Summary
אנו מתארים שיטה לביצוע ניתוח גנטי בכלמידיה מבוסס על mutagenesis הכימי וכל רצף הגנום. בנוסף, מערכת להמרת ה-DNA בתאים נגועים מתוארת שיכול לשמש למיפוי גנטי. שיטה זו יכולה להיות ישימה באופן נרחב למערכות חיידקים חסרות מערכות טרנספורמציה וכלים גנטיים מולקולריים.
Abstract
כלמידיה trachomatis, הסוכן האטיולוגי של מחלות מין ודלקות עיניות, נשאר גרוע מאופיין בשל חוסר היכולת להשתלט לשינוי ניסיוני עם ה-DNA רקומביננטי. פתחנו גישה לבצע ניתוח גנטי בג trachomatis למרות העדר כלים גנטיים מולקולריים. השיטה שלנו כוללת: i) mutagenesis הכימי כדי לייצר במהירות ספריות מקיפות של מוטציות גנטית שהוגדרו עם פנוטיפים שונים; II) הגנום כולו רצף (WGS) למפות את הנגעים הגנטיים הבסיסיים ולמצוא את הקשר בין הגן שעבר מוטציה (ים) ו.. הפנוטיפ משותף;. III) דור של זנים רקומביננטי באמצעות שיתוף זיהום של תאי יונקים עם חיידקים מסוג מוטציה ופראיים. בהתאם לכך, היינו יכול לבסס קשרים סיבתיים בין גנוטיפים ופנוטיפים. הצימוד של וריאציה הגנטית הנגרמת כימי WGS ולהקים עמותות גנוטיפ פנוטיפ-גומלות שוLD להיות באופן כללי החל על הרשימה הגדולה של מיקרואורגניזמים חשובים מבחינה רפואית והסביבה כרגע סוררים ניתוח גנטי.
Introduction
את החשבונות המחייבים תאיים חיידק כלמידיה trachomatis עבור 2.8 מיליון זיהומים באברי המין מוערכים בדרכי בשנה בארצות הברית (מרכז לבקרת מחלות) עם משויך sequelae כגון מחלת דלקתית של אגן ירכיים, הריונות מחוץ לרחם, ובעיות פוריות (1). כלמידיה spp לי ייחודיים פיזיולוגיה עם מחזור ההתפתחותי biphasic המורכב משתי צורות: גוף היסודי המדבק אך אינם שכפול (EB) וגוף reticulate noninfectious אבל replicative (RB). זיהום מתחיל עם הקובץ המצורף של EBS לתאי האפיתל ואחרי endoctyotosis (2). בתוך vacuole קרום הנכנס נקרא הכללה, EBS להתמיין טופס RB, אשר לאחר מכן משכפל על ידי החלוקה בינארית. באמצע המחזור, מעברי RBS בחזרה לEBS, אשר לאחר מכן גורש אל תוך החלל תאי ליזום סיבובים חדשים של הידבקות כאשר lyses תא המארח (3).
trachomatis ג הואעקשן למניפולציה שגרתית עם כלים גנטיים מולקולריים סטנדרטיים, כגון החלפה ממוקדת גן, transposons, וphages transducing, שהייתה מרכזי למרבית המחקרים בגנטיקה חיידקים, לא ברור באיזו מידת הגנים כלמידיה בודדות לתרום להתחמקות מהחסינות מולדת , רכישה מזינה, מעברים התפתחותיים, או תהליכים אחרים חשובים להישרדות של הפתוגן בתוך מארח אוקריוטים (4). כתוצאה מכך, הפתוגן זה נשאר מאופיין גרוע למרות החשיבות הקלינית שלה.
את הגנום של כלמידיה spp. הם קטנים יחסית (~ 1 Mb) (5) עם מינים רבים ותוך שימוש בטכנולוגיות biovars רצף רצף של הדור הבא. ניתוח הגנום השוואתי על ידי WGS סיפקה תובנות ייחודיות לאבולוציה של מיני כלמידיה והתאמת לבני אדם (6-8) ובמידה מסוימת סיפקה כמה פרטים כמו לפונקצית הפוטנציאל של גורמים ארסיות (9, 10). Tהוא מוצג על ידי מגוון גנטי קליני מבודדים אינו מספק הרזולוציה הנדרשת כדי למפות את הפונקציה של רוב הגורמים ארסיות באופן שיטתי, יש להניח כי מוטציות בגנים אלו היו נבחרו בקלות נגד. ללא תופעות של בלבול מברירה טבעית, וריאציה גן mutagen-Induced, יחד עם מבחני שהוגדרו כי פגמים למדוד בארסיות, יכולים להרחיב את הספקטרום של מוטציות שיכולים להיות שהשתתפו בסקר. מוטגנים כימיים, בפרט, הם שימושיים כפי שהם יכולים ליצור פונקציה (מופחתת) null, מותנית, hypomorphic, וhypermorphic (רווח של פונקציה) אללים. עם הגעתו של טכנולוגיות הגנום-הדור הבא של רצף חזקים, מוטציות כאלה ניתן לזהות בקלות וממופית. באופן זה, אסוציאציות חזקות יכולות להתבצע בין מוטציות במסלול גן או גנטי ופנוטיפ משותף, מה שמאפשר את היישום של קדימה גנטיים גישות.
את רצף הגנום של זנים קליניים חשף פסיפס בserovars etween ולוקוסים של רקומבינציה תכופה (11). ראיות אמפיריות של רקומבינציה הודגמה באמצעות שיתוף הזיהום משני זנים שונים עמידים לאנטיביוטיקה ובחירת צאצאי רקומביננטי הכפול עמידים, שנחשף ליש תרומה גנטית משני הזנים (12, 13). לפיכך, מטבע גנטי בין סוג בר וזנים מוטנטים בהגדרת שיתוף זיהום מאפשר הפרדה של מוטציות המושרה כימיים כדי לאתר את הגן הפגוע שמוביל לפנוטיפ הנצפה.
כאן אנו מתארים שיטה לביצוע ניתוח גנטי בכלמידיה מבוסס על mutagenesis הכימי, WGS, ומערכת להחלפת ה-DNA בתאים נגועים (14) (איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. כימית mutagenesis
הערה: מצאנו כי טופס RB replicative הוא נוח יותר לmutagenesis הכימי מסוג EB. באמצע המחזור (בין 18 עד 20 HPI), RBS נמצא במספרים הגדולים ביותר שקדמו למעבר RB-EB. בגלל כלמידיה trachomatis הוא פתוגן תאי בלבד, את ההשפעות של mutagen על בריאות המארח יכולות להגביל התאוששות חיידקים. תאי Vero נמצאו להיות עמיד יותר להשפעות השליליות של רמות גבוהות של EMS משורות תאים אחרים שנבדקו.
הפרדה של מוטציות על ידי רקומבינציה דורשת בחירה לצאצאי רקומביננטי עמיד לאנטיביוטיקה. אנו ממליצים להשתמש בזנים עמידים לתרופות (למשל ריפאמפין, spectinomycin, או trimethoprim) ליצירת מוטציות ליכולת לבצע ניתוח רקומביננטי ולבודד זני isogenic. זנים עמידים לאנטיביוטיקה שנוצרו על ידי תהליך בחירה בשלבים (15, 16).
לאדואר: כלמידיה trachomatis (זן L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) הוא BSL2 הפתוגן. מתייחס לנהלי עבודה סטנדרטיים מוסדיים (SOP) לטיפול בפתוגנים כאלה.
- הכנת תאים בתרבית וזיהום:
- זרעים כ 1 x 10 6 תאי Vero (ATCC CCL-81) ל25 ס"מ 2 (T25) בבקבוק 3 מ"ל של השתנה Dulbecco נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS). לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תאים צריכים טופס monolayer ומחוברת בתוך 24 שעות.
- לשאוב בינונית. להדביק T25 צלוחיות מחוברות של תאי Vero עם כלמידיה בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 5 (~ 14 x 10 6) בהיקף כולל של 3 מ"ל של מדיום (DMEM, 200 ng / ml cyclohexamide, FBS 10%).
- בגין mutagenesis בזיהום לאחר שעות 18 (HPI):
- הכן 20 מ"ג / מיליליטר EMS (אתיל methanesulfonate) בופר פוספט (PBS) עם סידן 0.9 מ"מכלוריד ומגנזיום כלוריד 0.49 מ"מ במכסת מנוע בטיחות כימית כEMS הוא נוזל נדיף.
הערה: EMS הוא mutagen וקרצינוגן חזקים. לנטרל EMS לבזבז ולטהר נשפך, פלסטיק, נייר וזכוכית עם הידרוקסיד 1 M נתרן. - לשאוב בינונית ולשטוף את תאי פעם אחת עם 3 מ"ל של PBS / MgCl 2 / CaCl 2. דגירה תאים עם 3 מ"ל של 20 מ"ג / מיליליטר EMS ב PBS / MgCl 2/2 CaCl לשעה אחת במנדף בטמפרטורת חדר. תאי Vero מסוגלים לשרוד זה ריכוז של EMS ותנאים מחוץ לחממה לתקופות קצרות. זכור לכלול מדגם שליטה שלא mutagenized.
- סור בינונית המכיל EMS ולמקם אותו במכל של 1 M NaOH כדי להשבית mutagen. לשטוף את התאים נגועים 3 פעמים ב 3 מ"ל PBS + MgCl 2/2 CaCl להסיר mutagen שיורית. הוסף 6 מ"ל של DMEM/10% FBS עם 200 ng / ml cyclohexamide ו25 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין, ולדגור על 5% CO
- לחלץ EBS על ידי תמוגה hypotonic: לחלוטין לשאוב בינונית. הוסף 1.0 מ"ל H 2 O ורוק כדי לסלק תאים למשך 10 דקות. Lyse תאים על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך לפחות 10 פעמים. לאסוף lysate בmicrofuge ולהוסיף 0.250 חיץ מיליליטר 5x סוכרוז פוספט גלוטמט (SPG) כדי להביא אותו לריכוז סופי 1x. חנות ב -80 ° C.
הערה: רמת mutagenesis ניתן להעריך על ידי האינדוקציה של התנגדות ריפאמפין. לassay התדירות של התנגדות ריפאמפין, לוח 1 x 10 x 7 8 ודילולי סדרתי של פי 10 של חיידקים בנוכחותם של 200 ng / ml של ריפאמפין. התדירות של התנגדות rifampin מוגדרת כמספר הלוחות העמידים rifampin מחולקים במספרם של חיידקים מצופים. סעיף שלהלן לקבלת הוראות פלאק לראות. - לחלץ EBS על ידי תמוגה hypotonic: לחלוטין לשאוב בינונית. הוסף 1.0 מ"ל H 2 O ורוק כדי לסלק תאים למשך 10 דקות. Lyse תאים על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך לפחות 10 פעמים. לאסוף lysate בmicrofuge ולהוסיף 0.250 חיץ מיליליטר 5x סוכרוז פוספט גלוטמט (SPG) כדי להביא אותו לריכוז סופי 1x. חנות ב -80 ° C.
- הכן 20 מ"ג / מיליליטר EMS (אתיל methanesulfonate) בופר פוספט (PBS) עם סידן 0.9 מ"מכלוריד ומגנזיום כלוריד 0.49 מ"מ במכסת מנוע בטיחות כימית כEMS הוא נוזל נדיף.
2. בידוד משובט של זנים מוטנטים כלמידיה trachomatis ידי טיהור רובד
- הגדר monolayers מחוברות של תאי Vero ב6 צלחות גם: זרעים ~ 0.4 x 10 6 תאים ב3 DMEM/10% FBS מ"ל לכל טוב. לאפשר לתאים ליצירת הומוגנית monolayer מעל 24 שעות הבאה.
- הפשירי פתרון המניות של כלמידיה mutagenized על קרח. לבצע 6 x דילולים סדרתי של פי 10 בהיקף כולל של 200 μl לדילול בDMEM/10% FBS ולהגדיר אותם על קרח.
הערה: כייל חיידקים ביחידות יוצרות הכללה (IFU) הוא הערכה טובה של יחידות להרכיב לוחית (pfu). שואף 10 פלאק, 100, ו -1000 pfu. - שטוף תאי Vero פעמיים עם 3 מ"ל PBS בכל טוב.
- הוסף 3 מ"ל DMEM זה גם עבור 6 גם צלחות ו100 μl של דילולים החיידקים בשני עותקים. מערבולת את הצלחת על מנת להבטיח אפילו תערובת.
- ספין צלחות נגועות ב2700 XG למשך 30 דקות ב 15 מעלות צלזיוס ואז לדגור על 37 מעלות צלזיוס בhumidified,% CO 2 באינקובטור במשך 1-2 שעות 5.
- הכן 0.54% agarose בDMEM (במשך 6 בארות):
- הוסף את המרכיבים הבאים: 18.9 מ"ל הקר 2x DMEM, 4.2 FBS מ"ל, 0.42 מ"ל 100x NEAA, 0.042 מ"ל 200 מיקרוגרם / מיליליטר cyclohexamide, 0.021 מ"ל 50mg/ml גנטמיצין. מערבבים היטב.
- מערבבים ב18.9 מ"ל של 1.2% סטרילי החם agarose / H 2 O, תוך ערבוב למניעת גושים. תערובת צריכה להיות חמה למגע. שמור באמבט מים חם על 55 מעלות צלזיוס לפני הוספה לתאים נגועים.
- לשאוב השעיה חיידקים מהמנות ולהחיל 6 מ"ל 0.54% agarose / DMEM בכל טוב. לאפשר agarose כדי לחזק לחלוטין בטמפרטורת חדר מחוץ למכסת מנוע במשך 15 דקות. ייבש את הצלחות עם המכסים הוסרו, במכסת מנוע הבטיחות הביולוגית במשך 15 דקות.
הערה: רעידות ממכסת מנוע הבלימה הביולוגית יכולות לעוות את agarose החיזוק. - לדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור במשך 7-10 ימים. שלטים צריכים להיות גלויים בסיוע מיקרוסקופ לנתח. (מחדשfer באיור 3 לתמונה אופיינית של פלאק.)
- יום לפני מוטציות בידוד, זרעי 1 x 10 4 תאי Vero ב100 μl לכל גם בצלחת 96 היטב. תאים יהיו מחוברות בתוך 24 שעות.
- שימוש במיקרוסקופ לנתיחה, לוחות סימן להיות הרים. לאסוף פקקים של הפלאק באמצעות קצה פיפטה מחסום סטרילי 1.0 מ"ל.
- הפלאק Resuspend ב 100 μl של DMEM בתוספת 10% FBS, 400 ng / ml cyclohexamide, 50 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין.
- כדי להרחיב את הזנים מוטנטים, כיסוי ההשעיה על monolayers מחוברות של תאי Vero. ספין צלחות ב2,700 XG, 15 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2 באינקובטור humidified. הקציר EBS כאשר> 50% מהתאים נגועים, אשר יכול להתרחש מוקדם ככל 48 HPI ומאוחר ככל 14 ימים. סכום זה של תאים נגועים מאפשר לחיידקים מספיק קיימא להיות מאוחסנים. זנים מוטנטים שונים בשיעורי צמיחה וinfectivity. תאפשר להאט זנים גדלים לNaturally מחדש להדביק תאים שכנים עד שמספיק תאים נגועים.
- לחלץ EBS על ידי תמוגה hypotonic של תאים נגועים:
- לחלוטין לשאוב בינונית.
- הוסף 160 μl של מים סטריליים. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
- לשבש את התאים על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים על מנת להבטיח תמוגה מלאה, השתמש טיפים מכשול כדי למנוע זיהום צולב.
- להעביר 160 μl של lysates לצינורות microfuge.
- מערבבים ב40 μl של SPG 5x. חנות ב -80 ° C.
- Assay ומסך מוטנטים לפנוטיפ (ים) של עניין.
3. רצף הגנום כולו של מוטציות כלמידיה נבחרות
- תמצית ה-DNA גנומי משיפוע-EBS מטוהר, שהם במידה רבה ללא זיהום דנ"א מארח. ניתן למצוא פרוטוקולים לתרבות בקנה מידה הגדולה של כלמידיה וטיהור של EBS בנ"צ. (17). השתמש בערכות טיהור DNA הגנומי מסחריות (לדוגמה: חתול Qiagen. 69,504) לשלוחהract DNA מחיידקי 2 10 9 x בהתאם להוראות יצרן.
- השתמש fluorometer (קיוביט, Invitrogen חתול. Q32866) כדי למדוד את כמות ה-DNA בצורה מדויקת. 1-5 מיקרוגרם של ה-DNA המטוהר נדרש עבור פלטפורמת רצף Illumina.
הערה: מספר פלטפורמות ניתן להשתמש כדי הגנום חיידקי רצף, כוללים מערכות מבוססות Illumina/Solexa- ומוצקה. אנחנו בחרנו להשתמש HiSeq (Illumina) כפי שהיא מייצרת צפיפות גבוהה של קצר, אבל רצף באיכות גבוהה קורא. מרצפי הגנום בקנה מידה קטנים יותר, כגון IonTorrent (חיים טכנולוגיים) וMySeq (Illumina) הם גם מתאימים ויותר מהדרוש לריבוב quencing של עד 4 גנומים אלו לכלמידיה בכל פעם, שעולה על הכיסוי מינימאלי של 25X להרכבת הגנום הולם. הכנה של ספריות רצפי DNA לפלטפורמת Illumina מתוארות להלן. - ה-DNA שבר לגודל מתאים (300-400 לזוג בסיס Illumina רצף) באמצעות אקוסטיקה ממוקדת מסתגלת בS220מחוונים (Covaris) לפי ההגדרות שהציע של היצרן. הערה: פיצול ה-DNA על ידי תוצאות ערפול באובדן גדול יותר של מדגם עקב aerosolization של מדגם.
- הכן את ספריות רצף גנומי באמצעות ערכות לבנייה מסחריות (Illumina FC-102-1001), בהתאם להוראות של היצרן. יכולות להיות צמודות ספריות באמצעות פריימרים המבורקד (Illumina FC-121-1003) כאלה שאפשר ונקווה דגימות מרובות ורצף בו זמנית.
- הפעלת רצף דגימות. צעד זה מבוצע בדרך כלל על ידי שירותים מסחריים או מתקני ליבה המופעלים על ידי צוות טכני ייעודי. בצע את ההליכים וההמלצות שלהם.
- Illumina כניסות (פורמט FASTQ) ניתן להרכיב להתייחסות הגנום באמצעות תוכנת ממשק משתמש גרפית ידידותית למשתמש, כגון Geneious (Biomatters), אשר יכול לשמש גם לSNP / זיהוי מוטציה. למוטציות המפה, להגדיר פרמטרים ל90% לתדירות חלופת מינימום ו50X לכיסוי מינימאלי. הפתוח sourcמאספי הגנום דואר, כגון Maq (18) וBWA (19), יכולים לשמש גם.
- לאשר מוטציות ידי סנגר רצף: להשתמש הדנ"א הגנומי כתבנית להגברת PCR של 300-500 אזורים נ"ב איגוף מוטציות ורצף שזוהו מטוהרים או מדוללת (1:20) מוצרי ה-PCR על ידי סנגר רצף.
4. דור של recombinants כלמידיה
הערה: כלמידיה יכולה להחליף DNA במהלך זיהום, אשר מאפשר לדור של זני רקומביננטי (12, 13, 20). אחרי שיתוף זיהום של תאים עם שני זנים עמידים לאנטיביוטיקה ייחודיות, רקומביננטי "צאצאים" ניתן לבחור עבור עמידות לאנטיביוטיקה כפולה (12, 13). אנחנו ניצל את התופעה הזאת לבודד מוטציות וליצור זני שיתוף isogenic. לפיכך, זנים מוטנטים נוצרו ברקע עמיד לאנטיביוטיקה (למשל rifampin התנגדות (הרי"ף R) H471Y בCTL0567 (rpoB)) באופן שהם יכולים להיות חצו לזן פראי סוג המיסבאלל ga שונה עמיד לאנטיביוטיקה (התנגדות spectinomycin למשל (SPC R), G1197A בr01/r02 (16SRNA עותקי 1 ו 2)). לפרטים בדבר חילופי דנ"א ורקומבינציה בכלמידיה, עיין בהפניות (12, 13).
- שיתוף להדביק סוג בר וזנים מוטנטים משובטים ידי centrifuging6 10 5 חיידקי X מכל זן על monolayers מחוברות של תאי Vero גדלו על צלחת 24 גם. במקביל, להדביק monolayers עם כל זן לבד.
- ב44 HPI, קציר EBS על ידי תמוגה hypotonic של תאים נגועים:
- לחלוטין לשאוב בינונית.
- הוסף 0.4 מ"ל של מים סטריליים ולתת לעמוד במשך 10 דקות.
- Lyse תאים על ידי נמרץ pipetting מעלה ומטה ולפחות 10 פעמים. העברת lysates לצינור microfuge.
- מערבבים ב0.1 מ"ל של SPG 5x לריכוז סופי של SPG 1x.
- ניתן להשתמש בו באופן מיידי lysates הגולמי או מאוחסן ב -80 ° C.
- פלאק μl 50 של EB גולמי prepsד 5 x 01:10 דילולים סדרו בagarose / DMEM בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה כדי לבחור עבור recombinants. (ראה טבלה לריכוזים של אנטיביוטיקה טיפוסית לבחירה של recombinants.)
- פלאק לטהר ולהעשיר זנים רקומביננטי כאמור לעיל. recombinants הציון לקיומו או העדרו של הפנוטיפ הרצוי. תמצית ה-DNA מזנים רקומביננטיים על ידי טיפול DNAzol (הסעיף הבא) לצורך genotyping לנוכחות או עדר של מוטציות.
- ניתן לחזור צלבים עם זנים עמידים לאנטיביוטיקה הנושאים סמנים אחרים לבודד עוד יותר מוטציות, וליצור זני isogenic. שיתוף להדביק recombinants שנבחר לזן פראי סוג נוסף נושא סמן אנטיביוטי שונה.
טבלת 1: ריכוזים אנטיביוטיים לבחירה של recombinants:
| ריכוז סופי | הוראות הכנה |
|---|---|
| 200 ng / ml rifampin הפוך את מניית אחסון מ"ל בsulfoxide דימתיל (DMSO) 25 מ"ג /. להמציא פתרון עובד מ"ל 200 מיקרוגרם / על ידי דילול מניות אחסון עם H 2 O. חנות ב -20 ° C בחושך. | |
| 200 מיקרוגרם / מיליליטר trimethoprim | הפוך את מניית מ"ג / 100 מ"ל ב DMSO. חנות ב -20 מעלות צלזיוס |
| 200 מיקרוגרם / מיליליטר spectinomycin | הפוך את מניית מ"ג / 100 מ"ל במים ב100 aliquots μl. חנות ב -20 ° C. הימנע מהפשרת הקפאה חוזרת ונשנית. |
5. מיצוי של הדנ"א הגנומי מזנים רקומביננטי לGenotyping
הערה: ניתן להשתמש גם ערכות טיהור מבוססות עמודה. יתרון של מיצוי DNA על ידי טיפול DNAzol הוא עלות.
- להדביק 5 chlamydiae 1.2 x 10 על monolayers של תאי Vero גדלו על 12 גם צלחות.
- ב36-48 HPI, לשאוב בינוניות ומוסיף 0.375 מ"ל של DNAzol (Invitrogen 10,503-027). בעדינות להתסיס את התאים וpipet ליסהTES לתוך צינור 1.5 מ"ל microfuge.
- ה-DNA משקע על ידי התוספת של 0.188 מ"ל של 100% אתנול. מערבבים על ידי היפוך.
- תמצית ה-DNA על ידי הדפסה ברקע עם קצה פיפטה ולמקם אותו בצינור נקי. לחלופין, גלולה ה-DNA על ידי צנטריפוגה במהירות שיא במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר או 4 מעלות צלזיוס, ולמזוג supernatant.
- ה-DNA לשטוף לזרז פעמיים עם 1.0 מ"ל של 75% אתנול.
- ה-DNA אוויר יבש לאחר הסרת אתנול במשך 15 שניות.
- Solubilize DNA עם 0.2 מיליליטר NaOH 8 מ"מ ואז לנטרל ל-pH 8.0 עם 20.2 μl של 0.1 HEPES ז. להביא עד נפח סופי של 0.5 מ"ל עם מים או TE. לחלופין, ה-DNA resuspend ב TE חיץ (DNA גלולה לא solubilized לחלוטין.).
- להשתמש ב-DNA-DNAzol חילוץ כתבנית להגברת PCR של אזורי 300-500 נ"ב איגוף מוטציות שזוהו. רצף מטוהר או מדולל (1:20) מוצרי ה-PCR על ידי סנגר רצף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חשיפה לmutagen מובילה לתכלילים המופיעים נטול חיידקים, ככל הנראה עקב מוות של תאי חיידקים. בדרך כלל, serovar LGV-L2 יהיה lyse לחלוטין תאים נגועים בתוך 48 שעות לאחר זיהום, אבל טיפול במוטגנים יכולים להרחיב את המעגל הזה ל> 90 שעות. בערך 10% מתכלילים צפויים להתאושש. בניסויים שלנו, תאי Vero נגועים טופלו ב -20 מ"ג / מיליליטר EMS הובילו לירידת 99% בהתאוששות של צאצאים זיהומיות בהשוואה לקבוצת ביקורת שלא טופלה. טיפול mutagen גם הוביל להופעתם של לוחות עם מורפולוגיות שהשתנו, כולל לוחות קטנים (SPQ) (איור 3). מורפולוגיות אחרות כוללות לוחות המופיעים פרטני, גבשושי, או חלת דבש בצורה (איור 3). פנוטיפים אלה עשויים לשקף פגמים בתהליכים הנדרשים לזיהום והישרדות בתוך סביבת המארחת. מוטנטים עם שלט קטן (SPQ) מורפולוגיה בדרך כלל לייצר צאצאים מדבקים פחות באופן משמעותי ועשויים להימשך עד 2-3 שבועות כדיmplify. יש להיזהר כאשר passaging זנים אלה כreversions ומוטציות מדכאי יכולים לצבור בתדירות גבוהה.
המינונים של EMS משמשים במחקרים אלה יכולים להוביל בין 3 ל -30 מוטציות בגנום כלמידיה, כפי שנבחנו בניסוי על ידי WGS (איור 4). למרות השיפוע המטוהר EBS הם במידה רבה ללא חומרי תא מארח, ה-DNA המארח הוא גם זוהה והוא מורכב על 10-15% מpreps הגנומי.
שיתוף זיהום משני זנים יכול ליצור צאצאים עם תרומות גנטיות משני הזנים ומתרחש בתדירות של 10 -4 עד 10 -3, כ -10 4 פעמים בתדירות גבוהה יותר מאשר התנגדות ספונטנית (13). נקודות לשבור רקומבינציה מתרחשות בדרך כלל בין ~ 100 KB עד 800 KB (12). ניתוח זנים רקומביננטי כאלה יכולים לחשוף מוטציות גנטי הקשורים לפנוטיפ תחת מחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מתודולוגיה זו עומדת בדרישות הבסיסיות לניתוח גנטי כפי שקובע זיקה בין גנוטיפים ופנוטיפים. חשוב מכך, זו מושגת ללא סיוע של כלים מולקולריים קונבנציונליים לשינוי DNA רקומביננטי ואיון insertional של גנים בחיידקים, שהוא לעתים קרובות צעד הגבלת שיעור בניתוח של תפקוד גן בחיידקים אי - מודל.
שלב קריטי אחד הוא להבטיח clonality של מוטציות פלאק מטוהרות. זיהום צולב עם סוג בר או מוטציות "כשירים" יותר יכול להוביל במהירות לזנים מוטנטים שoutcompeted. באופן דומה, על ידי מוטציות מיפוי רצף הגנום כולו של דגימות שאינן משובטות יכולות להוביל לתוצאות חד משמעיות. בידוד מוטנטים מבארות plaqued כבדות או חיבור לוחות כי הם קרובים מדי זה לזה יש להימנע. בנוסף, למוטציות צמיחה איטיות, revertants יכול לצוץ בתדרים גבוהים יחסית. אנו ממליצים לשמור על מניות מעבר מקוריות או נמוכות. Replמוטציות aque אם זיהום או revertants צלב חשודות.
הריכוז של EMS יכול להיות מושפל כדי להקטין את התדירות של מוטציות. שיעור המוטציות, כפי שהוערך על ידי הדור של וריאנטים עמידים rifampin (עקב להצביע מוטציות בקידוד גני RNA פולימראז, rpoB) היה אופטימלי בידיים שלנו ב 20 מ"ג / מיליליטר EMS. האינדוקציה של התנגדות rifampin ניתן להעריך על ידי התדירות של הפלאק נוצר בנוכחות rifampin וצריך להיצמד לתדר של מוטציות כימיות שגרמו.
ניתן להחליף EMS עם מוטגנים אחרים כדי להרחיב את הספקטרום של מוטציות שניתן להשיג. לדוגמה, ניתן להשתמש בסוכני intercalating DNA כמו psoralen ונגזרותיו כדי לגרום למחיקות והוספות (21).
מוטציות הממפות קרוב זה לזה בגנום (<100 KB זה מזה) קשות לבטל את הקישור באמצעות רקומבינציה. כאשר שיעורים גבוהים הם mutagenesis achievאד, זה עשוי להיות קשה לזיהוי מוטציה סיבתי באופן חד משמעי. עם זאת, מאז הפיכתו של ג trachomatis עכשיו זה אפשרי עם פלסמידים הסעות (22), אם כי לא יעיל, זה עשוי להיות אפשרי כדי לטפל בבעיות אלה על ידי ההצמדה משלים מוטציות בטראנס עם העתק סוג פראי של הגן שעבר מוטציה בפלסמיד.
איור 1. אסטרטגיה לניתוח קדימה גנטי ומיפוי מבוסס רקומבינציה בכלמידיה. עמיד ג rifampin (הרי"ף R) trachomatis היה mutagenized בשלב replicative ונהג להדביק monolayers הסלולרי Vero עד הפלאק נוצר גלוי. שיבוטים בודדים של מוטציות נאספו וassayed לפנוטיפים ספציפיים, כגון morphotypes פלאק שהשתנו. את הגנום של מוטציות שיתוף פנוטיפ משותף היה רצף ליdentify נגעים גנטיים משותפים. כדי לבסס את הקשר בין נגעי גנים אלה ומורפולוגיה רובד מסוימות, תאי Vero היו שיתוף נגועים במוטציות שנוצרו ברקע עריף R וזני הבר מסוג SPC R כלמידיה, ורקומביננטי זני Rif R SPC R בקרב הצאצאים זיהומית המתקבלים נבחרו ב נוכחות של rifampin וspectinomycin ("צלבים"). ההפרדה של מוטציות בודדות המצויים בזן מוטנטי ההורי הרי"ף R בין החיידקים רקומביננטי מוצגות מורפולוגיה פלאק שינה נקבעה על ידי רצפי DNA ממוקדים. (לשכפל באישור PNAS (14)) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. ייצוג סכמטי של תאים. EMS mutagenesis פרוטוקול כלמידיה trachomatis LGV-L2-נגועים נחשפו לEMS בשלב RB של המחזור המדבק, ואת הזיהום הורשה להמשיך במשך 72 שעות, כדי לאפשר לדור של גופים יסודיים זיהומיות (EB) . הבריכות EB Mutagenized נקצרו וtitered ליחידות הכללת יוצרים (IFU) ויחידות פלאק יוצרי על תאי Vero. N, גרעין. (לשכפל באישור PNAS (14)) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. דוגמאות של מורפולוגיות פלאק נפוצות בקרב EMS-mutagenized ג trachomatis. Mutagenized ג trachomatis LGV-L2 אפשר ליצירת פלאק על monolayer תא Vero14 שעות ליום. לוחות מגוונים בגודלם () ומורפולוגיה (ב), אשר יכולה להיות מבודד, מוגבר בתאי Vero, ומשמשים בreinfections של monolayers Vero כדי לאשר את היציבות של morphotypes פלאק. דוגמאות לפנוטיפים נפוצים מוצגות כולל חלת דבש (HCM), כבדות (Clmp), שלט קטן (SPQ), ופרטני (GRN). חצים מצביעים על פיקדונות גרעיניים גדולים בתוך שלט grn. (לשכפל באישור PNAS (14)) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. זיהוי של נגעי גנים EMS-Induced. מיקום הכרומוזומלי של גרסאות נוקלאוטיד במוטציות המציגות morphotype פלאק grn. רצף הגנום כולו של שלוש מוטציות שזוהו מוטציה GRNים שיוביל לשינויי חומצת אמינו glgB, קידוד לאנזים גליקוגן הסתעפות. (לשכפל באישור PNAS (14)) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
- Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
- Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
- Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
- Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
- Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
- Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
- Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
- Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
- DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
- Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
- Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
- Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
- Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
- Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
- Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).
