic | Alstoe Animal Health Ltd, UK | 0.3 mg/ml | |
| 1% Lignocaine | Hamlen Pharmaceuticals, UK | LD1010 | 10 ml ampoule |
| EMLA Cream | Astra Zeneca, UK | ||
| Sodium Pentobarbital | Ceva Animal Health Ltd, UK | ||
| Western Diet | Research Diets, USA | D12079B | 0.2% cholesterol |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma UK | P4417 | |
| Heparin (Mucous) | Leo Laboratories, UK | PL0043/003GR | 250,000 Units |
| Neutral Buffered Formalin | Sigma, UK | HT501128 | 10% |
| Ethanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20821.33 | Absolute AnalaR |
| Agarose | Invitrogen, UK | 16020050 | Low melting point |
| Filter Paper | GE Healthcare, UK | 113v | Whatman |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel, UK | 4304 | Loctite |
| Benzyl alcohol | Sigma, UK | B6630 | |
| Benzyl benzoate | Sigma, UK | 402834 | |
| Methanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20856.296 | 100% |
References
- Luis, A. J.
- Ross, R.
- Deuse, T. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J Vis Ex. (31), (2009).
- McAteer, M. A. Quantification and 3D reconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 2384-2390 (2004).
- Martinez, H. G. Microscopic Computed Tomography-Based Virtual Histology for Visualization and Morphometry of Atherosclerosis in Diabetic Apolipoprotein E Mutant Mice. Circulation. 120, 821-822 (2009).
- Langheinrich, A. C. Atherosclerotic Lesions at Micro CT: Feasibility for Analysis of Coronary Artery Wall in Autopsy Specimens. Radiology. 231, 675-681 (2004).
- Ambrosi, C. M. Virtual histology of the human heart using optical coherence tomography. J Biomed Opt. 14, 054002 (2009).
- Ku, G. Photoacoustic microscopy with 2-micron transverse resolution. J Biomed Opt. 15, 021302 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sharpe, J.
- Kirkby, N. S. Quantitative 3-Dimensional Imaging of Murine Neointimal and Atherosclerotic Lesions by Optical Projection Tomography. PloS ONE. 6 (2), e16906 (2011).
- Roque, M. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid, accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 335-342 (2000).
- Sata, M. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32, 2097-2104 (2000).
- Richards-Kortum, R., Sevick-Muraca, E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis. Annu Rev Phys Chem. 47, 555-606 (1996).
- Kirkby, N. S. Non-endothelial cell endothelin-B receptors limit neointima formation following vascular injury. Cardiovascular Research. 95, 19-28 (2012).
- Kipari, T., et al. 11-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 deficiency in bone marrow-derived cells reduces atherosclerosis. FASEB J. 27 (4), 1519-1531 (2013).
- Mackinnon, A. C. Inhibition of galectin-3 reduces atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice. Glycobiology. 23 (6), 654-663 (2013).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Walls, J. R. Correction of artefacts in optical projection tomography. Phys Med Biol. 50, 4645-4665 (2005).
- Walls, J. R. Resolution improvement in emission optical projection tomography. Phys Med Biol. 52, 2775-2790 (2007).
- Bucher, D. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100, 135-143 (2000).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat Methods. 4, 31-33 (2007).
