Summary
Vi beskriver en metod för att utföra genetisk analys i Chlamydia baserad på kemisk mutagenes och hela genomet sekvensering. Dessutom är ett system för utbyte av DNA inom infekterade celler beskrivs som kan användas för genetisk kartläggning. Denna metod kan vara i stort sett tillämpas på mikrobiella system saknar transformationssystem och molekylärgenetiska verktyg.
Abstract
Chlamydia trachomatis, det etiologiska medlet för sexuellt överförbara sjukdomar och infektioner okulära, fortfarande dåligt kännetecknas grund av dess intractability experimentell transformation med rekombinant DNA. Vi utvecklade en metod för att utföra genetisk analys i C. trachomatis trots avsaknaden av molekylärgenetiska verktyg. Vår metod innebär: i) kemisk mutagenes att snabbt generera omfattande bibliotek av genetiskt definierade mutanter med distinkta fenotyper, ii) hel-genom sekvensering (WGS) för att kartlägga de bakomliggande genetiska skador och att hitta samband mellan muterad gen (er) och.. en gemensam fenotyp,. iii) generation av rekombinanta stammar genom samtidig infektion av däggdjursceller med mutant och vildtyp bakterier. Därför kunde vi etablera orsakssamband mellan genotyper och fenotyper. Kopplingen av kemiskt inducerad gen variation och WGS att etablera korrelat genotyp-fenotyp föreningar should vara allmänt tillämplig på stora listan med medicinskt och miljömässigt viktiga mikroorganismer närvarande svårlösta för genetisk analys.
Introduction
De obligat intracellulära bakterien Chlamydia trachomatis står för uppskattningsvis 2,8 miljoner könsorgan infektioner per år i USA (Center for Disease Control) med tillhörande följdsjukdomar såsom inflammatoriska sjukdomar, ektopisk graviditet och infertilitet (1). Chlamydia spp. har en unik fysiologi med en bifasisk utvecklingscykel består av två former: den smittsamma men icke-replikerande elementarkropp (EB) och icke smittsamma men replicative reticulate kropp (RB). Infektion börjar med fastsättningen av EBS till epiteliala celler följt av endoctyotosis (2). Inom en membranbundna vacuole kallas en integration, EBS differentierar till RB formuläret, som sedan replikerar genom binär fission. Vid mitten av cykeln, RBS övergångar tillbaka till EBS, som sedan släpps ut i det extracellulära utrymmet för att påbörja nya infektioner när värdcellen lyserar (3).
C. trachomatis ärrefraktär till rutinmanipulering med vanliga molekylärgenetiska verktyg, såsom riktad genutbyte, transposoner och transducerande fager, som har varit centrala för de flesta studier i bakteriella genetik, är det oklart i vilken utsträckning enskilda Chlamydia gener bidrar till kringgående av medfödd immunitet , näringsämnen förvärv, utvecklingsmässiga övergångar, eller andra processer viktiga för patogenen överlevnad inom en eukaryot värd (4). Följaktligen är denna patogen dåligt karakteriserad trots dess kliniska betydelse.
Genom av Chlamydia spp.. är relativt liten (~ 1 Mb) (5) med flera arter och biovarer sekvenseras med nästa generations sekvensering. Jämförande genomet analys av WGS har gett en unik inblick i utvecklingen av klamydia arter och deras anpassning till människa (6-8) och i viss mån har lämnat vissa uppgifter om den potentiella funktionen av virulensfaktorer (9, 10). Than genetisk mångfald visas av kliniska isolat ger inte den upplösning som krävs för att systematiskt kartlägga funktionen hos de flesta virulensfaktorer, förmodligen eftersom mutationer i dessa gener skulle lätt ha valts emot. Utan störande effekter från naturligt urval, mutagena-inducerad gen variation, tillsammans med definierade analyser som mäter fel i virulens, kan utvidga det spektrum av mutationer som kan kartläggas. Kemiska mutagena, i synnerhet, är användbara eftersom de kan generera null, villkorligt, hypomorphic (nedsatt funktion), och hypermorphic (vinst av funktion) alleler. Med ankomsten av robusta nästa generations genomet-sekvensering teknik, kan sådana mutationer lätt identifieras och kartlagts. På detta sätt kan starka associationer göras mellan mutationer i en gen eller genetiska banan och en gemensam fenotyp, vilket möjliggör tillämpning av framåt genetiska metoder.
Genomet sekvenser av kliniska stammar avslöjade mosaicism Between serovarer och loci frekvent rekombination (11). Empiriska belägg för rekombination visades genom samtidig infektion av två olika antibiotikaresistenta stammar och urval av dubbla resistenta rekombinant avkomma, vilket avslöjades ha genetiska bidrag från båda stammarna (12, 13). Således tillåter genetiskt utbyte mellan vildtyp och muterade stammar i en co-infektion inställning segregering av kemiskt inducerade mutationer att peka ut den sjuka genen som leder till den observerade fenotypen.
Här beskriver vi en metod för att utföra genetisk analys i Chlamydia baserad på kemisk mutagenes, WGS, samt ett system för utbyte av DNA inom infekterade celler (14) (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Kemisk Mutagenes
OBS: Vi fann att den replikativa RB formen är mer mottaglig för kemisk mutagenes än EB formuläret. I mitten av cykeln (mellan 18 och den 20 HPI), RBS löper störst siffrorna före RB-EB övergång. Eftersom Chlamydia trachomatis är en obligat intracellulär patogen, kan effekterna av mutagen på värden hälsa begränsa bakteriell återhämtning. Vero-celler visade sig vara mer motståndskraftig mot de negativa effekterna av höga nivåer av EMS än andra testade cellinjer.
Segregation av mutationer genom rekombination kräver val för antibiotikaresistenta rekombinanta avkomma. Vi rekommenderar att du använder resistenta stammar (t.ex. rifampicin, spektinomycin, eller trimetoprim) för generering av mutanter för förmågan att utföra rekombinant analys och att isolera syngena stammar. Antibiotiska resistenta stammar genererades genom en stegvis urvalsprocessen (15, 16).
Intee: Chlamydia trachomatis (stam L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) är BSL2 patogen. Se institutionella standardrutiner (SOP) för hantering av sådana patogener.
- Framställning av odlade celler och infektion:
- Seed cirka 1 x 10 6 Vero-celler (ATCC CCL-81) per 25 cm 2 (T25) kolv i 3 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2. Celler bör utgöra en sammanhängande monoskikt inom 24 timmar.
- Aspirera medium. Infect konfluenta T25-kolvar av Vero-celler med Chlamydia vid en infektionsmultiplicitet (moi) av 5 (~ 14 x 10 6) i en total volym av 3 ml medium (DMEM, 200 ng / ml cyklohexamid, 10% FBS).
- Börja mutagenes vid 18 timmar efter infektion (HPI):
- Förbered 20 mg / ml EMS (etylmetansulfonat) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 0,9 mM kalciumklorid och 0,49 mM magnesiumklorid i en kemikaliesäkerhetsrapport huva som EMS är en flyktig vätska.
Obs: EMS är en potent mutagen och cancerframkallande. Neutralisera EMS avfall och sanera spill, plast, papper och glas med 1 M natriumhydroxid. - Aspirera mediet och tvätta cellerna en gång med 3 ml PBS / MgCl2 / CaCl 2. Inkubera cellerna med 3 ml av 20 mg / ml EMS i PBS / MgCl2 / CaCl2 under en timme i dragskåp vid rumstemperatur. Vero-celler kan överleva denna koncentration av EMS och förhållanden utanför inkubatorn under korta perioder. Kom ihåg att inkludera ett kontrollprov som inte har muterats.
- Ta medium innehållande EMS och placera den i en behållare med 1 M NaOH för att inaktivera mutagen. Tvätta infekterade celler tre gånger i 3 ml PBS + MgCl2 / CaCl 2 för avlägsnande av kvarvarande mutagen. Tillsätt 6 ml DMEM/10% FBS med 200 ng / ml cyklohexamid och 25 | ig / ml gentamicin, och inkubera vid 5% CO
- Utdrag EB genom hypoton lys: Helt aspirera mediet. Tillsätt 1,0 ml H2O och sten för att lösgöra cellerna under 10 min. Lyse cellerna genom att pipettera upp och ned under minst 10 gånger. Samla lysatet i en mikrofug och tillsätt 0,250 ml 5x sackarosbuffert fosfat glutamat (SPG) för att föra den till 1x slutlig koncentration. Förvara vid -80 ° C.
Anmärkning: Halten mutagenes kan bedömas genom induktion av rifampicin resistens. För att analysera frekvensen av rifampin motstånd, plack 1 x 10 8 och 7 x 10-faldiga serieutspädningar av bakterier i närvaro av 200 ng / ml rifampin. Frekvensen av rifampicin resistens definieras som antalet Rifampin resistenta plack dividerat med totalt antal bakterier pläterade. Se avsnittet nedan för plack instruktioner. - Utdrag EB genom hypoton lys: Helt aspirera mediet. Tillsätt 1,0 ml H2O och sten för att lösgöra cellerna under 10 min. Lyse cellerna genom att pipettera upp och ned under minst 10 gånger. Samla lysatet i en mikrofug och tillsätt 0,250 ml 5x sackarosbuffert fosfat glutamat (SPG) för att föra den till 1x slutlig koncentration. Förvara vid -80 ° C.
- Förbered 20 mg / ml EMS (etylmetansulfonat) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 0,9 mM kalciumklorid och 0,49 mM magnesiumklorid i en kemikaliesäkerhetsrapport huva som EMS är en flyktig vätska.
2. Klonal Isolering av Chlamydia trachomatis mutantstammar genom plackrening
- Ställ sammanflytande monoskikt av Vero-celler i 6 brunnar: Seed ~ 0,4 x 10 6 celler i 3 ml DMEM/10% FBS per brunn. Låt cellerna att bilda en homogen monoskikt under upp till 24 timmar.
- Tina stamlösning av mutageniserad Chlamydia på is. Utför 6 x 10-faldiga seriespädningar i en total volym av 200 | il per spädning i DMEM/10% FBS och ställa dem på is.
Obs: Bakteriell titer i integration bildande enheter (IFU) är en bra uppskattning av plackbildande enheter (PFU). Sikta på att plack 10, 100, och 1000 pfu. - Tvätta Vero-celler två gånger med 3 ml PBS per brunn.
- Tillsätt 3 ml DMEM till varje brunn för 6-brunnars plattor och 100 pl av de bakteriella utspädningar i duplikat. Snurra plattan att säkerställa en jämn blandning.
- Spin infekterade plattorna vid 2700 xg under 30 minuter vid 15 ° C och inkubera vid 37 ° C i en fuktig,5% CO2-inkubator under 1-2 timmar.
- Förbered 0,54% agaros i DMEM (för 6 brunnar):
- Lägg följande ingredienser: 18,9 ml kall 2x DMEM, 4,2 ml FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0,042 ml 200 mikrogram / ml cyklohexamid, 0,021 ml 50mg/ml gentamicin. Blanda väl.
- Blanda i 18,9 ml varm steril 1,2% agaros / H2O, omrörning för att förhindra klumpar. Blandningen ska vara varm vid beröring. Förvara i ett varmt vattenbad vid 55 ° C före tillsats till infekterade celler.
- Sug bakteriesuspension från disk och tillämpa 6 ml 0,54% agaros / DMEM per brunn. Låt agaros stelna helt i rumstemperatur utanför huven under 15 min. Torka plattorna med locken borttagna, i biosäkerhet huv i 15 min.
Obs: Vibrationer från biologisk inneslutning huven kan snedvrida den stelnande agaros. - Inkubera vid 37 ° C i CO2 inkubator under 7-10 dagar. Plack bör vara synlig med hjälp av en dissekera mikroskop. (Refer till figur 3 för en typisk bild av plack.)
- En dag före isolera mutanter, utsäde 1 x 10 4 Vero-celler i 100 ul per brunn i en 96-brunnars platta. Cellerna blir sammanflytande inom 24 timmar.
- Med hjälp av en dissektion mikroskop, för att markera plack plockas. Samla pluggar av plack med hjälp av en steril 1,0 ml barriär pipett spets.
- Återsuspendera plack i 100 | il av DMEM kompletterat med 10% FBS, 400 ng / ml cyklohexamid, 50 | ig / ml gentamicin.
- Att expandera muterade stammar, överlagra suspensionen på sammanflytande monoskikt av Vero-celler. Spin plattorna vid 2700 xg, 15 ° C under 30 min.
- Inkubera vid 37 ° C / 5% CO2 i en fuktad inkubator. Harvest EB när> 50% av cellerna är infekterade, vilket kan ske så tidigt som 48 HPI och så sent som 14 dagar. Denna mängd infekterade celler gör tillräckligt livskraftiga bakterier som ska lagras. Muterade stammar skiljer sig i tillväxt och smittsamhet. Tillåt långsamt växande raser till Naturally återinfektera angränsande celler tills tillräckligt många celler infekteras.
- Utdrag EB genom hypoton lys av infekterade celler:
- Helt aspirera mediet.
- Lägg 160 l sterilt vatten. Inkubera vid rumstemperatur under 10 min.
- Störa celler genom att pipettera upp och ned flera gånger för att säkerställa fullständig lys, använda mekaniska tips för att undvika korskontaminering.
- Överför 160 pl av lysat till mikrofugrör.
- Blanda i 40 ^ 5x SPG. Förvara vid -80 ° C.
- Analysen och skärm mutanter för fenotyp (er) av intresse.
Tre. Hela genomet sekvensering av valda Chlamydia Mutants
- Extrahera genomiskt DNA från gradient-renat EBS, som till stor del fri från kontaminerande värd-DNA. Protokoll för storskalig odling av Chlamydia och rening av EBS kan hittas i ref. (17). Använd kommersiella genomiska kit DNA-rening (t.ex. Qiagen katt. 69.504) till extRact DNA från 2 x 10 9 bakterier enligt tillverkarens anvisningar.
- Använd en fluorometer (Qubit, Invitrogen katt. Q32866) att noggrant mäta mängden DNA. 1-5 pg av renade DNA krävs för Illumina sekvensering plattformen.
Obs: Flera plattformar kan användas för att sekvensera bakteriella genomen, inklusive Illumina/Solexa- och solid-baserade system. Vi valde att använda HiSeq (Illumina) eftersom det producerar hög täthet av kort, men hög kvalitet sekvensering läser. Mindre skala genome sequencers, såsom IonTorrent (Life Technologies) och MySeq (Illumina) är lämpliga också och mer än tillräckligt för att multiplexera dessa quencing på upp till 4 Chlamydia genomen i taget, vilket överstiger minimal täckning av 25X för adekvat genomet montering. Framställning av DNA-sekvensering bibliotek för Illumina plattformen beskrivs nedan. - Fragment DNA till lämplig storlek (300-400 baspar för Illumina sekvensering) använda en adaptiv Fokuserade Akustik S220 imentet (Covaris) enligt tillverkarens föreslagna inställningarna. Obs: DNA fragmentering genom nebulisering resulterar i ökad förlust av provet på grund av aerosolbildning av provet.
- Förbered de genomiska sekvensering biblioteken med hjälp av kommersiella byggsatser (Illumina FC-102-1001) att följa instruktionerna från tillverkaren. Biblioteken kan indexeras med streckkod primers (Illumina FC-121 till 1003) så att flera prover kan slås samman och sekvenseras samtidigt.
- Kör sekvensering prover. Detta steg utförs vanligtvis av kommersiella tjänster eller core faciliteter som drivs av dedikerad teknisk personal. Följ deras rutiner och rekommendationer.
- Illumina läser (FASTQ format) kan monteras till en referens genom att använda användarvänliga grafiska programvara användargränssnitt, såsom Geneious (Biomatters), som också kan användas för SNP / mutationen identifiering. Till karta mutationer, ställa in parametrar till 90% för minsta varianten frekvens och 50X för minimal täckning. Open source genomet montörer, såsom MAQ (18) och BWA (19), kan också användas.
- Bekräfta mutationer av Sanger-sekvensering: använd genomisk DNA som mall för PCR-amplifiering av 300-500 bp som flankerar identifierade mutationer och sekvens renade eller utspädd (1:20) PCR-produkter från Sanger-sekvensering.
4. Generering av Chlamydia Rekombinanter
Obs: Chlamydia kan utbyta DNA under infektion, vilket medger för generering av rekombinanta stammar (12, 13, 20). Efter samtidig infektion av celler med två unika antibiotikaresistenta stammar, rekombinant "avkomma" kan väljas för dubbla antibiotikaresistens (12, 13). Vi drog fördel av detta fenomen att segregera mutationer och att generera co-syngena stammar. Därför fanns mutantstammar genereras i antibiotikaresistenta bakgrund (t.ex. rifampin resistans (rif R) H471Y i CTL0567 (rpoB)) så att de kan korsas till vildtypstammen bearinga olika antibiotikaresistenta allelen (t.ex. spektinomycinresistens (SPC R), G1197A i r01/r02 (16SRNA exemplaren nr 1 och 2)). För detaljer om utbyte av DNA och rekombination i Chlamydia, se referenserna (12, 13).
- Co-infektera vildtyp och klonala mutantstammar genom centrifuging6 x 10 5 bakterier från varje stam på sammanflytande monoskikt av Vero-celler odlade på en 24-brunnars platta. Parallellt infektera monoskikt med varje stam allena.
- Vid 44 HPI, skörd EBs genom hypoton lys av infekterade celler:
- Helt aspirera mediet.
- Tillsätt 0,4 ml sterilt vatten och låt stå i 10 min.
- Lyse cellerna genom kraftig pipettera upp och ned minst 10 gånger. Överför lysat till ett mikrofugrör.
- Blanda i 0,1 ml 5x SPG för en slutlig koncentration av 1x SPG.
- Råa lysat kan användas omedelbart eller lagras vid -80 ° C.
- Plack 50 ul av den råa EB preps end 5 x 1:10 seriespädningar i agaros / DMEM kompletterat med lämpliga antibiotika för att selektera för rekombinanter. (Se tabell för koncentrationer av typiska antibiotika för selektion av rekombinanter.)
- Plack rena och berika rekombinanta stammar som ovan. Medelvärde rekombinanter för närvaro eller frånvaro av den önskade fenotypen. Extrahera DNA från rekombinanta stammar genom DNAzol behandling (nästa avsnitt) i syfte att genotyping för närvaro eller frånvaro av mutationer.
- Korsningar kan upprepas med stammar som bär andra antibiotikaresistensmarkörer att ytterligare segregera mutationer, och generera isogena stammar. Co-smitta utvalda rekombinanter till annan vildtypstam med annan antibiotika markör.
Tabell 1: antibiotikakoncentrationer för urval av rekombinanter:
| Slutlig koncentration | Beredningsinstruktioner |
|---|---|
| 200 ng / ml rifampin Gör 25 mg / ml lagring lager i dimetylsulfoxid (DMSO). Späd 200 ^ g / ml arbetslösning genom utspädning av lagring lager med H2O Förvara vid -20 ° C i mörker. | |
| 200 ug / ml trimetoprim | Gör en 100 mg / ml förrådslösning i DMSO. Förvara vid -20 ° C |
| 200 ug / ml spektinomycin | Gör en 100 mg / ml förrådslösning i vatten i 100 | il alikvoter. Förvara vid -20 ° C. Undvik upprepad frysning upptining. |
Fem. Extraktion av genomisk DNA från rekombinanta stammar för genotypning
Obs: Kolonn-baserade rening kit kan också användas. En fördel med DNA-extraktion från DNAzol behandling kostar.
- Infect 1,2 x 10 5 chlamydia på monoskikt av Vero-celler som odlas på 12-brunnsplattor.
- Vid 36-48 HPI, aspirera mediet och tillsätt 0,375 ml DNAzol (Invitrogen 10.503 till 027). Skaka försiktigt cellerna och pipettera Lysates till ett 1,5 ml mikrofugrör.
- Fällning DNA genom tillsats av 0,188 ml 100% etanol. Blanda genom inversion.
- Extrahera DNA genom spolning med en pipett och placera det i ett rent provrör. Alternativt pellet DNA genom centrifugering vid högsta hastighet under 2 min vid rumstemperatur eller 4 ° C, och dekantera supernatanten.
- Tvätta DNA-fällningen två gånger med 1,0 ml 75% etanol.
- Lufttorka DNA efter avlägsnande av etanol under 15 sek.
- Lösa DNA med 0,2 ml 8 mM NaOH sedan neutralisera till pH 8,0 med 20,2 pl 0,1 M HEPES. Ta upp till en slutlig volym av 0,5 ml med vatten eller TE. Alternativt återsuspendera DNA i TE-buffert (DNA pelleten inte löses helt.).
- Använd DNAzol extraherade DNA som mall för PCR-amplifiering av 300-500 bp som flankerar identifierade mutationer. Sekvens renat eller utspädd (1:20) PCR-produkter från Sanger-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exponering för mutagen leder till inneslutningar som visas saknar bakterier, förmodligen på grund av bakteriell celldöd. Vanligtvis kommer serovaren LGV-L2 lyserar helt infekterade celler inom 48 timmar efter infektion, men behandling med mutagena ämnen kan förlänga denna cykel till> 90 timmar. Ungefär 10% av inneslutningar väntas återhämta sig. I våra experiment, infekterade Vero-celler som behandlats med 20 mg / ml EMS ledde till en 99% minskning av återvinning av infektiös avkomma jämfört med obehandlade kontroller. Mutagen behandling ledde också till uppkomsten av plack med förändrade morfologier, inklusive små plack (SPQ) (Figur 3). Andra morfologierna inkluderar plack som visas granulat, klumpiga, eller honeycomb formad (Figur 3). Dessa fenotyper kan avspegla brister i processer som krävs för infektion och överlevnad i den mottagande miljön. Mutanter med liten plakett (SPQ) morfologi generellt producerar betydligt färre infektiös avkomma och kan ta upp till 2-3 veckor till ettmplify. Försiktighet bör iakttas vid passage dessa stammar som reversioner och suppressormutationer kan samlas på en hög frekvens.
Doserna av EMS användes i dessa studier kan leda till mellan 3 till 30 mutationer per Chlamydia genomet vid utvärdering experimentellt genom WGS (Figur 4). Även gradient renat EB är i stort sett fria från värdcellens material, är värd DNA upptäcks också och består ca 10-15% av genomiska preps.
Samtidig infektion av två stammar kan generera avkomma med genetiska bidrag från båda stammarna och uppstår vid frekvenser på 10 -4 10 -3, ca 10 4 gånger oftare än spontant motstånd (13). Rekombinationsställen brytpunkter inträffar vanligtvis mellan ~ 100 kb till 800 kb (12). En analys av sådana rekombinanta stammar kan avslöja mutationer som är genetiskt kopplade till fenotypen som studeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod uppfyller de grundläggande kraven för genetisk analys eftersom det fastställer koppling mellan genotyper och fenotyper. Huvudsakligen uppnås detta utan hjälp av konventionella molekylära verktyg för rekombinant DNA-transformation och insättningsinaktivering av gener i bakterier, vilket ofta är ett hastighetsbegränsande steg i analysen av geners funktion i icke-modell mikrober.
Ett viktigt steg är att se till clonality av plackrenade mutanter. Korskontaminering med vildtyp eller "montör" mutanter kan snabbt leda till muterade stammar som konkurreras. Likaså kan kartläggning mutationer av hela genomet sekvensering av icke-klonade prover leda till tvetydiga resultat. Isolera mutanter från tungt plaqued brunnar eller ansluta plack som ligger för nära varandra bör undvikas. Dessutom, för långsamt växande mutanter kan revertanter uppstå vid relativt höga frekvenser. Vi rekommenderar bevara ursprungliga eller låg passage bestånd. Ersaque mutanter om korskontaminering eller revertanter misstänks.
Koncentrationen av EMS kan sänkas för att minska frekvensen av mutationer. Mutationen takt, enligt bedömning av generering av rifampicin resistenta varianter (på grund av punktmutationer i genen som kodar för RNA-polymeras, rpoB) var optimalt i våra händer vid 20 mg / ml EMS. Induktion av rifampicin resistens kan bedömas av frekvensen av plack som bildas i närvaro av rifampicin och bör korrelera till frekvensen av kemiskt inducerade mutationer.
EMS kan ersättas med andra mutagener för att vidga det spektrum av mutationer som kan uppnås. Till exempel kan DNA-interkalerande medel såsom psoralen och dess derivat användas för att inducera deletioner och insertioner (21).
Mutationer som kartlägger nära varandra i genomet (<100 kb från varandra) är svåra att ta bort länken genom rekombination. När höga mutagenesstrategierna priser gäller achieved, kan det vara svårt att otvetydigt identifiera en kausal mutation. Eftersom omvandlingen av C. trachomatis är nu möjligt med shuttle plasmider (22), om än ineffektivt, kan det vara möjligt att lösa dessa koppling problem genom att komplettera mutationer i träns med en vild typ kopia av den muterade genen på en plasmid.
Figur 1. Strategi för vidare genetisk analys och rekombination-baserad kartläggning i Chlamydia. Rifampin resistenta (Rif R) C. trachomatis mutageniserades under dess replikationsförmåga scenen och användes för att infektera Vero cellmonoskikt tills synliga plack bildas. Individuella kloner av mutanter uppsamlades och analyserades med avseende på specifika fenotyper, såsom förändrade plack morphotypes. Genom av mutanter som delar en gemensam fenotyp sekvenserades för att identify gemensamma genetiska lesioner. Att upprätta en koppling mellan dessa fem genetiska skador och särskilda morfologier plack, var Vero-celler infekterade med mutanter som genereras i arif R bakgrund och vildtyp Spc R Chlamydia-stammar, och rekombinanta Rif R Spc R stammar bland den resulterande infektiös avkomma valdes i närvaron av rifampicin och spektinomycin ("kors"). Den segregering av enskilda mutationer i föräldrahemmet Rif R mutant stam bland de rekombinanta bakterier uppvisar förändrad plackmorfologi bestämdes genom riktade DNA-sekvensering. (Reproducerad med tillstånd från PNAS (14)) Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Schematisk representation av EMS mutagenes-protokollet. Chlamydia trachomatis LGV-L2-infekterade celler exponerades för EMS under RB skede av infektionscykeln, och infektionen fick äga rum under 72 timmar för att möjliggöra generering av infektiösa elementarkroppar (EB) . Mutageniserade EB pooler skördades och titrerades för integration forming units (IFU) och plaque-forming units på Vero-celler. N, nucleus. (Reproducerad med tillstånd från PNAS (14)) Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Exempel på vanliga plack morfologier bland EMS-mutageniserad C. trachomatis. Mutageniserade C. trachomatis LGV-L2 tillåtet att bilda plack på Vero cellmonoskiktets för 14 dag. Plack varierade i storlek (A) och morfologi (B), som kan isoleras, förstärks i Vero-celler, och används i reinfektioner av Vero monolager att bekräfta stabiliteten av plack morphotypes. Exempel på vanliga fenotyper visas inklusive honungskaka (Hcm), ihopklumpad (Clmp), liten plakett (SPQ) och granulat (mp). Pilar indikerar stora granulära insättningar inom en Grn plack. (Reproducerad med tillstånd från PNAS (14)) Klicka här för att se större bild .
Figur 4. Identifiering av EMS-inducerade genen lesioner. Kromosomställe av nukleotidvarianter i mutanter som visar Grn plack morphotype. Hel-genomet sekvensering av tre Grn mutanter identifierade mutationens att leda till aminosyraförändringar i glgB, som kodar för en glykogen-förgreningsenzym. (Reproducerad med tillstånd från PNAS (14)) Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inget att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
- Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
- Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
- Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
- Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
- Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
- Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
- Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
- Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
- DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
- Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
- Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
- Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
- Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
- Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
- Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).
