Summary
Vi beskriver en metode til at udføre genetisk analyse i Chlamydia baseret på kemisk mutagenese og hele genomet sekventering. Desuden er et system til DNA-udveksling inden inficerede celler beskrevet, som kan anvendes til genetisk kortlægning. Denne metode kan være bredt anvendelig til mikrobielle systemer mangler transformation systemer og molekylærgenetiske værktøjer.
Abstract
Chlamydia trachomatis, den ætiologiske agens af seksuelt overførte sygdomme og øjeninfektioner, forbliver dårligt karakteriseret på grund af sin intractability til eksperimentel transformation med rekombinant DNA. Vi udviklede en metode til at udføre genetisk analyse i C. trachomatis trods manglen på molekylærgenetiske værktøjer. Vores fremgangsmåde involverer: i) kemisk mutagenese til hurtigt at generere omfattende biblioteker af genetisk definerede mutanter med forskellige fænotyper ii) hel-genom sekventering (WGS) at kortlægge de underliggende genetiske læsioner og finde sammenhænge mellem muterede gen (r) og.. en fælles fænotype,. iii) generation af rekombinante stammer gennem co-infektion af pattedyrceller med mutant og vildtype bakterier. Derfor var vi i stand til at etablere årsagssammenhænge genotyper og fænotyper. Koblingen af kemisk-induceret gen variation og WGS at etablere korrelationsmaalinger genotype-fænotype foreninger Should være bredt anvendelig til den store liste over lægeuddannede og miljømæssigt vigtige mikroorganismer i øjeblikket uløselige til genetisk analyse.
Introduction
De obligate intracellulære bakterien Chlamydia trachomatis regnskab for en anslået 2,8 millioner genitale infektioner om året i USA (Center for Disease Control) med tilhørende følgesygdomme såsom underlivsbetændelse, graviditet udenfor livmoderen, og infertilitet (1). Chlamydia-arter har en unik fysiologi med en bifasisk udviklingsmæssige cyklus bestående af to former: den infektiøse, men ikke-replikerende elementær krop (EB) og infektiøse men replikative reticulate legeme (RB). Infektion begynder med fastgørelsen af EBS til epitelceller efterfulgt af endoctyotosis (2). Inden for en membran-bundet vacuole betegnet en optagelse, EBS differentiere i RB formular, som så replikater ved binær fission. Midt i cyklus, RBS overgange tilbage i EBS, som derefter bortvist i det ekstracellulære rum til at starte en ny omgang infektion, når værten celle lyserer (3).
C. trachomatis errefraktær over for rutinemæssig manipulation med standard molekylærgenetiske redskaber, såsom målrettet genudskiftning, transposoner og transducerende fager, som har været centralt for de fleste studier i bakterielle genetik, Det er uklart, i hvilket omfang de enkelte Chlamydia gener bidrager til unddragelse af medfødte immunitet , næringsstof erhvervelse, udviklingsmæssige overgange, eller andre processer der er vigtige for patogenet overlevelse i en eukaryot vært (4). Følgelig dette patogen stadig dårligt karakteriseret trods sin klinisk betydning.
Genomer af Chlamydia spp. er relativt lille (~ 1 Mb) (5) med flere arter og biovarer sekventeret bruge næste generation sekventering teknologier. Sammenlignende genom analyse WGS har givet enestående indblik i udviklingen af chlamydia arter og deres tilpasning til mennesker (6-8), og til en vis grad har givet nogle oplysninger, som den potentielle funktion virulensfaktorer (9, 10). THan genetiske mangfoldighed vises af kliniske isolater giver ikke beslutningen forpligtet til systematisk at kortlægge funktionen af de fleste virulensfaktorer, formentlig fordi mutationer i sådanne gener ville have været let vælges imod. Uden forstyrrende effekter fra naturlig udvælgelse, mutagen-induceret gen variation, kombineret med definerede analyser, der måler fejl i virulens, kan udvide det spektrum af mutationer, der kan adspurgte. Kemiske mutagener i særdeleshed, er nyttige, da de kan generere null, betinget hypomorphic (nedsat funktion) og hypermorphic (gevinst på funktion) alleler. Med ankomsten af robuste næste generations genom-sekventering teknologier, kan sådanne mutationer let identificeres og kortlægges. På denne måde kan stærke associationer foretages mellem mutationer i et gen eller genetisk vej og en fælles fænotype, der muliggør anvendelse af forward genetiske metoder.
Genom-sekvenser af kliniske stammer afslørede mosaicisme Between serovarer og loci for hyppig rekombination (11). Empiriske beviser for rekombination blev demonstreret gennem co-infektion af to forskellige antibiotikaresistente stammer og valg af dobbelt resistente rekombinant afkom, som blev åbenbaret for at have genetiske bidrag fra begge stammer (12, 13). Således genetisk udveksling mellem vildtype og mutantstammer i en co-infektion indstilling giver adskillelse af kemisk inducerede mutationer til at lokalisere genet påvirkede, der fører til den observerede fænotype.
Her beskriver vi en metode til at udføre genetisk analyse i Chlamydia baseret på kemisk mutagenese, WGS, og et system til DNA udveksling i inficerede celler (14) (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kemisk mutagenese
Bemærk: Vi fandt, at den replikative RB formen er mere modtagelig for kemisk mutagenese end EB formularen. Midt i cyklus (mellem 18.-20 HPI) er RB på det største antal forud for RB-EB overgang. Fordi Chlamydia trachomatis er en obligat intracellulær patogen, kan virkningerne af mutagen på værten sundhed begrænse bakteriel genopretning. Vero-celler blev fundet at være mere modstandsdygtige over for de negative virkninger af høje niveauer af EMS end andre testede cellelinier.
Adskillelse af mutationer ved rekombination kræver selektion for antibiotikaresistente rekombinant afkom. Vi anbefaler anvendelse af lægemiddelresistente stammer (f.eks rifampin spectinomycin, eller trimethoprim) til at frembringe mutanter for evnen til at udføre rekombinant analyse og isolere isogene stammer. Antibiotikaresistente stammer blev frembragt ved en trinvis udvælgelsesproces (15, 16).
Ikkee: Chlamydia trachomatis (stamme L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) er BSL2 patogen. Der henvises til de institutionelle standard operationelle procedurer (SOP) til håndtering af sådanne patogener.
- Fremstilling af dyrkede celler og infektion:
- Seed ca 1 x 10 6 Vero-celler (ATCC CCL-81) pr 25 cm 2 (T25) kolbe i 3 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS). Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2. Cellerne skal danne en sammenflydende monolag inden 24 timer.
- Aspirere medium. Inficere konfluente T25 kolber af Vero-celler med Chlamydia ved en multiplicitet af infektion (MOI) på 5 (~ 14 x 10 6) i et samlet volumen på 3 ml medium (DMEM, 200 ng / ml cyclohexamid, 10% FBS).
- Begynd mutagenese ved 18 timer efter infektion (HPI):
- Forbered 20 mg / ml EMS (ethylmethansulfonat) i phosphatpufret saltvand (PBS) med 0,9 mM calciumchlorid og 0,49 mM magnesiumchlorid i en kemisk sikkerhed hætte som EMS er en flygtig væske.
Bemærk: EMS er et potent mutagen og kræftfremkaldende. Neutralisere EMS affald og rense udslip, plast, papir og glas med 1 M natriumhydroxid. - Aspirere medium og vaskes cellerne en gang med 3 ml PBS / MgCl2 / CaCl2. Cellerne inkuberes med 3 ml 20 mg / ml EMS i PBS / MgCl2 / CaCl2 i en time i stinkskab ved stuetemperatur. Vero-celler er i stand til at overleve denne koncentration af EMS og betingelser uden inkubatoren i korte perioder. Husk at inkludere en kontrolprøve, der ikke er mutageniseret.
- Fjern medie indeholdende EMS og placere den i en beholder med 1 M NaOH for at inaktivere mutagen. Vask inficerede celler 3 gange i 3 ml PBS + MgCl2 / CaCl2 for at fjerne resterende mutagen. Tilføj 6 ml DMEM/10% FBS med 200 ng / ml cyclohexamid og 25 ug / ml gentamicin, og der inkuberes ved 5% CO
- Uddrag EB'er ved hypotonisk lysis: Helt aspirere medium. Tilsæt 1,0 ml H2O og rock at løsne cellerne i 10 min. Lyse celler ved pipettering op og ned mindst 10 gange. Saml lysat i en mikrocentrifuge og tilsættes 0,250 ml 5x sucrosephosphat glutamat-puffer (SPG) for at bringe det til 1x slutkoncentration. Opbevares ved -80 ° C.
Note: Graden af mutagenese kan vurderes ved induktion af rifampin modstand. For at analysere hyppigheden af rifampin resistens, plaque 1 x 10 8 og 7 x 10-fold seriefortyndinger af bakterier i nærvær af 200 ng / ml rifampicin. Hyppigheden af rifampin resistens defineres som antallet af rifampin resistente plaques divideret med totalt antal bakterier belagt. Se nedenfor for plak instruktioner. - Uddrag EB'er ved hypotonisk lysis: Helt aspirere medium. Tilsæt 1,0 ml H2O og rock at løsne cellerne i 10 min. Lyse celler ved pipettering op og ned mindst 10 gange. Saml lysat i en mikrocentrifuge og tilsættes 0,250 ml 5x sucrosephosphat glutamat-puffer (SPG) for at bringe det til 1x slutkoncentration. Opbevares ved -80 ° C.
- Forbered 20 mg / ml EMS (ethylmethansulfonat) i phosphatpufret saltvand (PBS) med 0,9 mM calciumchlorid og 0,49 mM magnesiumchlorid i en kemisk sikkerhed hætte som EMS er en flygtig væske.
2.. Klonal Isolering af Chlamydia trachomatis mutantstammer ved plakoprensning
- Set konfluente monolag af Vero-celler i plader med 6 brønde: Frø ~ 0,4 x 10 6 celler i 3 ml DMEM/10% FBS per brønd. Tillade at cellerne danner en homogen monolag løbet af de næste 24 timer.
- Tø stamopløsning af mutageniserede Chlamydia på is. Udfør 6 x 10-fold seriefortyndinger i et samlet volumen på 200 pi pr fortynding i DMEM/10% FBS og satte dem på is.
Bemærk: Bakteriel titer i inklusionslegemer dannende enheder (IFU) er et godt estimat af plakdannende enheder (pfu). Formål at plaque 10, 100 og 1000 pfu. - Vask Vero-celler to gange med 3 ml PBS per brønd.
- Tilsæt 3 ml DMEM til hver brønd i 6-brøndsplader og 100 gl af de bakterielle fortyndinger i to eksemplarer. Swirl pladen for at sikre jævn blanding.
- Spin inficerede plader ved 2.700 xg i 30 minutter ved 15 ° C, hvorefter der inkuberes ved 37 ° C i en fugtig,5% CO2-inkubator i 1-2 timer.
- Forbered 0,54% agarose i DMEM (for 6 brønde):
- Tilføj følgende ingredienser: 18,9 ml kold 2x DMEM, 4,2 ml FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0,042 ml 200 pg / ml cyclohexamid, 0,021 ml 50mg/ml gentamicin. Bland godt.
- Bland i 18,9 ml varm steril 1,2% agarose / H 2 O, omrøring for at forhindre klumper. Blandingen skal være varm at røre ved. Opbevares i et varmt vandbad ved 55 ° C før du tilføjer til inficerede celler.
- Aspirere bakteriesuspension fra skåle og anvende 6 ml 0,54% agarose / DMEM per brønd. Tillad agarose at størkne fuldstændigt ved stuetemperatur udenfor hætte til 15 min. Tør pladerne med låg fjernet i biosikkerhed hætte til 15 min.
Bemærk: Vibration fra den biologiske indeslutning hætten kan forvrænge størknende agarose. - Inkuber ved 37 ° C i CO2-inkubator i 7-10 dage. Plaques må være synlig ved hjælp af et dissektionsmikroskop. (Refer til figur 3 for en typisk billede af plaques.)
- En dag før isolering mutanter, frø 1 x 10 4 Vero-celler i 100 pi per brønd i en plade med 96 brønde. Celler bliver sammenflydende inden 24 timer.
- Ved hjælp af en dissektion mikroskop for at markere plaques blive plukket. Saml propper af plaques ved hjælp af en steril 1,0 ml barriere pipettespids.
- Resuspender plaques i 100 ul DMEM suppleret med 10% FBS, 400 ng / ml cyclohexamid, 50 ug / ml gentamicin.
- At udvide mutantstammer overlay suspensionen på sammenflydende monolag af Vero-celler. Spin plader ved 2.700 xg, 15 ° C i 30 min.
- Inkuber ved 37 ° C / 5% CO 2 i en fugtig inkubator. Harvest EB'er når> 50% af cellerne er inficeret, hvilket kan ske så tidligt som 48 HPI og så sent som 14 dage. Denne mængde af inficerede celler tillader nok levedygtige bakterier skal lagres. Mutantstammerne forskellige i vækstrater og smitteevne. Tillad langsomtvoksende stammer Naturally re-inficere naboceller indtil nok celler er inficeret.
- Uddrag EB'er ved hypotonisk lysis af inficerede celler:
- Helt aspirere medium.
- Tilføj 160 ul sterilt vand. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
- Forstyrre cellerne ved pipettering op og ned flere gange for at sikre en fuldstændig lyse, brug barriere tips til at undgå krydskontaminering.
- Overfør 160 ul lysater til mikrocentrifugerør.
- Bland i 40 pi 5x SPG. Opbevares ved -80 ° C.
- Assay og skærm mutanter til fænotype (r) af interesse.
3.. Hele Genomsekvensering af udvalgte Chlamydia Mutants
- Uddrag genomisk DNA fra gradient-oprenset EBS, som stort set er fri for kontaminerende host DNA. Protokoller for dyrkning i stor skala af Chlamydia og oprensning af EB kan findes i ref. (17). Benytte kommerciel genomiske DNA rensning kits (fx Qiagen kat. 69504) til extract DNA fra 2 x 10 9 bakterier efter fabrikantens anvisninger.
- Brug et fluorometer (Qubit, Invitrogen kat. Q32866) til nøjagtigt at måle mængden af DNA. 1-5 ug oprenset DNA er nødvendig for Illumina sekventering platform.
Bemærk: Flere platforme kan bruges til sekvens bakterielle genomer, herunder Illumina/Solexa- og faststof-baserede systemer. Vi valgte at bruge HiSeq (Illumina), da det producerer høj tæthed af kort, men høj kvalitet sekventering læser. Mindre målestok genom sequencer, såsom IonTorrent (Life Technologies) og MySeq (Illumina) er egnede for og mere end tilstrækkelige til multipleksning disse quencing af op til 4 Chlamydia genomer på et tidspunkt, der overstiger den minimale dækning af 25X for passende genom samling. Fremstilling af DNA-sekventering biblioteker for Illumina platform er beskrevet nedenfor. - Fragment DNA til passende størrelse (300-400 basepar til Illumina sekventering) under anvendelse af en adaptiv Fokuseret Akustik S220 istrument (Covaris) i henhold til fabrikantens foreslåede indstillinger. Bemærk: DNA fragmentering ved nebulisering resulterer i større tab af prøven på grund af aerosolisering prøve.
- Forbered de genomiske sekventering biblioteker anvender kommercielle byggesæt (Illumina FC-102 til 1001) ved at følge producentens anvisninger. Biblioteker kan indekseres med stregkodede primere (Illumina FC-121 til 1003), således at flere prøver kan samles og sekventeret samtidigt.
- Kør sekventering prøver. Dette trin er normalt udføres af kommercielle tjenester eller centrale faciliteter, der drives af dedikerede tekniske personale. Følg deres procedurer og anbefalinger.
- Illumina læser (FASTQ format) kan samles til en reference genom med brugervenlig grafisk brugergrænseflade software, såsom Geneious (Biomatters), som også kan benyttes til SNP / mutation identifikation. Til kort mutationer parametre indstilles til 90% for mindst variant frekvens og 50X for minimum dækning. Open source genom montører, såsom MAQ (18) og BWA (19), kan også anvendes.
- Bekræft mutationer af Sanger sekventering: Brug genomisk DNA som skabelon for PCR-amplifikation af 300-500 bp regioner, der flankerer identificerede mutationer og sekvens rensede eller fortyndes (1:20) PCR produkter ved Sanger sekventering.
4.. Generering af Chlamydia rekombinanter
Bemærk: Chlamydia kan udveksle DNA under infektion, som giver mulighed for generering af rekombinante stammer (12, 13, 20). Efter co-infektion af celler med to unikke antibiotikaresistente stammer, rekombinant "afkom" kan vælges for dobbelt antibiotikaresistens (12, 13). Vi tog fordel af dette fænomen at adskille mutationer og skabe co-isogene stammer. Således blev mutantstammer genereret på antibiotikaresistente baggrund (f.eks rifampin modstand (rif R) H471Y i CTL0567 (rpoB)), således at de kan krydses til vildtypestamme bearinga forskellige antibiotikaresistente allel (f.eks spectinomycinresistens (SPC R), G1197A i r01/r02 (16SRNA eksemplar 1 og 2)). For detaljer vedrørende DNA udveksling og rekombination i Chlamydia henvises til referencer (12, 13).
- Co-inficere vildtype og klonede mutantstammer ved centrifuging6 x 10 5 bakterier fra hver stamme på sammenflydende monolag af Vero-celler dyrket på en plade med 24 brønde. Parallelt hermed inficere monolag med hver stamme alene.
- Ved 44 HPI, høst EB'er ved hypotonisk lysis af inficerede celler:
- Helt aspirere medium.
- Tilføj 0,4 ml sterilt vand og lad stå i 10 min.
- Lyse cellerne ved kraftig pipettering op og ned mindst 10 gange. Overførsel lysater til et mikrofugerør.
- Bland 0,1 ml 5x SPG til en endelig koncentration på 1x SPG.
- Rålysater kan anvendes straks eller opbevares ved -80 ° C.
- Plaque 50 pi af det rå EB preps end 5 x 01:10 serielle fortyndinger i agarose / DMEM suppleret med passende antibiotika til at vælge for rekombinanter. (Se tabel for koncentrationer af typiske antibiotika til selektion af rekombinanter.)
- Plaque oprense og berige rekombinante stammer som ovenfor. Score rekombinanter for tilstedeværelse eller fravær af den ønskede fænotype. At udvinde DNA fra rekombinante stammer af DNAzol behandling (næste afsnit) med henblik på genotypebestemmelse for tilstedeværelse eller fravær af mutationer.
- Krydsninger kan gentages med stammer, der bærer andre antibiotikaresistensmarkører til yderligere adskille mutationer, og generere isogene stammer. Co-inficere udvalgte rekombinanter til en anden vildtypestammen bærer et andet antibiotikum markør.
Tabel 1: antibiotisk koncentrationer for udvælgelse af rekombinanter:
| Slutkoncentration | Klargøringsanvisninger |
|---|---|
| 200 ng / ml rifampin Make 25 mg / ml opbevaring lager i dimethylsulfoxid (DMSO). Udgør 200 ug / ml arbejdsopløsning ved at fortynde opbevaring lager med H 2 O. Opbevar ved -20 ° C i mørke. | |
| 200 ug / ml trimethoprim | Lav en 100 mg / ml lager i DMSO. Opbevar ved -20 ° C |
| 200 ug / ml spectinomycin | Lav en 100 mg / ml lager i vand i 100 gl portioner. Opbevar ved -20 ° C. Undgå gentagne fryse tø. |
5.. Udvinding af genomisk DNA fra rekombinante stammer for Genotypning
Bemærk: Søjle-baserede rensning kits kan også anvendes. En fordel ved DNA-ekstraktion ved DNAzol behandling koste.
- Inficere 1,2 x 10 5 chlamydier på monolag af Vero-celler dyrket på 12-brønds plader.
- Ved 36-48 HPI, aspirere medium og tilsæt 0,375 ml DNAzol (Invitrogen 10.503-027). Ryst forsigtigt cellerne og Pipet lysAtes til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Bundfald DNA ved tilsætning af 0,188 ml 100% ethanol. Bland ved inversion.
- Uddrag DNA ved spooling med en pipette spids og placere den i et rent glas. Alternativt pellet DNA'et ved centrifugering ved tophastighed i 2 minutter ved stuetemperatur eller 4 ° C, og dekanter supernatanten.
- Vask DNA udfældes to gange med 1,0 ml 75% ethanol.
- Air-tør DNA efter fjernelse af ethanol i 15 sek.
- Opløse DNA med 0,2 ml 8 mM NaOH og derefter neutralisere til pH 8,0 med 20,2 ul 0,1 M HEPES. Bring op til et endeligt volumen på 0,5 ml med vand eller TE. Alternativt Resuspender DNA i TE-buffer (DNA pellet vil ikke solubiliseres fuldstændigt.).
- Brug DNAzol ekstraheret DNA som template for PCR-amplifikation af 300-500 bp regioner, der flankerer identificerede mutationer. Sequence renset eller fortyndes (1:20) PCR produkter ved Sanger sekventering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udsættelse for mutagen fører til indeslutninger, der vises uden bakterier, formentlig på grund af bakteriel celledød. Typisk vil serovar LGV-L2 helt lysere inficerede celler inden for 48 timer efter infektion, men behandling med mutagener kan udvide denne cyklus> 90 timer. Omkring 10% af indeslutninger ventes at komme sig. I vores eksperimenter, behandlede inficerede Vero celler med 20 mg / ml EMS førte til et 99% fald i inddrivelse af infektiøse afkom i forhold til ubehandlede kontroller. Mutagen behandling førte også til fremkomsten af plaques med ændrede morfologier, herunder små plaques (SPQ) (Figur 3). Andre morfologier omfatter plaques, der vises granuleret, clumpy eller honeycomb formede (Figur 3). Disse fænotyper kan afspejle defekter i processer, der kræves for infektion og overlevelse inden værten miljø. Mutanter med lille plakette (SPQ) morfologi generelt producere væsentligt færre infektiøse afkom og kan tage op til 2-3 uger til etmplify. Der bør udvises forsigtighed, når passage disse stammer som rettelser og suppressor mutationer kan ophobes på en høj frekvens.
Doserne af EMS anvendes i disse undersøgelser kan føre til mellem 3 til 30 mutationer pr Chlamydia genom, vurderet eksperimentelt ved WGS (figur 4). Selvom gradient renset EB'er er stort set fri for værtscelle materiale er værtens dna også påvist og består omkring 10-15% af genomiske preps.
Samtidig infektion af to stammer kan generere afkom med genetiske bidrag fra begge stammer og forekommer ved frekvenser på 10 -4 til 10 -3, cirka 10 4 gange hyppigere end spontan modstand (13). Rekombination break point opstår typisk mellem ~ 100 kb til 800 kb (12). En analyse af sådanne rekombinante stammer kan afsløre mutationer genetisk knyttet til fænotype under undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode opfylder de grundlæggende krav til genetisk analyse da det etablerer forbindelsen mellem genotyper og fænotyper. Vigtigere er, opnås dette uden hjælp af konventionelle molekylære værktøjer til rekombinant DNA-transformation og insertionel inaktivering af gener i bakterier, som ofte er et hastighedsbegrænsende trin i analysen af genfunktion i ikke-model mikrober.
Et kritisk trin er at sikre klonalitet af plak-oprensede mutanter. Krydskontaminering med vildtype eller "montør" mutanter kan hurtigt føre til mutante stammer bliver udkonkurreret. Tilsvarende kan kortlægning mutationer ved hele genomet sekventering af ikke-klonede prøver fører til tvetydige resultater. Isolere mutanter fra kraftigt plaqued brønde eller sætte mindeplader, der er for tæt på hinanden, bør undgås. Derudover, for langsomt voksende mutanter kan revertanter opstå ved relativt høje frekvenser. Vi anbefaler at bevare originale eller lav passage bestande. Replaque mutanter hvis krydskontaminering eller revertanter er mistænkt.
Koncentrationen af EMS kan sænkes for at mindske hyppigheden af mutationer. Mutationen sats, som vurderet ved genereringen af rifampin resistente varianter (grundet punktmutationer i genet kodende RNA-polymerase, rpoB) var optimal i vores hænder ved 20 mg / ml EMS. Induktion af rifampin resistens kan vurderes ved frekvensen af plaques dannet i nærvær af rifampin og bør korrelere til hyppigheden af kemisk inducerede mutationer.
EMS kan erstattes med andre mutagener at udvide spektret af mutationer, der kan opnås. For eksempel kan DNA-interkalerende midler som psoralen og dets derivater anvendes til at inducere og-insertioner (21).
Mutationer, der kort tæt på hinanden i genomet (<100 kb mellemrum) er vanskelige at fjerne linket via rekombination. Når høje mutagenese satser er achieved, kan det være vanskeligt entydigt at identificere en kausal mutation. Men da transformation af C. trachomatis er nu muligt med shuttle plasmider (22), omend ineffektivt, kan det være muligt at behandle disse linkage problemer ved at supplere mutationer i trans med en vildtype kopi af det muterede gen på et plasmid.
Figur 1. Strategi for fremad genetisk analyse og rekombination-baserede kortlægning i Chlamydia. Rifampin resistente (Rif R) C. trachomatis blev mutageniseret under dens replikativ fase og anvendt til at inficere Vero-cellemonolag indtil synlige plaks dannet. Individuelle kloner af mutanter blev opsamlet og analyseret for specifikke fænotyper, såsom ændrede plaque morphotypes. Genomer af mutanter deler en fælles fænotype blev sekventeret til identify fælles genetiske læsioner. At skabe en kobling mellem disse gen læsioner og specifikke plaque morfologier blev Veroceller co-inficeret med mutanter genereret i Arif R baggrund og vild-type SPC R Klamydia stammer og rekombinante Rif R Spc R stammer blandt den resulterende infektiøse afkom blev valgt i tilstedeværelsen af rifampin og spectinomycin ("sender"). Adskillelse af de enkelte mutationer i forældrenes Rif R mutantstamme blandt de rekombinante bakterier udviser ændret plak morfologi blev bestemt ved målrettet DNA-sekventering. (Gengivet med tilladelse fra PNAS (14)) Klik her for at se større billede .
Figur 2. Skematisk repræsentation af EMS mutagenese protokol. Chlamydia trachomatis LGV-L2-inficerede celler blev eksponeret for EMS under RB fase af infektiøse cyklus, og infektionen fik lov at forløbe i 72 timer for at tillade generering af infektiøse elementarlegemer (EB) . Mutageniserede EB puljer blev høstet og titreret for inklusion dannende enheder (IFU) og plak-dannende enheder på Vero celler. N, nucleus. (Gengivet med tilladelse fra PNAS (14)) Klik her for at se større billede .
Figur 3. Eksempler på almindelige plaque morfologier blandt EMS-muterede C. trachomatis. Mutageniserede C. trachomatis LGV-L2 lov at danne plaques på Vero celle monolags for 14 dage. Plaques varierede i størrelse (A) og morfologi (B), der kan isoleres, amplificeres i Vero-celler, og der anvendes i reinfektion af Vero monolag at bekræfte stabiliteten af plak morphotypes. Eksempler på almindelige fænotyper er vist herunder cellestruktur (Hcm), klumpet (CLMP), lille plakette (SPQ) og granulat (Grn). Pile angiver store kornede indskud i en Grn plak. (Gengivet med tilladelse fra PNAS (14)) Klik her for at se større billede .
Figur 4.. Identifikation af EMS-inducerede gen læsioner. Kromosomal placering nukleotid varianter i mutanter, der viser Grn plaque morphotype. Whole-genom sekventering af tre Grn mutanter identificeret mutations, der fører til aminosyreændringer i glgB, der koder for et glycogen-forgreningsenzym. (Gengivet med tilladelse fra PNAS (14)) Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
- Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
- Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
- Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
- Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
- Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
- Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
- Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
- Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
- DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
- Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
- Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
- Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
- Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
- Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
- Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).
