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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

में फॉरवर्ड जेनेटिक प्रयास Published: October 23, 2013 doi: 10.3791/50636
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Center for Microbial Pathogenesis, Duke University Medical Center

Summary

हम रासायनिक mutagenesis के और पूरे जीनोम अनुक्रमण पर आधारित क्लैमाइडिया में आनुवांशिक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक पद्धति का वर्णन. इसके अलावा, संक्रमित कोशिकाओं के भीतर डीएनए आदान प्रदान के लिए एक प्रणाली आनुवंशिक मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि वर्णित है. इस विधि परिवर्तन प्रणाली और आणविक आनुवंशिक उपकरणों की कमी माइक्रोबियल सिस्टम के लिए मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है.

Abstract

क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस, यौन संचारित रोग और नेत्र संक्रमण के हेतुकविज्ञानी, पुनः संयोजक डीएनए के साथ खराब होने के कारण प्रयोगात्मक परिवर्तन करने के लिए अपने बेअदबी करने की विशेषता बनी हुई है. हम सी में आनुवांशिक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित आणविक आनुवंशिक उपकरणों की कमी के बावजूद ट्रैकोमैटिस. हमारे विधि शामिल है: i) के तेजी से अलग phenotypes के साथ आनुवंशिक रूप से परिभाषित म्यूटेंट की व्यापक पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए रासायनिक उत्परिवर्तजनन ii) पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) अंतर्निहित आनुवंशिक घावों नक्शा करने के लिए और उत्परिवर्तित जीन (एस) के बीच संघों को खोजने के लिए और.. एक आम फेनोटाइप;. उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के जीवाणु के साथ स्तनधारी कोशिकाओं के सह संक्रमण के माध्यम से पुनः संयोजक उपभेदों के तीन) पीढ़ी. तदनुसार, हम जीनोटाइप और phenotypes के बीच अनौपचारिक सम्बन्ध स्थापित करने में सक्षम थे. रासायनिक प्रेरित जीन भिन्नता और WGS के युग्मन correlative जीनोटाइप-phenotype संघों मज़ा स्थापित करने के लिएld आनुवांशिक विश्लेषण के लिए वर्तमान में असभ्य चिकित्सकीय और पर्यावरण की दृष्टि से महत्वपूर्ण सूक्ष्म जीवाणुओं की बड़ी सूची के लिए मोटे तौर पर लागू हो.

Introduction

संबद्ध के साथ संयुक्त राज्य अमेरिका में प्रति वर्ष एक अनुमान के अनुसार 2.8 मिलियन जननांग पथ के संक्रमण (रोग नियंत्रण के लिए केंद्र) sequelae ऐसे श्रोणि सूजन बीमारी, अस्थानिक गर्भधारण, और बांझपन (1) के रूप में के लिए लाचार intracellular जीवाणु क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस खातों. क्लैमाइडिया एसपीपी एक अद्वितीय है संक्रामक लेकिन गैर नकल प्राथमिक शरीर (ईबी) और noninfectious लेकिन replicative जालीदार शरीर (आरबी): दो रूपों से मिलकर एक Biphasic विकास चक्र के साथ शरीर क्रिया विज्ञान. संक्रमण endoctyotosis (2) के बाद उपकला कोशिकाओं को ईबीएस की कुर्की के साथ शुरू होता है. एक झिल्ली ही सीमित रिक्तिका एक शामिल किए जाने के करार के भीतर, ईबीएस तो द्विआधारी विखंडन द्वारा replicates जो आरबी रूप है, में अंतर. मध्य चक्र में, आरबीएस बदलाव वापस तो संक्रमण का नया दौर शुरू करने के लिए बाह्य अंतरिक्ष में निष्कासित कर दिया जाता है जो ईबीएस में जब मेजबान सेल lyses (3).

सी. ट्रैकोमैटिस हैऐसे जीवाणु आनुवंशिकी में सबसे अध्ययन के लिए केंद्रीय किया गया है जो लक्षित जीन प्रतिस्थापन, transposons, और transducing फगेस, के रूप में मानक आणविक आनुवंशिक उपकरण, साथ दिनचर्या हेरफेर करने के लिए आग रोक, यह जो व्यक्ति क्लैमाइडिया जीन जन्मजात उन्मुक्ति की चोरी करने के लिए योगदान करने के लिए इस हद तक स्पष्ट नहीं है , पोषक अधिग्रहण, विकास संबंधी संक्रमण, या एक यूकेरियोटिक मेजबान (4) के भीतर रोगज़नक़ के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण अन्य प्रक्रियाओं. नतीजतन, इस रोगज़नक़ अपनी नैदानिक ​​महत्व के बावजूद खराब होती रहती है.

क्लैमाइडिया एसपीपी के जीनोम. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर अनुक्रम कई प्रजातियों और biovars साथ (5) (~ 1 एमबी) अपेक्षाकृत छोटे हैं. WGS द्वारा तुलनात्मक जीनोम विश्लेषण विषैलापन कारकों की संभावित समारोह (9, 10) के रूप में कुछ जानकारी प्रदान की गई है chlamydial प्रजातियों और मानव (6-8) और कुछ हद तक उनके अनुकूलन के विकास में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान की है. टीचिकित्सीय आइसोलेट्स द्वारा प्रदर्शित वह आनुवंशिक विविधता ऐसे जीन में उत्परिवर्तन आसानी खिलाफ चयनित किया गया होगा, शायद क्योंकि व्यवस्थित सबसे विषैलापन कारकों का कार्य नक्शा करने के लिए आवश्यक संकल्प प्रदान नहीं करता है. डाह में उपाय दोषों का सर्वेक्षण किया जा सकता है कि परिवर्तन के स्पेक्ट्रम का विस्तार कर सकते हैं कि परिभाषित assays के साथ युग्मित प्राकृतिक चयन, उत्परिवर्तजन प्रेरित जीन भिन्नता से confounding प्रभाव के बिना. रासायनिक उत्परिवर्तजन, विशेष रूप से, वे अशक्त, सशर्त, hypomorphic (कम समारोह) उत्पन्न कर सकते हैं के रूप में उपयोगी है, और hypermorphic (समारोह का लाभ) alleles के हैं. मजबूत अगली पीढ़ी के जीनोम अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के आगमन के साथ, इस तरह के म्यूटेशन की पहचान आसानी से और मैप किया जा सकता है. इस तरीके में, मजबूत संघों आगे आनुवंशिक दृष्टिकोण के आवेदन को सक्षम करने, एक जीन या आनुवंशिक मार्ग में परिवर्तन और एक आम phenotype के बीच बनाया जा सकता है.

नैदानिक ​​उपभेदों के जीनोम अनुक्रम mosaicism ख प्रगटetween serovars और लगातार पुनर्संयोजन (11) की लोकी. पुनर्संयोजन के अनुभवजन्य साक्ष्य दोनों उपभेदों से आनुवंशिक योगदान (12, 13) के लिए पता चला था जो दोहरी प्रतिरोधी पुनः संयोजक संतान के दो अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोधी उपभेदों और चयन के सह संक्रमण के माध्यम से प्रदर्शन किया गया. इस प्रकार, एक सह संक्रमण सेटिंग में जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों के बीच आनुवंशिक विनिमय रासायनिक प्रेरित परिवर्तन के अलगाव मनाया फेनोटाइप की ओर जाता है कि प्रभावित जीन इंगित करने के लिए अनुमति देता है.

यहाँ हम रासायनिक उत्परिवर्तजनन, WGS, और संक्रमित कोशिकाओं के भीतर डीएनए विनिमय (14) (चित्रा 1) के लिए एक प्रणाली के आधार पर क्लैमाइडिया में आनुवांशिक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक पद्धति का वर्णन.

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Protocol

1. रासायनिक Mutagenesis

नोट: हम replicative आरबी फार्म ईबी रूप से रासायनिक mutagenesis के लिए उत्तरदायी है कि पाया. मध्य चक्र (HPI 18 से 20 के बीच) में, आरबीएस पहले आरबी ईबी संक्रमण के लिए सबसे बड़ी संख्या में हैं. क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस एक लाचार इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ है, क्योंकि मेजबान स्वास्थ्य पर उत्परिवर्तजन के प्रभाव बैक्टीरियल वसूली सीमित कर सकते हैं. वेरो कोशिकाओं का परीक्षण अन्य सेल लाइनों से ईएमएस के उच्च स्तर के प्रतिकूल प्रभावों के लिए प्रतिरोधी होना पाया गया है.

पुनर्संयोजन द्वारा परिवर्तन के पृथक्करण एंटीबायोटिक प्रतिरोधी पुनः संयोजक संतान के लिए चयन की आवश्यकता है. हम पुनः संयोजक विश्लेषण करने के लिए और isogenic उपभेदों अलग करने की क्षमता के लिए म्यूटेंट पैदा करने के लिए दवा प्रतिरोधी उपभेदों (जैसे rifampin, spectinomycin, या Trimethoprim) का उपयोग करने की सलाह देते हैं. एंटीबायोटिक प्रतिरोधी उपभेदों एक stepwise चयन प्रक्रिया (15, 16) द्वारा उत्पन्न किया गया.

नहींई: क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस (तनाव एल 2 / 434/Bu / ATCC VR902B) BSL2 रोगज़नक़ है. ऐसे रोगजनकों से निपटने के लिए संस्थागत मानक संचालन प्रक्रिया (एसओपी) का संदर्भ लें.

  1. संवर्धित कोशिकाओं और संक्रमण की तैयारी:
    1. 25 सेमी 2 (T25) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक के 3 मिलीलीटर में कुप्पी प्रति बीज लगभग 1 एक्स 10 6 वेरो कोशिकाओं (ATCC सीसीएल-81). 37 में सेते डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2. कोशिकाओं को 24 घंटे के भीतर एक मिला हुआ monolayer के रूप में करना चाहिए.
    2. मध्यम Aspirate. मध्यम के 3 मिलीलीटर की कुल मात्रा में 5 (~ 14 10 x 6) के संक्रमण की बहुलता (MOI) (DMEM, 200 एनजी / एमएल cyclohexamide, 10% एफबीएस) पर क्लैमाइडिया साथ वेरो कोशिकाओं से मिला हुआ T25 बोतल संक्रमित.
  2. 18 घंटे के बाद संक्रमण (HPI) पर mutagenesis के शुरू:
    1. फॉस्फेट में 20 मिलीग्राम / एमएल ईएमएस (इथाइल methanesulfonate) तैयार खारा (पीबीएस) 0.9 मिमी कैल्शियम के साथ बफरईएमएस रूप में एक रासायनिक सुरक्षा हुड में क्लोराइड और 0.49 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड एक वाष्पशील तरल है.
      नोट: ईएमएस एक शक्तिशाली उत्परिवर्तजन और कैसरजन है. ईएमएस बर्बाद और 1 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड के साथ फैल, प्लास्टिक, कागज, और कांच के बने पदार्थ शुद्ध करना बेअसर.
    2. मध्यम Aspirate और पीबीएस / 2 MgCl / 2 CaCl के 3 मिलीलीटर के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लो. कमरे के तापमान पर धूआं हुड में एक घंटे के लिए पीबीएस / 2 MgCl / 2 CaCl में 20 मिलीग्राम / एमएल ईएमएस के 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को सेते हैं. वेरो कोशिकाओं को संक्षिप्त अवधि के लिए इनक्यूबेटर बाहर ईएमएस और शर्तों की यह एकाग्रता जीवित करने में सक्षम हैं. Mutagenized नहीं किया गया है कि एक नियंत्रण नमूना शामिल करने के लिए याद रखें.
    3. ईएमएस युक्त मध्यम निकालें और उत्परिवर्तजन निष्क्रिय करने के लिए 1 एम NaOH के एक कंटेनर में रखें. अवशिष्ट उत्परिवर्तजन दूर करने के लिए 3 मिलीलीटर पीबीएस + 2 MgCl / 2 CaCl में संक्रमित कोशिकाओं को 3 बार धोएं. 200 एनजी / एमएल cyclohexamide और 25 माइक्रोग्राम / एमएल gentamicin साथ DMEM/10% FBS की 6 मिलीलीटर जोड़ें, और 5% सीओ पर सेते
    4. Hypotonic सेल द्वारा ईबीएस निकालें: पूरी तरह से मध्यम aspirate. 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए 1.0 मिलीलीटर एच 2 हे और रॉक जोड़ें. कम से कम 10 बार के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं lyse. एक microfuge में lysate और 1x अंतिम एकाग्रता के लिए इसे लाने के लिए 0.250 मिलीग्राम 5x सूक्रोज फॉस्फेट ग्लूटामेट बफर (एसपीजी) जोड़ लीजिए. -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस
      नोट: mutagenesis के स्तर rifampin प्रतिरोध के शामिल होने से मूल्यांकन किया जा सकता है. Rifampin प्रतिरोध की परख आवृत्ति, पट्टिका 1 से 10 x 8 और 7 एक्स 200 एनजी / rifampin की मिलीलीटर की उपस्थिति में बैक्टीरिया का 10 गुना धारावाहिक dilutions. rifampin प्रतिरोध की आवृत्ति चढ़ाया बैक्टीरिया की कुल संख्या से विभाजित rifampin प्रतिरोधी सजीले टुकड़े की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया है. पट्टिका निर्देशों के लिए नीचे अनुभाग देखें.

2. फलक शोधन द्वारा क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस उत्परिवर्ती उपभेदों के प्रतिरूप अलगाव

  1. 6 अच्छी तरह प्लेटें में वेरो कोशिकाओं का मिला हुआ monolayers सेट: बीज ~ 0.4 अच्छी तरह से प्रति 3 मिलीग्राम DMEM/10% FBS में x 10 6 कोशिकाओं. कोशिकाओं को अगले 24 घंटे में एक समरूप monolayer के फार्म करने की अनुमति दें.
  2. बर्फ पर mutagenized क्लैमाइडिया के शेयर समाधान पिघलना. DMEM/10% FBS में कमजोर पड़ने प्रति 200 μl की कुल मात्रा में 6 एक्स 10 गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन और बर्फ पर उन्हें सेट.
    नोट: समावेश बनाने इकाइयों में बैक्टीरियल अनुमापांक (IFU) पट्टिका गठन इकाइयों का एक अच्छा अनुमान (pfu) है. पट्टिका 10, 100 करने का लक्ष्य है, और 1000 pfu.
  3. अच्छी तरह से प्रति 3 मिलीलीटर पीबीएस के साथ दो बार वेरो कोशिकाओं को धो लें.
  4. 6 अच्छी तरह प्लेटें और दो प्रतियों में बैक्टीरियल dilutions की 100 μl के लिए एक अच्छी तरह से 3 मिलीलीटर DMEM जोड़ें. भंवर भी मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए थाली.
  5. 15 पर 30 मिनट के लिए 2700 XG पर संक्रमित प्लेट स्पिन डिग्री सेल्सियस तो एक humidified में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं,1-2 घंटे के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर.
  6. 0.54% DMEM में agarose (6 कुओं के लिए) तैयार करें:
    1. 18.9 मिलीलीटर ठंड 2x DMEM, 4.2 मिलीलीटर एफबीएस, 0.42 मिलीग्राम 100x NEAA, 0.042 मिलीग्राम 200 माइक्रोग्राम / एमएल cyclohexamide, 0.021 मिलीग्राम 50mg/ml जेंटामाइसिन: निम्नलिखित सामग्री जोड़ें. अच्छी तरह से मिलाएं.
    2. झुरमुटों को रोकने के लिए सरगर्मी, गर्म बाँझ 1.2% agarose / एच 2 ओ के 18.9 मिलीलीटर में मिलाएं. मिश्रण को छूने के लिए गर्म होना चाहिए. संक्रमित कोशिकाओं को जोड़ने से पहले 55 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म पानी के स्नान में रखें.
  7. बर्तन से जीवाणु निलंबन महाप्राण और 6 मिलीलीटर 0.54% agarose / DMEM के प्रति अच्छी तरह से लागू होते हैं. Agarose 15 मिनट के लिए हुड के बाहर कमरे के तापमान पर पूरी तरह से जमना करने की अनुमति दें. पलकों 15 मिनट के लिए जैव सुरक्षा हुड में, हटा के साथ प्लेटें सूखी.
    नोट: जैविक नियंत्रण हुड से कंपन solidifying agarose विकृत कर सकते हैं.
  8. 7-10 दिनों के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. सजीले एक विदारक माइक्रोस्कोप की सहायता से दिखाई जानी चाहिए. (Reसजीले टुकड़े की एक विशिष्ट छवि के लिए 3 चित्रा fer.)
  9. पहले अलग म्यूटेंट के लिए एक दिन, बीज 1 एक्स 10 100 μl में प्रति अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से थाली में 4 वेरो कोशिकाओं. कोशिकाओं को 24 घंटे के भीतर मिला हुआ होगा.
  10. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, निशान सजीले टुकड़े उठाया जाएगा. एक बाँझ 1.0 मिलीलीटर बाधा विंदुक टिप का उपयोग सजीले टुकड़े के प्लग लीजिए.
  11. DMEM के 100 μl में Resuspend सजीले टुकड़े 10% FBS, 400 एनजी / एमएल cyclohexamide, 50 माइक्रोग्राम / एमएल gentamicin साथ पूरक.
  12. उत्परिवर्ती उपभेदों का विस्तार, वेरो कोशिकाओं का मिला हुआ monolayers पर निलंबन उपरिशायी. 30 मिनट के लिए 2700 XG, 15 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों स्पिन.
  13. एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर सेते हैं. 48 HPI के रूप में जल्दी और 14 दिनों के रूप में के रूप में देर हो सकता है जो कोशिकाओं की> 50% संक्रमित हैं जब फसल ईबीएस,. संक्रमित कोशिकाओं की यह राशि पर्याप्त व्यवहार्य बैक्टीरिया जमा करने के लिए अनुमति देता है. उत्परिवर्ती उपभेदों विकास दर और संक्रामकता में मतभेद है. नेचुरा के लिए बढ़ रही उपभेदों धीमी गति की अनुमति देंपर्याप्त कोशिकाओं को संक्रमित कर रहे हैं जब तक lly पड़ोसी कोशिकाओं को फिर से संक्रमित.
  14. संक्रमित कोशिकाओं के hypotonic सेल द्वारा ईबीएस निकालें:
    1. पूरी तरह से मध्यम aspirate.
    2. बाँझ पानी के 160 μl जोड़ें. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    3. पूरा सेल सुनिश्चित करने के लिए कई बार ऊपर नीचे pipetting और से कोशिकाओं को बाधित, पार संक्रमण से बचने के लिए बाधा सुझावों का उपयोग करें.
    4. Microfuge ट्यूबों को lysates के 160 μl स्थानांतरण.
    5. 5x एसपीजी के 40 μl में मिलाएं. -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस
  15. ब्याज की phenotype (ओं) के लिए परख और स्क्रीन म्यूटेंट.

3. चयनित क्लैमाइडिया म्यूटेंट के पूरे जीनोम अनुक्रमण

  1. मेजबान डीएनए दूषित करने की काफी हद तक स्वतंत्र हैं, जो ढाल शुद्ध ईबीएस, से जीनोमिक डीएनए निकालें. ईबीएस के क्लैमाइडिया और शुद्धि की बड़े पैमाने संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल रेफरी में पाया जा सकता है. (17). Ext के लिए वाणिज्यिक जीनोमिक डीएनए शुद्धि किट (जैसे क्विएज़न बिल्ली. 69504) का उपयोग करेंनिर्माता निर्देशों का पालन 2 एक्स 10 9 बैक्टीरिया से डीएनए ract.
  2. सही डीएनए की मात्रा को मापने के लिए एक fluorometer (Qubit, Invitrogen बिल्ली. Q32866) का प्रयोग करें. शुद्ध डीएनए 1-5 ग्राम Illumina अनुक्रमण मंच के लिए आवश्यक है.
    नोट: कई प्लेटफार्मों Illumina/Solexa- और ठोस आधारित प्रणालियों सहित अनुक्रम बैक्टीरिया का जीनोम, करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम इसे कम से उच्च घनत्व पैदा HiSeq (Illumina) का उपयोग करने के लिए चुना है, लेकिन उच्च गुणवत्ता अनुक्रमण पढ़ता है. ऐसे IonTorrent (जीवन टेक्नोलॉजीज) और MySeq (Illumina) के रूप में छोटे पैमाने जीनोम sequencers, बहुत उपयुक्त हैं और पर्याप्त जीनोम विधानसभा के लिए 25x की न्यूनतम कवरेज से अधिक है जो एक समय में 4 क्लैमाइडिया जीनोम तक की इन quencing बहुसंकेतन के लिए पर्याप्त से अधिक है. Illumina मंच के लिए डीएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों की तैयारी के नीचे वर्णित हैं.
  3. में S220 एक अनुकूली केंद्रित ध्वनिकी का उपयोग कर उचित आकार के लिए टुकड़ा डीएनए (Illumina अनुक्रमण के लिए 300-400 आधार जोड़ी)निर्माता का सुझाव दिया सेटिंग्स के अनुसार (Covaris) strument. नोट: नमूना की aerosolization के कारण नमूना का अधिक से अधिक नुकसान में nebulization के परिणामों से डीएनए विखंडन.
  4. निर्माता के निर्देशों का पालन करने, वाणिज्यिक निर्माण किट (Illumina एफसी-102-1001) का उपयोग जीनोमिक अनुक्रमण पुस्तकालयों को तैयार है. पुस्तकालय कई नमूने जमा और एक साथ अनुक्रम किया जा सकता है कि इस तरह के बारकोड प्राइमरों (Illumina एफसी-121-1003) का उपयोग कर अनुक्रमित किया जा सकता है.
  5. नमूने अनुक्रमण चलाएँ. यह कदम आम तौर पर व्यावसायिक सेवाओं या समर्पित तकनीकी कर्मचारियों द्वारा संचालित कोर सुविधाओं के द्वारा किया जाता है. उनकी प्रक्रियाओं और सिफारिशों का पालन करें.
  6. Illumina पढ़ता (FASTQ प्रारूप) भी एसएनपी / उत्परिवर्तन की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो इस तरह के (Biomatters) Geneious के रूप में, उपयोगकर्ता के अनुकूल ग्राफिक यूजर इंटरफेस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक संदर्भ जीनोम को इकट्ठा किया जा सकता है. नक्शा परिवर्तन करने के लिए, कम से कम संस्करण आवृत्ति और न्यूनतम कवरेज के लिए 50X के लिए 90% करने के लिए मानकों सेट. ओपन sourcऐसे MAQ (18) और बीडब्ल्यूए (19) के रूप में ई जीनोम, assemblers, भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  7. सेंगर अनुक्रमण द्वारा उत्परिवर्तन की पुष्टि करें: सेंगर अनुक्रमण द्वारा शुद्ध या (1:20) पीसीआर उत्पादों पतला पहचान म्यूटेशनों और अनुक्रम flanking 300-500 बीपी क्षेत्रों की पीसीआर प्रवर्धन के लिए टेम्पलेट के रूप में जीनोमिक डीएनए का उपयोग करें.

4. क्लैमाइडिया रिकोम्बिनेंट्स की पीढ़ी

नोट: क्लैमाइडिया संक्रमण के दौरान डीएनए का आदान प्रदान कर सकते हैं, जो पुनः संयोजक उपभेदों की पीढ़ी (12, 13, 20) के लिए अनुमति देता है. बाद दो अद्वितीय एंटीबायोटिक प्रतिरोधी उपभेदों, पुनः संयोजक "संतान" के साथ कोशिकाओं के सह संक्रमण (12, 13) दोहरे एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए चुना जा सकता है. हम म्यूटेशनों अलग करने के लिए और सह isogenic उपभेदों उत्पन्न करने के लिए इस घटना का फायदा उठाया. इसलिए, उत्परिवर्ती उपभेदों (CTL0567 (rpoB) में जैसे rifampin प्रतिरोध (राइफल्स नि.) H471Y) एंटीबायोटिक प्रतिरोधी पृष्ठभूमि में उत्पन्न थे वे जंगली प्रकार तनाव bearin को पार किया जा सकता है कि इस तरह केगा विभिन्न एंटीबायोटिक प्रतिरोधी एलील (जैसे spectinomycin प्रतिरोध (छठे वेतन आयोग नि.), r01/r02 में G1197A (16SRNA 1 और 2 प्रतियां)). क्लैमाइडिया में डीएनए विनिमय और पुनर्संयोजन के बारे में जानकारी के लिए, संदर्भ (12, 13) को देखें.

  1. 24 अच्छी तरह से थाली पर हो वेरो कोशिकाओं का मिला हुआ monolayers पर प्रत्येक तनाव से centrifuging6 एक्स 5 10 बैक्टीरिया द्वारा जंगली प्रकार और प्रतिरूप उत्परिवर्ती उपभेदों सह संक्रमित. समानांतर में, अकेले प्रत्येक तनाव के साथ monolayers संक्रमित.
  2. 44 में HPI, संक्रमित कोशिकाओं के hypotonic सेल द्वारा फसल ईबीएस:
    1. पूरी तरह से मध्यम aspirate.
    2. बाँझ पानी की 0.4 मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए खड़े हो जाओ.
    3. जोरदार कम से कम 10 बार के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं lyse. स्थानांतरण एक microfuge ट्यूब lysates.
    4. 1x एसपीजी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 5x एसपीजी की 0.1 मिलीलीटर में मिलाएं.
    5. क्रूड lysates तुरंत इस्तेमाल किया या -80 पर संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस
  3. कच्चे ईबी की पट्टिका 50 μl एक prepsघ 5 agarose / DMEM में एक्स 1:10 धारावाहिक dilutions रिकोम्बिनेंट्स के लिए चयन करने के लिए उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक. (रिकोम्बिनेंट्स के चयन के लिए विशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं की सांद्रता के लिए तालिका देखें.)
  4. फलक को शुद्ध और ऊपर के रूप में पुनः संयोजक उपभेदों समृद्ध. वांछित phenotype की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए कुल रिकोम्बिनेंट्स. परिवर्तन की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए जीनोटाइपिंग के प्रयोजन के लिए DNAzol उपचार (अगले अनुभाग) द्वारा पुनः संयोजक उपभेदों से डीएनए निकालने.
  5. क्रॉस आगे म्यूटेशनों अलग, और isogenic उपभेदों उत्पन्न करने के लिए अन्य एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्करों असर उपभेदों के साथ दोहराया जा सकता है. एक अलग एंटीबायोटिक मार्कर असर एक और जंगली प्रकार के तनाव के लिए चयनित रिकोम्बिनेंट्स सह संक्रमित.

तालिका 1: रिकोम्बिनेंट्स के चयन के लिए एंटीबायोटिक सांद्रता:

अंतिम एकाग्रता तैयारी निर्देश
200 एनजी / एमएल rifampin 25 मिलीग्राम / डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में मिलीलीटर भंडारण शेयर करें. एच 2 ओ के साथ भंडारण शेयर गिराए द्वारा 200 माइक्रोग्राम / एमएल काम कर समाधान श्रृंगार अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
200 माइक्रोग्राम / एमएल Trimethoprim DMSO में एक 100 मिलीग्राम / एमएल शेयर करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
200 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर spectinomycin 100 μl aliquots में पानी में एक 100 मिलीग्राम / एमएल शेयर करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर दोहराया फ्रीज पिघलना बचें.

5. जीनोटाइपिंग के लिए संयोजक उपभेदों से जीनोमिक डीएनए की निकासी

नोट: स्तंभ आधारित शुद्धि किट का भी इस्तेमाल किया जा सकता है. DNAzol उपचार द्वारा डीएनए निष्कर्षण का एक लाभ यह लागत है.

  1. 12 अच्छी तरह से प्लेटों पर हो वेरो कोशिकाओं के monolayers पर 1.2 एक्स 10 5 Chlamydiae संक्रमित.
  2. 36-48 HPI कम, मध्यम aspirate और DNAzol (Invitrogen 10503-027) की 0.375 मिलीग्राम जोड़ें. धीरे कोशिकाओं और pipet लाइसा आंदोलनएक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में tes है.
  3. 100% इथेनॉल की 0.188 मिलीग्राम के अलावा द्वारा वेग डीएनए. उलटा द्वारा मिश्रण.
  4. एक विंदुक टिप के साथ स्पूलन से डीएनए निकालने और एक स्वच्छ ट्यूब में जगह है. वैकल्पिक रूप से, गोली 2 कमरे के तापमान पर मिनट या 4 डिग्री सेल्सियस, और छानना सतह पर तैरनेवाला के लिए शीर्ष गति पर centrifugation द्वारा डीएनए.
  5. धो डीएनए 75% इथेनॉल के 1.0 मिलीलीटर के साथ दो बार वेग.
  6. 15 सेकंड के लिए इथेनॉल हटाने के बाद हवा शुष्क डीएनए.
  7. 0.2 मिलीलीटर 8 मिमी NaOH तो 0.1 एम HEPES की 20.2 μl के साथ 8.0 पीएच को बेअसर साथ डीएनए solubilize. पानी या ते साथ 0.5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को लाओ. वैकल्पिक रूप से, ते बफर में resuspend डीएनए (डीएनए गोली पूरी तरह से solubilized नहीं होगा.).
  8. पहचान म्यूटेशनों flanking 300-500 बीपी क्षेत्रों की पीसीआर प्रवर्धन के लिए टेम्पलेट के रूप में DNAzol निकाले डीएनए का प्रयोग करें. अनुक्रम शुद्ध या सेंगर अनुक्रमण द्वारा (1:20) पीसीआर उत्पादों पतला.

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Representative Results

उत्परिवर्तजन के संपर्क में बैक्टीरिया कोशिका मृत्यु की वजह से मुमकिन है, बैक्टीरिया से रहित दिखाई देते हैं समावेशन की ओर जाता है. आमतौर पर, serovar LGV-एल 2 पूरी तरह से 48 घंटे के बाद संक्रमण के भीतर संक्रमित कोशिकाओं lyse जाएगा, लेकिन उत्परिवर्तजन साथ उपचार> 90 घंटे के लिए इस चक्र का विस्तार कर सकते हैं. Inclusions की लगभग 10% की वसूली के लिए उम्मीद कर रहे हैं. हमारे प्रयोगों में, संक्रमित वेरो कोशिकाओं अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में संक्रामक संतान की वसूली में एक 99% कमी के चलते 20 मिलीग्राम / एमएल ईएमएस के साथ इलाज किया. उत्परिवर्तजन उपचार भी छोटे सजीले टुकड़े (SPQ) (चित्रा 3) सहित बदल morphologies है, साथ सजीले टुकड़े का उद्भव हुआ. अन्य morphologies, बारीक clumpy, या (चित्रा 3) के आकार का मधुमक्खी के छत्ते दिखाई देते हैं सजीले टुकड़े शामिल हैं. इन phenotypes मेजबान वातावरण में संक्रमण और अस्तित्व के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं में दोष प्रतिबिंबित कर सकते हैं. छोटे पट्टिका (SPQ) के साथ म्यूटेंट आकारिकी आम तौर पर काफी कम संक्रामक संतान का उत्पादन और एक के लिए 2-3 सप्ताह का समय लग सकता हैmplify. Reversions और शमन म्यूटेशन एक उच्च आवृत्ति में जमा कर सकते हैं के रूप में इन उपभेदों passaging जब सावधानी प्रयोग किया जाना चाहिए.

इन अध्ययनों में प्रयुक्त ईएमएस की खुराक के रूप में WGS (चित्रा 4) के द्वारा प्रयोगात्मक मूल्यांकन क्लैमाइडिया जीनोम प्रति 30 के बीच 3 से म्यूटेशन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. ढाल शुद्ध ईबीएस मेजबान सेल सामग्री का काफी हद तक स्वतंत्र हैं, हालांकि, मेजबान डीएनए भी पता लगाया है और जीनोमिक preps के 10-15% के बारे में होते हैं.

दो उपभेदों के सह संक्रमण दोनों उपभेदों से आनुवंशिक योगदान के साथ संतान पैदा करते हैं और अधिक बार सहज प्रतिरोध (13) से 10 -3 -4 10 की आवृत्तियों, लगभग 10 4 बार से कम होता है सकते हैं. पुनर्संयोजन ब्रेक अंक आमतौर पर 800 केबी (12) को ~ 100 केबी के बीच होते हैं. ऐसे पुनः संयोजक उपभेदों के विश्लेषण आनुवंशिक अध्ययन के तहत phenotype के लिए जुड़े हुए हैं कि उत्परिवर्तन प्रकट कर सकते हैं.

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Discussion

यह जीनोटाइप और phenotypes के बीच संबंध स्थापित करता है, के रूप में इस पद्धति को आनुवांशिक विश्लेषण के लिए बुनियादी आवश्यकताओं को पूरा करती है. महत्वपूर्ण बात, इस पुनः संयोजक डीएनए परिवर्तन और अक्सर गैर मॉडल रोगाणुओं में जीन समारोह के विश्लेषण में एक दर सीमित कदम है जो बैक्टीरिया के जीन की insertional निष्क्रियता के लिए पारंपरिक आणविक उपकरणों की सहायता के बिना हासिल की है.

एक महत्वपूर्ण कदम पट्टिका शुद्ध म्यूटेंट की clonality सुनिश्चित करने के लिए है. जंगली प्रकार या "फिटर" म्यूटेंट साथ क्रॉस संदूषण जल्दी outcompeted जा रहा उत्परिवर्ती उपभेदों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसी तरह, गैर प्रतिरूप नमूने के पूरे जीनोम अनुक्रमण द्वारा मानचित्रण म्यूटेशनों अस्पष्ट परिणाम हो सकता है. भारी plaqued कुओं से म्यूटेंट अलग या भी एक दूसरे के करीब हैं कि सजीले टुकड़े plugging से बचा जाना चाहिए. इसके अलावा, धीमी गति से बढ़ रहा है म्यूटेंट के लिए, revertants अपेक्षाकृत उच्च आवृत्तियों पर उभर सकता है. हम मूल या कम बीतने शेयरों के संरक्षण की सलाह देते हैं. Replपार संक्रमण या revertants अगर aque म्यूटेंट संदेह कर रहे हैं.

ईएमएस की एकाग्रता परिवर्तन की आवृत्ति कम करने के लिए उतारा जा सकता है. के रूप में rifampin प्रतिरोधी वेरिएंट की पीढ़ी द्वारा मूल्यांकन उत्परिवर्तन दर, (जीन एन्कोडिंग शाही सेना पोलीमरेज़ में परिवर्तन इंगित करने के लिए कारण, rpoB) 20 मिलीग्राम / एमएल ईएमएस पर हमारे हाथ में इष्टतम था. rifampin प्रतिरोध की प्रेरण rifampin की उपस्थिति में गठन और रासायनिक प्रेरित परिवर्तन की आवृत्ति के लिए सहसंबंधी चाहिए सजीले टुकड़े की आवृत्ति द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है.

ईएमएस प्राप्त की जा सकती है कि परिवर्तन के स्पेक्ट्रम चौड़ा करने के लिए अन्य उत्परिवर्तजन के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, psoralen और उसके डेरिवेटिव की तरह डीएनए intercalating एजेंट विलोपन और सम्मिलन (21) को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

जीनोम (अलग <100 केबी) में एक दूसरे के करीब मैप म्यूटेशनों कि पुनर्संयोजन के माध्यम से लिंक रद्द करना मुश्किल है. उच्च उत्परिवर्तजनन दरों achiev कर रहे हैंएड, यह स्पष्ट रूप से एक कारण उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए मुश्किल हो सकता है. हालांकि, सी. के परिवर्तन के बाद ट्रैकोमैटिस अब निकम्मेपन हालांकि शटल प्लास्मिड (22), के साथ हो सकता है, यह एक प्लाज्मिड पर उत्परिवर्तित जीन की एक जंगली प्रकार की नकल के साथ ट्रांस में परिवर्तन के पूरक द्वारा इन उठाना समस्याओं का समाधान संभव हो सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. क्लैमाइडिया में आगे आनुवांशिक विश्लेषण और पुनर्संयोजन आधारित मैपिंग के लिए रणनीति. Rifampin प्रतिरोधी (राइफल्स आर) सी. ट्रैकोमैटिस अपने replicative चरण के दौरान mutagenized और दिखाई सजीले टुकड़े का गठन तक वेरो सेल monolayers संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. म्यूटेंट की व्यक्तिगत क्लोन ऐसे बदल पट्टिका morphotypes के रूप में विशिष्ट phenotypes, के लिए एकत्र और assayed थे. एक आम फेनोटाइप बांटने म्यूटेंट के जीनोम मैं करने के लिए अनुक्रम गयाआम आनुवंशिक घावों dentify. इन जीन घावों और विशिष्ट पट्टिका morphologies के बीच संबंध स्थापित करने के लिए, वेरो कोशिकाओं आरिफ आर पृष्ठभूमि और जंगली प्रकार छठे वेतन आयोग आर क्लैमाइडिया उपभेदों में उत्पन्न म्यूटेंट के साथ सह संक्रमित थे, और जिसके परिणामस्वरूप संक्रामक संतान के बीच पुनः संयोजक राइफल्स आर छठे वेतन आयोग आर उपभेदों में चयन किया गया था rifampin और spectinomycin ("पार") की उपस्थिति. बदल पट्टिका आकारिकी प्रदर्शित पुनः संयोजक बैक्टीरिया के बीच पैतृक राइफल्स आर उत्परिवर्ती तनाव में उपस्थित व्यक्ति परिवर्तन के अलगाव लक्षित डीएनए अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किया गया था. (PNAS (14) से अनुमति के साथ Reproduced) बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. ईएमएस mutagenesis के प्रोटोकॉल. क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस LGV-एल 2 से संक्रमित कोशिकाओं की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व संक्रामक चक्र की आरबी चरण के दौरान ईएमएस के संपर्क में थे, और संक्रमण संक्रामक प्राथमिक निकायों की पीढ़ी (ईबी) के लिए अनुमति देने के लिए 72 घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दी गई थी . Mutagenized ईबी पूल काटा और वेरो कोशिकाओं पर शामिल किए जाने के गठन इकाइयों (IFU) और पट्टिका के गठन इकाइयों के लिए titered थे. एन, नाभिक. (PNAS (14) से अनुमति के साथ Reproduced) बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. ईएमएस-mutagenized सेल्सियस के बीच आम पट्टिका morphologies का उदाहरण ट्रैकोमैटिस. Mutagenized सी. ट्रैकोमैटिस LGV-एल 2 वेरो सेल monolayer पर सजीले टुकड़े फार्म की अनुमति दी14 दिन के लिए है. अलग किया जा सकता है, जो आकार (ए) और आकारिकी में विविध सजीले (बी), वेरो कोशिकाओं में परिलक्षित, और पट्टिका morphotypes की स्थिरता की पुष्टि के लिए वेरो monolayers के reinfections में इस्तेमाल किया. आम phenotypes का उदाहरण छत्ते (HCM), clumped (Clmp), छोटे पट्टिका (SPQ), और बारीक (Grn) सहित दिखाए जाते हैं. तीर एक Grn पट्टिका भीतर बड़ी बारीक जमा संकेत मिलता है. (PNAS (14) से अनुमति के साथ Reproduced) बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
4 चित्रा. ईएमएस प्रेरित जीन घावों की पहचान. Grn पट्टिका morphotype कि प्रदर्शन म्यूटेंट में न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट के गुणसूत्र स्थान. उत्परिवर्तन की पहचान की तीन Grn म्यूटेंट के पूरे जीनोम अनुक्रमणहै कि एक ग्लाइकोजन-शाखाओं में एंजाइम के लिए कोडिंग, glgB में एमिनो एसिड बदलाव के लिए नेतृत्व. (PNAS (14) से अनुमति के साथ Reproduced) बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 11995-073
Fetal Bovine Serum (FBS) Cellgro 35-010-CV
Ethyl methanesulfonate (EMS) Sigma M0880
Cyclohexamide Sigma C4859-1ML
Gentamicin Life Technologies 15750-060
Phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies 14190-144
Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) Life Technologies 14040-133
1 M NaOH
5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)
SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)
Water (sterile, tissue culture grade)
2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate Sigma D7777
Nonessential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140-050
1.2% GTG Agarose , autoclaved Lonzo 50070
Genomic DNA purification kits Qiagen 69504
DNAzol Life Technologies 10503-027
Ethanol (molecular biology grade)
8 mM NaOH
0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer
25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)
6-well tissue culture plates
12-well tissue culture plates
96-well tissue culture plates
Chemical safety hood
Biological safety hood
>Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates
>Dissection microscope
Fluorometer (Qubit) Invitrogen Q32866
Adaptive Focused Acoustics S220 instrument Covaris

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 80 आनुवांशिकी रासायनिक उत्परिवर्तजनन पूरे जीनोम अनुक्रमण
में फॉरवर्ड जेनेटिक प्रयास<em&gt; क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस</em
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Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (80), e50636, doi:10.3791/50636 (2013).

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