Summary
Descriviamo una metodologia per effettuare l'analisi genetica in Chlamydia sulla base di mutagenesi chimica e il sequenziamento dell'intero genoma. Inoltre, un sistema di scambio di DNA all'interno delle cellule infettate è descritto che può essere utilizzato per la mappatura genetica. Questo metodo può essere ampiamente applicabile a sistemi microbici privi sistemi di trasformazione e strumenti genetici molecolari.
Abstract
Chlamydia trachomatis, l'agente eziologico di malattie sessualmente trasmissibili e infezioni oculari, rimane poco caratterizzato per la sua intrattabilità di trasformazione sperimentale con il DNA ricombinante. Abbiamo sviluppato un metodo per eseguire l'analisi genetica in C. trachomatis, nonostante la mancanza di strumenti di genetica molecolare. Il nostro metodo prevede: i) la mutagenesi chimica per generare rapidamente ampie librerie di mutanti geneticamente definiti con fenotipi distinti; ii) il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) per mappare le lesioni genetiche sottostanti e di trovare associazioni tra gene mutato (s) e.. un fenotipo comune,. iii) generazione di ceppi ricombinanti attraverso la co-infezione di cellule di mammifero con batteri tipo mutante e selvaggio. Di conseguenza, siamo stati in grado di stabilire relazioni causali tra genotipi e fenotipi. L'accoppiamento di variazione del gene indotto chimicamente e WGS per stabilire associazioni genotipo-fenotipo correlativi should essere ampiamente applicabile alla lunga lista di medico ed ecologicamente importanti microrganismi attualmente intrattabili per l'analisi genetica.
Introduction
Le intracellulare obbligato batterio Chlamydia trachomatis conti per una stima di 2,8 milioni di infezioni del tratto genitale ogni anno negli Stati Uniti (Center for Disease Control) con associata sequele come la malattia infiammatoria pelvica, gravidanze ectopiche e sterilità (1). Chlamydia spp hanno un unico fisiologia con un ciclo di sviluppo bifasico costituito da due forme: il corpo elementare infettiva ma non replicante (EB) e il corpo reticolato non infettiva ma replicativa (RB). Infezione inizia con l'attaccamento di EBS per cellule epiteliali seguite da endoctyotosis (2). All'interno di un vacuolo di membrana chiamato un'inclusione, EBS differenziarsi in forma RB, che poi si replica per scissione binaria. A metà ciclo, transizioni RBS nuovo in EBS, che vengono poi espulse nello spazio extracellulare di iniziare nuovi cicli di infezione quando i lisi della cellula ospite (3).
C. trachomatis èrefrattario alla manipolazione di routine con strumenti genetici molecolari standard, ad esempio la sostituzione mirata del gene, trasposoni, e fagi trasduttori, che sono stati al centro di molti studi di genetica batterica, non è chiaro in che misura i singoli geni Chlamydia contribuiscono alla evasione di immunità innata , l'acquisizione di nutrienti, le transizioni evolutive, o altri processi importanti per la sopravvivenza del patogeno all'interno di un ospite eucariotica (4). Di conseguenza, questo patogeno rimane poco caratterizzato, nonostante la sua importanza clinica.
I genomi di Chlamydia spp. sono relativamente piccole (~ 1 Mb) (5), con più specie e biotipi sequenziati usando Avanti tecnologie di sequenziamento generazione. Analisi genomica comparativa di WGS ha fornito intuizioni uniche nella evoluzione della specie Chlamydia e il loro adattamento per l'uomo (6-8) e in qualche misura ha fornito alcune informazioni circa la potenziale funzione di fattori di virulenza (9, 10). Tegli diversità genetica visualizzata da isolati clinici non fornisce la risoluzione richiesta per mappare sistematicamente la funzione della maggior fattori di virulenza, presumibilmente perché tali mutazioni in geni sarebbero stati prontamente contro selezionato. Senza effetti confondenti di selezione naturale, variazione del gene mutageno indotto, insieme con dosaggi definiti che i difetti misurano in virulenza, possono ampliare lo spettro di mutazioni che possono essere esaminati. Mutageni chimici, in particolare, sono utili in quanto possono generare null, condizionale, hypomorphic (ridotta funzione), e hypermorphic (guadagno di funzione) alleli. Con l'arrivo delle tecnologie di sequenziamento del genoma-robusti di prossima generazione, tali mutazioni possono essere facilmente identificati e mappati. In questo modo, le associazioni forti può essere fatta tra mutazioni in un gene o genetico percorso ed un fenotipo comune, consentendo l'applicazione di approcci genetici avanti.
Le sequenze del genoma dei ceppi clinici hanno rivelato mosaicismo bra sierotipi ei loci di ricombinazione frequente (11). L'evidenza empirica di ricombinazione è stata dimostrata attraverso la co-infezione di due diversi ceppi resistenti agli antibiotici e la selezione di progenie ricombinante resistente doppio, che si è rivelato di avere contributi genetici di entrambi i ceppi (12, 13). Così, scambio genetico tra ceppi wild type e mutanti in un ambiente co-infezione permette segregazione delle mutazioni indotti chimicamente per individuare il gene alterato che porta al fenotipo osservato.
Qui si descrive un metodo per effettuare analisi genetica in Chlamydia base di mutagenesi chimica, WGS, e un sistema di scambio di DNA all'interno delle cellule infettate (14) (Figura 1).
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Protocol
1. Mutagenesi chimica
Nota: Abbiamo trovato che la forma replicativa RB è più suscettibile di mutagenesi chimica rispetto alla forma EB. A metà ciclo (tra i 18 a 20 HPI), RBS sono a maggior numeri precedenti RB-EB transizione. Poiché Chlamydia trachomatis è un patogeno intracellulare obbligato, gli effetti del mutageno sulla salute dell'ospite può limitare recupero batterica. Cellule Vero sono stati trovati per essere più resistenti agli effetti negativi di livelli elevati di SME che altre linee cellulari testate.
Separazione delle mutazioni di ricombinazione richiede la selezione di progenie ricombinante resistenti agli antibiotici. Si consiglia di utilizzare ceppi resistenti ai farmaci (ad esempio rifampicina, spectinomicina, o trimetoprim) per la generazione di mutanti per la capacità di eseguire analisi ricombinante e di isolare ceppi isogeni. Ceppi resistenti agli antibiotici sono stati generati da un processo di selezione stepwise (15, 16).
None: Chlamydia trachomatis (ceppo L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) è BSL2 patogeno. Per la gestione di tali agenti patogeni, consultare le procedure operative standard (SOP istituzionali).
- Preparazione delle cellule in coltura e l'infezione:
- Seme di circa 1 x 10 6 cellule Vero (ATCC CCL-81), ogni 25 cm 2 (T25) beuta in 3 ml di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS). Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2. Le cellule devono formare un monostrato confluente all'interno di 24 h.
- Aspirare il terreno. Infettare confluenti T25 fiaschi di cellule Vero con Chlamydia ad una molteplicità di infezione (moi) di 5 (~ 14 x 10 6) in un volume totale di 3 ml di medium (DMEM, 200 ng / ml cyclohexamide, 10% FBS).
- Inizia mutagenesi a 18 ore dopo l'infezione (HPI):
- Preparare 20 mg / ml di EMS (Etil methanesulfonate) in tampone fosfato (PBS) con 0,9 mM di calciocloruro e 0,49 mM di cloruro di magnesio in una cappa di sicurezza chimica, come lo SME è un liquido volatile.
Nota: EMS è un potente mutageno e cancerogeno. Neutralizzare SME rifiuti e decontaminare le fuoriuscite, plastica, carta e vetro con 1 M di idrossido di sodio. - Aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con 3 ml di PBS / MgCl 2 / CaCl 2. Incubare le cellule con 3 ml di 20 mg / ml in PBS EMS / MgCl 2 / CaCl 2 per un'ora sotto cappa a temperatura ambiente. Cellule Vero sono in grado di sopravvivere a questa concentrazione di SME e condizioni all'esterno dell'incubatrice per brevi periodi. Ricordati di includere un campione di controllo che non è stato mutagenizzate.
- Togliere terreno contenente SME e metterla in un contenitore di 1 M di NaOH per inattivare l'agente mutageno. Lavare le cellule infette 3 volte in 3 ml di PBS + MgCl2 / CaCl 2 per rimuovere mutageno residuo. Aggiungere 6 ml di DMEM/10% FBS con 200 ng ml cyclohexamide / e di 25 mg / ml di gentamicina, e incubare a 5% di CO
- Estrarre EBs da lisi ipotonica: aspirare Completamente media. Aggiungere 1,0 ml di H 2 O e rock per staccare le cellule per 10 min. Lisare cellule pipettando su e giù per almeno 10 volte. Raccogliere lisato in una microcentrifuga e aggiungere 0,250 ml 5x saccarosio fosfato tampone glutammato (SPG) per portarlo a 1x concentrazione finale. Conservare a -80 ° C.
Nota: il livello di mutagenesi può essere valutata l'induzione di resistenza rifampicina. Per saggiare la frequenza di resistenza rifampicina, placca 1 x 10 x 8 e 7 diluizioni seriali di 10 volte di batteri in presenza di 200 ng / ml di rifampicina. La frequenza di resistenza rifampicina è definito come il numero di placche resistenti es.Rifampin diviso per il numero totale di batteri placcato. Vedere la sezione sottostante per le istruzioni di placca. - Estrarre EBs da lisi ipotonica: aspirare Completamente media. Aggiungere 1,0 ml di H 2 O e rock per staccare le cellule per 10 min. Lisare cellule pipettando su e giù per almeno 10 volte. Raccogliere lisato in una microcentrifuga e aggiungere 0,250 ml 5x saccarosio fosfato tampone glutammato (SPG) per portarlo a 1x concentrazione finale. Conservare a -80 ° C.
- Preparare 20 mg / ml di EMS (Etil methanesulfonate) in tampone fosfato (PBS) con 0,9 mM di calciocloruro e 0,49 mM di cloruro di magnesio in una cappa di sicurezza chimica, come lo SME è un liquido volatile.
2. Isolamento clonale di Chlamydia trachomatis ceppi mutanti dalla placca Purificazione
- Impostare monostrati confluenti di cellule Vero in 6 pozzetti: Seed ~ 0,4 x 10 6 cellule in 3 ml DMEM/10% FBS per pozzetto. Consentono alle cellule di formare un monostrato omogeneo per il prossimo 24 h.
- Scongelare soluzione stock di Chlamydia mutagenizzato sul ghiaccio. 6 x eseguire diluizioni seriali di 10 volte in un volume totale di 200 microlitri per diluizione in DMEM/10% FBS e quali sono disposti su ghiaccio.
Nota: titolo batterica in unità formanti inclusione (IFU) è una buona stima di unità formanti placca (PFU). Obiettivo di placca 10, 100, e 1000 PFU. - Lavare le cellule Vero due volte con 3 ml di PBS per pozzetto.
- Aggiungere 3 ml DMEM a ciascun pozzetto per piastre da 6 pozzetti e 100 microlitri delle diluizioni batteriche in duplicato. Agitare la piastra per assicurare una miscela.
- Spin piastre infettate a 2.700 xg per 30 min a 15 ° C e poi incubare a 37 ° C in un umidificata,5% di CO 2 incubatore per 1-2 ore.
- Preparare 0,54% agarosio in DMEM (per 6 pozzi):
- Aggiungere i seguenti ingredienti: 18,9 ml freddo 2x DMEM, 4,2 ml di FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0.042 ml 200 mg / ml cyclohexamide, 0.021 ml 50mg/ml gentamicina. Mescolare bene.
- Mescolare in 18,9 ml di caldo sterile 1,2% agarosio / H 2 O, mescolando per evitare grumi. Miscela deve essere caldo al tatto. Conservare in un bagno di acqua calda a 55 ° C prima di aggiungere alle cellule infette.
- Aspirare sospensione batterica da piatti e applicare 6 ml 0,54% agarosio / DMEM per pozzetto. Lasciare agarosio solidificare completamente a temperatura ambiente fuori dalla cappa per 15 min. Asciugare le piastre con i coperchi rimossi, nella cappa di biosicurezza per 15 min.
Nota: Vibrazioni dalla cappa di contenimento biologico può distorcere la solidificazione agarosio. - Incubare a 37 ° C in CO 2 incubatore per 7-10 giorni. Placche dovrebbero essere visibili con l'aiuto di un microscopio da dissezione. (ReFER alla Figura 3 per una tipica immagine di placche.)
- Un giorno prima isolare mutanti, seme 1 x 10 4 cellule Vero in 100 microlitri per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Le cellule saranno confluenti entro 24 h.
- Utilizzando un microscopio dissezione, marchio placche di essere raccolti. Raccogliere tappi di placche utilizzando un 1,0 ml puntale barriera sterile.
- Placche Risospendere in 100 ml di DMEM supplementato con 10% FBS, 400 ng / ml cyclohexamide, 50 mg / ml di gentamicina.
- Per espandere ceppi mutanti, sovrapporre la sospensione su monostrati confluenti di cellule Vero. Spin piastre a 2.700 xg, 15 ° C per 30 min.
- Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 in un incubatore umidificato. Vendemmia EBs quando> 50% delle cellule sono infettati, che può verificarsi già nel 48 HPI e il più tardi 14 giorni. Questa quantità di cellule infette permette ai batteri abbastanza vitali da memorizzare. Ceppi mutanti si differenziano per tassi di crescita e la loro infettività. Consentire ceppi a crescita lenta per naturally re-infettare le cellule vicine fino a quando abbastanza cellule sono infettate.
- Estrarre EBs da lisi ipotonica delle cellule infette:
- Aspirare Completamente media.
- Aggiungere 160 ml di acqua sterile. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Disrupt cellule pipettando su e giù diverse volte per garantire la completa lisi, utilizzare puntali per evitare la contaminazione incrociata.
- Trasferire 160 microlitri di lisato di tubi microcentrifuga.
- Miscelare in 40 ml di SPG 5x. Conservare a -80 ° C.
- Dosaggio e schermo mutanti per fenotipo (s) di interesse.
3. Whole Genome Sequencing dei Mutanti Chlamydia selezionati
- Estrarre il DNA genomico da gradiente-purificata EBS, che sono in gran parte privo di contaminazione del DNA dell'ospite. Protocolli per cultura su larga scala di Chlamydia e purificazione di EBs possono essere trovati in rif. (17). Utilizzare i kit di purificazione del DNA genomico commerciali (ad esempio Qiagen cat. 69504) per extragiscono DNA da 2 x 10 9 batteri seguendo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare un fluorimetro (Qubit, Invitrogen cat. Q32866) per misurare con precisione la quantità di DNA. È richiesta 1-5 mg di DNA purificato per la piattaforma Illumina sequenziamento.
Nota: Diverse piattaforme possono essere utilizzate per sequenze genomi batterici, tra cui i sistemi di Illumina/Solexa- e Solid-based. Abbiamo scelto di utilizzare HiSeq (Illumina) in quanto produce alta densità di breve, ma la sequenza di alta qualità si legge. Piccoli sequencer genoma scala, come IonTorrent (Life Technologies) e MySeq (Illumina) sono adatti anche e più che sufficiente per la multiplazione questi quencing di fino a 4 genomi Chlamydia alla volta, che supera la copertura minima di 25X per un'adeguata assemblaggio del genoma. Preparazione di librerie di DNA sequenziamento per la piattaforma Illumina sono descritte di seguito. - Frammento di DNA di dimensioni adeguate (300-400 coppia di basi per Illumina sequenziamento) utilizzando un Adaptive Acustica Focused S220 instrumento (Covaris) in base alle impostazioni suggerite dal produttore. Nota: la frammentazione del DNA dai risultati di nebulizzazione in una maggiore perdita di campione a causa di aerosol del campione.
- Preparare le librerie di sequenziamento genomico utilizzando kit di costruzione commerciali (Illumina FC-102-1001), seguendo le istruzioni del produttore. Le librerie possono essere indicizzati utilizzando primer codice a barre (Illumina FC-121-1003) che tali campioni multipli possono essere messe in comune e sequenziati contemporaneamente.
- Esegui il sequenziamento dei campioni. Questo passaggio è di solito eseguita da servizi commerciali o strutture centrali gestite da personale tecnico dedicato. Seguire le procedure e le raccomandazioni.
- Illumina letture (formato FASTQ) possono essere assemblati in un genoma di riferimento utilizzando user friendly software di interfaccia grafica utente, ad esempio Geneious (Biomatters), che può essere utilizzato anche per SNP / identificazione mutazione. Per mappare le mutazioni, impostare i parametri per il 90% per la frequenza minima variante e 50X per la copertura minima. Apri Sourcelettroniche genoma assemblatori, come MAQ (18) e BWA (19), possono anche essere usate.
- Confermate le mutazioni da Sanger: utilizzare il DNA genomico come stampo per l'amplificazione PCR di 300-500 bp regioni fiancheggianti mutazioni identificate e sequenza purificati o diluito (1:20) I prodotti di PCR di sequenziamento Sanger.
4. Generazione di ricombinanti Chlamydia
Nota: Chlamydia può scambiare DNA durante l'infezione, che consente la generazione di ceppi ricombinanti (12, 13, 20). Dopo la co-infezione di cellule con due ceppi resistenti agli antibiotici unici, ricombinante "progenie" può essere selezionato per il doppio resistenza agli antibiotici (12, 13). Abbiamo approfittato di questo fenomeno per separare le mutazioni e di generare ceppi co-isogenici. Quindi, ceppi mutanti sono stati generati in fondo resistente agli antibiotici (es. rifampicina resistenza (Rif. R) H471Y in CTL0567 (rpoB)) tali da poter essere attraversato a wild type strain bearinga diverso allele resistente agli antibiotici (es. resistenza spectinomicina (SPC R), G1197A nel r01/r02 (16SRNA esemplari 1 e 2)). Per i dettagli riguardanti lo scambio di DNA e ricombinazione in Chlamydia, consultare la Bibliografia (12, 13).
- Co-infettare wild type e mutanti clonali da centrifuging6 x 10 5 batteri da ogni ceppo su monostrati confluenti di cellule Vero cresciute su una piastra a 24 pozzetti. In parallelo, infettare monostrati con ciascun singolo ceppo.
- Al 44 hpi, raccolto EBs da lisi ipotonica delle cellule infette:
- Aspirare Completamente media.
- Aggiungere 0,4 ml di acqua sterile e lasciare riposare per 10 min.
- Lyse cellule vigoroso pipettare su e giù per almeno 10 volte. Trasferimento lisati in una provetta.
- Mescolare in 0,1 ml di SPG 5x per una concentrazione finale di 1x SPG.
- Lisato grezzo può essere utilizzato immediatamente o conservato a -80 ° C.
- Targa 50 microlitri della EB greggio preps und 5 x 01:10 diluizioni seriali in agarosio / DMEM supplementato con antibiotici appropriati alla selezione di ricombinanti. (Vedi tabella per le concentrazioni di antibiotici tipici per la selezione dei ricombinanti.)
- Targa purificare e arricchire ceppi ricombinanti come sopra. Ricombinanti punteggio per la presenza o l'assenza del fenotipo desiderato. Estrarre il DNA da ceppi ricombinanti mediante trattamento DNAzol (sezione successiva) allo scopo di genotipizzazione per la presenza o assenza di mutazioni.
- Croci possono essere ripetuti con ceppi recanti altri marcatori di resistenza agli antibiotici a segregare ulteriormente mutazioni, e generare ceppi isogeni. Co-infettare ricombinanti selezionati a un altro ceppo selvatico recanti un marcatore antibiotico diverso.
Tabella 1: le concentrazioni di antibiotici per la selezione dei ricombinanti:
| Concentrazione finale | Istruzioni di preparazione |
|---|---|
| 200 ng / ml di rifampicina Fai 25 mg / ml di brodo di stoccaggio in dimetilsolfossido (DMSO). Portare 200 mcg / ml soluzione di lavoro diluendo il magazzino di stoccaggio con H 2 O. Conservare a -20 ° C al buio. | |
| 200 mg / ml di trimetoprim | Fare un mg / ml di brodo di DMSO 100. Conservare a -20 ° C |
| 200 mcg / ml spectinomicina | Fare un mg / ml di brodo in acqua 100 in aliquote di 100 microlitri. Conservare a -20 ° C. Evitare cicli ripetuti di gelo-disgelo. |
5. Estrazione di DNA genomico da ceppi ricombinanti per la genotipizzazione
Nota: I kit di purificazione basato su colonne possono anche essere utilizzati. Un vantaggio di estrazione del DNA da trattamento DNAzol è costato.
- Infettare 1.2 x 10 5 clamidie su monostrati di cellule Vero coltivate su piastre da 12 pozzetti.
- A 36-48 hpi, aspirare medio e aggiungere 0,375 ml di DNAzol (Invitrogen 10.503-027). Agitare delicatamente le cellule e seminare il LysaTES in una provetta da microcentrifuga 1,5.
- DNA precipitato mediante aggiunta di 0,188 ml di etanolo al 100%. Miscelare per inversione.
- Estrarre DNA da spooling con un puntale e metterla in una provetta pulita. In alternativa, il DNA pellet tramite centrifugazione a velocità massima per 2 minuti a temperatura ambiente oa 4 ° C, e supernatante decantare.
- Lavare DNA precipitato due volte con 1,0 ml di etanolo al 75%.
- DNA aria secca dopo aver rimosso l'etanolo per 15 sec.
- Solubilizzazione del DNA con 0.2 ml di 8 mm di NaOH quindi neutralizzare a pH 8,0 con 20,2 ml di 0.1 M HEPES. Portare ad un volume finale di 0,5 ml con acqua o TE. In alternativa, il DNA risospendere in tampone TE (pellet di DNA non sarà completamente solubilizzata.).
- Utilizzare DNA DNAzol estratte come modello per l'amplificazione PCR di 300-500 bp regioni fiancheggianti mutazioni identificate. Sequenza purificato o diluito (1:20) I prodotti di PCR di sequenziamento Sanger.
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Representative Results
L'esposizione a mutageno porta a inclusioni che appaiono privi di batteri, presumibilmente a causa di morte delle cellule batteriche. Tipicamente, sierotipo LGV-L2 sarà completamente lisare le cellule infette entro 48 ore dopo l'infezione, ma il trattamento con agenti mutageni può estendere questo ciclo di> 90 h. Circa il 10% delle inclusioni sono tenuti a recuperare. Nei nostri esperimenti, cellule Vero infettate trattati con 20 mg / ml di EMS portato ad una diminuzione del 99% nel recupero della progenie infettive rispetto ai controlli non trattati. Trattamento Mutageno ha portato anche alla nascita di placche con morfologie alterati, comprese le piccole placche (SPQ) (Figura 3). Altre morfologie includono placche che appaiono granulari, clumpy, oppure a forma di nido d'ape (Figura 3). Questi fenotipi possono riflettere difetti nei processi richiesti per l'infezione e la sopravvivenza all'interno dell'ambiente host. Mutanti con piccola placca (SPQ) morfologia generalmente producono significativamente meno progenie infettiva e può richiedere fino a 2-3 settimane per unmplify. Si deve usare cautela quando passaging questi ceppi come ritorni e mutazioni soppressori possono accumulare ad alta frequenza.
Le dosi di EMS utilizzati in questi studi possono portare a tra 3 a 30 mutazioni per Chlamydia genoma, valutate sperimentalmente WGS (Figura 4). Sebbene gradiente purificato EBs sono in gran parte priva di materiale cellula ospite, il DNA ospite è inoltre rilevato e compone circa il 10-15% delle preparazioni genomiche.
Co-infezione di due ceppi in grado di generare progenie con il contributo genetico da entrambi i ceppi e si verifica a frequenze di 10 -4 a 10 -3, circa 10 4 volte più frequentemente di resistenza spontanea (13). Punti di rottura di ricombinazione si verifica in genere tra ~ 100 kb a 800 kb (12). Un'analisi di tali ceppi ricombinanti può rivelare mutazioni che sono geneticamente collegati al fenotipo sotto studio.
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Discussion
Questa metodologia soddisfa i requisiti di base per l'analisi genetica in quanto stabilisce il collegamento tra genotipi e fenotipi. È importante sottolineare che questo è realizzato senza l'ausilio di strumenti molecolari convenzionali per la trasformazione del DNA ricombinante e inattivazione inserzionale di geni nei batteri, che è spesso una tappa limitante nell'analisi della funzione del gene in microbi non-modello.
Un passo fondamentale è quello di garantire clonalità di mutanti placca-purificati. La contaminazione incrociata con wild type o mutanti "montatore" può portare rapidamente a ceppi mutanti di essere sorpassato le classiche. Allo stesso modo, le mutazioni di mappatura di tutto il sequenziamento del genoma di campioni non clonali possono portare a risultati ambigui. Isolando mutanti da pozzi pesantemente plaqued o collegando placche troppo vicini gli uni agli altri dovrebbe essere evitato. Inoltre, per mutanti crescita lenta, revertanti possono emergere a frequenze relativamente elevate. Si consiglia di conservare le scorte brano originale o bassa. Replmutanti Aque caso di contaminazione incrociata o revertenti sono sospettati.
La concentrazione di EMS può essere abbassata per ridurre la frequenza delle mutazioni. Il tasso di mutazione, come valutato mediante la generazione di varianti resistenti rifampicina (a causa di mutazioni puntiformi nel gene che codifica per l'RNA polimerasi, rpoB) era ottimale nelle nostre mani a 20 mg / ml di EMS. L'induzione di resistenza rifampicina può essere valutata la frequenza di placche formate in presenza di rifampicina e dovrebbe correlare alla frequenza di mutazioni indotte chimicamente.
EMS può essere sostituito con altri agenti mutageni di ampliare lo spettro di mutazioni che possono essere ottenuti. Per esempio, agenti intercalanti del DNA come psoraleni e suoi derivati possono essere utilizzati per indurre delezioni e inserzioni (21).
Le mutazioni che mappano vicino all'altro nel genoma (<100 kb a parte) sono difficili da scollegare tramite ricombinazione. Quando elevati tassi di mutagenesi sono raged, può essere difficile identificare univocamente una mutazione causale. Tuttavia, poiché la trasformazione di C. trachomatis è ora possibile con plasmidi navetta (22), sia pure in maniera inefficiente, può essere possibile per risolvere questi problemi di collegamento completando mutazioni in trans con un tipo di copia selvaggia del gene mutato in un plasmide.
Figura 1. Strategia per l'analisi in avanti genetica e mappatura ricombinazione basata sulla Chlamydia. Resistente Rifampicina (Rif. R) C. trachomatis stato mutagenizzato durante la sua fase replicativa e utilizzato per infettare monostrati di cellule Vero fino placche visibili formate. Cloni individuali dei mutanti sono stati raccolti e analizzati per fenotipi specifici, come morfotipi placca alterati. I genomi di mutanti che condividono un fenotipo comune sono stati sequenziati per identify lesioni genetiche comuni. Per stabilire il collegamento tra queste lesioni geniche e morfologie placca specifici, cellule Vero sono stati co-infettati con mutanti generati in Arif R sfondo e wild-type Spc R Chlamydia ceppi, e Rif R Spc ceppi ricombinanti R tra la progenie infettiva risultante sono stati selezionati in presenza di rifampicina e spectinomicina ("croci"). La segregazione delle singole mutazioni presenti nel parentale Rif. R ceppo mutante tra i batteri ricombinanti mostrano alterata morfologia della placca è stato determinato mediante sequenziamento del DNA mirato. (Riprodotto con permesso da PNAS (14)) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Rappresentazione schematica di EMS mutagenesi protocollo. Chlamydia trachomatis cellule LGV-L2-infette sono stati esposti a EMS durante la fase RB del ciclo infettivo, e l'infezione è stata lasciata procedere per 72 h per permettere la generazione di corpi elementari infettive (EB) . Piscine EB mutagenizzate sono state raccolte e titolati per unità formanti inclusione (IFU) e le unità formanti placca su cellule Vero. N, nucleo. (Riprodotto con permesso da PNAS (14)) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Esempi di morfologie placca comuni tra EMS-mutagenizzato C. trachomatis. Mutagenizzato C. trachomatis LGV-L2 permesso di formare placche sul monostrato di cellule Veros per 14 giorni. Targhe variavano nelle dimensioni (A) e morfologia (B), che possono essere isolati, amplificati in cellule Vero, ed utilizzati in reinfezioni di monostrati Vero per confermare la stabilità dei morfotipi placca. Esempi di fenotipi comuni sono illustrati anche a nido d'ape (HCM), clumped (CLMP), piccola targa (spq) e granulare (GRN). Le frecce indicano grandi depositi granulari all'interno di una placca grn. (Riprodotto con permesso da PNAS (14)) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Identificazione delle lesioni geniche EMS-indotte. Localizzazione cromosomica di varianti nucleotidiche in mutanti che mostrano il morfotipo placca grn. Sequenziamento dell'intero genoma di tre mutanti Grn identificate mutazionis che portano a cambiamenti di aminoacidi nella glgB, che codifica per un enzima glicogeno-branching. (Riprodotto con permesso da PNAS (14)) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Disclosures
Non c'è nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
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