Summary
Nous décrivons une méthode pour effectuer l'analyse génétique dans Chlamydia basé sur la mutagenèse chimique et le séquençage complet du génome. En outre, un système d'échange de l'ADN dans les cellules infectées est décrite qui peut être utilisé pour la cartographie génétique. Cette méthode peut être largement applicable à des systèmes microbiens manquant des systèmes de transformation et des outils de génétique moléculaire.
Abstract
Chlamydia trachomatis, l'agent étiologique des maladies sexuellement transmissibles et les infections oculaires, reste mal caractérisée par son indocilité à la transformation expérimentale avec de l'ADN recombinant. Nous avons développé une approche pour effectuer l'analyse génétique de C. trachomatis malgré l'absence d'outils de génétique moléculaire. Notre méthode consiste à: i) la mutagenèse chimique pour générer rapidement des bibliothèques complètes de mutants génétiquement définis avec des phénotypes distincts; ii) séquençage du génome entier (WGS) pour cartographier les lésions génétiques sous-jacents et de trouver des associations entre gène muté (s) et.. un phénotype commun;. iii) la production de souches recombinantes à travers la co-infection de cellules de mammifères par des bactéries de type mutant et sauvage. En conséquence, nous avons pu établir des relations causales entre les génotypes et les phénotypes. Le couplage de variation génique induite chimiquement et WGS de créer des associations génotype-phénotype corrélatives should être largement applicable à la grande liste des micro-organismes médicalement et écologiquement importantes actuellement insolubles à l'analyse génétique.
Introduction
Les intracellulaire obligatoire bactérie Chlamydia comptes trachomatis pour environ 2,8 millions d'infections génitales des voies par an aux Etats-Unis (Center for Disease Control) avec associé séquelles telles que la maladie inflammatoire pelvienne, des grossesses ectopiques et l'infertilité (1). Chlamydia spp ont une occasion unique physiologie d'un cycle de développement biphasique consistant en deux formes: le corps élémentaire infectieux mais non répliquant (EB) et le corps réticulé non infectieux mais réplicatif (RB). L'infection commence par la fixation d'EBS aux cellules épithéliales suivies endoctyotosis (2). Au sein d'une vacuole membranaire appelé une inclusion, EBS se différencier en forme RB, qui reproduit ensuite par scissiparité. Au milieu de cycle, les transitions RBS retour dans EBS, qui sont ensuite expulsés dans l'espace extracellulaire pour initier de nouveaux cycles d'infection lors de la lyse de la cellule hôte (3).
C. trachomatis estréfractaires à une manipulation de routine avec des outils de génétique moléculaire standard, telles que le remplacement ciblé de gènes, transposons, et les phages transducteurs, qui ont été au centre de la plupart des études en génétique bactérienne, on ne sait dans quelle mesure les gènes de Chlamydia individuels contribuent à l'évasion de l'immunité innée , l'acquisition des éléments nutritifs, transitions développementales, ou d'autres processus importants pour la survie de l'agent pathogène dans un hôte eucaryote (4). Par conséquent, cet agent pathogène reste mal caractérisée, malgré son importance clinique.
Les génomes de Chlamydia spp. sont relativement faibles (~ 1 Mb) (5) avec de multiples espèces et biovars séquencés en utilisant des technologies de séquençage de prochaine génération. Analyse comparative du génome par WGS a fourni un aperçu unique dans l'évolution des espèces Chlamydia et leur adaptation à l'homme (6-8) et dans une certaine mesure, a fourni quelques informations sur la fonction potentielle de facteurs de virulence (9, 10). TIl diversité génétique affichée par les isolats cliniques ne fournit pas la résolution requise pour cartographier systématiquement la fonction de la plupart des facteurs de virulence, sans doute parce que des mutations dans ces gènes auraient été facilement sélectionné contre. Sans effets confondants de la sélection naturelle, la variation du gène mutagène induit, couplée à des tests définis qui permettent de mesurer les défauts de virulence, peuvent étendre le spectre des mutations qui peuvent être interrogés. Mutagènes chimiques, en particulier, sont utiles car ils peuvent générer nulle conditionnelle hypomorphic (fonction réduite), et hypermorphic (gain de fonction) allèles. Avec l'arrivée des technologies de séquençage des génomes robustes de la prochaine génération, telles mutations peuvent être facilement identifiés et cartographiés. De cette manière, les associations fortes peuvent être faites entre des mutations dans un gène ou voie génétique et le phénotype commun, permettant l'application d'approches avant génétiques.
Les séquences du génome des souches cliniques ont révélé mosaïque bntre les sérotypes et les lieux de recombinaison fréquente (11). Les données empiriques de recombinaison a été démontré par la co-infection de deux souches résistantes aux antibiotiques différents et le choix de la double descendance recombinante résistant, qui a été révélé à avoir des contributions génétiques de deux souches (12, 13). Ainsi, l'échange génétique entre les souches de type sauvage et mutants dans un milieu de co-infection permet la séparation des mutations induites chimiquement de localiser le gène concerné qui conduit au phénotype observé.
Nous décrivons ici une méthode pour effectuer l'analyse génétique dans Chlamydia basé sur la mutagenèse chimique, WGS, et un système d'échange de l'ADN dans les cellules infectées (14) (figure 1).
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Protocol
1. Mutagenèse chimique
Note: Nous avons constaté que la forme de RB réplicative est plus propice à la mutagenèse chimique que le formulaire de EB. Au milieu de cycle (entre 18 à 20 HPI), RBS sont au plus grand nombre avant la transition RB-EB. Parce que Chlamydia trachomatis est un pathogène intracellulaire obligatoire, les effets de l'agent mutagène sur la santé de l'hôte peut limiter la récupération bactérienne. Des cellules Vero ont été trouvés à être plus résistantes aux effets néfastes des niveaux élevés de SME que d'autres lignées cellulaires testées.
Séparation des mutations par recombinaison nécessite sélection pour antibiotique descendance recombinante résistant. Nous vous recommandons d'utiliser des souches résistantes aux médicaments (par exemple rifampicine, la spectinomycine, ou triméthoprime) pour générer des mutants de la capacité d'effectuer des analyses recombinant et d'isoler des souches isogéniques. Souches résistantes aux antibiotiques ont été générés par un processus de sélection par étapes (15, 16).
None: Chlamydia trachomatis (souche L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) est BSL2 pathogène. Reportez-vous aux procédures d'utilisation normalisées (SOP institutionnels) pour le traitement de ces agents pathogènes.
- Préparation des cellules en culture et de l'infection:
- Seed environ 1 x 10 6 cellules Vero (ATCC CCL-81) par 25 cm 2 (T25) flacon dans 3 ml de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS). Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. Les cellules doivent former une monocouche confluentes dans les 24 h.
- Aspirer moyenne. Infect confluentes flacons T25 de cellules Vero avec Chlamydia à une multiplicité d'infection (MOI) de 5 (~ 14 x 10 6) dans un volume total de 3 ml de milieu (DMEM, 200 ng / ml cyclohexamide, 10% de FBS).
- Commencez mutagenèse à 18 heures après l'infection (HPI):
- Préparer 20 mg / ml EMS (Ethyl methanesulfonate) en phosphate salin (PBS) tamponnée avec 0,9 mM de calciumchlorure et chlorure de magnésium 0,49 mM dans une hotte de sécurité chimique EMS est un liquide volatil.
Note: EMS est un mutagène puissant et cancérigène. Neutraliser EMS déchets et décontamination des déversements, plastique, papier, et la verrerie avec 1 M d'hydroxyde de sodium. - Aspirer à moyen et laver les cellules une fois avec 3 ml de PBS / MgCl 2 / CaCl 2. Incuber les cellules avec 3 ml de 20 mg / ml dans le SME PBS / MgCl 2 / CaCl 2 pendant une heure dans la hotte à température ambiante. Les cellules Vero sont capables de survivre à cette concentration de SME et conditions en dehors de l'incubateur pour de courtes périodes. N'oubliez pas d'inclure un échantillon de contrôle qui n'a pas été mutagenèse.
- Retirer milieu contenant SME et le placer dans un récipient de 1 M NaOH pour inactiver le mutagène. Laver les cellules infectées par 3 fois dans 3 ml de PBS + MgCl 2 / CaCl2 pour enlever mutagène résiduelle. Ajouter 6 ml de DMEM/10% FBS avec 200 ng / ml cyclohexamide et 25 pg / ml de gentamicine, et incuber à 5% de CO
- Extrait EBs par lyse hypotonique: Aspirer entièrement le support. Ajouter 1,0 ml H 2 O et le rock pour déloger les cellules pendant 10 min. Lyse des cellules par pipetage de haut en bas pendant au moins 10 fois. Recueillir lysat dans une micro et ajouter 0,250 ml de tampon 5x en saccharose glutamate de phosphate (SPG) pour l'amener à une concentration finale 1x. Conserver à -80 ° C.
Note: Le niveau de mutagenèse peut être évaluée par l'induction de la résistance à la rifampicine. Pour doser la fréquence de la résistance à la rifampicine, la plaque 1 x 10 8 et 7 x dilutions en série de 10 fois des bactéries en présence de 200 ng / ml de rifampicine. La fréquence de la résistance à la rifampicine est défini comme le nombre de plaques résistantes à la rifampicine divisé par le nombre total de bactéries plaqués. Voir la section ci-dessous pour les instructions de la plaque. - Extrait EBs par lyse hypotonique: Aspirer entièrement le support. Ajouter 1,0 ml H 2 O et le rock pour déloger les cellules pendant 10 min. Lyse des cellules par pipetage de haut en bas pendant au moins 10 fois. Recueillir lysat dans une micro et ajouter 0,250 ml de tampon 5x en saccharose glutamate de phosphate (SPG) pour l'amener à une concentration finale 1x. Conserver à -80 ° C.
- Préparer 20 mg / ml EMS (Ethyl methanesulfonate) en phosphate salin (PBS) tamponnée avec 0,9 mM de calciumchlorure et chlorure de magnésium 0,49 mM dans une hotte de sécurité chimique EMS est un liquide volatil.
2. Isolation clonale de Chlamydia trachomatis souches mutantes par purification sur plaque
- Définir des monocouches confluentes de cellules Vero en plaques de 6 puits: Seed ~ 0,4 x 10 6 cellules dans 3 ml DMEM/10% FBS par puits. Laisser les cellules forment une monocouche homogène sur les prochaines 24 h.
- Décongeler solution stock de Chlamydia muté sur la glace. Effectuez 6 x dilutions en série de 10 fois dans un volume total de 200 ul par dilution dans DMEM/10% de FBS et les mettre sur la glace.
Note: titre bactérienne en unités formant d'inclusion (IFU) est une bonne estimation des unités formant plages (UFP). But de la plaque 10, 100 et 1000 pfu. - Laver les cellules Vero deux fois avec 3 ml de PBS par puits.
- Ajouter 3 ml de DMEM à chaque puits pour les plaques 6 puits et 100 pi des dilutions bactériennes en double. Swirl la plaque pour assurer une mélange.
- Spin plaques infectées à 2700 g pendant 30 min à 15 ° C puis incuber à 37 ° C dans une atmosphère humide,5% de CO 2 incubateur pendant 1-2 heures.
- Préparez 0,54% d'agarose dans du DMEM (pour 6 puits):
- Ajouter les ingrédients suivants: 18,9 ml froide 2x DMEM, 4,2 ml de FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0,042 ml 200 ug / ml cyclohexamide, 0,021 ml 50mg/ml gentamicine. Mélangez bien.
- Mélanger dans 18,9 ml d'agarose à 1,2% / H 2 O stérile chaud, en remuant pour éviter les grumeaux. Mélange doit être tiède au toucher. Conserver dans un bain d'eau chaude à 55 ° C avant de l'ajouter aux cellules infectées.
- Aspirer suspension bactérienne de plats et appliquer 6 ml 0,54% agarose / DMEM par puits. Laisser agarose se solidifie complètement à la température ambiante à l'extérieur de la hotte pendant 15 min. Sécher les plaques avec les couvercles enlevés, dans la hotte de biosécurité pour 15 min.
NB: Les vibrations de la hotte de confinement biologique peut fausser l'agarose se solidifie. - Incuber à 37 ° C en CO 2 incubateur pendant 7-10 jours. Les plaques doivent être visibles à l'aide d'un microscope à dissection. (Refer à la figure 3 pour une image typique de plaques.)
- Un jour avant l'isolement des mutants, des semences 1 x 10 4 cellules Vero dans 100 ul par puits dans une plaque de 96 puits. Les cellules seront confluentes dans les 24 h.
- En utilisant un microscope de dissection, marque plaques à être cueillies. Collecter des bouchons de plaques en utilisant une pointe ml barrière stérile 1,0 pipette.
- Plaques remettre en suspension dans 100 ul de DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 400 ng / ml cyclohexamide, 50 pg / ml de gentamicine.
- Pour développer des souches mutantes, superposer la suspension sur des monocouches confluentes de cellules Vero. Faites tourner les plaques à 2700 xg, 15 ° C pendant 30 min.
- Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 dans un incubateur humidifié. Récolte EB lorsque> 50% des cellules sont infectées, ce qui peut se produire dès 48 HPI et aussi tard que 14 jours. Cette quantité de cellules infectées permet aux bactéries viables suffisant pour être stockés. Les souches mutantes diffèrent des taux de croissance et l'infectiosité. Laisser ralentir souches à croissance naturaLLY ré-infecter les cellules voisines jusqu'à ce que suffisamment de cellules sont infectées.
- Extrait EBs par lyse hypotonique des cellules infectées:
- Aspirer entièrement le support.
- Ajouter 160 ul d'eau stérile. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Broyer les cellules par pipetage de haut en bas plusieurs fois pour assurer une lyse complète, utiliser des embouts de barrière pour éviter la contamination croisée.
- Transférer 160 ul de lysats de microtubes.
- Mélanger dans 40 pl de SPG 5x. Conserver à -80 ° C.
- mutants d'analyse et d'un écran de phénotype (s) d'intérêt.
3. Séquençage du génome entier de mutants de Chlamydia sélectionnés
- Extraire l'ADN génomique de gradient purifié EBS, qui sont en grande partie exempte de contamination de l'ADN de l'hôte. Les protocoles de culture à grande échelle de la chlamydia et la purification d'EBS peuvent être trouvés dans ref. (17). Utilisez des kits de purification d'ADN génomique commerciaux (par exemple cat Qiagen. 69504) à posteRACT ADN de 2 x 10 9 bactéries en suivant les instructions du fabricant.
- Utilisez un fluorimètre (qubit, Invitrogen cat. Q32866) pour mesurer avec précision la quantité d'ADN. 05.01 pg d'ADN purifié est requis pour la plate-forme de séquençage Illumina.
Note: Plusieurs plates-formes peuvent être utilisés pour les génomes bactériens de la séquence, y compris les systèmes Illumina/Solexa- et solide base. Nous avons choisi d'utiliser HiSeq (Illumina) car elle produit une grande densité de court, mais le séquençage de haute qualité lit. Les petits séquenceurs de génome d'envergure, tels que IonTorrent (Life Technologies) et myseq (Illumina) conviennent aussi, et plus que suffisant pour multiplexer ces Quencing jusqu'à 4 génomes de Chlamydia à la fois, ce qui dépasse la couverture minimale de 25X pour l'assemblage du génome adéquate. Préparation des bibliothèques de séquençage d'ADN pour la plateforme Illumina sont décrits ci-dessous. - ADN Fragment de taille appropriée (300-400 paires de bases pour Illumina séquençage) en utilisant un Adaptive Acoustics ciblées S220 danstrument (Covaris) selon les réglages suggérés par le fabricant. Note: fragmentation de l'ADN par les résultats de nébulisation à une plus grande perte de l'échantillon en raison de nébulisation de l'échantillon.
- Préparer les bibliothèques de séquençage génomique en utilisant des kits de construction commerciale (Illumina FC-102-1001), en suivant les instructions du fabricant. Les bibliothèques peuvent être indexés en utilisant des amorces à code-barres (Illumina FC-121-1003) telles que de multiples échantillons peuvent être mis en commun et séquencés simultanément.
- Exécutez le séquençage d'échantillons. Cette étape est généralement effectuée par les services commerciaux ou d'installations de base exploités par le personnel technique dédié. Suivez leurs procédures et recommandations.
- Illumina lectures (format FASTQ) peuvent être assemblés pour un génome de référence en utilisant le logiciel d'interface utilisateur graphique conviviale, comme Geneious (Biomatters), qui peut également être utilisé pour SNP / identification de la mutation. Pour carte mutations, définir les paramètres à 90% pour la fréquence variant minimum et 50X pour une couverture minimum. Ouvert source du génome monteurs, comme MAQ (18) et BWA (19), peuvent également être utilisés.
- Confirmez mutations par séquençage Sanger: utiliser l'ADN génomique comme matrice pour l'amplification par PCR des régions 300-500 pb flanquant mutations identifiées et la séquence purifiés ou dilué (1:20) Les produits de PCR par séquençage Sanger.
4. Production de recombinants de Chlamydia
Note: La chlamydia peut échanger l'ADN au cours de l'infection, ce qui permet la génération de souches recombinantes (12, 13, 20). Après avoir co-infection de cellules par deux souches résistantes aux antibiotiques uniques, "descendance" recombinant peut être sélectionnée pour la résistance aux antibiotiques double (12, 13). Nous avons profité de ce phénomène pour séparer les mutations et pour générer des souches co-isogéniques. Par conséquent, les souches mutantes ont été générés en arrière-plan résistantes aux antibiotiques (par exemple rifampicine résistance (rif R) H471Y dans CTL0567 (rpoB)) de telle sorte qu'ils peuvent être croisées pour souche de type sauvage bearinga allèle de résistance aux antibiotiques différents (par exemple la résistance à la spectinomycine (CPS R), G1197A dans r01/r02 (16SRNA copie 1 et 2)). Pour plus de détails concernant les échanges d'ADN et la recombinaison à Chlamydia, reportez-vous aux références (12, 13).
- Co-infecter type sauvage et des souches mutantes clonales par centrifuging6 x 10 5 bactéries de chaque souche sur des monocouches confluentes de cellules Vero cultivées sur une plaque de 24 puits. En parallèle, infecter des monocouches avec chaque souche seul.
- À 44 HPI, la récolte EBs par lyse hypotonique des cellules infectées:
- Aspirer entièrement le support.
- Ajouter 0,4 ml d'eau stérile et laisser reposer pendant 10 min.
- Lyse des cellules par vigoureuse pipetage de haut en bas pendant au moins 10 fois. Transfert lysats dans un tube à centrifuger.
- Mélanger dans 0,1 ml de SPG 5x pour une concentration finale de 1x SPG.
- Lysats peuvent être utilisées immédiatement ou conservés à -80 ° C.
- Plaque 50 pi de l'EB brut preps uned 5 x 1h10 dilutions en série dans agarose / DMEM supplémenté avec des antibiotiques appropriés pour sélectionner des recombinants. (Voir le tableau des concentrations d'antibiotiques classiques pour la sélection des recombinants.)
- Plaque purifier et d'enrichir souches recombinantes comme ci-dessus. recombinants de marque pour la présence ou l'absence du phénotype souhaité. Extraire l'ADN des souches recombinantes par traitement DNAzol (section suivante) dans le but de génotypage pour la présence ou l'absence de mutations.
- Crosses peuvent être répétées avec des souches portant d'autres marqueurs de résistance aux antibiotiques de séparer davantage les mutations et générer des souches isogéniques. Co-infecter recombinants sélectionnés pour une autre souche de type sauvage porteur d'un marqueur antibiotique différent.
Tableau 1: concentrations d'antibiotiques pour la sélection des recombinants:
| Concentration finale | Conseils de préparation |
|---|---|
| 200 ng / ml de rifampicine Faire 25 mg / stock de stockage ml dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Maquillage 200 pg / ml solution de travail en diluant le stock de stockage avec H 2 O. Conserver à -20 ° C dans l'obscurité. | |
| 200 pg / ml de triméthoprime | Faire un mg / ml de bouillon 100 dans le DMSO. Conserver à -20 ° C |
| 200 pg / ml de spectinomycine | Faire un mg / ml de bouillon 100 dans l'eau dans 100 aliquotes. Conserver à -20 ° C. Évitez gel-dégel répété. |
5. Extraction d'ADN génomique de souches recombinantes pour le génotypage
Remarque: des kits de purification basée sur les colonnes peuvent aussi être utilisés. Un avantage de l'extraction de l'ADN par traitement DNAzol est le coût.
- Infect 1,2 x 10 5 chlamydiae sur des monocouches de cellules Vero cultivées sur des plaques à 12 puits.
- À 36-48 HPI, aspirer moyen et ajouter 0,375 ml de DNAzol (Invitrogen 10503-027). Agitez doucement les cellules et les pipettes l'lysates dans un tube à centrifuger de 1,5 ml.
- précipiter l'ADN par addition de 0,188 ml d'éthanol à 100%. Mélanger par inversion.
- Extraire l'ADN par bobinage avec une pipette et le placer dans un tube propre. Alternativement, un culot d'ADN par centrifugation à vitesse maximale pendant 2 min à température ambiante ou à 4 ° C, et le surnageant décanter.
- Lavez ADN précipiter deux fois avec 1,0 ml d'éthanol à 75%.
- ADN air sec après élimination de l'éthanol pendant 15 sec.
- Solubiliser ADN avec 0,2 ml 8 mM NaOH puis neutraliser à pH 8,0 avec 20,2 ul de 0,1 M HEPES. Apportez jusqu'à un volume final de 0,5 ml d'eau ou de TE. Alternativement, l'ADN remettre en suspension dans un tampon TE (culot d'ADN ne sera pas complètement solubilisé.).
- Utilisez ADN DNAzol-extrait de matrice pour l'amplification par PCR des régions 300-500 pb flanquant mutations identifiées. Séquence purifié ou dilué (1:20) Les produits de PCR par séquençage Sanger.
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Representative Results
L'exposition aux substances mutagènes conduit à inclusions qui semblent dépourvues de bactéries, probablement en raison de la mort de la cellule bactérienne. Typiquement, le sérotype LGV-L2 sera complètement lyse des cellules infectées dans les 48 heures après l'infection, mais le traitement avec mutagènes peut prolonger ce cycle> 90 h. Environ 10% des inclusions devraient se redresser. Dans nos expériences, les cellules Vero infectées traitées avec 20 mg / ml EMS a entraîné une diminution de 99% dans la récupération de descendance infectieuse par rapport aux témoins non traités. Traitement mutagène a également conduit à l'émergence de plaques avec des morphologies altérées, y compris les petites plaques (SPQ) (Figure 3). Autres morphologies comprennent plaques qui apparaissent granuleux, grumeleux, ou en forme de nid d'abeille (Figure 3). Ces phénotypes peuvent refléter des défauts dans les processus nécessaires à l'infection et à la survie dans l'environnement hôte. Mutants avec petite plaque (SPQ) morphologie généralement produisent beaucoup moins de descendance infectieuse et peuvent prendre jusqu'à 2-3 semaines pour unmplify. Il faut être prudent lors de passages de ces souches comme réversions et des mutations suppressives peuvent s'accumuler à une fréquence élevée.
Les doses de SME utilisées dans ces études peuvent conduire à entre 3 et 30 mutations par Chlamydia génome, évaluées expérimentalement par WGS (Figure 4). Bien gradient purifié EB sont largement exempt de matière de la cellule hôte, l'ADN de l'hôte est également détectée et se compose d'environ 10-15% des préparations génomiques.
Co-infection par deux souches peut générer progéniture avec des contributions génétiques à partir de deux souches et se produit à des fréquences de 10 -4 à 10 -3, environ 10 4 fois plus souvent que la résistance spontanée (13). Recombinaison des points de rupture se produisent généralement entre ~ 100 ko à 800 ko (12). Une analyse de ces souches recombinantes peut révéler des mutations qui sont génétiquement liés au phénotype à l'étude.
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Discussion
Cette méthodologie répond aux exigences de base pour l'analyse génétique, car elle établit lien entre les génotypes et les phénotypes. Surtout, ce résultat est obtenu sans l'aide d'outils moléculaires classiques pour la transformation de l'ADN recombinant et inactivation par insertion de gènes dans des bactéries, ce qui est souvent une étape limitante dans l'analyse de la fonction des gènes dans les microbes non-modèles.
Une étape essentielle est d'assurer la clonalité des mutants purifiés sur plaque. La contamination croisée avec le type sauvage ou mutants "ajusteur" peut rapidement conduire à des souches mutantes étant supplantée. De même, les mutations de cartographie par le séquençage complet du génome d'échantillons non clonales peuvent conduire à des résultats ambigus. Isoler des mutants de puits fortement Plaqued ou de brancher plaques qui sont trop proches les uns des autres doit être évité. En outre, des mutants à croissance lente, revertants peuvent émerger à des fréquences relativement élevées. Nous vous recommandons de conserver les stocks de passage original ou faible. Remplmutants aque en cas de contamination ou revertants croix sont soupçonnés.
La concentration de l'EMS peut être abaissée pour diminuer la fréquence des mutations. Le taux de mutation, tel qu'évalué par la génération de variants résistants rifampicine (due à des mutations ponctuelles dans le gène codant l'ARN polymérase, rpoB) était optimale dans nos mains à 20 mg / ml EMS. L'induction de la résistance à la rifampicine peut être évaluée par la fréquence des plaques formées en présence de rifampicine et doit correspondre à la fréquence des mutations induites chimiquement.
EMS peut être remplacé par d'autres substances mutagènes pour élargir le spectre des mutations qui peuvent être obtenus. Par exemple, les agents intercalants d'ADN, comme le psoralène et ses dérivés peuvent être utilisés pour induire des suppressions et des insertions (21).
Des mutations qui correspondent à proximité les uns aux autres dans le génome (<100 kb intervalle) sont difficiles à dissocier par recombinaison. Lorsque les taux de mutagenèse élevés sont achieved, il peut être difficile d'identifier sans ambiguïté une mutation causale. Cependant, depuis la transformation de C. trachomatis est désormais possible avec plasmides navettes (22), quoique inefficace, il peut être possible de résoudre ces problèmes de liaison en complétant les mutations en trans avec une copie du gène muté sur un plasmide de type sauvage.
Figure 1. Stratégie pour l'analyse et la cartographie génétique avant recombinaison basée à Chlamydia. Rifampicine résistant (Rif R) C. trachomatis a été muté au cours de sa phase de réplication et utilisé pour infecter des monocouches de cellules Vero jusqu'à plaques visibles formés. Les clones individuels de mutants ont été recueillis et analysés pour phénotypes spécifiques, tels que morphotypes de plaque altérées. Les génomes de mutants qui partagent un phénotype commun ont été séquencés à identify lésions génétiques communes. Pour établir un lien entre ces lésions génétiques et des morphologies de plaques spécifiques, les cellules Vero ont été co-infectées avec les mutants générés dans Arif R fond et les souches de type sauvage Spc R chlamydia, et des souches recombinantes Rifr Spc R parmi la descendance infectieuse résultant ont été sélectionnés dans le présence de rifampicine et à la spectinomycine («croix»). La ségrégation des mutations individuelles présentes dans le Rif R souche mutante parental chez les bactéries recombinantes présentant morphologie de la plaque modifiée a été déterminée par séquençage de l'ADN cible. (Reproduit avec la permission de PNAS (14)) Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Représentation schématique. trachomatis cellules LGV-L2-infectés par mutagénèse EMS protocole Chlamydia ont été exposés à SME pendant la phase RB du cycle infectieux, et on a laissé l'infection se dérouler pendant 72 h pour permettre la génération de corps élémentaires infectieuses (EB) . Piscines EB mutées ont été récoltés et titrés pour les unités de formation d'inclusion (IFU) et des unités formatrices de plages sur des cellules Vero. N, noyau. (Reproduit avec la permission de PNAS (14)) Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Exemples de morphologies de plaque communs entre EMS-mutagénisé C. trachomatis. Mutagénisé C. trachomatis LGV-L2 autorisé à former des plaques sur monocouche de cellules Veros pour 14 jours. Plaques varient en taille (A) et de la morphologie (B), qui peuvent être isolés, amplifiés dans des cellules Vero, et utilisés dans les réinfections de monocouches Vero pour confirmer la stabilité des morphotypes de la plaque. Des exemples de phénotypes communs sont présentés, y compris en nid d'abeilles (HCM), groupée (CLMP), petite plaque (Spq) et granulaire (NRG). Les flèches indiquent les grands dépôts granulaires dans une plaque NRG. (Reproduit avec la permission de PNAS (14)) Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. L'identification des lésions génétiques EMS-induites. Localisation chromosomique des variants nucléotidiques mutants qui affichent le morphotype de la plaque NRG. Séquençage du génome entier de trois mutants Vrt identifiés mutations qui entraînent des changements d'acides aminés dans glgB, codant pour une enzyme glycogène ramification. (Reproduit avec la permission de PNAS (14)) Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Disclosures
Il n'y a rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
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