Summary
Vi beskriver en metode for å utføre genetiske analyser i Chlamydia basert på kjemisk mutagenese og hele genom sekvensering. I tillegg, er et system for utveksling DNA innenfor infiserte celler er beskrevet som kan anvendes for genetisk kartlegging. Denne metoden kan være bredt anvendelig på mikrobielle systemer mangler transformasjon systemer og molekylære genetiske verktøy.
Abstract
Chlamydia trachomatis, den agens for seksuelt overførbare sykdommer og okulære infeksjoner, forblir dårlig karakterisert grunn av sin intractability til eksperimentell transformasjon med rekombinant DNA. Vi utviklet en tilnærming til å utføre genetiske analyser i C. trachomatis tross for mangel på molekylærgenetiske verktøy. Vår metode innebærer: i) kjemisk mutagenese å raskt generere omfattende biblioteker av genetisk definerte mutanter med forskjellige fenotyper, ii) hel-genom sekvensering (WGS) å kartlegge de underliggende genetiske lesjoner og for å finne sammenhenger mellom muterte genet (e) og.. en felles fenotype;. iii) generering av rekombinante stammer gjennom co-infeksjon i celler hos pattedyr med mutant og villtype bakterier. Følgelig kunne vi etablere årsakssammenhenger mellom genotyper og fenotyper. Koblingen av kjemikalieutløst genet variasjon og WGS å etablere korrelative genotype-fenotype assosiasjoner Should være bredt aktuelt for stor liste over medisinsk og miljømessig viktige mikroorganismer i dag vanskelige å genetisk analyse.
Introduction
De obligate intracellulære bakterien Chlamydia trachomatis står for anslagsvis 2,8 millioner genitale infeksjoner per år i USA (Center for Disease Control) med tilhørende følgetilstander som bekkeninfeksjon, ektopisk svangerskap og infertilitet (1). Chlamydia spp. har en unik fysiologi med en bifasisk utviklingsmessig syklus bestående av to former: den smittsomme men ikke-replikerende elementær hoveddel (EB) og infeksiøs men replikative reticulate legeme (RB). Infeksjon begynner med å feste en EBS til epitelceller etterfulgt av endoctyotosis (2). Innenfor en membran-bundet vakuole kalles en inkludering, EBS differensiere inn i RB form, som deretter gjentak av binær fisjon. Midt i syklusen, RBS overganger tilbake til EBS, som deretter utvist i det ekstracellulære plass til å sette i gang nye runder med infeksjon når verten celle løser opp (3).
C. trachomatis erildfast til rutine manipulasjon med standard molekylærgenetiske verktøy, for eksempel målrettet genet erstatning, transposoner, og transducing phages, som har stått sentralt i de fleste studier i bakterielle genetikk, er det uklart i hvilken grad individuelle Chlamydia gener bidrar til unndragelse av medfødt immunitet , nærings oppkjøpet, utviklingsmessige overganger eller andre prosesser som er viktige for patogen overlevelse innenfor en eukaryote vert (4). Derfor forblir dette patogenet dårlig karakterisert tross for sin kliniske betydning.
Genomet hos Chlamydia SPP. er relativt liten (~ 1 Mb) (5) med flere arter og biovars sekvensert ved hjelp av neste generasjons sekvensering teknologier. Komparativ genom analyse av WGS har gitt unik innsikt i utviklingen av chlamydia-arter og deres tilpasning til mennesker (6-8) og til en viss grad har gitt noen opplysninger om den potensielle funksjon av virulens faktorer (9, 10). THan genetisk mangfold vises av kliniske isolater gir ikke den oppløsningen som kreves for å systematisk kartlegge funksjonen til de fleste virulens faktorer, antagelig fordi mutasjoner i slike gener ville ha vært lett valgt mot. Uten konfunderende effekter av naturlig utvalg, mutagene-indusert genet variasjon, kombinert med definerte analyser som måler feil i virulens, kan utvide spekteret av mutasjoner som kan kartlagt. Kjemiske mutagener, i særdeleshet, er anvendbare som de kan generere null, betinget, hypomorphic (redusert funksjon), og hypermorphic (gevinst funksjon) alleler. Med ankomsten av robuste neste generasjons genom-sekvensering teknologi, kan slike mutasjoner kan lett identifiseres og kartlegges. På denne måte kan sterke assosiasjoner foretas mellom mutasjoner i et gen eller genetisk vei og en felles fenotype, det mulig å anvende frem genetiske tilnærminger.
De genomsekvenser av kliniske stammer avslørt mosaicism between serovarer og loci av hyppige rekombinasjon (11). Empirisk bevis for rekombinasjon ble demonstrert ved koinfeksjon av to forskjellige antibiotika resistente stammer og valg av den doble motstandsdyktig rekombinant avkom, som ble avdekket for å ha genetiske bidrag fra begge stammer (12, 13). Dermed kan genetisk utveksling mellom villtype og mutant stammer i en co-infeksjon innstilling segregering av kjemisk-indusert mutasjoner for å finne den berørte genet som fører til den observerte fenotype.
Her beskriver en metode for å utføre genetisk analyse på Chlamydia basert på kjemisk mutagenese, WGS og et system for utveksling DNA innenfor infiserte celler (14) (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Kjemisk Mutagenese
Merk: Vi fant at replicative RB form er mer mottagelig for kjemisk mutagenese enn EB skjemaet. Midt i syklusen (mellom 18. til 20. HPI), RBS er på de største tallene før RB-EB overgang. Fordi Chlamydia trachomatis er en obligat intracellulær patogen, kan virkningene av mutagen på vertens helse begrense bakteriell utvinning. Vero-celler ble funnet å være mer resistente overfor de negative virkningene av høye nivåer av EMS enn andre cellelinjene som ble testet.
Segregering av mutasjoner ved rekombinasjon krever valg for antibiotikaresistente rekombinant avkom. Vi anbefaler bruk av medikament-resistente stammer (f.eks rifampin, spektinomycin, eller trimetoprim) for å generere mutanter for evnen til å utføre rekombinant analyse og for å isolere isogene stammer. Antibiotika resistente stammer ble generert ved en trinnvis utvelgelsesprosess (15, 16).
Ikkee: Chlamydia trachomatis (stamme L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) er BSL2 patogen. Referere til institusjonelle standard operasjonsprosedyrer (SOP) for håndtering av slike patogener.
- Utarbeidelse av dyrkede celler og infeksjon:
- Seed omtrent 1 x 10 6 Vero-celler (ATCC CCL-81) pr 25 cm 2 (T25) kolbe i 3 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2. Cellene skal danne en konfluent monolag innen 24 timer.
- Aspirere medium. Infect konfluent T25 kolber av Vero-celler med Chlamydia ved en multiplisitet av infeksjon (moi) på 5 (14 x 10 ~ 6) i et totalt volum på 3 ml medium (DMEM, 200 ng / ml cyclohexamide, 10% FBS).
- Begynn mutagenese ved 18 hr etter infeksjon (HPI):
- Forbered 20 mg / ml EMS (ethyl-sulfonat) i fosfatbufret saltvann (PBS) med 0,9 mM kalsiumklorid og 0,49 mM magnesiumklorid i en kjemisk sikkerhetshette som EMS er en flyktig væske.
Merk: EMS er en potent mutagen og kreftfremkallende. Nøytralisere EMS avfall og rense utslipp, plast, papir og glass med en M natriumhydroksid. - Medium Aspirer og vask cellene én gang med 3 ml PBS / MgCl 2 / CaCl 2. Inkuber cellene med 3 ml av 20 mg / ml EMS i PBS / MgCl 2 / CaCl 2 i én time i avtrekkskap ved romtemperatur. Vero-celler er i stand til å overleve denne konsentrasjon av EMS og tilstander utenfor inkubatoren i korte perioder. Husk å inkludere en kontrollprøve som ikke har blitt mutagenisert.
- Fjern medium som inneholder EMS og legg den i en beholder med en M NaOH til inaktivere mutagen. Vask infiserte celler tre ganger i 3 ml PBS + MgCl 2 / CaCl 2 for å fjerne rester av mutagenet. Tilsett 6 ml DMEM/10% FBS med 200 ng / ml cyclohexamide og 25 ug / ml gentamicin, og inkuberes ved 5% CO
- Pakk EBS ved hypoton lysis: Helt aspirer medium. Tilsett 1,0 ml H 2 O og rock å løsne cellene i 10 min. Lyse celler ved pipettering opp og ned i minst 10 ganger. Samle lysatet i en microfuge og tilsett 0.250 ml 5x sukrose fosfat glutamat buffer (SPG) å bringe den til 1x endelig konsentrasjon. Oppbevares ved -80 ° C.
Merk: Nivået på mutagenese kan vurderes ved induksjon av rifampicin motstand. Til analysen hyppigheten av rifampicin motstand, plakk 1 x 10 8 og 7 x 10-ganger seriefortynninger av bakterier i nærvær av 200 ng / ml rifampicin. Hyppigheten av rifampicin motstand er definert som det antall rifampin resistente plaques dividert med totalt antall bakterier belagt. Se avsnittet nedenfor for plakk instruksjoner. - Pakk EBS ved hypoton lysis: Helt aspirer medium. Tilsett 1,0 ml H 2 O og rock å løsne cellene i 10 min. Lyse celler ved pipettering opp og ned i minst 10 ganger. Samle lysatet i en microfuge og tilsett 0.250 ml 5x sukrose fosfat glutamat buffer (SPG) å bringe den til 1x endelig konsentrasjon. Oppbevares ved -80 ° C.
- Forbered 20 mg / ml EMS (ethyl-sulfonat) i fosfatbufret saltvann (PBS) med 0,9 mM kalsiumklorid og 0,49 mM magnesiumklorid i en kjemisk sikkerhetshette som EMS er en flyktig væske.
2. Klonal Isolering av Chlamydia trachomatis mutantstammer av plakk Rensing
- Sett konfluente monolayers av Vero celler i 6 brønners plater: Seed ~ 0,4 x 10 6 celler i 3 ml DMEM/10% FBS per brønn. Tillat celler til å danne en homogen monolag over de neste 24 timer.
- Tine stamløsning av mutageniserte Chlamydia på is. Gjør 6 x 10-ganger seriefortynninger i et totalt volum på 200 ul pr fortynning i DMEM/10% FBS og satt dem på is.
Merk: Bakteriell titer i inkludering forming units (IFU) er et godt estimat av plakk forming units (PFU). Mål å plakett 10, 100 og 1000 PFU. - Vask Vero-celler tre ganger med 3 ml PBS per brønn.
- Tilsett 3 ml DMEM til hver brønn i 6-brønners plater og 100 pl av den bakterielle fortynninger i duplikat. Virvel platen for å sikre jevn blanding.
- Spinn infiserte plater ved 2700 xg i 30 min ved 15 ° C og deretter inkuberes ved 37 ° C i en fuktet,5% CO2-inkubator i 1-2 timer.
- Forbered 0,54% agarose i DMEM (for 6 brønner):
- Legg følgende ingredienser: 18,9 ml kald 2x DMEM, 4,2 ml FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0,042 ml 200 ug / ml cyclohexamide, 0,021 ml gentamicin 50mg/ml. Bland godt.
- Bland i 18,9 ml varmt steril 1,2% agarose / H 2 O, røring for å unngå klumper. Blandingen skal være varm å berøre. Oppbevares i et varmt vannbad ved 55 ° C før du legger til infiserte celler.
- Sug bakteriell suspensjon fra retter og bruke 6 ml 0,54% agarose / DMEM per brønn. Tillat agarose for å størkne fullstendig ved romtemperatur utenfor hetten i 15 min. Tørk platene med lokkene fjernet, i biosikkerhet hette i 15 min.
Merk: Vibrasjoner fra den biologiske containment panseret kan forvrenge størknende agarose. - Inkuber ved 37 ° C i CO 2 inkubator i 7-10 dager. Plaques bør være synlig ved hjelp av et disseksjonsmikroskop. (Refer til figur 3 for et typisk bilde av plakk.)
- En dag før isolere mutanter, frø 1 x 10 4 Vero-celler i 100 ul per brønn i en 96-brønns plate. Celler blir sammenflytende i løpet av 24 timer.
- Ved hjelp av en disseksjon mikroskop, for å markere plaketter bli plukket. Samle plugger av plakk ved hjelp av en steril 1,0 ml barriere pipette tips.
- Resuspender plakk i 100 ul DMEM supplert med 10% FBS, 400 ng / ml cyclohexamide, 50 ug / ml gentamicin.
- Å utvide mutantstammer, overlappe suspensjon på konfluerende monolayers av Vero celler. Spinn plater ved 2700 xg, 15 ° C i 30 min.
- Inkuber ved 37 ° C / 5% CO2 i en fuktig inkubator. Innhøsting EBS når> 50% av cellene er infisert, noe som kan skje så tidlig som 48 hpi og så sent som 14 dager. Denne mengden av infiserte celler tillater nok levedyktige bakterier som skal lagres. Mutantstammer varierer i vekstrater og smittsomhet. Tillat sakte voksende stammer til naturally re-infisere nabocellene inntil nok celler er infisert.
- Pakk EBS ved hypoton lysis av infiserte celler:
- Helt aspirer medium.
- Legg 160 mikroliter sterilt vann. Inkuber ved romtemperatur i 10 min.
- Forstyrre celler ved pipettering opp og ned flere ganger for å sikre fullstendig lysis, bruke mekaniske tips for å unngå krysskontaminering.
- Overfør 160 mL av lysatene til mikrofugerør.
- Bland i 40 ul av 5x SPG. Oppbevares ved -80 ° C.
- Analyseresultatene og skjerm mutanter for fenotype (r) av interesse.
3. Hele Genome Sekvensering av utvalgte klamydia Mutants
- Utdrag genomisk DNA fra gradient-renset EBS, som er stort sett fri for forurensende host DNA. Protokoller for stor skala kultur av Chlamydia og rensing av EBS kan finnes i Ref. (17). Bruke kommersielle genomisk DNA rensing kits (f.eks Qiagen katt. 69504) til extRACT DNA fra 2 x 10 9 bakterier følge produsentens instruksjoner.
- Bruk en fluorometer (Qubit, Invitrogen katt. Q32866) for å måle mengden av DNA. 1-5 ug av renset DNA er nødvendig for Illumina sekvensering plattformen.
Merk: Flere plattformer kan brukes til sekvens bakterielle genomer, inkludert Illumina/Solexa- og solid-baserte systemer. Vi valgte å bruke HiSeq (Illumina) som den produserer høy tetthet av kort, men høy kvalitet sekvensering leser. Mindre skala genom sequencere, for eksempel IonTorrent (Life Technologies) og MySeq (Illumina) er egnet for og mer enn tilstrekkelig for multipleksing disse quencing på opptil 4 klamydia genomer om gangen, noe som overstiger minimal dekning av 25X for tilstrekkelig genom montering. Fremstilling av DNA-sekvensering bibliotekene for den Illumina plattform er beskrevet nedenfor. - Fragment DNA til passende størrelse (300-400 basepar for Illumina sekvensering) ved hjelp av en adaptiv Fokusert Acoustics S220 iment (Covaris) i henhold til produsentens foreslåtte innstillinger. Merk: DNA fragmentering av nebulization resulterer i større tap av prøven på grunn av aerosolization av prøven.
- Forbered genomisk sekvensering bibliotekene bruker kommersielle byggesett (Illumina FC-102-1001), å følge instruksjonene fra produsenten. Bibliotekene kan indekseres med strekkode primere (Illumina FC-121-1003) slik at flere prøver kan samles og sekvensert samtidig.
- Kjør sekvensering prøver. Dette trinnet er vanligvis utføres av kommersielle tjenester eller kjerne anlegg som drives av eget teknisk personale. Følg deres prosedyrer og anbefalinger.
- Illumina leser (FASTQ format) kan settes sammen til en referanse genom ved hjelp av brukervennlig grafisk brukergrensesnitt programvare, for eksempel Geneious (Biomatters), som også kan brukes for SNP / mutasjon identifikasjon. Å kartlegge mutasjoner, sette parametre til 90% for minimum variant frekvens og 50X for minimum dekning. Åpen Source genom montører, slik som MAQ (18) og BWA (19), kan også brukes.
- Bekreft mutasjoner ved Sanger-sekvensering: bruk genomisk DNA som mal for PCR forsterkning av 300-500 bp regioner flankerer identifiserte mutasjoner og sekvens renset eller fortynnet (1:20) PCR produkter ved Sanger-sekvensering.
4. Generasjon av klamydia rekombinantar
Merk: Chlamydia kan utveksle DNA under infeksjonen, som gjør det mulig for generering av rekombinante stammer (12, 13, 20). Etter co-infeksjon i celler med to unike antibiotikaresistente stammer, rekombinant "avkom" kan velges for to antibiotikaresistens (12, 13). Vi har benyttet seg av dette fenomenet til å segregere mutasjoner og å generere co-isogene stammer. Derfor ble mutantstammer generert på antibiotikaresistente bakgrunn (f.eks rifampicin resistens (rif R) H471Y i CTL0567 (rpoB)) slik at de kan krysses til villtypestammen bearinga forskjellige antibiotikaresistente allel (f.eks spectinomycin motstand (SPC R), G1197A i r01/r02 (16SRNA kopierer 1 og 2)). For detaljer angående DNA utveksling og rekombinasjon i klamydia, se referanser (12, 13).
- Co-infisere vill type og klonal mutantstammer av centrifuging6 x 10 5 bakterier fra hver stamme på konfluerende monolayers av Vero celler dyrket på en 24-brønners plate. Parallelt infisere monolag med hver stamme alene.
- På 44 HPI, høste EBS ved hypoton lysis av infiserte celler:
- Helt aspirer medium.
- Legg 0,4 ml sterilt vann og lar stå i 10 min.
- Lyse celler etter kraftig pipettering opp og ned i minst 10 ganger. Transfer lysater til en mikrofuge tube.
- Bland i 0,1 ml av 5x SPG til en sluttkonsentrasjon på 1 x SPG.
- Rå lysater kan brukes umiddelbart eller lagres ved -80 ° C.
- Plakett 50 ul av råolje EB preps end 5 x 01:10 seriefortynning i agarose / DMEM supplert med passende antibiotika å velge for rekombinantar. (Se tabell for konsentrasjoner av typiske antibiotika for valg av rekombinantar.)
- Plakk rense og berike rekombinante stammer som ovenfor. Score rekombinanter for tilstedeværelse eller fravær av den ønskede fenotype. Ekstraher DNA fra rekombinante stammer av DNAzol behandling (neste avsnitt) for det formål å genotype for tilstedeværelse eller fravær av mutasjoner.
- Crosses kan gjentas med stammer bærer andre antibiotikaresistens markører for ytterligere å skille mutasjoner, og generere isogene stammer. Co-infisere utvalgte rekombinanter til en annen villtypestammen som bærer en annen antibiotisk markør.
Tabell 1: antibiotikum som for utvelgelse av rekombinanter:
| Endelig konsentrasjon | Klargjøringsinstrukser |
|---|---|
| 200 ng / ml rifampicin Lag 25 mg / ml lager lagring i dimetylsulfoksyd (DMSO). Utgjør 200 ug / ml arbeidsløsning ved å fortynne lagring lager med H2O Oppbevares ved -20 ° C i mørket. | |
| 200 pg / ml trimetoprim | Lag en 100 mg / dl buljong i DMSO. Oppbevares ved -20 ° C |
| 200 pg / ml spectinomycin | Gjør en 100 mg / ml lager i vann i 100 pl aliquoter. Oppbevares ved -20 ° C. Unngå gjentatt frysing tine. |
5. Utvinning av genomisk DNA fra Rekombinant Stammer for Genotyping
Bemerk: Kolonne-baserte rensing settene kan også brukes. En fordel med DNA ekstraksjon ved DNAzol behandling er kostnaden.
- Infisere 1,2 x 10 5 Chlamydia på monolayers av Vero celler dyrket på 12-brønners plater.
- På 36-48 HPI, aspirere medium og tilsett 0.375 ml DNAzol (Invitrogen 10503-027). Beveg lett cellene og pipette den Lysates inn i et 1,5 ml mikro-sentrifugerør.
- Bunnfallet DNA ved tilsetning av 0,188 ml av 100% etanol. Bland ved.
- Pakk DNA ved spoling med en pipette tips og legg den i et rent rør. Alternativt pelletere DNA ved sentrifugering i høy hastighet i 2 min ved romtemperatur eller 4 ° C, og dekanter supernatanten.
- Vask DNA utfelles to ganger med 1,0 ml av 75% etanol.
- Lufttørke DNA etter fjerning av etanol i 15 sek.
- Oppløseliggjøre DNA med 0,2 ml 8 mM NaOH, deretter nøytralisere til pH 8,0 med 20,2 pl av 0,1 M HEPES. Ta opp til et endelig volum på 0,5 ml med vann eller TE. Alternativt resuspender DNA i TE buffer (DNA pellet ikke vil oppløseliggjøres helt.).
- Bruk DNAzol-ekstrahert DNA som mal for PCR forsterkning av 300-500 bp regioner flankerer identifiserte mutasjoner. Sekvens renset eller fortynnet (1:20) PCR produkter ved Sanger-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksponering for mutagen fører til inneslutninger som vises blottet for bakterier, antagelig på grunn av bakteriell celledød. Vanligvis vil serovar LGV-L2 helt lyse infiserte celler i løpet av 48 timer etter infeksjonen, men behandling med mutagener kan utvide denne syklusen til> 90 timer. Omtrent 10% av inneslutninger er forventet å komme seg. I våre forsøk, infiserte Vero-celler ble behandlet med 20 mg / ml EMS førte til en 99% reduksjon i utvinningen av smittsomme avkom sammenlignet med ubehandlede kontroller. Mutagen behandling også ført til fremveksten av plakk med endrede morfologi, inkludert små plaketter (SPQ) (figur 3). Andre morfologi inkluderer plakk som vises kornet, klumpete, eller honeycomb formet (figur 3). Disse fenotypene kan skyldes defekter i prosesser som er nødvendige for infeksjon og overlevelse i verten miljø. Mutanter med liten plakett (SPQ) morfologi generelt produsere betydelig færre smittsomme avkom og kan ta opptil 2-3 uker til enmplify. Forsiktighet bør utvises ved passering disse stammene som reversions og suppressor mutasjoner kan samle på en høy frekvens.
De doser av EMS benyttet under disse forsøkene kan føre til mellom 3-30 mutasjoner per Chlamydia genomet, som målt eksperimentelt ved WGS (figur 4). Selv gradient renset EBS er stort sett fri for vertcelle materiale, er vertskap DNA også oppdaget og består ca 10-15% av genomisk forbereder.
Koinfeksjon av to stammer kan generere avkom med genetiske bidrag fra begge stammer og forekommer ved frekvenser på 10 -4 til 10 -3, ca 10 4 ganger så ofte som spontan motstand (13). Rekombinasjon brytepunkter oppstår vanligvis mellom ~ 100 kb til 800 kb (12). En analyse av slike rekombinante stammer kan avsløre mutasjoner som er genetisk koblet til fenotype under studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metodikken oppfyller grunnleggende krav til genetisk analyse som det etablerer sammenhengen mellom genotyper og fenotyper. Viktigere, hvilket oppnås uten hjelp av konvensjonelle molekylære verktøy for rekombinant DNA-transformasjon og innsettingen inaktivering av gener i bakterier, som ofte er et hastighetsbegrensende trinn i analysen av gen-funksjon i ikke-modell mikrober.
Et kritisk trinn for å sikre klonalitet av plaque-rensede mutanter. Krysskontaminering med vill type eller "montør" mutanter kan raskt føre til mutantstammer blir utkonkurrert. På samme måte kan mutasjoner kartlegging av hele genomet sekvensering av ikke-klonale prøver fører til tvetydige resultater. Isolere mutanter fra tungt plaqued brønner eller plugging plakk som er for nær hverandre bør unngås. I tillegg, for langsomt voksende mutanter kan dukke opp revertanter ved relativt høye frekvenser. Vi anbefaler å bevare originale eller lav passasje aksjer. ReplAque mutanter hvis krysskontaminering eller revertanter er mistenkt.
Konsentrasjonen av EMS kan senkes for å redusere hyppigheten av mutasjoner. Mutasjon rate, som vurdert av den generasjonen av Rifampicin resistente varianter (på grunn peke mutasjoner i genet som koder for RNA polymerase, rpoB) var optimalt i våre hender ved 20 mg / ml EMS. Induksjon av rifampicin motstand kan vurderes ved hyppigheten av plakk som dannes i nærvær av rifampicin og bør relateres til frekvensen av kjemisk induserte mutasjoner.
EMS kan erstattes med andre mutagener å utvide spekteret av mutasjoner som kan oppnås. For eksempel kan DNA-interkalerende midler slik som psoralen og dets derivater brukes for å indusere slettinger og innsettinger (21).
Mutasjoner som kartlegger nær hverandre i genomet (<100 kb fra hverandre) er vanskelige å oppheve koblingen ved rekombinasjon. Når høye mutageneseprosedyrer priser er achieved, kan det være vanskelig å entydig identifisere en kausal mutasjon. Men siden transformasjon av C. trachomatis er nå mulig med transport plasmider (22), dog lite effektiv måte, kan det være mulig å løse disse problemene ved å supplere linkage mutasjoner i trans med en villtype kopi av det muterte genet på et plasmid.
Figur 1. Strategi for videre genetisk analyse og rekombinasjon-basert kartlegging i Chlamydia. Rifampicin resistente (Rif R) C. trachomatis ble mutagenisert under dets replikative stadium og brukt til å infisere Vero-celle-monolag inntil synlige plakk dannet. Individuelle kloner av mutanter ble samlet og analysert for spesifikke fenotyper, slik som endrede plakk morphotypes. Genomet hos mutanter som deler en felles fenotype ble sekvensert til identify felles genetiske lesjoner. Å etablere sammenhengen mellom disse genet lesjoner og spesifikke plakk morfologi, ble Vero celler som er infisert med mutanter som genereres i Arif R bakgrunn og vill type Spc R klamydia stammer, og rekombinant Rif R Spc R stammer blant den resulterende smittsomme avkom ble valgt i nærvær av rifampicin og spektinomycin ("kryss"). Segregering av individuelle mutasjoner i foreldrenes Rif R mutant belastningen blant de rekombinante bakterier som viser endret plakk morfologi ble bestemt av målrettet DNA-sekvensering. (Gjengitt med tillatelse fra PNAS (14)) Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Skjematisk representasjon av mutagenese EMS-protokollen. Chlamydia trachomatis LGV-L2-infiserte celler ble eksponert for EMS under RB fasen av den infeksiøse syklus, og infeksjonen fikk foregå i 72 timer for å tillate generering av infeksiøse elementære legemer (EB) . Mutagenisert EB bassenger ble høstet og titered for inkludering forming units (IFU) og plakk-forming enheter på Vero-celler. N, kjerne. (Gjengitt med tillatelse fra PNAS (14)) Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Eksempler på vanlige plakk morfologi blant EMS-mutageniserte C. trachomatis. Mutageniserte C. trachomatis LGV-L2 lov til å danne plakk på Vero cellemonoskiktets for 14 dag. Plaques varierte i størrelse (A) og morfologi (B), som kan bli isolert, amplifisert i Vero-celler, og anvendes i reinfections for Vero monolag å bekrefte stabiliteten av plakk morphotypes. Eksempler på vanlige fenotyper er vist inkludert honeycomb (Hcm), clumped (CLMP), liten plakett (SPQ), og granulat (Grn). Pilene indikerer store granulære innskudd innen en Grn plakett. (Gjengitt med tillatelse fra PNAS (14)) Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. Identifisering av EMS-induserte genet lesjoner. Kromosomal plasseringen av nukleotid varianter i mutanter som viser Grn plakk morphotype. Hel-genom sekvensering av tre GRN mutanter identifiserte mutasjons som fører til aminosyre-forandringer i glgB, som koder for en glykogen-forgrening enzymet. (Gjengitt med tillatelse fra PNAS (14)) Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
- Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
- Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
- Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
- Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
- Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
- Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
- Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
- Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
- DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
- Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
- Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
- Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
- Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
- Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
- Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).
