Etikett-fri isolering och anrikning av celler Genom kontaktlös dielectrophoresis

Summary

Kontaktlösa dielectrophoresis (CDEP) uppnår sortering och anrikning av partiklar genom deras inneboende dielektriska egenskaper. Fluidelektrodkanaler ersätter metallelektroder traditionella till DEP, passande CDEP till icke-skadliga steril karakterisering och sortering av biologiska partiklar. Vi visar hur man förbereder en CDEP mikroanordning och genomföra cell karakterisering och sorteringsexperiment.

Abstract

Dielektrofores (DEP) är det fenomen genom vilket polarise partiklar i ett olikformigt elektriskt fält undergå translationsrörelse, och kan användas för att styra rörelsen av mikropartiklar i en ytmarkör-oberoende sätt. Traditionellt DEP enheter inkluderar plana metallelektroder mönstrade i provkanalen. Detta tillvägagångssätt kan vara dyrt och kräver ett specialiserat renrumsmiljö. Nyligen har en beröringsfri metod som kallas kontakt dielectrophoresis (CDEP) utvecklats. Denna metod använder den klassiska principen för DEP samtidigt undvika direkt kontakt mellan elektroderna och provet genom mönstring fluid elektroder och en provkanal från en enda polydimetylsiloxan (PDMS) substrat, och har program som en snabb mikroflödes strategi för att sortera och berika mikropartiklar. Unikt för denna metod är att det elektriska fältet som genereras via fluidelektrodkanaler innehållande en starkt ledande vätska, som är skild frånprovkanalen med en tunn isolerande barriär. Eftersom metallelektroder som inte direkt kommer i kontakt med provet, är elektrolys, elektrod delaminering, och provkontaminering undviks. Dessutom möjliggör detta att en billig och enkel tillverkningsprocess.

CDEP är därmed väl lämpad för att manipulera känsliga biologiska partiklar. Den dielektroforetiska kraften som verkar på partiklarna beror inte bara på rumsliga gradienter av det elektriska fältet som alstras av anpassnings anordningens konstruktion geometri, utan de inneboende biofysiska egenskaper hos cellen. Som sådan är CDEP en etikett-fri teknik som undviker beroende på ytuttryckta molekylära biomarkörer som kan steglöst uttrycks inom en population, och samtidigt tillåta karakterisering, anrikning, och sortering av biopartiklar.

Här visar vi grunderna i tillverkning och experiment med hjälp CDEP. Vi förklarar den enkla beredning av en CDEP chip med mjuk litografiy tekniker. Vi diskuterar den experimentella proceduren för att karakterisera delningsfrekvens av en partikel eller cell, den frekvens vid vilken den dielektroforetiska kraften är noll. Slutligen visar vi att använda denna teknik för sortering av en blandning av äggstockscancerceller och fluorescerande mikrosfärer (pärlor).

Introduction

Biologisk provanrikning och partikelsortering är ofta nödvändigt för efterföljande analys. ¹ har till exempel isolering av sällsynta celler från kroppsvätskor viktiga tillämpningar inom cancer upptäckt och individualiserad medicin. ^2,3 De vanligaste teknikerna anrikning är fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS ) ⁴ och magnetisk aktiverad cellsortering (MACS), ^5, som förlitar sig på uttryckta ytmarkörer att skilja celler. Andra strategier inkluderar hydrodynamisk ⁶ eller tröghets ^7,8 sortering, optisk pincett, ⁹ akustofores, ¹⁰ och dielektrofores. ^11,12 dielektrofores är rörelsen av en polariserad partikel i närvaro av ett icke likformigt elektriskt fält. ¹³ DEP har använts för ett brett spektrum av tillämpningar, ^2,14 inklusive sorterings celler baserat på lönsamheten, ¹⁵ karakterisera bioelektriska egenskaper hos celler, ¹⁶ och sorteraing upon inducerade förändringar i biofysikaliska egenskaper hos celler. ^17,18 Traditionell DEP utnyttjar plana elektroder mönstrade inom en mikroflödeskanalen för att applicera en spänning och inducera ett olikformigt elektriskt fält. ¹³ Även om detta är en kraftfull teknik, kan problem uppkomma, såsom elektrod delaminering och elektrolys. Insulator-baserade dielectrophoresis (IDEP) ¹⁹ har tagit upp de utmaningar som nedsmutsning, elektroddelaminering, och spatial nedbrytning av elektrodfältet genom mönstring isolerande strukturer som inducerar ojämnheter i en DC elektriskt fält. IDEP har använts för att selektivt separera levande och döda bakterier celler, ¹⁹ isolera bakteriesporer, ²⁰ och manipulera DNA, ²¹ bland andra applikationer. Joule-uppvärmning kan vara en utmaning, eftersom den kan ske som ett resultat av de höga likspänningar ofta krävs. För att lindra dessa utmaningar, har kontaktfria DEP microdevices utvecklats. ^22-24

22 Unikt för denna strategi är att ersätta metallelektroder med vätskeelektrodkanaler fyllda med en starkt ledande lösning. Dessa fluidelektroderna är kapacitivt kopplad över ett tunt isolerande barriär till provkanalen via en växelspänning. Eliminera prov kontakt med elektroder minskar frågor i samband med DEP-baserade metoder som elektrolys och bubbelbildning, prov förorening, och elektroddelaminering. Som ett resultat är CDEP speciellt användbar för biologiska prover eftersom det stöder livskraften hos cellerna i provet. Viktigt kan CDEP håller proven sterilitet. Ett chip kan förberedas i en cellkultur huva och försöket kan genomföras utan att prov kontakt med metallelektroder eller som kräver att provet vara öppet för environment. En enkel reservoar kan fixeras till chipet utlopp för att underlätta steril provutbyte. Dessutom vid tillverkning av vätskeelektroder från samma biokompatibla polymermaterial (PDMS) som provkanalen reducerar den höga kostnaden med anpassade mönstring av metallelektroder, tiden som krävs för fabricering, och begränsar behovet av specialiserad renrumsutrustning till den initiala mönstring av den återanvändbara kiselwafer stämpel.

Förflyttning av partiklar på grund DEP beror på egenskaperna hos partikeln och medium, liksom de rumsliga gradienter av det elektriska fältet. En partikel-och frekvensberoende faktor, kallad Clausius-Mossotti (CM) faktor, antar ett värde i området -0,5 till 1, och bestämmer riktningen för DEP-kraft. Den frekvens vid vilken CM faktorn är exakt noll kallas delningsfrekvensen. Detta är den punkt vid vilken ingen dielektroforetisk kraft utövas på en partikel och GH faktorändringar tecken. A single delningsfrekvens för inerta fasta mikrosfärer uppstår när CM faktorn ändras från negativ till positiv ²⁵ För däggdjursceller i låg buffert konduktivitet i storleksordningen 0,01 S / m, en första delningsfrekvens indikerar en övergång från NDEP till PDEP finns nära 10. - 100 kHz, och påverkas av storleken, formen, cytoskelettet och membranegenskaperna hos cellen. ^26,27 En andra brytfrekvensen vid en övergång från den PDEP till NDEP regimen är av storleksordningen 10 MHz, och påverkas av den nucleus-cytoplasman förhållande, cytoplasma ledningsförmåga, och endoplasmatiska retiklet. ²⁷ DEP kraft kan appliceras utan närvaro av vätskeflöde, men här använder vi en flödande vätska för att uppnå kontinuerlig sortering av suspenderade partiklar. Den kombinerade inverkan av dielektroforetisk kraft och Stokes dragkraft diktera translationsrörelsen hos en partikel.

Vi har utvecklat produkter för drift i två frekvensområden. Högre frequency-enheter (100-600 kHz) som har fungerat med användning PDEP och uppnått satsvis sortering av celler, såsom prostatatumör initierande celler (tics), murina äggstocksytan epithelial (Mosè) celler, MDA-MB-231-bröstcancerceller, eller bor THP -1 celler genom att selektivt fånga celler av intresse på isolerande beskickningar som ligger i provkanalen. ^28-31 lägre frekvens (5-100 kHz) enheter arbeta kontinuerligt, och när de används på en frekvens där en befolkning upplever PDEP medan bakgrundsbefolknings upplevelser NDEP kan omdirigera partikel banor för att uppnå sortering. ^32-34 Dessa lågfrekventa anordningar har använts för att sortera cancerceller från röda blodkroppar, fastställa förändringar i dielektriska egenskaperna hos en progressiv MOSE cellinje, och att belysa effekterna av icke- giftiga sfingolipiden behandlingar vända aggressiva egenskaper aggressiva mose celler. Dessutom kan CDEP microdevices vara konstruerade för att arbeta vid en ökad genomströmning, för närvarande upp till 1 ml / timmer.. ^31,35

Som beskrivits, flexibilitet och låga kostnader för tillverkningsprocessen kan göra utformade enhet geometrier, som gör det presenterade försöksförfarandet vara relevant för ett brett spektrum av applikationer. Det långsiktiga målet för CDEP är att realisera etikett-fri cellsortering och anrikning på en klinisk nivå, med prov återhämtning för efterföljande kultur eller behandling. Tekniken som presenteras här är en enkel och billig metod, från tillverkning till experiment, vilket ökar tillgängligheten för DEP. Vi visar framställningen av en CDEP chip och det experimentella protokollet för att uppnå karakterisering och anrikning av äggstockscancerceller från fluorescerande mikrosfärer.

Protocol

1. Tillverka en prototyp CDEP mikroflödessystem enhet: Översikt

1. Följ tidigare redovisade förfaranden ²² med hjälp av fotoresist och Deep Reactive Ion Etching (DRIE) att etsa önskad kanal utformning (figur 1) i en kiselskiva (Figur 2). Avsätt ett tunt lager av teflon för att förbättra frigörandet av den mikroanordning från skivan.

Figur 1. Schematisk bild av en lågfrekvent kontinuerliga sorteringsenhet. Provkanal körningar vänster till höger och är 500 ^ m bred med sågtand förträngningar till 100 | im. De två paren av fluidelektrodkanaler komponera käll-och sjunkelektroderna, respektive, och är separerade från provet kanalen genom en 20 ^ m tjock PDMS barriär.

Figur 2. Den fabrblue processen för en CDEP enhet. (a) för 60 sekund, reagerar UV-ljus selektivt med fotoresist exponeras genom ett maskmönster av CDEP enheten geometri. (b) fotoresisten avlägsnas med hjälp av framkallare. (c) Djup reaktiv jonetsning (DRIE) används för att etsa 50 um djupa funktioner och 5 min av våtetsning av tetrametylammoniumhydroxid (TMAH) 25% vid 70 ° C används för att reducera grovheten på sidoväggarna. (d) en teflonbeläggning tillsätts för att förbättra enhetens frisättning från skivan. (e) PDMS hälls på den återanvändningsbara wafer stämpel Efter avgasning och härdades under 45 minuter vid 100 ° F (f) PDMS avlägsnas från skivan. PDMS och ett rent objektglas exponeras för luftplasma under 2 min och sammanbundna.

2. Linda skivan med aluminiumfolie för att förhindra spridningseffekter. Blanda polydimetylsiloxan (PDMS) i 10:1 av elastomer till härdare, de-gas i ca 20 minOch häll ut på skivan. Värme i 45 min vid 100 ° C för att undvika att skada teflonbeläggning av stämpeln. Låt enheten svalna.
3. Efter kylning avlägsna aluminiumfolie, trim PDMS med användning av ett kirurgiskt blad, och stansa accesshålen vid kanalinlopp / utlopp, med hjälp av en trubbig lagare anpassad till storleken på slangen. Här är en 1,5 mm trubbig puncher används.
4. Ren en glasmikroskopskiva med användning av en sköljning av tvål och vatten, etanol, avjoniserat vatten, och torkningen med luft, respektive. Rengör PDMS-enheten med hjälp av Scotch Magic Tape. Undersök i mikroskop för att vara säker på att kanalerna är rena. Exponera bilden och PDMS-enheten till luftplasma i 2 min. Tryck fast kanalsidan av enheten till glasskiva, undvika att luftbubblor bildas mellan enheten och bilden (Figur 3).

Figur 3. (a) Den mask som används för fotolitografi under kiselskivan stämpeltillverkning, och (b) det färdiga PDMS-glasanordning med provet och vätskeelektrod kanaler fyllda med grön och röd karamellfärg, respektive. Se figur 1 för dimensioner. Klicka här för att visa en större bild .

2. Förbereda en cellsuspension i DEP Buffer

1. Förbered en låg ledningsförmåga (100 ^ S / cm) buffert, som kommer att kallas "DEP buffert" (8,5% sackaros [w / v], 0,3% glukos [w / v], 0.725% RPMI [w / v]) . ¹⁶
2. Suspendera cellerna i DEP-buffert vid 3 x 10 ⁶ celler / ml. Här är cancerogena slutskedet mus äggstocks yta epitel (MOSE-L)-celler som används.

OBS: Cellviabilitet analys av trypanblått uteslutningsmetoden visade en liten minskning av lönsamheten(Från 95,1 till 91,6%) i ett tidigt skede MOSE (MOSE-E)-celler suspenderade i DEP-buffert vid rumstemperatur efter 5 timmar. Det förutspås att en motsvarande liten minskning av viabilitet inträffar för MOSE-L-celler, vilket indikerar att cellerna inte bör förvaras i DEP-buffert långsiktigt.

3. Dye-celler med användning av en fluorescerande membran-permeabla färgämne, såsom enzymatiskt aktiverad Calcein AM.
4. Mät ledningsförmåga färgade cellsuspensionen. Konduktiviteten bör vara ungefär 100 | iS / cm. Om mätningen konduktiviteten är för hög, centrifugera provet ned, återsuspendera i DEP-buffert vid 3 x 10 ⁶ celler / ml och upprepa mätningen ledningsförmåga.

3. Fylla på CDEP Microfluidic Chip

1. Placera microfluidic chip under vakuum under 30 min.
2. Samtidigt skära en bit av flexibel slang för att spänna över avståndet från sprutpumpen till mikroskopet stadium där microfluidic chip kommer att placeras. Här, ett 6 tum rörlängdkrävs. Montera slangen till nålen spets på sprutan.
3. Uppskatta den erforderliga längden för utloppsslangen genom att dividera målet uppsamlades prowolymen av tvärsnittsarean av röret. Skär kräver lång slang.
4. Draw cellsuspensionen i sprutan. Kontrollera att inga bubblor finns i slangen eller spruta.
5. När du tar bort chip från vakuum, sätt i utloppsslangen och fyll provkanalen snabbt för att undvika luftbubblor i kanalerna. Knacka försiktigt på sprutan när grundning för att undvika att sprängas sönder det tunna (20 nm) isolerande barriär, även om det har observerats att barriären tål en konstant hög genomströmning nära 5 ml / h utan att brista.
6. För prime elektrodkanalerna, snabbt placera tomma pipettspetsar i ett uttag på varje fluidic elektrodkanal. Pipettera 200 | il PBS innehållande en liten mängd av rodamin B och knacka försiktigt för att införa fluid i den motsatta änden av elektrodkanal. Behåll lätt trycktills PBS med rodamin B fortskrider synbart upp spetsen av den tomma pipettspetsen. Upprepa för varje elektrodkanal. Rodamin B används endast för att fluorescerande visualisera fluidelektrodkanalerna.
7. Efter grundmålning, fyller varje pipettspetsen behållare med PBS med rodamin B. Undvik bubbelbildning i pipettspetsen reservoarer, och ta bort eventuella synliga bubbla genom att pipettera försiktigt upp och ner. Lossa utloppsslangen och kassera på lämpligt sätt, sätt in ett nytt utlopp slang behållare för att samla målvolymen.

4. Characterizing Övergångsfrekvens av celler med hjälp CDEP Chip

1. Placera marker på scenen av ett inverterat mikroskop utrustad med digitalkamera (Figur 4).

Figur 4. (a) Total experimentuppställning för CDEP experiment. Den CDEP chip ligger på plattformen av den inverterat mikroskop. En kamera skickar bilder till datorn för inspelning. Sprutpumpen upprätthåller ett konstant inloppsflödet. Funktionsgeneratorn genererar en signal som intensifieras av högspänningsförstärkare och ansluten till CDEP chip med trådelektroder. Oscilloskopet övervakar signalen sänds till chip. (B) detaljerad bild av CDEP chip och fluidic och elektroniska kontakter. Klicka här för att visa en större bild .

2. Montera sprutan på sprutpumpen och sätt trådelektroder i fluidelektrodkanal reservoarer.
3. Pumpa fluid genom åtmin 1 ml / h för att säkerställa god kontakt mellan sprutpumpen och sprutan. Inspektera kanallängd för att säkerställa obehindrat flöde av celler och frånvaron av bubblor eller läckor. Röduce flödeshastigheten till 0,005 ml / timme.
   Notera: Genom så hög som 1 ml / h ^31,35 har uppnåtts i enheter från andra geometrier.
4. För säkerhets skull testa elektroniken genom att driva på funktionsgenerator, högspänning förstärkare, och oscilloskop, och justera till önskad spänning och frekvens. Här dessa parametrar är 200 V och 20 kHz. Vid verifiering av acceptabla prestanda, avstängning. Anslut elektroderna till högspänningsförstärkare.
   Obs: Följ lämpliga elektriska säkerhetsrutiner vid drift elektroniken vid höga spänningar som används för dessa experiment.
5. Vid uppnå jämn ström, tillämpa den önskade spänningen vid önskad frekvens. I detta experiment är spänningen 200 V _rms vid frekvenser mellan 5-60 kHz.
6. Spela in videofiler av cellresponsen med bildbehandlingstekniker (steg 5) för att kvantifiera cellfördelning i kanalen och för att karakterisera den delningsfrekvens. För att göra detta,upprätthålla en konstant spänning och variera frekvensen systematiskt. I början och slutet av försöket, liksom slumpmässigt mellan försökskörningar, spela distributionskontrollcellen, fördelningen av cellerna utan att tillämpa någon elektriskt fält. Uppskatta den tid som erfordras för celler att flöda från inloppet till den övervakade platsen (här 5 min). Efter att ha ställt en ny frekvens, vänta denna tid, sedan börja spela in (här, en 2 min video distributions cell).

5. Bildbehandling för karakterisering Delningsfrekvens

1. Med hjälp av en beräkningsskript, analysera varje video ram för ram för att bestämma den relativa y-positionen (där z-riktningen är det vertikala djup av kanalen, är y-riktningen kanalbredden, och x-riktningen är kanallängden) av varje fluorescerande cell eller partikel vid ett givet x-koordinat nedströms region med hög DEP-kraft i kanalen. Skapa en graf över de relativa disbution.
2. Jämför mot centrumlinjen för fördelning vid varje spänning och frekvens med centrumlinjen hos styrdistributions. För en given spänning och varierande frekvenser, fastställa vilken delningsfrekvens, där mittlinjen överensstämmer med y-positionen av styrningen.

6. Variera Experiment för att utföra Cell Sorting eller anrikning

1. Suspendera önskade blandningen i DEP-buffert vid en total koncentration av 3 x 10 ⁶ partiklar / ml. Här är denna blandning MOSE-L-celler med 4 ìm fluorescerande pärlor i DEP-buffert. Utför de tidigare beskrivna åtgärder för att förbereda en CDEP enhet.
2. Om du vill sortera eller berika celler från en blandning, bestämma delningsfrekvenser för målceller och bakgrundspartiklarna som tidigare beskrivits. Kör experimentet med en frekvens mellan de två delningsfrekvenser för målceller och bakgrundspartiklarna så att de två populationer av partiklar upplever DEP krafter i motsatt directions. Om du vill sortera MOSE-L-celler och 4 ìm pärlor, driva mikroanordning ovanför 11,90 ± 0,63 kHz. den första övergångsfrekvens MOSE-L-celler nyligen rapporterades av Salmanzadeh et al. ³³
3. För att samla innehållet i en sorterad prov avlägsna utloppsslangen vid uttag av den målvolym, genom placering av en handske finger över utloppsöppningen och försiktigt rycka i slangen. Häll den uppsamlade målvolymen i en behållare för vidare analys Anm. Andra prov utvinningsmetoder kan innefatta fastsättning av en permanent reservoar till chipet och avlägsna provet genom enkel pipettering.

Representative Results

DEP bör observeras kvalitativt i provet kanal för att bekräfta att enheten är i drift, när det elektriska fältet är närvarande. En metod för att undersöka förekomsten av DEP är att justera frekvensen till värden långt från övergångsfrekvensen där stark PDEP och NDEP förutspås (ungefär> 40 kHz för att observera PDEP och <10 kHz för att observera NDEP för de flesta däggdjurscancerceller i en buffert med ledningsförmåga av 100 | iS / cm). Det bör noteras att inerta mikrosfärer uppvisar PDEP nedanför deras delningsfrekvens och NDEP ovanför deras delningsfrekvens. För sågtand funktionen geometri presenteras här bör PDEP ses för celler vid den högre frekvensen testet, indikeras av förekomsten av pärla kedja och fokusering av celler eller partiklar på sågtand inslag kanten av kanalen, medan den lägre mätfrekvens NDEP bör vara uppenbart som celler är begränsade till regionen närmare den raka kanten av kanalen. Vid dessa låga frekvenser, kan celler Lyse på grund av elektroporation, så provet kan synas innehålla färre celler, och de som är synliga kan visas förstoras eller suddiga om med användning av en enzymatiskt aktiverad fluorescerande färgämne. Verifiera de frekvenser vid vilka PDEP och NDEP inträffar medger bestämning av delningsfrekvensen, såsom beskrivs i protokollet. För däggdjurscancerceller, såsom MOSE-L användes här, observerade vi NDEP vid 5 kHz (figur 5a) och stark PDEP vid 60 kHz (Fig. 5b). MOSE-L-celler hade en diameter av 17,7 ± 3,3 nm (n = 268 celler) och pärlorna har en 4 | im nominell diameter. En fullständig analys av de dielektriska egenskaperna hos MOSE-L-celler jämfört med Mose celler i tidigare stadier av progression finns i det senaste arbetet Salmanzadeh et al. ³³

Om PDEP och NDEP inte observeras vid dessa ytterligheter, kan olika problem förekomma. Provet ledningsförmåga kan vara för hög på grund av föroreningar eller cellupplösning. OTILLRÄCKLnt elektriska fältet kan alstras på grund av att bubblor fastnar i de fluidelektrodkanaler, som förhindrar ledning av ström till den del av de kanaler som gränsar till provkanalen. Unsteady flödet kan orsakas av en bubbla som fångas i sprutan eller inloppsslang, bubblor till följd av att inte hålla anordningen under vakuum under en tillräckligt lång tid eller inte snabbt fylla anordningen vid avlägsnande från vakuum, läckage på grund av delaminering av svagt bundna PDMS till glasskiva, tårar i barriärmembranet på grund av överdrivet våld som utövas när du fyller kanalerna, eller flöden i extremlägena för pumpens driftområde.

Förutom att bestämma övergångsfrekvensen av celler, kan denna metod användas för att sortera en blandning, som illustreras här av en blandning av MOSE-L-celler och pärlor. Detta exempel utnyttjar den negativa dielektrofores (NDEP) som uppvisas av 4 ^ m pärlor vid frekvenser där MOSE-L-celler erfar positiv dielektrofores (PDEP). Vi operated apparaten på 200 V _RMS och 10 kHz (figur 6a) och konstaterade att både celler och pärlor blandades som de upplevde NDEP. Vid 50 kHz vi observerade rörelse MOSE-L-celler till den övre delen av kanalen, medan pärlorna var begränsade till den nedre delen av kanalen, vilket möjliggör separation av blandningen i två komponenter (fig. 6B).

Figur 5. Placeringen av MOSE-L-celler manipuleras genom att ändra frekvensen av det pålagda elektriska fältet. Bilderna är tagna vid det sista sågtand inslag i provkanalen och fluidic elektroderna är placerade i hörnen på den högra sidan. De är fyllda med PBS innehållande rodamin B som fluorescerar att visualisera kanalerna. (A) MOSE-L-celler upplever NDEP vid 200 V _RMS och 5 kHz. (b) MOSE-L-celler upplever pärla kedja och PDEP på 200 V _RMS och 60 kHz. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 6. En blandning av MOSE-L-celler (grön) och 4 ìm pärlor (röd) flödar genom den slutliga sågtand inslag i provkanalen av en lågfrekvent CDEP enhet. (A) Vid 200 V och 10 kHz celler och pärlor blandas. Pilarna pekar på svagt visas celler som troligen har dött på grund av de låga förhållanden frekvens. (B) Vid 200 V och 50 kHz celler upplever PDEP och flytta till funktionen kanten av kanalen, medan pärlor upplever NDEP och förblir begränsad till regionen närmare den raka kanten.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

DEP är en kraftfull teknik för att bestämma de dielektriska egenskaperna hos partiklarna och styra partikelrörelse mot sortering, isolering eller anrikning tillämpningar. På grund av den skadliga inverkan som direktelektrodkontakt med ett prov, andra har tagit metoder som liknar den tidigare presenterade metoden för att undvika kontakt. Exempelvis Bashir et al. Utvecklat kontaktfria DEP-enheter med hjälp av en mikroflödes PDMS enheten separeras från kretskorts elektroder av ett tunt täckglas, och denna teknik är också tillgänglig i videoformat. ^23,36

Här har vi visat tillverkning av en CDEP chip och fluidiska elektroder med användning av ett enda PDMS-substrat, och det experimentella protokollet för separering av ovariala cancerceller från en blandning av celler och fluorescerande pärlor. Den presenterade Tekniken har framgångsrikt använts för en mängd olika mer komplexa och fysiologiskt relevanta tillämpningar, inklusive sortering live och döda celler, ²⁸ tumör initierande celler från prostatacancerceller, ³⁰ cancerceller från utspädda röda blodkroppar, ^31,32 och differentiering bland stadier av bröstcancer ³⁷ och äggstockscancer. ²⁹ CDEP har också använts för att blanda partiklarna. ³⁸ Dessa ansökningar föreslår att genom att använda den enkla tekniken presenterad kan olika ändamål åstadkommas helt enkelt genom att ändra utformningen av kanalgeometrin.

. DEP är användbar på mikroskala för manipulering av partiklar ¹³ För sfäriska partiklar, den translation dielektroforetisk kraft beror på storleken och elektriska egenskaperna hos partikeln och suspensionsmediet, såväl som lutningen av det elektriska fältet i kvadrat:

där ε _m är permittiviteten hos det suspenderande mediet, r är radienav partikeln, och Re [k (ω)] är den reella delen av Clausius-Mossotti (CM) faktor. CM Faktorn är ett mått på den relativa polariserbarheten för partikeln jämfört med suspensionsmediet och bestämmer riktningen för den dielektroforetiska kraften. Det beskrivs som

där och är de komplexa dielektricitetskonstanter av partikeln och mediet, respektive. Den komplexa permittiviteten, , Beror på konduktivitet (σ) och frekvens (ω). CM faktor sfäriska partiklar är teoretiskt bunden mellan -0,5 och 1. Om CM faktorn är negativ, att partiklarna upplever NDEP eftersom mediet är mer polariserbara än partikeln, så att partiklarna rör sig bort från regioner avhöga elektriska fältgradienter. Om CM faktor är positiv, partiklarna är mer polariserbara än mediet och de upplever PDEP i vilken de rör sig mot områden med höga elektriska fältgradienter.

För biologiska partiklar som är icke-homogena i strukturen, exempelvis celler, kan Clausius-Mossotti faktorn bestämmas från ett effektivvärde för partikel permittivitet:

där och är det komplexa permittiviteten hos den effektiva komplexa permittiviteten hos det inre av cellen, såsom cytoplasman, och plasmamembranet, respektive;. r är radien av cellen, och d är tjockleken på plasmamembranet ²⁶

När DEP sker med partiklar suspenderade i envätska, kommer rörelsen av partikeln relativt fluiden alstra en motståndskraft på partikeln. Denna dragkraft måste beaktas vid fastställandet av den totala kraften som verkar på partikeln. I de situationer av intresse här, viskösa krafter dominerar och partiklar antas sfäriska, liten, och rör sig med relativt låg hastighet, så Stokes dra lagen ger en god approximation för dragkraft:

där η är viskositeten hos fluiden, är u _s. hastigheten för partikeln, och u _{^ är} hastigheten för den fluid, som också kan vara i rörelse. Med tanke på den dielektroforetiska kraften, känd vätska och partikelegenskaper, och en känd flödeshastighet, kan balansen mellan dragkraften och den dielektroforetiska kraften lösas för att uppskatta den partikelhastighet. Skjuvhastigheten att celler erfarenhet bör vara under tröskeln där cell lysera kan ske.

Karakterisering av de elektriska egenskaperna hos partiklar som är nödvändigt för att förutsäga och styra hur de kommer att svara i enlighet med DEP dem. I detta arbete, vi specifikt utnyttjas lågfrekventa CDEP med MOSE-L-celler för att visa protokollet för att fastställa första crossover-frekvens för celler, och sedan visade kontinuerlig sortering av polystyren pärlor och MOSE-L-celler baserat på deras motsatta DEP svar.

Förändringar geometri CDEP anordningen kommer att ändra de rumsliga gradienter av det elektriska fältet, att enheterna kan vara utformade för hög frekvens eller låg frekvens, och för hög selektivitet och effektivitet av sortering för en bestämd celltyp. Dessutom kan höga genomströmningsanordningar utvecklas genom tillverkning bredare kanaler, ³⁰ kanaler parallellt, ³⁰ eller genom flerskikts fabrikation ^35, i vilken elektrodkanaler är vertikalt staplade över och under en relativt djupprovkanal. Tunna membran bildar en barriär mellan skikten. Preliminär testning med anordningar som tillverkats i polymetylmetakrylat (PMMA) och polykarbonat (PC) tunna filmer har visat DEP respons MOSE-L-celler. Det pågående arbetet pågår för att förfina flera lager hög kapacitet enheter och för att förbättra det perifera systemet till en långsiktig plug-and-play-plattform. För att expandera från den grundläggande experimentell teknik presenteras, kan ansökningarna och specifikationer för enheten skräddarsys för att passa särskilda krav, till exempel sortering kontra karakterisering, eller lägga till provbehållare och ett halvautomatiskt system för enheten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning, Midland, MI,USA	Sylgard 184
Glass slides	The Microscope Depot	76079	2x3 inch-ground edges
Microbore PTFE Tubing	Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA	EW-06417-31	Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll
Luer-slip plastic syringes	National Scientific company	S7510-1
Needle tip	Howard Electronic instruments	JG20-1.0	20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"
D(+)-Sucrose	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S3-500
D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous	Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ	AC410955000
RPMI-1640 Medium	Quality Biological Inc.	112-025-101
Calcein AM, Molecular Probes	Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA	C3100MP	excitation wavelength 488/emission wavelength 516
Rhodamine B, O	Science Lab	SLR1465-100G	excitation wavelength 540/emission wavelength 625
Phosphate buffered saline (10X)	Gbiosciences, St. Louis, MO	RC-147
Leica, inverted light microscope	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	Leica DMI 6000B
Leica DFC420, color camera	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	Leica DFC420
Function generator	GW Instek, Taipei, Taiwan	GFG-3015
Wideband power amplifier	Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA	AL-50HF-A
HFHV Output Transformer		AL-T50-V25/300-F100K-600K
High voltage amplifier	Trek	Model 2205
USB Modular Oscilloscope, 100 MHz	AgilentTechnologies	U2701A
Expanded Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001/002 (115/230V)	air plasma
Scotch Magic tape	3M		any available width is sufficient
1.5 mm puncher	Harris Uni-Core	Z708836-25EA
.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
FluoSpheres Sulfate Microspheres	Invitrogen	F8858	4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)
AZ 9260 photoresist	AZ Electronic Materials
AZ 400 K developer	AZ Electronic Materials
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%			provided by Virginia Tech cleanroom
Teflon coating			applied using DRIE machine
Silicon wafer	University Wafer	452	100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP)
Deep Reactive Ion Etching (DRIE)	Alcatrel	AMS SDE 100