Summary
우리는 화학 돌연변이 및 전체 게놈 시퀀싱에 따라 클라미디아의 유전자 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 감염된 세포 내에서 DNA 교환을위한 시스템은 유전자 매핑에 사용할 수있는 설명합니다. 이 방법은 변환 시스템 및 분자 유전 학적 도구가 부족한 미생물 시스템에 광범위하게 적용 할 수있다.
Abstract
클라미디아의 trachomatis, 성병 및 안구 감염의 병인 에이전트, 재조합 DNA와 가난 때문에 실험 변환에 해당 다루기 힘듦을 특징으로 남아있다. 우리는 C에서 유전자 분석을 수행 할 수있는 방법을 개발 분자 유전 학적 도구의 부족에도 불구의 trachomatis. 우리의 방법이 포함됩니다 : I)를 빠르게 별개의 표현형과 유전 정의 된 돌연변이의 포괄적 인 라이브러리를 생성하는 화학 돌연변이, ii)에서 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)가 기본 유전 병변을지도하고 변이 유전자 (들) 사이의 연결을 발견하고.. 일반적인 표현형;. 돌연변이 야생형 박테리아와 포유 동물 세포의 공동 감염을 통해 재조합 균주의 III는) 생성. 따라서, 우리는 유전자형과 표현형 사이의 인과 관계를 확립 할 수 있었다. 화학적으로 유도 된 유전자 변이와 WGS의 결합은 상호 유전자형 - 표현형 협회에게 우리말을 설정하려면LD는 유전자 분석에 현재 어려운 의학 및 환경 중요한 미생물의 큰 목록에 광범위하게 적용합니다.
Introduction
관련과 미국에서 연간 약 280 만 생식기 감염 (질병 통제 센터) 후유증과 같은 골반 염증성 질환, 자궁외 임신, 불임 (1)에 대한 의무 세포 내 세균 클라미디아의 trachomatis 계정. 클라미디아 균은 고유 한이 전염성하지만 비 복제 초등학교 바디 (EB) 및 비 감염성하지만, 증식하는 그물 몸 (RB) : 두 가지 형태로 구성된 이상성 개발주기 생리학. 감염 endoctyotosis (2) 다음 상피 세포에 사채의 첨부 파일이 시작됩니다. 막 바인딩 공포는 포함을라고 이내에 교환 사채는 이진 핵분열에 의해 복제 RB 형태로 분화. 중반 사이클에서, RBS 전환 당시 감염의 새로운 라운드를 시작하기 위해 세포 공간으로 추방 사채,에 때 숙주 세포 lyses (3).
C. trachomatis에 있습니다이러한 세균 유전학 대부분의 연구 중심되었습니다 타겟 유전자 교체, 트랜스포존과 transducing에 파지, 표준 분자 유전 학적 도구와 일상적인 조작에 내화물, 그것은 개인의 클라미디아 유전자가 타고난 면역 회피에 기여하는 정도 불분명하다 , 영양소 수집, 개발 전환, 또는 진핵 호스트 (4) 내 병원체의 생존에 중요한 다른 프로세스. 따라서이 병원체는 임상 적 중요성에도 불구하고 저조한 특징 남아있다.
클라미디아 균의 게놈. 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 염기 서열 여러 종 biovars와 (5) (~ 1MB의) 상대적으로 작은 수 있습니다. WGS하여 비교 게놈 분석은 독성 요인의 잠재적 기능 (9, 10)에 관해서 몇 가지 정보를 제공하고 있습니다 클라미디아 종과 인간 (6-8)에 어느 정도에 그들의 적응의 진화에 독특한 통찰력을 제공하고 있습니다. 티임상 분리하여 표시 그는 유전 적 다양성은 유전자의 돌연변이가 쉽게에 대한 선택했을 아마도 때문에, 체계적으로 대부분의 독성 요소의 기능을 매핑하는 데 필요한 해상도를 제공하지 않습니다. 독성의 측정 결함, 조사 할 수있는 돌연변이의 스펙트럼을 확장 할 수있는 정의 된 분석과 함께 자연 선택, 돌연변이 유발 유전자 변이의 혼란 함을 주죠 효과없이. 화학 돌연변이는 특히 그들이 널, 조건, hypomorphic (감소 함수)를 생성 할 수 있습니다으로 유용하고, hypermorphic (함수의 이득) 대립 유전자이다. 강력한 차세대 게놈 시퀀싱 기술의 도착과 함께, 이러한 돌연변이 쉽게 식별 매핑 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 강한 협회는 앞으로 유전자 접근 방식의 적용을 가능하게하는 유전자 또는 유전 경로의 변이와 일반적인 표현형 사이에 만들 수 있습니다.
임상 균주의 게놈 시퀀스 모자이 B 밝혀etween의 혈청 형과 자주 재조합 (11)의 궤적. 재조합 경험적 증거는 두 계통에서 유전 적 기여 (12, 13)을 가지고 계시 이중 저항 재조합 자손의 두 가지 항생제 내성과 선택의 공동 감염을 통해 증명되었다. 따라서, 공동 감염 설정 야생형과 돌연변이 균주 간의 유전 적 교환은 화학적으로 유도 된 돌연변이의 분리가 관찰 된 표현형에 이르게 영향을받는 유전자를 찾아 낼 수 있습니다.
여기에서 우리는 화학 돌연변이, WGS, 감염된 세포 내에서 DNA 교환 (14) (그림 1)에 대한 시스템을 기반으로 클라미디아의 유전자 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
1. 화학적 돌연변이 유발
참고 : 우리는 증식하는의 RB 양식 EB 양식보다 화학적 돌연변이 유발에 더 순종 것으로 나타났습니다. 중간 사이클 (HPI 20-18 사이)에서 RBS는 사전 RB-EB 전환에 가장 큰 숫자에 있습니다. 클라미디아의 trachomatis는 의무 세포 내 병원체이기 때문에, 호스트 건강에 돌연변이의 효과는 세균의 회복을 제한 할 수 있습니다. 베로 세포는 테스트를 다른 세포 라인보다 EMS 높은 수준의 부작용에 저항 것으로 밝혀졌다.
재조합에 의한 변이의 분리는 항생제 내성 유전자 재조합 자손에 대한 선택을해야합니다. 우리는 재조합 분석을 수행하고 isogenic 균주를 분리하는 능력 돌연변이를 생성하기위한 약물 내성 변종 (예를 들어, 리팜핀, 스펙 티노 마이신, 또는 트리 메토 프림) 사용하는 것이 좋습니다. 항생제 내성은 단계적으로 선택 과정 (15, 16)에 의해 생성되었다.
아니E : 클라미디아의 trachomatis (변형 L2 / 434/Bu / ATCC VR902B가) BSL2 병원체이다. 이러한 병원균을 처리하기위한 제도적 표준 운영 절차 (SOP)를 참조하십시오.
- 배양 세포와 감염의 준비 :
- 25cm 2 (T25) Dulbecco 수정 이글 중간 (DMEM) 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 보충 3 ㎖의 플라스크 당 종자 약 1 × 10 6 베로 세포 (ATCC CCL-81). 37 품어 ° C, 5 % CO 2.에게 세포는 24 시간 안에 합류 단층을 형성해야한다.
- 매체를 대기음. 매체의 3 ML의 총 볼륨 5 (~ 14 × 10 6)의 감염의 다중성 (모이) (DMEM, 200 NG / ML cyclohexamide, 10 % FBS)에서 클라미디아와 베로 세포의 합류 T25 플라스크를 감염.
- 18 시간 게시물 감염 (HPI)에서 돌연변이를 시작합니다 :
- 인산의 20 MG / ML EMS (에틸 메탄)를 준비 식염수 (PBS)는 0.9 mM의 칼슘과 버퍼EMS와 같은 화학 물질 안전성 후드 염화 0.49 밀리미터 염화 마그네슘은 휘발성 액체이다.
참고 : EMS는 강력한 돌연변이 및 발암 물질이다. EMS 낭비하고 1 M 수산화 나트륨과 유출, 플라스틱, 종이 및 유리의 오염을 제거 중화. - 매체를 대기음 PBS / MgCl 2 / 염화칼슘 2 3 ㎖ 한 번 세포를 씻으십시오. 상온에서 흄 후드에서 한 시간 동안 PBS / MgCl 2 / 염화칼슘 20 MG / ML EMS 3 ml의 세포를 품어. 베로 세포는 짧은 기간 동안 인큐베이터 외부 EMS 및 조건이 농도 살아남을 수 있습니다. mutagenized되지 않은 컨트롤 샘플을 포함해야합니다.
- EMS를 포함하는 매체를 제거하고 돌연변이를 비활성화하는 1 M NaOH를 용기에 넣습니다. 잔여 돌연변이를 제거하는 3 ML PBS + MgCl 2 / 염화칼슘에 감염된 세포에게 3 번 씻으십시오. 200 NG / ML cyclohexamide 25 ㎍ / ㎖ 겐타 마이신과 DMEM/10 % FBS 6 ML을 추가하고, 5 % CO 품어
- 저장성 용해에 의해 사채를 추출 완전히 매체를 대기음. 10 분 동안 세포를 이동시키다하는 1.0 ML H 2 O와 바위를 추가합니다. 적어도 10 번과 위아래로 pipetting하여 세포를 용해. 의 microfuge에서 해물과 1X 최종 농도를 가져다 0.250 ML 배 자당 인산 글루 탐 산염 버퍼 (SPG)를 추가를 수집합니다. -80에서 보관 ° C.
참고 : 돌연변이 유발의 수준이 리팜핀 내성의 유도에 의해 평가 될 수있다. 리팜핀 내성 시험 주파수를, 패 1 × 10 8 7 X 200 NG / 리팜핀의 ML의 면전에서 박테리아의 10 배 연속 희석. 리팜핀 내성의 빈도는 도금 된 박테리아의 총 개수로 나눈 리팜핀 내성 패의 숫자로 정의됩니다. 플라크 지침은 아래 섹션을 참조하십시오. - 저장성 용해에 의해 사채를 추출 완전히 매체를 대기음. 10 분 동안 세포를 이동시키다하는 1.0 ML H 2 O와 바위를 추가합니다. 적어도 10 번과 위아래로 pipetting하여 세포를 용해. 의 microfuge에서 해물과 1X 최종 농도를 가져다 0.250 ML 배 자당 인산 글루 탐 산염 버퍼 (SPG)를 추가를 수집합니다. -80에서 보관 ° C.
- 인산의 20 MG / ML EMS (에틸 메탄)를 준비 식염수 (PBS)는 0.9 mM의 칼슘과 버퍼EMS와 같은 화학 물질 안전성 후드 염화 0.49 밀리미터 염화 마그네슘은 휘발성 액체이다.
2. 패 정화하여 클라미디아의 trachomatis 돌연변이 균주의 클론 분리
- 6 잘 접시의 베로 세포의 합류 단층을 설정 종자 ~ 0.4도 당 3 ML DMEM/10 % FBS에서 x 10 6 세포. 세포는 다음 24 시간 동안 균일 한 단일 층을 형성 할 수 있습니다.
- 얼음에 mutagenized 클라미디아의 원액을 녹여. DMEM/10 % FBS에 희석 당 200 μL의 총 볼륨 6 X 10 배 연속 희석을 수행하고 얼음을 설정합니다.
참고 : 포함 형성 단위 세균 역가 (IFU)이 플라크 형성 단위의 좋은 추정치 (PFU)입니다. 패 10, 100 목표로 1000 PFU. - 물론 당 3 ML PBS로 두 번 베로 세포를 씻으십시오.
- 6 - 잘 접시와 중복의 세균 희석 100 μl를 각 well에 3 ML DMEM을 추가합니다. 소용돌이도 혼합물을 보장하기 위해 판.
- 15시 30 분 2,700 XG에 감염된 접시를 스핀 ° C 다음 가습에 37 ° C에서 알을 품다,1 ~ 2 시간 동안 5 % CO 2 배양기.
- 0.54 % DMEM의 아가로 오스 (6 우물) 준비 :
- 18.9 ML 추위 2X DMEM, 4.2 ML FBS, 0.42 ML 100 배 NEAA, 0.042 ML 200 ㎍ / ㎖ cyclohexamide, 0.021 ML 50mg/ml 겐타 마이신 : 다음 성분을 추가합니다. 잘 섞는다.
- 수풀을 방지하기 위해 교반, 뜨거운 멸균 1.2 % 아가로 오스 / H 2 O의 18.9 ㎖를 혼합한다. 혼합물에 열이어야합니다. 감염된 세포에 추가하기 전에 55 ° C에서 따뜻한 물을 욕조에 보관하십시오.
- 접시에서 세균 현탁액을 대기음 6 ML 0.54 % 아가로 오스 / DMEM을 당에도 적용됩니다. 아가로 오스 15 분 후드 외부 실온에서 완전히 응고 할 수 있습니다. 뚜껑은 15 분 동안 바이오 안전성 후드 제거와 접시를 건조.
참고 : 생물학적 밀폐 후드에서 진동 고형화 아가을 왜곡 할 수 있습니다. - 7 ~ 10 일 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 알을 품다. 플라크는 해부 현미경의 도움으로 볼 수 있어야합니다. (재플라크의 전형적인 이미지 그림 3 FER).
- 사전 분리 돌연변이에 하루 씨앗 1 개 10 100 μL에 잘 당 96 - 웰 플레이트의 4 베로 세포. 세포는 24 시간 안에 합류 할 것입니다.
- 해부 현미경을 사용하여, 표시 패를 선택할 수 있습니다. 멸균 1.0 ML 장벽 피펫 팁을 사용하여 패의 플러그를 수집합니다.
- DMEM 100 μL의를 Resuspend 패 10 % FBS, 400 NG / ML cyclohexamide, 50 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신과 보충.
- 돌연변이 균주를 확장하려면, 베로 세포의 합류 단층에 현탁액을 오버레이. 30 분 2,700 XG, 15 ° C에서 접시를 회전.
- 가습 배양기에서 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어. 48 HPI 빠르면 14 일로 늦게 발생할 수있는 세포의> 50 % 감염되어 수확 사채. 감염된 세포의이 금액은 충분히 가능한 박테리아가 저장 될 수 있습니다. 돌연변이 균주의 성장 속도와 감염에 차이가 있습니다. 타고난로 성장하는 균주를 느리게 할 수충분한 세포가 감염 될 때까지 에서야 이웃 세포를 다시 감염.
- 감염된 세포의 삼투압 용해에 의해 사채의 압축을 풉니 다 :
- 완전히 매체를 대기음.
- 멸균 물 160 μl를 추가합니다. 10 분 실온에서 알을 품다.
- 완전한 용해를 보장하기 위해 여러 번 위아래로 pipetting에 의해 세포를 중단, 교차 오염을 방지하기 위해 장벽 팁을 사용합니다.
- 의 microfuge 튜브에 해물 160 μl를 전송합니다.
- 배 SPG의 40 μL에 섞는다. -80에서 보관 ° C.
- 그 표현형 (들)에 대한 분석 및 화면 돌연변이.
3. 선택한 클라미디아 돌연변이의 전체 게놈 시퀀싱
- 호스트 DNA 오염의 대부분 무료입니다 그라디언트 정제 사채에서 게놈 DNA를 추출합니다. 사채의 클라미디아와 정화의 대규모 문화 프로토콜은 심판에서 찾을 수 있습니다. (17). 내선 번호에 상용 게놈 DNA 정제 키트 (예 : Qiagen의 고양이. 69504)를 사용하여제조업체의 지침에 따라 2 × 10 9 박테리아에서 DNA를 ract.
- 정확하게 DNA의 양을 측정하는 형광을 (큐 비트, Invitrogen의 고양이. Q32866)를 사용합니다. 정제 된 DNA를 1-5 μg은 Illumina의 시퀀싱 플랫폼이 필요합니다.
참고 : 여러 플랫폼을 Illumina/Solexa- 고체 기반의 시스템을 포함한 일련의 세균 게놈에 사용할 수 있습니다. 우리는 짧은 고밀도 생산으로 HiSeq (Illumina의)를 사용하기로 결정했습니다, 그러나 고품질 시퀀싱을 읽습니다. 같은 IonTorrent (생명 기술)와 MySeq (Illumina의)와 같은 작은 규모의 게놈 시퀀서도 적합하며, 적절한 유전체 어셈블리 25X의 최소 범위를 초과하는 시간에 4 클라미디아 게놈까지 이러한 quencing 다중화를위한 충분한보다. 일루미나 플랫폼의 DNA 시퀀싱 라이브러리의 준비 아래에 설명되어 있습니다. - 에 S220 적응 집중 음향을 사용하여 적절한 크기로 조각 DNA (Illumina의 시퀀싱 300-400 기본 쌍)제조업체의 권장 설정에 따라 (Covaris) strument. 참고 : 샘플 aerosolization에 의한 시료의 큰 손실 분무 결과로 DNA 파편.
- 제조업체의 지침에 따라, 상업 건설 장비 (Illumina의 FC-102-1001)을 사용하여 게놈 시퀀싱 라이브러리를 준비합니다. 라이브러리는 여러 샘플을 풀링 동시에 염기 서열 될 수있는 바코드 프라이머 (Illumina의 FC-121-1003)를 사용하여 인덱싱 할 수 있습니다.
- 샘플 시퀀싱 실행합니다. 이 단계는 일반적으로 상용 서비스 또는 전용 기술 직원에 의해 운영 핵심 시설에 의해 수행됩니다. 그 절차와 권장 사항을 따르십시오.
- Illumina의 읽기는 (FASTQ 형식)는 SNP / 돌연변이 식별에 이용 될 수있는, 그러한 (Biomatters) Geneious으로, 사용자 친화적 인 그래픽 사용자 인터페이스 소프트웨어를 사용하여 참조 게놈에 조립 될 수있다. 지도 돌연변이에 최소 변형 주파수 및 최소 범위에 대한 50X를 90 %로 매개 변수를 설정합니다. 오픈 원료에서같은 MAQ (18)와 BWA (19)와 같은 전자 게놈 어셈블러는,도 사용할 수 있습니다.
- 생어 시퀀싱으로 돌연변이를 확인 : 생어 시퀀싱으로 정제 또는 (1시 20분) PCR 제품을 희석하여 확인 된 돌연변이 순서를 측면에서는 300 ~ 500 bp의 영역의 PCR 증폭을위한 템플릿으로 게놈 DNA를 사용합니다.
4. 클라미디아 재조합의 생성
참고 : 클라미디아 감염 중 DNA를 교환 할 수있는 재조합 균주의 생성 (12, 13, 20) 할 수 있습니다. 이후 두 개의 고유 한 항생제 내성 재조합 "자손"로 세포의 공동 감염 (12, 13) 이중 항생제 내성 선택할 수 있습니다. 우리는 돌연변이를 분리하고 공동 isogenic 변종을 생성하는이 현상을 이용했다. 따라서 돌연변이 균주 (CTL0567 (rpoB) 예를 들면 리팜핀 내성 (RIF R) H471Y) 항생제 내성 백그라운드에서 생성 된 그들은 야생형 균주 bearin에 교차 될 수있는조지아 다른 항생제 내성 대립 유전자 (예를 들어, 스펙 티노 마이신 저항 SPC (R), r01/r02에 G1197A (16SRNA 1, 2 부)). 클라미디아의 DNA 교환 및 재조합에 대한 자세한 내용은 참조 (12, 13)를 참조하십시오.
- 24 잘 접시에 성장 베로 세포의 합류 단층 위에 각 변형에서 centrifuging6 × 10 5 박테리아에 의해 야생 유형 및 클론 돌연변이 균주를 공동 감염. 병렬로 혼자 각 변형에 단일 층을 감염.
- 44시 HPI, 감염된 세포의 삼투압 용해하여 수확 사채 :
- 완전히 매체를 대기음.
- 멸균 0.4 ML을 추가하고 10 분 동안 서 보자.
- 활발한 적어도 10 번 상하 pipetting하여 세포를 용해. 전송의 microfuge 튜브에 해물.
- 1X 배속 SPG의 최종 농도 5 배 SPG 0.1 ㎖를 혼합한다.
- 원유 해물 즉시 사용 또는 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다
- 원유 EB의 플라크 50 μL은을 준비합니다D 5 아가 / DMEM에서 x 1시 10분 시리얼 희석은 재조합을 위해 선택할 수있는 적절한 항생제로 보충. (재조합의 선택에 대한 일반적인 항생제의 농도에 대한 표를 참조하십시오.)
- 플라크 정화 상기 재조합 균주를 풍부. 원하는 표현형의 존재 또는 부재에 대한 점수 재조합. 돌연변이의 존재 또는 부재에 대한 유전자형의 목적을 위해 DNAzol 치료 (다음 섹션 참조)에 의해 재조합 균주에서 DNA를 추출합니다.
- 십자가는 더욱 돌연변이를 분리하고, isogenic 변종을 생성하는 다른 항생제 내성 마커가 부착 된 균주 반복 할 수 있습니다. 다른 항생제 마커가 부착 된 다른 야생형 균주에 선택한 재조합을 공동 감염.
표 1 : 재조합의 선택을위한 항생제 농도 :
| 최종 농도 | 준비 지침 |
|---|---|
| 200 NG / ML 리팜핀 25 ㎎ / 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 ML 저장 재고를 확인합니다. H 2 O와 스토리지 주식을 희석하여 200 ㎍ / ㎖ 작업 솔루션을 만들 어둠 속에서 -20 ° C에서 보관. | |
| 200 ㎍ / ㎖의 메소 | DMSO에 100 밀리그램 / ML 주식을합니다. -20 ° C에서 보관 |
| 200 ㎍ / ㎖의 스펙 티노 마이신 | 100 μL 분주 물에 100 밀리그램 / ML 주식을합니다. -20 ° C.에 저장 반복되는 동결 융해를 피할 수 있습니다. |
5. 유전자형에 대한 재조합 균주의 게놈 DNA의 추출
참고 : 열 기반의 정화 키트도 사용할 수 있습니다. DNAzol 처리에 의한 DNA 추출의 장점은 비용입니다.
- 12 잘 접시에 성장 베로 세포의 단일 층에 1.2 × 10 5 chlamydiae를 감염.
- 36-48 HPI에서 매체를 대기음 DNAzol (Invitrogen 사 10503-027)의 0.375 ML을 추가합니다. 부드럽게 세포와 피펫 리사를 교반1.5 ML의의 microfuge 튜브에 TES.
- 100 % 에탄올 0.188 mL를 첨가하여 침전 DNA. 반전으로 섞는다.
- 피펫 팁과 스풀링하여 DNA를 추출하고 깨끗한 튜브에 넣습니다. 또한, 펠릿 2 실온에서 분, 4 ° C, 그리고 가만히 따르다 뜨는을위한 최고 속도로 원심 분리하여 DNA.
- 세척 DNA는 75 % 에탄올 1.0 ML로 두 번 침전.
- 15 초 동안 에탄올을 제거한 후 공기 건조 DNA.
- 0.2 ML 8 개 MM NaOH를 다음 0.1 M의 HEPES의 20.2 μL로 pH를 8.0으로 중화와 DNA를 용해. 물이나 TE로 0.5 ML의 최종 볼륨에 불러옵니다. 또는, TE 버퍼를 Resuspend의 DNA가 (DNA 침전물이 완전히 용해되지 않습니다.).
- 확인 된 돌연변이를 측면에서는 300 ~ 500 bp의 영역의 PCR 증폭을위한 템플릿으로 DNAzol - 추출 된 DNA를 사용합니다. 순서는 정제 또는 생어 시퀀싱에 의해 (1시 20분) PCR 제품을 희석.
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Representative Results
돌연변이에 노출 세균 세포의 죽음으로 인해 아마도, 세균없는 표시 함유로 연결됩니다. 일반적으로 혈청 형 LGV-L2 완전히 48 시간 게시물 감염에서 감염 세포를 용해되지만, 돌연변이와 치료> 90 시간이 사이클을 확장 할 수 있습니다. 흠의 약 10 %를 회복 할 것으로 예상된다. 우리의 실험에서, 감염 베로 세포 치료 컨트롤에 비해 전염성 자손의 회복에 99 % 감소했다 20 MG / ML EMS로 처리. 돌연변이 처리는 작은 플라크 (SPQ) (그림 3)를 포함 변경된 형태학과 plaques의 출현했다. 다른 형태학은 세분화 clumpy, 또는 (그림 3) 모양의 벌집 표시 패 (가) 있습니다. 이러한 표현형은 호스트 환경에서 감염과 생존을 위해 필요한 과정에 결함이 반영 될 수 있습니다. 작은 플라크 (SPQ)의 돌연변이 형태 일반적으로 훨씬 적은 전염성 자손을 생산하고 2 ~ 3 주 소요될 수 있습니다mplify. reversions과 억제 돌연변이 빈도가 높은 축적 이러한 변종과 Passaging 경우에는주의가 필요합니다.
이 연구에서 사용 된 EMS의 용량은 WGS (그림 4)에 의해 실험적으로 평가 클라미디아 게놈 당 30-3 사이의 돌연변이로 이어질 수 있습니다. 그라데이션 정제 사채는 숙주 세포 물질의 대부분 무료이지만, 호스트 DNA도 검출 게놈 조제품의 약 10-15 %로 구성되어 있습니다.
두 균주의 공동 감염은 두 균주의 유전 적 기여와 자손을 생성하고 더 자주 자연 저항 (13)보다 10 -3 ~ 10 -4의 주파수, 약 10 4 시간에 발생 할 수 있습니다. 재조합 브레이크 포인트는 일반적으로 8백킬로바이트 (12)에 ~ 1백킬로바이트 사이에 발생합니다. 이러한 재조합 균주의 분석은 유전자 연구에 따라 표현형에 연결되어 돌연변이를 공개 할 수 있습니다.
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Discussion
이 유전자형과 표현형 사이의 연계를 설정으로이 방법은 유전자 분석을위한 기본 요구 사항을 충족합니다. 중요한 것은,이 재조합 DNA의 변화와 종종 비 모델 미생물의 유전자 기능의 분석 속도 제한 단계는 박테리아 유전자의 insertional 비활성화에 대한 기존의 분자 도구의 도움없이 달성된다.
하나의 중요한 단계는 패 정제 된 돌연변이 체의 클론을 보장하는 것입니다. 야생 유형 또는 "벤치"돌연변이와 교차 오염을 신속 얻은 결과되는 돌연변이 균주로 이어질 수 있습니다. 마찬가지로, 비 클론 샘플의 전체 게놈 시퀀싱에 의해 매핑 돌연변이는 모호한 결과를 초래할 수 있습니다. 많이 plaqued 우물에서 돌연변이를 분리하거나 서로 너무 가까이에 플라크를 연결은 피해야한다. 또한, 느린 성장 돌연변이를 들어, revertants는 상대적으로 높은 주파수에서 나올 수 있습니다. 우리는 원본 또는 낮은 통로 주식을 보존 좋습니다. REPL교차 오염 또는 revertants 경우 aque 돌연변이가 의심됩니다.
EMS의 농도는 돌연변이의 빈도를 감소 낮출 수있다. 로 리팜핀 내성 변종의 발생에 의해 평가 돌연변이 비율 (부호화하는 유전자 RNA 중합 효소의 돌연변이를 가리 인해, rpoB) 20 밀리그램 / ML EMS에서 우리 손에 최적이었다. 리팜핀 내성의 유도는 리팜핀의 존재에 형성된 화학적으로 유도 된 돌연변이의 빈도에 상관해야 플라크의 주파수에 의해 평가 될 수있다.
EMS는 얻을 수 변이의 스펙트럼을 넓혀 다른 돌연변이로 대체 할 수 있습니다. 예를 들어, 소라렌과 그 유도체와 같은 DNA intercalating 에이전트 삭제 및 삽입 (21) 유도하는 데 사용할 수 있습니다.
게놈 (떨어져 <1백킬로바이트)에서 서로에지도 닫기 돌연변이 재결합을 해제하기가 어렵습니다. 높은 돌연변이 비율은 achiev 때ED, 그것은 명확하게 원인 돌연변이를 식별하기 어려울 수 있습니다. 그러나 C의 변환 이후 트라코마는 이제 비효율적이라도 셔틀 플라스미드 (22), 가능, 그것은 플라스미드에 돌연변이 유전자의 야생형 사본 트랜스의 돌연변이를 보완하여 이러한 링크 문제를 해결 할 수 있습니다.
그림 1. 클라미디아에 앞으로 유전자 분석과 재조합 기반 매핑을위한 전략. 리팜핀 내성 (리프 R) C. 의 trachomatis은 그 증식하는 단계에서 mutagenized 눈에 보이는 플라크가 형성 될 때까지 베로 세포 단일 층을 감염하는 데 사용되었다. 돌연변이의 개별 클론 같은 변경된 플라크의 형태 형과 같은 특정 표현형, 수집 및 assayed되었다. 일반적인 표현형을 공유 돌연변이의 게놈은 나에게 순서가되었다일반적인 유전자 병변을 dentify. 이러한 유전자 병변 및 특정 패 형태학 간의 연동을 설정하려면, 베로 세포 아리프 R 배경과 야생 형 상병 R 클라미디아 균주에서 발생하는 돌연변이와 공동 감염, 결과 전염성 자손 사이에 재조합 리프 R 상병 R 균주는에서 선택 리팜핀과 스펙 티노 마이신 ( "십자가")의 존재. 변경된 플라크의 형태를 표시하는 재조합 박테리아 사이에 부모 리프 R 균주에 존재하는 각 돌연변이의 분리는 타겟 DNA 염기 서열에 의해 결정되었다. (PNAS (14)의 허가를 재현) 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. EMS 돌연변이 유발 프로토콜입니다. 클라미디아의 trachomatis LGV-L2에 감염된 세포의 도식 표현은 전염성 사이클 RB 단계에서 EMS에 노출되고, 감염은 전염성 초등학교 기관의 생성 (EB) 수 있도록 72 시간 동안 진행시켰다 . Mutagenized EB 풀을 수확 베로 세포에 포함 형성 단위 (IFU)와 플라크 형성 단위 titered 하였다. N, 핵. (PNAS (14)의 허가를 재현) 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. EMS-mutagenized C. 사이에서 일반적인 패 형태학의 예 트라코마. Mutagenized C. trachomatis에 LGV-L2 베로 세포 단일 층에 플라크를 형성 할 수십사일에 대한의. 분리 할 수있는 크기 (A) 및 형태에서 변화 패 (B)는 베로 세포에서 증폭 플라크 형태 형의 안정성을 확인하기 위해 베로 단층의 재감염에 사용됩니다. 일반적인 표현형의 예는 벌집 (HCM), 응집 (CLMP), 작은 플라크 (SPQ) 및 과립 (GRN)를 포함 표시됩니다. 화살표는 GRN 플라크 내에서 큰 과립 예금을 나타냅니다. (PNAS (14)의 허가를 재현) 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. EMS-유도 유전자 병변의 ID입니다. GRN 플라크 morphotype을 표시 돌연변이 염기 변형 염색체 위치. 돌연변이를 발견 세 가지 GRN 돌연변이의 전체 게놈 시퀀싱의 그는 글리코겐-분기 효소를 코딩, glgB의 아미노산 변화로 이어집니다. (PNAS (14)의 허가를 재현) 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Disclosures
공개 할 아무것도 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
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