Summary
We beschrijven een methode om genetische analyse in Chlamydia op basis van chemische mutagenese en hele genoom sequencing uitvoeren. Bovendien wordt een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen beschreven die kunnen worden gebruikt voor genetische mapping. Deze methode kan breed toepasbaar microbiële systemen ontbreekt transformatiesystemen en moleculair genetische hulpmiddelen.
Abstract
Chlamydia trachomatis, het etiologische agens van seksueel overdraagbare ziekten en oculaire infecties, blijft weinig gekarakteriseerd door zijn ontoegevendheid experimentele transformatie met recombinant DNA. We ontwikkelden een aanpak om genetische analyses uit te voeren in C. trachomatis ondanks het gebrek aan moleculair genetische hulpmiddelen. Onze methode bestaat uit: i) chemische mutagenese om snel genereren van uitgebreide bibliotheken van genetisch gedefinieerde mutanten met verschillende fenotypes; ii) hele genoom sequencing (WGS) naar de onderliggende genetische letsels in kaart en associaties tussen gemuteerde gen (s) te vinden en.. een gemeenschappelijk fenotype;. iii) genereren van recombinante stammen door co-infectie van zoogdiercellen met mutant en wild type bacterie. Dienovereenkomstig, waren we in staat om causale verbanden tussen genotypes en fenotypes vestigen. De koppeling van chemisch-geïnduceerde gen variatie en WGS aan correlatieve genotype-fenotype associaties vast Should in grote lijnen van toepassing zijn op de grote lijst van medisch en ecologisch belangrijke micro-organismen momenteel hardnekkige naar genetische analyse.
Introduction
De obligaat intracellulaire bacterie Chlamydia trachomatis is goed voor een geschatte 2,8 miljoen genitale infecties per jaar in de Verenigde Staten (Center for Disease Control) met bijbehorende complicaties zoals bekken ontstekingsziekte, buitenbaarmoederlijke zwangerschappen en onvruchtbaarheid (1). Chlamydia spp hebben een unieke fysiologie met een bifasische ontwikkelingscyclus uit twee vormen: de infectieuze maar niet replicerende elementaire lichaam (EB) en infectueuze maar replicatieve netvormige body (RB). Infectie begint met de bevestiging van EBS aan epitheelcellen endoctyotosis gevolgd door (2). Binnen een membraangebonden vacuole genoemd een opname, EBS differentiëren in de RB vorm, die vervolgens repliceert door binaire splijting. Halverwege de cyclus, RBS overgangen terug in EBS, die vervolgens worden uitgestoten in de extracellulaire ruimte om nieuwe serie infecties teweeg wanneer de gastheercel lyses (3).
C. trachomatis isongevoelig routine manipulatie met standaard moleculaire genetische hulpmiddelen, zoals gerichte genvervanging, transposons en transducerende fagen, die centraal in de meeste studies in bacteriële genetica hebben, is onduidelijk welke mate individuele Chlamydia genen in het ontduiken van aangeboren immuniteit , nutriënten verwerving, ontwikkelings overgangen of andere processen van belang voor het overleven van de ziekteverwekker in een eukaryotische gastheer (4). Bijgevolg is deze ziekteverwekker blijft slecht gekarakteriseerd ondanks zijn klinisch belang.
De genomen van Chlamydia spp. zijn relatief klein (~ 1 Mb) (5) met meerdere soorten en biovars gesequenced met behulp van Next Generation sequencing technologieën. Vergelijkende genoomanalyse door WGS heeft een uniek inzicht in de evolutie van Chlamydia species en hun aanpassing aan de mens (6-8) en tot op zekere hoogte heeft enige informatie verstrekt over de mogelijke functie van virulentiefactoren (9, 10). THij genetische diversiteit weergegeven door klinische isolaten niet voorziet de resolutie die nodig is om systematisch in kaart de functie van de meeste virulentiefactoren, vermoedelijk omdat mutaties in dergelijke genen zou zijn gemakkelijk geselecteerd tegen. Zonder verstorende effecten van natuurlijke selectie, mutageen-geïnduceerde gen variant, in combinatie met gedefinieerde assays die maatregel defecten in virulentie, kan het spectrum van mutaties die kunnen worden onderzocht breiden. Chemische mutagenen, in het bijzonder, zijn nuttig als ze null, voorwaardelijke, hypomorphic (verminderde functie) te genereren en hypermorphic (gain of function) allelen. Met de komst van robuuste volgende generatie genoom-sequencing technologieën, kunnen dergelijke mutaties gemakkelijk worden geïdentificeerd en in kaart gebracht. Op deze wijze kan worden sterke associaties tussen veranderingen in een gen of genetische weg en een gemeenschappelijk fenotype, waardoor de toepassing van voorwaartse genetische methoden.
Het genoom sequenties van klinische stammen geopenbaard mosaicism bussen serovars en loci van frequente recombinatie (11). Empirisch bewijs voor recombinatie werd aangetoond door de co-infectie van twee verschillende antibiotica resistente stammen en selectie van dual resistente recombinant nageslacht, die werd geopenbaard aan genetische bijdragen van beide stammen (12, 13) hebben. Aldus genetische uitwisseling tussen wild type en mutante stammen in een co-infectie instelling maakt scheiding van chemisch-geïnduceerde mutaties op te sporen het aangetaste gen dat leidt tot de waargenomen fenotype.
Hier beschrijven we een werkwijze voor genetische analyse Chlamydia basis van chemische mutagenese, WGS en een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen (14) (fig. 1) uitvoeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chemische mutagenese
Opmerking: We vonden dat de replicatieve vorm RB ontvankelijker voor chemische mutagenese dan de EB vorm. Midden in de cyclus (tussen de 18 tot 20 hpi), RBS zijn op de grootste aantallen voorafgaand aan RB-EB overgang. Omdat Chlamydia trachomatis is een obligaat intracellulair pathogeen, kunnen de effecten van de mutagene stof op de gezondheid gastheer bacteriën herstel beperken. Vero-cellen bleken beter bestand tegen de nadelige effecten van hoge niveaus van EMS dan andere geteste cellijnen.
Scheiding van mutaties door recombinatie vereist selectie van antibioticaresistente recombinante nakomelingen. We raden gebruik van resistente bacteriestammen (bijv. rifampine, spectinomycine of trimethoprim) voor het genereren van mutanten op het vermogen om recombinant analyses uit te voeren en isogene stammen te isoleren. Antibiotica resistente stammen werden gegenereerd door een stapsgewijze selectie (15, 16).
Niete: Chlamydia trachomatis (stam L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) is BSL2 pathogeen. Raadpleeg institutionele standard operating procedures (SOP) voor de behandeling van dergelijke pathogenen.
- Bereiding van celcultuur en infectie
- Seed ongeveer 1 x 10 6 cellen Vero (ATCC CCL-81) per 25 cm 2 (T25) kolf in 3 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) gesupplementeerd met 10% foetaal bovine serum (FBS). Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. De cellen moeten een confluente monolaag vormen binnen de 24 uur.
- Aspireren medium. Infect confluente T25 flessen van Vero cellen met Chlamydia bij een multipliciteit van infectie (moi) van 5 (14 x 10 ~ 6) in een totaal volume van 3 ml medium (DMEM, 200 ng / ml cyclohexamide, 10% FBS).
- Begin mutagenese bij 18 uur na infectie (hpi):
- Bereid 20 mg / ml EMS (Ethyl methaansulfonaat) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,9 mM calciumchloride en 0,49 mM magnesiumchloride in een chemisch veiligheidsrapport kap als EMS is een vluchtige vloeistof.
Opmerking: EMS is een krachtige mutageen en carcinogeen. Neutraliseren EMS afval en ontsmetten morsen, plastic, papier en glaswerk met 1 M natriumhydroxide. - Aspireren medium en cellen een keer wassen met 3 ml PBS / MgCl2 / CaCl2. Incubeer cellen met 3 ml van 20 mg / ml EMS in PBS / MgCl2 / CaCl2 gedurende een uur in de zuurkast bij kamertemperatuur. Vero-cellen zijn in staat om deze concentratie van EMS en omstandigheden die buiten de couveuse overleven voor korte periodes. Vergeet niet om een controlemonster dat niet is gemutageniseerd bevatten.
- Verwijder medium met EMS en plaats het in een container van 1 M NaOH aan het mutageen inactiveren. Was geïnfecteerde cellen 3 keer in 3 ml PBS + MgCl 2 / CaCl2 om resterende mutageen verwijderen. Voeg 6 ml DMEM/10% FBS met 200 ng / ml cyclohexamide en 25 ug / ml gentamicine en incubeer bij 5% CO
- Extract EBS door hypotone lysis: Geheel zuigen medium. Voeg 1,0 ml H2O en Rock om cellen los gedurende 10 minuten. Lyse cellen door pipetteren en deze gedurende ten minste 10 maal. Verzamel lysaat in een microfuge en voeg 0,250 ml 5x sucrose fosfaat glutamaat buffer (SPG) om het naar 1x uiteindelijke concentratie te brengen. Bewaren bij -80 ° C.
Opmerking: Het niveau van mutagenese kan worden beoordeeld door de inductie van resistentie rifampin. Om bepaling van de frequentie van rifampicine resistentie, plaque 1 x 10 7 en 8 x 10-voudige seriële verdunningen van bacteriën in de aanwezigheid van 200 ng / ml rifampicine. De frequentie van rifampicine resistentie wordt gedefinieerd als het aantal rifampicine resistente plaques gedeeld door het totaal aantal bacteriën geplateerd. Zie hieronder voor plaque instructies. - Extract EBS door hypotone lysis: Geheel zuigen medium. Voeg 1,0 ml H2O en Rock om cellen los gedurende 10 minuten. Lyse cellen door pipetteren en deze gedurende ten minste 10 maal. Verzamel lysaat in een microfuge en voeg 0,250 ml 5x sucrose fosfaat glutamaat buffer (SPG) om het naar 1x uiteindelijke concentratie te brengen. Bewaren bij -80 ° C.
- Bereid 20 mg / ml EMS (Ethyl methaansulfonaat) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,9 mM calciumchloride en 0,49 mM magnesiumchloride in een chemisch veiligheidsrapport kap als EMS is een vluchtige vloeistof.
2. Klonale isolatie van Chlamydia trachomatis mutantstammen door Plaque Zuivering
- Set confluente monolagen van Vero-cellen in 6 well platen: Zaad ~ 0,4 x 10 6 cellen in 3 ml DMEM/10% FBS per putje. Laat cellen om een homogene monolaag de volgende 24 uur te vormen.
- Ontdooien voorraad oplossing van gemutageniseerde Chlamydia op ijs. Uitvoeren 6 x 10-voudige seriële verdunningen in een totaal volume van 200 ul per verdunning in DMEM/10% FBS en zet ze op ijs.
Opmerking: Bacteriële titer in opname vormende eenheden (IFU) is een goede schatting van plaque vormende eenheden (PFU). Doel om plaque 10, 100, en 1000 pfu. - Was de Vero-cellen tweemaal met 3 ml PBS per well.
- Voeg 3 ml DMEM aan elk putje voor platen met 6 putjes en 100 gl van de bacteriële verdunningen in duplo. Swirl de plaat om zelfs mengsel zorgen.
- Spin geïnfecteerde platen bij 2700 xg gedurende 30 min bij 15 ° C en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde,5% CO2 incubator gedurende 1-2 uur.
- Bereid 0,54% agarose in DMEM (6 putjes):
- Voeg de volgende bestanddelen: 18,9 ml koude 2 x DMEM, 4,2 ml FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0,042 ml 200 ug / ml cyclohexamide, 0,021 ml 50mg/ml gentamicine. Meng goed.
- Meng in 18,9 ml hete steriele 1,2% agarose / H 2 O, roeren om klonten te voorkomen. Mengsel moet warm aan te raken zijn. Houd in een warm waterbad bij 55 ° C voor het toevoegen aan geïnfecteerde cellen.
- Aspireren bacteriële suspensie van gerechten en toepassing 6 ml 0,54% agarose / DMEM per put. Laat agarose volledig stollen bij kamertemperatuur buiten de kap 15 minuten. Droog de platen met de deksels verwijderd, in de bioveiligheid kap gedurende 15 minuten.
Opmerking: Trillingen van de biologische inperking kap kan vervormen de stollende agarose. - Incubeer bij 37 ° C in CO2 incubator gedurende 7-10 dagen. Plaques moet zichtbaar met behulp van een dissectie microscoop. (Refer naar figuur 3 voor een typisch beeld van plaques.)
- Een dag voor het isoleren van mutanten, zaad 1 x 10 4 Vero cellen in 100 ul per putje in een 96-well plaat. Cellen zullen samenvloeiing binnen 24 uur.
- Met behulp van een dissectie microscoop, merk plaques om geplukt te worden. Verzamel stekkers van plaques met een steriele 1,0 ml barrière pipet tip.
- Resuspendeer plaques in 100 ul DMEM gesupplementeerd met 10% FBS, 400 ng / ml cyclohexamide, 50 ug / ml gentamicine.
- Om mutantstammen breiden, overlappen de schorsing op samenvloeiing monolagen van Vero-cellen. Spin platen bij 2700 xg, 15 ° C gedurende 30 minuten.
- Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 in een bevochtigde incubator. Harvest EBS bij> 50% van de cellen geïnfecteerd, wat kan optreden zo vroeg als 48 hpi en zo laat als 14 dagen. Deze hoeveelheid geïnfecteerde cellen laat voldoende levensvatbare bacteriën worden opgeslagen. Mutante stammen verschillen in groeipercentages en besmettelijkheid. Laat langzaam groeiende stammen naturally herinfecteren naburige cellen totdat er voldoende cellen worden geïnfecteerd.
- Extract EBS door hypotone lysis van geïnfecteerde cellen:
- Volledig aspireren medium.
- Voeg 160 ul van steriel water. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Verstoren cellen door en neer te pipetteren meerdere malen om volledige lysis te garanderen, gebruiken barrière tips om kruisbesmetting te voorkomen.
- Breng 160 pi van lysaten te microfugebuizen.
- Meng in 40 pi 5x SPG. Bewaren bij -80 ° C.
- Assay en scherm mutanten voor fenotype (s) van belang.
3. Hele Genome Sequencing van Selected Chlamydia Mutants
- Uittreksel genomisch DNA van gradiënt-gezuiverd EBS, die grotendeels vrij van verontreinigende gastheer-DNA. Protocollen voor grootschalige kweek van Chlamydia en zuivering van EVSA's zijn te vinden in ref. (17). Gebruik commerciële genomische DNA-zuivering kits (bijv. cat Qiagen. 69504) aan extRact DNA van 2 x 10 9 bacteriën volgens instructies van de fabrikant.
- Gebruik een fluorometer (qubit, Invitrogen cat. Q32866) om de hoeveelheid DNA nauwkeurig meten. 1,5 ug van gezuiverd DNA is vereist voor de Illumina sequencing platform.
Opmerking: meerdere platforms kunnen worden gebruikt om de sequentie bacterieel genoom, waaronder Illumina/Solexa- en Solid-systemen. We kozen ervoor om HiSeq (Illumina) gebruiken als het produceert een hoge dichtheid van de korte, maar hoge kwaliteit sequencing leest. Kleinere schaal genoom sequencers zoals IonTorrent (Life Technologies) en MySeq (Illumina) te geschikt en meer dan voldoende voor multiplexen deze quencing tot 4 Chlamydia genomen tegelijk dat de minimale dekking van 25X adequate genoom montage overschrijdt. Bereiding van DNA sequencing bibliotheken voor Illumina platform worden hieronder beschreven. - Fragment DNA op de juiste grootte (300-400 baseparen voor Illumina sequencing) met behulp van een Adaptive Gericht Akoestiek S220 instrument (Covaris) volgens de aanbevolen instellingen van de fabrikant. Opmerking: DNA-fragmentatie door verneveling leidt tot groter verlies van het monster als gevolg van aërosolvorming van het monster.
- Bereid de genome sequencing bibliotheken met behulp van commerciële bouwpakketten (Illumina FC-102-1001), volgens de instructies van de fabrikant. Bibliotheken kunnen worden geïndexeerd met behulp van barcode primers (Illumina FC-121-1003), zodanig dat meerdere monsters kunnen worden samengevoegd en tegelijkertijd gesequenced.
- Run sequencing monsters. Deze stap wordt meestal uitgevoerd door commerciële diensten of kernfaciliteiten geëxploiteerd door toegewijde technische staf. Volg hun procedures en aanbevelingen.
- Illumina leest (FASTQ format) kunnen worden samengevoegd tot een referentie genoom met gebruikersvriendelijke grafische user interface software, zoals Geneious (Biomatters), die ook kan worden gebruikt voor SNP / mutatie identificatie. Naar map mutaties, parameters tot 90% voor minimum variant frequentie en 50X voor minimale dekking. Open source genoom monteurs, zoals MAQ (18) en BWA (19), kunnen ook worden gebruikt.
- Bevestig mutaties door Sanger sequentiebepaling: Gebruik genomisch DNA als template voor PCR amplificatie van 300-500 bp flankerende sequentie geïdentificeerd mutaties en gezuiverde of verdund (1:20) PCR producten van Sanger sequentiebepaling.
4. Generatie van Chlamydia Recombinanten
Opmerking: Chlamydia ruilen DNA tijdens infectie, waardoor de productie van recombinante stammen (12, 13, 20). Na co-infectie van cellen met twee unieke antibiotica resistentie, recombinant "nageslacht" selecteren voor dubbele antibiotische weerstand (12, 13). We hebben gebruik gemaakt van dit fenomeen om mutaties te scheiden en te co-isogene stammen genereren. Daarom werden mutante stammen gegenereerd antibiotica resistente achtergrond (bijv. rifampine weerstand (R rif) H471Y in CTL0567 (rpoB)) zodat zij kunnen worden gekruist met wild type stam bearinga verschillende antibiotica-resistente allel (bijv. spectinomycineresistentie (spc R), G1197A in r01/r02 (16SRNA exemplaren nrs. 1 en 2)). Voor details met betrekking tot DNA-uitwisseling en recombinatie in Chlamydia, zie referenties (12, 13).
- Co-infecteren wild type en klonale mutante stammen door centrifuging6 x 10 5 bacteriën uit elke stam op confluente monolagen van Vero-cellen gekweekt op een 24-well plaat. Parallel infecteren monolagen met elke stam alleen.
- Op 44 hpi, oogst EBS door hypotone lysis van geïnfecteerde cellen:
- Volledig aspireren medium.
- Voeg 0,4 ml steriel water en laat gedurende 10 minuten staan.
- Lyse cellen door krachtig pipetteren up & down voor ten minste 10 keer. Transfer lysaten een microfugebuis.
- Meng 0,1 ml 5x SPG een eindconcentratie van 1 x SPG.
- Ruwe lysaten kunnen onmiddellijk worden gebruikt of bewaard bij -80 ° C.
- Plaquette 50 ul van de ruwe EB preps eend 5 x 01:10 seriële verdunningen in agarose / DMEM aangevuld met geschikte antibiotica te kiezen voor recombinanten. (Zie tabel voor de concentratie van typische antibiotica voor de selectie van recombinanten.)
- Plaque zuiveren en te verrijken recombinante stammen zoals hierboven. Score recombinanten voor aanwezigheid of afwezigheid van het gewenste fenotype. Uittreksel DNA van recombinante stammen van DNAzol behandeling (volgende sectie) voor de genotypering van de aanwezigheid of de afwezigheid van mutaties.
- Kruisen kan worden herhaald met stammen dragen andere antibioticaresistentiemarkers verder te scheiden mutaties, en het genereren van isogene stammen. Co-infecteren geselecteerde recombinanten naar een ander wild type stam met een verschillend antibioticum marker.
Tabel 1: antibiotica concentraties voor de selectie van recombinanten:
| Final Concentratie | Bereidingsinstructies |
|---|---|
| 200 ng / ml rifampicine Maak 25 mg / ml opslag stock in dimethylsulfoxide (DMSO). Make up 200 pg / ml werkoplossing door verdunning van de opslag stock met H 2 O. Bewaar bij -20 ° C in het donker. | |
| 200 ug / ml trimethoprim | Maak een 100 mg / ml voorraad in DMSO. Bewaren bij -20 ° C |
| 200 ug / ml spectinomycine | Maak een 100 mg / ml voorraad in water in 100 ul monsters. Bewaren bij -20 ° C. Vermijd herhaalde vries dooi. |
5. Extractie van Genomic DNA van recombinante stammen voor Genotyping
NB Het gebaseerde zuivering kits kunnen ook worden gebruikt. Een voordeel van DNA-extractie door DNAzol behandeling kost.
- Infect 1,2 x 10 5 chlamydiae op monolagen van Vero-cellen gekweekt op platen met 12 putjes.
- Op 36-48 hpi, zuigen medium en voeg 0,375 ml DNAzol (Invitrogen 10503-027). Schud voorzichtig de cellen en pipet de lysates in een ml microfugebuis 1.5.
- DNA precipitaat door toevoeging van 0.188 ml 100% ethanol. Meng door omkeren.
- Extract DNA door spoolen met een pipet tip en plaats het in een schone buis. Alternatief, de DNA pellet door centrifugeren bij topsnelheid gedurende 2 min bij kamertemperatuur of 4 ° C en giet supernatant.
- Wassen DNA precipitaat tweemaal met 1,0 ml 75% ethanol.
- De lucht drogen DNA na het verwijderen van de ethanol gedurende 15 sec.
- Oplosbaar DNA met 0,2 ml 8 mM NaOH vervolgens neutraliseren tot pH 8,0 met 20,2 gl 0,1 M HEPES. Brengen tot een uiteindelijk volume van met water of TE 0,5 ml. Als alternatief, resuspendeer DNA in TE-buffer (DNA pellet wordt niet volledig opgelost.).
- Gebruik DNAzol geëxtraheerd DNA als template voor PCR amplificatie van 300-500 bp flankerende geïdentificeerde mutaties. Sequence gezuiverd of verdund (1:20) PCR-producten door Sanger sequencing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blootstelling aan mutageen tot insluitsels die zonder bacteriën, waarschijnlijk als gevolg van bacteriële celdood verschijnen. Kenmerkend zal serovar LGV-L2 volledig lyseren geïnfecteerde cellen binnen 48 uur na infectie, maar behandeling met mutagene kan deze cyclus uitbreiden tot> 90 h. Ongeveer 10% van de insluitingen verwachting herstellen. In onze experimenten geïnfecteerde Vero cellen behandeld met 20 mg / ml EMS tot een afname 99% in de terugwinning van infectueuze nageslacht vergeleken met onbehandelde controles. Mutageen behandeling ook geleid tot het ontstaan van plaques met veranderde morfologie, met inbegrip van kleine plaques (VPI) (figuur 3). Andere morfologie zijn plaques die korrelige, klonterig, of honingraat gevormde (figuur 3) verschijnen. Deze fenotypes kunnen defecten in processen die nodig zijn voor infectie en overleving binnen de nieuwe omgeving weerspiegelen. Mutanten met kleine plaque (VPI) morfologie produceren in het algemeen beduidend minder infectieus nageslacht en kan tot 2-3 weken naar eenmplify. Voorzichtigheid moet worden betracht bij passage deze stammen als reversions en suppressor mutaties kunnen ophopen bij een hoge frequentie.
De doses van EMS gebruikt in deze studies kan leiden tot tussen 3-30 mutaties per genoom Chlamydia, zoals experimenteel vastgesteld door WGS (figuur 4). Hoewel gradiënt gezuiverde EBs zijn grotendeels vrij van gastheercel materiaal, is gastheer-DNA ook gedetecteerd en bestaat ongeveer 10-15% van genomische preps.
Co-infectie van twee stammen kunnen nakomelingen met genetische bijdragen genereren uit beide stammen en komt bij een frequentie van 10 tot 10 -4 -3 ongeveer 10 4 keer zoveel als spontane weerstand (13). Recombinatie breekpunten zich meestal tussen ~ 100 kb tot 800 kb (12). Een analyse van dergelijke recombinante stammen kunnen mutaties die genetisch gekoppeld zijn aan het fenotype onderzochte onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode voldoet aan de basiseisen voor genetische analyse als het vaststelt koppeling tussen genotypes en fenotypes. Belangrijk is dat deze wordt gerealiseerd zonder de hulp van conventionele moleculaire hulpmiddelen voor recombinant DNA transformatie en insertie inactivatie van genen in bacteriën, die vaak een snelheidsbeperkende stap in de analyse van genfunctie in non-model microben.
Een cruciale stap is om klonaliteit van plaque-gezuiverde mutanten te garanderen. Kruisbesmetting met wild-type of "fitter" mutanten kan snel leiden tot mutante stammen worden weggeconcurreerd. Op dezelfde manier kan in kaart brengen van mutaties door whole genome sequencing van niet-klonale samples leiden tot dubbelzinnige resultaten. Isoleren van mutanten van zwaar plaqued putten of inpluggen plaques die te dicht op elkaar moeten worden vermeden. Bovendien, voor langzaam groeiende mutanten kunnen teruggekeerde ontstaan bij relatief hoge frequenties. Wij raden behoud originele of lage passage voorraden. Replaque mutanten als kruisbesmetting of revertanten worden verdacht.
De concentratie van EMS verlaagd kan worden om de frequentie van mutaties verminderen. De mutaties, zoals beoordeeld door het genereren van rifampicine resistente varianten (door mutaties in het gen coderend RNA polymerase punt, rpoB) optimaal was in onze handen bij 20 mg / ml EMS. De inductie van rifampicine resistentie kan worden vastgesteld door de frequentie van de gevormde plaques in aanwezigheid van rifampicine en moeten correleren met de frequentie van chemisch geïnduceerde mutaties.
EMS kan worden vervangen door andere mutagenen het spectrum van mutaties die kunnen worden verkregen verbreden. Zo kan DNA intercalerende middelen zoals psoraleen en zijn derivaten worden gebruikt om deleties en inserties (21) induceren.
Mutaties die kaart dicht bij elkaar in het genoom (<100 kb elkaar) zijn moeilijk te ontkoppelen door recombinatie. Bij hoge mutagenese tarieven zijn achieved, kan het moeilijk zijn om een oorzakelijke mutatie ondubbelzinnig te identificeren. Aangezien transformatie van C. trachomatis is nu mogelijk met shuttle plasmiden (22), hoewel inefficiënt, kan het mogelijk zijn deze problemen aangepakt door koppeling aanvulling mutaties in trans met een wildtype kopie van het gemuteerde gen op een plasmide.
Figuur 1. Strategie voor voorwaartse genetische analyse en recombinatie-based mapping in Chlamydia. Rifampin resistent (Rif R) C. trachomatis werd gemutageniseerd tijdens de replicatieve fase en gebruikt om Vero cel monolagen infecteren tot zichtbare plaques gevormd. Individuele klonen van mutanten werden verzameld en getest op specifieke fenotypes, zoals veranderde plaque morphotypes. De genomen van mutanten met een gemeenschappelijk fenotype werden gesequenced om identify gemeenschappelijke genetische laesies. Om koppeling tussen deze genen laesies en specifieke plaque morfologie te stellen, Vero-cellen werden geïnfecteerd zijn met mutanten gegenereerd in Arif R achtergrond en wild-type Spc R Chlamydia stammen, en recombinante Rif R Spc R stammen behoren tot de resulterende besmettelijke nageslacht werden geselecteerd in de aanwezigheid van rifampicine en spectinomycine ("kruisen"). De scheiding van de individuele mutaties in de ouderlijke Rif R mutant van de recombinante bacteriën tonen gewijzigde plaque morfologie bepaald target DNA sequencing. (Overgenomen met toestemming van PNAS (14)) Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Schematische weergave van EMS mutagenese protocol. Chlamydia trachomatis LGV-L2-geïnfecteerde cellen werden blootgesteld aan EMS tijdens de RB stadium van de infectieuze cyclus, en de infectie liet men gedurende 72 uur om de vorming van infectieuze elementaire lichamen (EB) . Gemutageniseerde EB pools werden geoogst en getitreerd voor opname eenheden (IFU) en plaque-vormende eenheden op Vero-cellen. N, nucleus. (Overgenomen met toestemming van PNAS (14)) Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Voorbeelden van veelgebruikte plaque morfologie bij EMS-gemuteerde C. trachomatis. Gemutageniseerde C. trachomatis LGV-L2 toegestaan om plaques te vormen op Vero cel monolaags voor 14 dagen. Plaques variëren in grootte (A) en morfologie (B), die kunnen worden geïsoleerd, geamplificeerd in Vero cellen, en gebruikt herbesmetting van Vero monolagen de stabiliteit van de plaque morphotypes bevestigen. Voorbeelden van veelgebruikte fenotypes worden getoond waaronder honingraat (HCM), samengeklonterd (CLMP), kleine plaque (VPI) en granulaire (Grn). Pijlen geven grote granulaire deposito's binnen een Grn plaquette. (Overgenomen met toestemming van PNAS (14)) Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. Identificatie van EMS-geïnduceerde laesies gen. Chromosomale locatie van nucleotidevarianten in mutanten die de Grn plaque morfotype geven. Hele genoom sequencen van drie Grn mutanten geïdentificeerde mutaties die leiden tot aminozuurveranderingen in glgB, codeert voor een glycogeen vertakkende enzym. (Overgenomen met toestemming van PNAS (14)) Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er is niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
- Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
- Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
- Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
- Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
- Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
- Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
- Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
- Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
- DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
- Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
- Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
- Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
- Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
- Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
- Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).
