Summary
Mange terapeutiske applikationer kræver sikker og effektiv transport af narkotika luftfartsselskaber og deres last over cellulære barrierer i kroppen. Denne artikel beskriver en tilpasning af etablerede metoder til at vurdere hastigheden og mekanismen for transport af narkotika nanocarriers (NCS) over cellulære barrierer, såsom den gastrointestinale (GI) epitel.
Abstract
Sub-mikrometer luftfartsselskaber (nanocarriers; NCS) øge effektiviteten af lægemidler ved at forbedre opløselighed, stabilitet, cirkulation tid, målretning og frigivelse. Derudover gennemkører cellulære barrierer i kroppen er afgørende for både oral levering af terapeutiske NCs i omsætning og transport fra blodet ind i væv, hvor der er behov intervention. NC transport over cellulære barrierer opnås ved: (i) den paracellulære rute via forbigående afbrydelse af vejkryds, der griber ind i hinanden tilstødende celler, eller (ii) transcellulær vej, hvor materialer internaliseres ved endocytose, transporteres på tværs af cellen kroppen og udskilles på den modsatte celleoverfladen (transyctosis). Levering over cellulære barrierer kan lettes ved at koble lægemidler eller deres luftfartsselskaber med målretning agenter, der binder specifikt til celle-overflade markører er involveret i transport. Her giver vi metoder til at måle omfanget og mekanisme NC transport på tværs af en model cellebarriere, whilm består af et monolag af gastrointestinal (GI) epitelceller dyrket på en porøs membran placeret i en transwell insert. Dannelse af en permeabilitetsbarriere bekræftes ved at måle transepithelial elektrisk modstand (TEER) transepithelial transport af et kontrolstof og immunfarvning af tight junctions. Som et eksempel er ~ 200 nm polymer NCs anvendes som bærer et terapeutisk gods og er belagt med et antistof, der er rettet mod en celleoverflade-determinanten. Antistoffet eller terapeutisk last er mærket med 125I til radioisotop sporing og mærkede NCs tilsættes til det øvre kammer over cellemonolaget i kortere perioder. NCs forbundet med cellerne og / eller transporteres til det underliggende kammer kan påvises. Måling af fri 125I tillader fratrækning af nedbrudte fraktion. Den paracellulære rute vurderes ved at bestemme potentielle ændringer forårsaget af NC transport barriereegenskaber ovenfor beskrevne parametre. Transcellulære transport is bestemmes ved at tage effekten af modulerende endocytose og transcytose veje.
Introduction
Cellular barrierer i kroppen fungerer som en gateway mellem det ydre miljø og indvendige rum. Dette er tilfældet for epitelforingen adskille eksternt eksponerede overflade af den gastrointestinale (GI)-kanalen og blodstrømmen 1-3. Cellulære barrierer også repræsenterer grænsefladen mellem blodbanen og parenkym og cellulære komponenter af væv og organer. Dette er tilfældet for den indre endotelhinden i blodkarrene, såsom blod-lunge barrieren blod-hjerne-barrieren, etc. 1. Evnen til at krydse disse cellulære barrierer i kroppen er afgørende for effektiv levering af terapeutiske og diagnostiske midler i omsætning og væv / organer, hvor der er behov for indgreb.
For at forbedre levering af terapeutiske eller diagnostiske midler, kan disse forbindelser lægges ind i sub-mikrometer nanocarriers (NCS). Disse drug delivery køretøjer kan formuleres med en rækkekemi og strukturer for at optimere lægemiddelopløselighed, beskyttelse, farmakokinetik, frigivelse, og stofskifte 4,5. NCs kan også funktionaliserede med affinitet eller targetingdele (fx antistoffer, peptider sukkerarter, aptamerer osv.) for at lette vedhæftning til områder af kroppen, hvor den terapeutiske virkning kræves 2,6. Målretning af NCs til determinanter udtrykt på overfladen af cellulære barrierer kan yderligere lette transport ind og / eller på tværs af disse foringer 2,6.
Den rolle, som selektivt at transportere stoffer mellem to miljøer kræver, at visse unikke funktioner blandt cellelag. En sådan funktion er cellepolaritet hvorved den apikale membran vender mod lumen af hulrum varierer fra den basolaterale membran orienteret mod vævet interstitium med hensyn til membran morfologi og sammensætning af lipider, transportører, og receptorer 2. En anden funktion indebærer intercellulære Junctions forbinder tilstødende celler. Regulering af de proteiner, der danner stramme vejkryds, især Junctional adhæsionsmolekyler (marmelade), occludins og claudins, modulere barriere funktion til selektivt at tillade eller ikke transport af stoffer mellem celler, kendt som paracellulær transport, tillader passage af materialer fra lumen til den basolaterale rum 3. Binding af mange naturlige og syntetiske elementer (leukocytter, molekyler, partikler og drug delivery systemer) til cellulære barrierer i kroppen kan fremkalde celle-kryds åbning, som kan være forbigående og relativt uskadelige eller mere langvarig, og derfor usikre med adgang uønskede stoffer på tværs af barrieren 2,5,7-9. Følgelig kan denne vej bedømmes ved måling af transepithelial elektrisk modstand (TEER) og passiv paracellulær diffusion af molekyler (heri kaldet paracellulær lækage), nedsat, hvorved modstandsdygtighed over for en elektrisk strøm eller forøget paracellulær lækage af en inert forbindelse i basolaterale rum indikerer åbning af celle vejkryds henholdsvis 5,10,11. For at supplere disse metoder, kan enhver af de stramme krydset proteiner nævnt ovenfor farves for at vurdere deres integritet, hvor farvningen skal vises koncentreret ved celle-celle grænser hele cellen periferien 5,10,12.
Alternativt kan drug delivery systemer, der er rettet mod specifikke celleoverflade-determinanter, såsom dem forbundet med clathrin-overtrukne gruber eller kolbe-formet membran invaginationer kaldet caveolae, udløse vesikulær optagelse i celler ved endocytose, som giver en mulighed for drug delivery til intracellulære rum 5, 13.. Desuden kan endocytose føre til menneskehandel af vesikler i hele cellen kroppen til overgang på den basolaterale side, et fænomen kendt som transyctosis eller transcellulær transport 14. Derfor kan viden om kinetik og mekanisme af endocytose skal bruges til at udnytte intracellulære etnd transcellulær drug delivery, hvilket giver en relativ sikker og kontrolleret leveringsmåde forhold til den paracellulære rute. Mekanismen endocytose kan evalueres med modulatorer af klassiske veje (clathrin-og caveolin endocytose og macropinocytosis) eller ikke-klassiske ruter (såsom tilfælde af celleadhæsionsmolekyle (CAM) endocytose) 5,13,15 .
Der henviser til intracellulær transport ofte undersøgt i standard brønde eller dækglas, fraværet af en basolaterale rum hinder cellepolarisering og evnen til at studere transport tværs cellelag. For at overvinde denne hindring, har transport på tværs cellemonolagene været længe undersøgt ved hjælp transwell indsætter 10,11,16,17, som består af en øvre (apikale) kammer, en porøs membran, hvor cellerne vedhæfte og danne en tæt monolag, og en lavere (basolaterale) kammer (figur 1). I denne konfiguration kan måles transport iapikale-til-basolateral retning ved indgivelse af en behandling i det øvre kammer efter transporten gennem cellemonolaget, og den underliggende porøse membran, og endelig opkrævning af mediet i det nedre kammer til kvantificering af transporteret materiale. Transport i den basolaterale-til-apikal retning kan også måles ved første indgivelse til det nederste kammer og efterfølgende indsamling fra det øvre kammer 5,10,12,16. Forskellige teknikker findes for at kontrollere dannelsen af permeabilitetsbarriere på Transwells, herunder TEER og paracellulære transport assays, som beskrevet ovenfor. Desuden kan det permeable filter på hvilke celler dyrkes fjernes til billeddannelse analyse (fx ved fluorescens, konfokal, elektronmikroskopi) som yderligere validering af cellemonolaget model samt mekanismen for transport. Udvælgelse af membran-type, som er tilgængelig i forskellige porestørrelser, materialer og overfladearealer afhænger af forskellige factors såsom størrelsen af stoffer eller genstande, der skal transporteres, celletype, og billedbehandling metode 16,18-20. Transwell skær også lette kontrolleret og præcis kvantificering af transport i forhold til komplekse pattedyr systemer, som mængderne af kamre og celle areal er kendte konstanter. Mens mange faktorer involveret i in vivo levering elimineres, herunder forekomst af tarm slim, shear stress, fordøjelsesenzymer, immunceller, etc., denne lille skala in vitro-model giver nyttige foreløbige oplysninger vedrørende transport.
Som et eksempel for at illustrere tilpasning af disse metoder til at studere NC transport over cellulære barrierer 10,11,16,17, vi beskriver her en sag, hvor potentialet for NC-transport på tværs af GI epitel blev modelleret ved at vurdere passage af en model drug delivery systemet gennem et monolag af humane epitelial kolorektal adenocarcinom (Caco-2-celler). Til dette formål calen blev dyrket i Transwell skær, på en 0,8 um porestørrelse polyethylenterephthalat (PET) filter (6,4 mm i diameter), der er transparent og kan anvendes til mikroskopi billeddannelse. Status for permeabilitetsbarrieren valideres ved måling TEER, apikal-til-basolaterale transport af et kontrolstof, albumin og fluorescens mikroskopi visualisering af et element af den stramme vejkryds, occludin protein. En model af målrettet polymer NC er brugt, der består af 100 nm, ikke-bionedbrydelige polystyren nanopartikler. NCs coates ved overfladeadsorption med en målsøgende antistof alene eller en kombination af en målsøgende antistof og en terapeutisk last, hvor hver komponent kan være mærket med 125I til radioisotop sporing. I det valgte eksempel antistoffet genkender intercellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1), et protein, der udtrykkes på overfladen af GI epitel (og andre celler), som har vist sig at lette intracellulær og transcellulær transport o f narkotika luftfartsselskaber og deres last 21. Lasten er alfa-galactosidase (α-Gal), et terapeutisk enzym, der anvendes til behandling af Fabrys sygdom, en genetisk lysosomal aflejringssygdom 22.
De coatede NCS omkring 200 nm i størrelse, tilsættes til det apikale kammer over cellemonolaget og inkuberet ved 37 ° C i varierende tidsrum, hvorefter 125 I på NCs kan detekteres associeret cellemonolaget, og / eller transporteres til den basolaterale kammeret under cellerne. Yderligere bestemmelse af frit 125I tillader subtraktion af den forringede fraktion og estimering af belagt NC transport. Mekanismen for transport vurderes endvidere ved at undersøge ændringer i permeabilitetsbarrieren vedrørende den paracellulære rute gennem de ovenfor beskrevne parametre, mens transcellulær transport bestemmes ved at undersøge ændringer i transport, når modulerende veje endocytose og transcytose.
NDHOLDET "> Disse metoder giver værdifulde oplysninger om cellulær barriere modeller, omfanget og hastigheden af transport af et drug delivery system, og mekanismen for en sådan transport, helt muliggør vurdering af potentialet for drug delivery over cellulære barrierer.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Dyrkning af en celle monolag i Transwell Inserts
- I en steril, biosikkerhed niveau 2 cellekultur hætte, anbringe 0,8 mm pore PET Transwell indstik i en plade med 24 brønde (4 brønde pr betingelse, for statistisk signifikans) med pincet. Alle materialer, der kommer ind i hætten skal steriliseres med ethanol.
Bemærk: Porestørrelsen af filteret skal vælges i overensstemmelse med den gennemsnitlige størrelse af NC anvendes til at tillade transport over membranen. Også for statistisk signifikante resultater, hver eksperimentel betingelse kræver et minimum af fire gentagelser (brønde) i det samme forsøg, og et minimum af tre uafhængige eksperimenter.
- Forbered cellekulturmedium indeholdende DMEM-medium suppleret med 4,5 g / l glucose, 15% føtalt bovint serum og 1% Pen Strep, og opvarm til 37 ° C i et vandbad.
- Human epithelial kolorektal adenocarcinom fortyndes (Caco-2)-celler i celle-medium og sted200-400 pi af cellen opløsningen i den øverste (apikale) kammer i transwell indsatsen ved en densitet på 1,5 x 10 5 celler / cm2. Fyld lavere (basolaterale) kammer med 700-900 pi cellemedium.
- Kultur-celler ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fugtighed i 16-21 dage, erstatte mediet i den øvre og nedre kammer hver 3-4 dage, ved hjælp af de angivne i trin 1.3 mængder. Udskift mediet i følgende rækkefølge for at opretholde trykket over (snarere end nedenfor) cellemonolaget: aspireres mediet fra det nedre kammer, aspireres mediet fra det øvre kammer, fyldes det øvre kammer med frisk medium, og fylde det nedre kammer med frisk medium.
2. Validering af GI Epithelial permeabilitetsbarriere Brug transepithelial elektrisk modstand (TEER) og Immunfarvning af stramme vejkryds
- For kortvarig opbevaring (mindre end 2 uger), nedsænkes STX100 elektroder i en elektrolyt løsningning (0,1-0,15 M KCl eller NaCl). Slut elektrodekablet til elektroden porten på EVOM volt-ohm meter, så er systemet internt kortsluttes og elektrode symmetri opretholdes. For langtidsopbevaring, skyl med dH2O og opbevares i et tørt, mørkt tilstand.
- At sterilisere elektroderne nedsænkes i ethanol i 15 min, og lad det lufttørre i 15 sek. Alternativt kan elektroderne blive opbevaret i en UV-hætte. Skyl elektroderne i en steril elektrolyt-opløsning (phosphatpuffersaltopløsning, PBS) eller 0,1-0,15 M KCl eller NaCl-opløsning, før hver modstand måling.
- Med volt-ohm meter indstillet til modstand indstillingen vertikalt placere elektroderne i en brønd indeholdende transwell indsatsen, med den korte elektrode i det øvre kammer og den lange elektrode i det nedre kammer rører bunden af brønden. Når EVOM læsning stabiliserer, registrerer modstanden værdi (givet i ohm; Ω) for hver brønd.
- Beregn resistivitet (resistance normaliseret til område Ω × cm 2) af prøver ved at fratrække baggrunden resistens (TEER af Transwell indsatse uden celler) og multiplicere med membran areal. Resistivitetsværdier oftest rapporteret i litteraturen. (Se diskussionen)
- Gentag målinger hver 1-2 dage, indtil TEER værdier stiger til et maksimum og plateau, hvilket indikerer dannelsen af en permeabilitetsbarriere, hvilket typisk tager 2-3 uger fra det øjeblik celle flettede. Plateau TEER værdier og nødvendige tid til at opnå barriere integritet kan variere efter celle passage nummer.
- For at verificere tilstedeværelsen af tight junctions i cellemonolag med høj TEER (lig med eller over tærskelværdien for barriere dannelse), fix celler ved inkubering med kold 2% paraformaldehyd i 15 min. Derefter vaskes cellerne med PBS og inkubere dem i 30 minutter ved stuetemperatur med 1 ug / ml anti-occludin. Vask cellerne igen med PBS og inkubere dem i 30 minutter ved stuetemperatur med 7,5 ug / ml fluorescently-mærkede sekundære antistoffer. Brug brønde med lav TEER som en negativ kontrol for barriere formation.
Bemærk: Som erstatning for anti-occludin kan antistoffer til alternative tight junction proteiner anvendes.
- Punktafgifter forsigtigt filtermembranen hvor den faste monolag er fastgjort, og montere på dias for billedbehandling ved hjælp epifluorescens eller konfokal mikroskopi.
3. Evaluering transepithelial Transport af målrettede Carriers
- Mærk rettet antistof (muse-monoklonalt antistof mod ICAM-1, anti-ICAM, i dette eksempel) med 125I, som tidligere beskrevet 7. Brug Bradford-assay til at estimere proteinkoncentration og en gammatæller for at bestemme 125I indhold på antistoffet, og derefter beregne den specifikke aktivitet i tællinger per minut (CPM) / mg af mærket antistof.
Bemærk: For at kontrollere for specificitet, retørv proceduren ved mærkning mus IgG, som vil blive brugt til at udarbejde ikke-målrettede coatede NCs. At studere transport af et terapeutisk last, gentages proceduren mærkning lasten, fx alfa-galactosidase (α-Gal), i dette eksempel. Alternativt kan anvendes til targeting middel, ikke-specifik kontrol eller terapeutisk last. Alternative fremgangsmåder kan også anvendes til mærkning af forbindelser, og estimere koncentrationen af de mærkede modstykker.
- Par det mærkede målrettet antistof (anti-ICAM i vores eksempel) til overfladen NCS. I dette eksempel inkuberes polystyren nanobeads (100 nm diameter) i 1 time ved stuetemperatur med 125I-anti-ICAM at tillade overfladeadsorption som beskrevet 7.
Bemærk: For de ikke-specifikke kontrol bruge 125I-IgG. At spore transport af en ladning, skal du bruge en kombination af at målrette antistof og 125I-mærket fragt (α-Gal i vores eksempel).
- Centrifuger ved 13.000 x g i 3 minutter, og fjern ikke-overtrukne modstykker i supernatanten ved aspiration. Resuspender pellet indeholdende overtrukne NCs anvendelse af 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS ved pipettering, og sonikeres ved lav effekt at forstyrre potentielle partikelaggregater (20-30 korte pulser).
- For NC karakterisering, måle størrelse, polydispersiteten, og ζ-potentialet af coatede partikler ved hjælp af dynamisk lysspredning (efter leverandør instruktioner), og kvantificere antallet af 125I-mærket målretning antistofmolekyler (fx anti-ICAM) på partikel overfladen ved hjælp af en gammatæller.
Bemærk: Disse fremgangsmåder kan gentages for ikke-specifikke og terapeutiske modstykker. Størrelsen af coatede partikler svinger omkring 200 nm.
- Tilføj 125 I-antistof NCS (fx 125I-anti-ICAM NCS, 56 nCi / ml) til det øvre kammer over sammenflydende Caco-2-monolag med TEER &# 8805; 350 Ω × cm 2 (se Diskussion) i løbet af baggrunden (16-21 dage efter såning). Der inkuberes ved 37 ° C i en eller flere ønskede tidsintervaller. Mål TEER (afsnit 2.3) før og efter inkubation for at vurdere virkningerne af NCs på permeabilitetsbarrieren.
Bemærk: Denne procedure kan gentages for ikke-specifikke og terapeutiske modstykker.
- Saml medium fra de øvre og nedre kamre og vaske dem en gang med 0,5 ml DMEM ved 37 ° C (øvre kammer) eller 1 ml dH2O (nedre kammer). Saml de vasker til måling af total radioisotop indhold ved hjælp af en gamma-tæller.
- Til måling af fraktionen cellen, udskære permeable filter, fx ved hjælp af et barberblad til at skære rundt om kanterne, og inkuberes i en gammatæller rør med 1% Triton X-100 i 10 minutter (for at frigive celleindhold), før målecelle -associeret totale radioaktivitet.
- For at måle 125I releaset fra NCs under transport eller på grund af potentiel nedbrydning, første mix 300 pi prøve (fra de øverste, nederste eller cellefraktioner) med 700 pi 3% BSA i PBS og 200 ul trichloreddikesyre (TCA). Inkuber ved stuetemperatur i 15 min. Imens dette tidspunkt, måle den totale radioaktivitet af denne prøve i en gammatæller.
- Centrifuge TCA prøver ved 3.000 x g i 5 minutter for at separere intakt protein (pellet) fra det forringede protein eller 125I fraktion (supernatant). Kvantificere radioaktiviteten af det frie 125I fraktion og trække denne værdi fra den totale radioaktivitet målt før centrifugering. Dette vil give mængden af mærket protein, som ikke er nedbrudt.
4.. Mekanisme af transepithelial Transport af målrettede Nanocarriers
- Label albumin med 125I som beskrevet i afsnit 3.1 og tidligere rapporteret 7.
Bemærk: Albumin er en 66,5kDa-proteinet og dermed en relativt stor stof. Selv om en gyldig kontrol for passiv transport af større genstande (f.eks 200 nm NCs bruges her), skal det erstattes med mindre inaktive tracer molekyler, når studerer transport af mindre narkotika luftfartsselskaber (se Diskussion).
- For at vurdere paracellulær transport ved hjælp albumin paracellulær lækage, kultur Caco-2-monolag på Transwell inserts, som beskrevet ovenfor.
- Til det øvre kammer mediet over cellemonolaget, tilsættes enten 125I-albumin alene (negativ kontrol viser basisniveauet for lækage) eller 125I-albumin og ikke-radioaktivt mærkede antistof-målrettede NCs (som beskrevet i afsnit 3.5). Der inkuberes ved 37 ° C for det valgte tidsinterval (r), som skal matche de undersøgte ved afprøvning NC transport. Mål TEER (afsnit 2.3), før, under og efter inkubation, derefter indsamle alle fraktioner for total 125I og frie 125 I målinger som angiveti afsnit 3 Bemærk:. Samtidig tilsætning af 125 I-albumin og ikke-radioaktivt mærkede kontrol IgG NCs kan anvendes som en kontrol.
- Som en positiv kontrol for åbning af intercellulære junctions, tilsættes cellemedier indeholdende 5 mM H 2 O 2 til de øvre og nedre kamre i transwell indsatsen, og der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Derefter måle TEER (afsnit 2.3), og der tilsættes 125I-albumin til det øvre kammer for de valgte tidsintervaller. Mål TEER på forskellige tidspunkter i løbet af inkubationen at identificere TEER værdi henfald forårsaget af H 2 O 2-induceret åbningen af cellens knudepunkter.
- I parallelle eksperimenter, evaluere transcellulær transport, også kaldet transcytose af 125 I-målrettede NCs efter inkubering sammenflydende Caco-2-monolag med enten 50 uM monodansylcadaverin (MDC, inhibitor af clathrin endocytose), 1 ug / ml filipin (hæmmer af caveolar endocytose), 0,5 uM Wortmanni (inhibitor af phosphatidylinositol 3-kinase [PI3K] involveret i macropinocytosis) eller 20 pM [5 - (N-ethyl-N-isopropyl) amilorid] (EIPA, inhibitor af macropinocytosis og CAM-medieret endocytose 15).
Bemærk: 125I-IgG NCs og 125I-albumin kan anvendes som negative kontroller for effekten af disse inhibitorer, og andre metoder (f.eks siRNA teknikker) kan give mere selektiv hæmning.
- Mål TEER (afsnit 2.3), før, under og efter inkubation af celler med hæmmere og radioaktivt mærkede materialer, som en yderligere kontrol for effekten af inhibitorer på monolag permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som validering af vores celle model til at studere transepitelial transport af målrettede NCS Figur 2 viser, at Caco-2 cellemonolag udpladet ved en tæthed på 1,5 x 10 5 celler / cm2 opnås sammenflydning ~ Dag 12 og vedligeholdes monolag integritet op til dag 18, indikeret ved TEER (figur 2A). Dette blev bekræftet af tilstedeværelsen af occludin-positive stramme vejkryds (figur 2B) i monolag med høj TEER (390 Ω × cm 2, dag 14) sammenlignet med dårlig tight junction mærkning ved lav TEER (17 Ω × cm 2, Dag 5 ).
Sporing af det radioaktive mærke på NC elementer bestemmer den samlede mængde af disse komponenter (NC målretning antistof eller fragt) oprindelig tilføjet til apikale kammer, deres celle brøkdel forbundet, og deres fraktion transporteres til den basolaterale side. Disse værdier kan bruges til at beregne forskellige parametre, der beskriver NC transport i etmere relevant måde, især efter subtraktion af fri 125I indholdet af hver fraktion, som repræsenterer nedbrudte modstykker. For eksempel er antallet af antistofmolekyler, lastmolekyler eller associerede NCs der er tværgående kan beregnes cellemonolaget at estimere absolut transport. Også den procentdel af molekylerne og NCS, der transporteres til den basolaterale side i forhold til det samlede antal af molekyler og NCS associeret cellemonolaget vurderer effektiviteten af nævnte transport. Endelig den tilsyneladende permeabilitetskoefficient (P app), en standard parameter for hastigheden af transport, kan estimeres. Disse parametre er beregnet som det følger:
Molekyler transporteres eller NCs transporteret = CPM basolateral × (Molekyler tilføjet eller NC tilføjede / CPM tilføjet)
% molekyler eller NCs transporterede = 100 x [CPM basolateral / (CPM basolateral + CPMcellefraktion)]
P app (cm / s) = (CPM basolaterale × bd.) / (A × t × CPM tilsat)
hvor CPM er 125I tællinger-per-minut tilsat til det øvre kammer (CPM tilsat), cellemonolaget fraktion (CPMcell fraktion) eller det nedre kammer (CPM basolaterale) og NC tilføjet eller Molekyler tilsættes, er antallet NCS eller molekyler indledningsvis tilsættes til det øverste kammer, A er overfladearealet af filtermembranen (cm 2), bd. er mediets volumen i det øvre kammer (ml), og t er inkubationstiden (r).
I vores eksempel, når den radioaktive isotop mærkning af målrettet antistof denne analyse afslører graden og effektiviteten af transport i form af antistoffer eller NCs transporteret per celle og procentdelen af cellemonolag-associerede antistoffer eller NCs der blev transporteret (figur 3A og 3B ), som vill som satsen for transport i form af P-app (figur 3D). Disse parametre, der anslås i vores eksempel for 125 I-anti-ICAM-NCS blev også sammenlignet med dem i kontrol 125I-IgG NCs at påvise transporteffektivitet i forhold til en ikke-målrettet modpart (figur 3C og 3D).
Når det radioaktive etiket er indarbejdet på NC fragt, de beskrevne parametre afspejler transport af lasten, som i vores eksempel var α-Gal enzym, der anvendes til behandling af en genetisk lysosomale lidelse kendt som Fabry sygdom (tabel 1). Udover at beregne NC transport ved at spore sagde last, transepithelial levering af denne terapeutiske enzym kan estimeres, fx ved at udtrykke det som molekyler eller masse af α-Gal transporteret per celle.
Endelig er denne metode tilskriver transport vej til paracellulære rute eller dentranscellulær vej. For eksempel, i vores eksempel, EIPA reducerede transport af 125 I-anti-ICAM NCs tværs Caco-2-cellemonolag (figur 4A), mens MDC filipin og wortmannin ikke reducerer transport niveauer med hensyn til kontrol tilstand (ingen inhibitor ). Dette tyder på, at anti-ICAM NCs udnytte CAM endocytose for transcellulære transport, men ikke clathrin-, caveolar-eller macropinocytosis-relaterede transcytose. Desuden blev paracellulær transport udelukket ved hjælp af målinger af TEER (figur 4B) og en albumin passiv transport (figur 4C), hvorved et fald i TEER og en stigning i albumin paracellulær lækage i det nedre kammer under transport af anti-ICAM-NCs ville have angivet afbrydelse af intercellulære junctions. Men inkubation med anti-ICAM NCs ikke ændre TEER eller 125I-albumin paracellulær lækage over en periode på 48 timer, svarende til at styre IgG NCs, der ikke transporteres. Somen positiv kontrol for åbning af celle kryds og paracellulære transport, H 2 O 2 faldt TEER til basale niveauer og øget markant 125I-albumin lækage til den basolaterale kammer.
Figur 1. Skematisk af transepithelial transport af målrettede nanocarriers tværs af en mave epitelial model. (A) som en platform til at studere transepithelial transport, Caco-2-cellemonolag dyrkes på Transwell indsætter indtil en stram monolag dannes (16-21 dage efter såning, TEER ≥ 350 Ω × cm 2 over baggrunden). Et eksempel på en drug delivery køretøj såsom 125I-anti-ICAM-NCS sættes til den øverste (apikale) kammeret over cellemonolaget at undersøge transporten i celler og gennem den underliggende porøse membran.Mediet i den nederste (basolaterale) kammer opsamles derefter til kvantificering af transporterede materiale. (B) Transport gennem cellemonolaget sker enten via et paracellulære eller transcellulære / transcytose rute. Gengivet fra Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klik her for at se større figur
Figur 2. Caco-2-monolag som en model for transepitelial transport. Caco-2-celler blev dyrket på Transwell skær på 1,5 x 10 5 celler / cm2. (A) transepithelial elektrisk modstand (TEER) blev målt for at vurdere monolag integritet. Data er vist som middelværdi ± SEM, n = 3. (B) Fluorescens mikroskopi af stramme vejkryds immunolabeled med anti-occludin og Texas Red-mærket sekundært antistof, på dag 5 eller 14 (lavtillids TEER værdier, henholdsvis). Gengivet fra Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klik her for at se større figur
Figur 3. Transport af anti-ICAM nanocarriers over Caco-2 cellemonolag. Sammenflydende Caco-2-monolag dyrket på Transwell inserter blev inkuberet med 125I-anti-ICAM NCs eller 125I-IgG NCs tilføjet til det apikale kammer. (AC) 125I-indhold i den basolaterale kammer blev målt ved de angivne tidspunkter at beregne NCS transported per celle (se Repræsentative resultater). (B) Procent af transporterede NCs blev beregnet som forholdet mellem luftfartsselskaber, der findes i den basolaterale fraktion til, at der i de kombinerede basolaterale og cellefraktioner. (D) Tilsyneladende permeabilitet koefficienter (P app) blev beregnet som beskrevet i Repræsentative resultater, hvilket afspejler satserne for transport af 125I-anti-ICAM NCs eller 125I-IgG NCs. Data er vist som middelværdi ± SEM, n = 4. Gengivet fra Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klik her for at se større figur
Figur 4.. Mekanisme af transport af etNTI-ICAM nanocarriers tværs Caco-2-monolag. (A) transcellulære transport af 125 I-anti-ICAM NCs tværs sammenflydende Caco-2-monolag blev vurderet ved 24 hr i fraværet eller tilstedeværelsen af 20 pM EIPA, 1 mg / ml filipin, 50 uM MDC, eller 0,5 uM wortmannin. (B) TEER blev målt under transport af 125I-anti-ICAM NCs over Caco-2-monolag, at vurdere paracellulær transport. TEER værdier i mangel af NCs er vist som kontroller (den stiplede interval markerer SEM af middelværdien). Inkubation med 5 mM H 2 O 2 er en positiv kontrol for åbning af intercellulære vejkryds. (C) paracellulær protein lækage, målt som den tilsyneladende permeabilitetskoefficient (Papp) af 125I-Albumin passage cellemonolaget i fravær eller nærvær af 5 mM H 2 O 2, IgG-NCS eller anti-ICAM NCS blev målt og beregnet som i fig. 3. Dataene er shown som middel ± SEM, n ≥ 4. Gengivet fra Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klik her for at se større figur
| Samlet NCs associeret / celle | Intracellulære NCs / celle | Transported NCs / celle | % Transporteres | Transporteres α-Gal molekyler / celle × 10 5 | pg transporteret / celle × 10 -3 | Papp (× 10 -8 cm / sek) | |
| 3 timer | 663,4 ± 116,0 | 434,0 ± 76,8 | 243.6 ± 15,4 | 44,4 ± 6,7 | 1,8 ± 0,2 | 9,7 ± 1,2 | 8,1 ± 1,1 |
| 24 hr | 2024,8 ± 409,3 | 1218,9 ± 255,6 | 806,9 ± 164,1 | 40,6 ± 2,0 | 3,9 ± 0,5 | 21,3 ± 2,5 | 1,9 ± 0,4 |
| NCS = nanocarriers, α-Gal = α-galactosidase, alt NCs forbundet / celle = Intracellulær NCs / celle + NCs transporterede / celle;% Transporteret = (NCS transporterede / Samlet NCs Associated) × 100, P app = tilsyneladende permeabilitetskoefficient (cm / s). Se Metoder til yderligere beskrivelse af disse parametre. Data er vist som middelværdier ± SEM (n = 8 brønde) (-TNF-α Caco-2-celler). | |||||||
Tabel 1. Transepitelial transport af α-Gal af anti-ICAM nanocarriers. Transcellulær transport af anti-ICAM / 125I-α-Gal NCs tværs conflydende Caco-2-monolag blev vurderet på 3 timer og 24 timer. Radioisotopaffald indhold af apikale, basolaterale og cellefraktioner blev omdannet til forskellige værdier, der er relevante for transport, som er beskrevet i Repræsentative resultater. Gengivet fra Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet ovenfor, kan der etableres en celle model til at studere transport af målrettede NCs tværs cellulære barrierer, såsom eksemplet til Caco-2-epitelceller, som er relevante for at vurdere transporten fra GI lumen ind i blodet i tilfælde af oral drug delivery-systemer. Dyrkning af GI epitelial cellemonolag i Transwell indsatse aktiveret måling af TEER og fluorescens immunfarvning af stramme vejkryds for at bekræfte dannelsen af en celle permeabilitetsbarriere. Efterfølgende radiomærkning af målretning og midler med 125I leveret hurtig og følsom kvantificering af målrettede NCs i og på tværs af GI cellemonolagene. Endelig blev mekanistiske undersøgelser anvendes ved hjælp endocytiske inhibitorer, TEER og en albumin paracellulær lækage assay at vurdere, om transporten sker gennem en vesikulær rute versus en paracellulær rute.
En vigtig parameter i etableringen af lignende modeller is udvælgelse af en celletype, der skal afspejle den fysiologiske natur af den cellulære barriere under undersøgelse. Forskellige epitel og endotelceller fra human eller animalsk oprindelse er kommercielt tilgængelige 16,18-20. Disse kan dyrkes alene som enkelte kulturer, som beskrevet her, eller som co-kulturer af disse celler med andre celletyper (fx mucus-secernerende celler, immunceller, pericytter etc.) 16,18-20. I en sådan co-kultur form kan Transwell indsætte betingelser moduleres til at justere de respektive vækstrater og krav til differentiering faktorer i cellen medier 16,18-20. For eksempel kan en blod-hjerne-barrieren model involverer co-dyrkning af hjernen mikrovaskulære endotelceller og astrocytter eller pericytter på den modsatte overflade af det porøse filtermedium, og de respektive medier for hver celletype skal placeres i hvert kammer 19. Desuden, afhængigt af den cellelinie, ekstracellulære matrixkomponenter kan required effektiv cellebinding til den porøse membran 18-20. Det er vigtigt at overveje, at hver enkelt model vil gøre forskellige basale niveauer med hensyn til permeabilitetsbarriere parametre og transportpriser og-mekanisme, og dermed styre værdierne skal indhentes, og disse metoder er optimeret til hver enkelt situation.
Transwell indsatser som dem der er beskrevet her, er ofte blevet brugt til at studere transport af materialer på tværs cellemonolagene fra apikale ind i en basolaterale rum eller omvendt 5,10-12,16,17. Dette kan ikke opnås ved dyrkning af celler på klassiske brønde eller dækglas fordi sådanne systemer udelukker denne form for transport, som de ikke tilbyder to uafhængige rum og dermed ikke kan give et realistisk billede af cellesortering. For eksempel kan materialer naturligvis bestemt til frigivelse fra den basolaterale membran rangeres til andre cellerum i et dækglas model, hvilket gør det vanskeligt at resoLVE mekanismen for transcellulær transport. Desuden, i modsætning til dækglas den transwell konfiguration giver anledning til fysiologisk relevante træk forbundet med celledifferentiering og membran polaritet 10,11,16-19. For eksempel Caco-2-celler dyrket på Transwells udviser karakteristika modne enterocyterne, herunder tilstedeværelsen af mikrovilli og stram vejkryds, kuppel dannelse, og produktion af børste grænserne enzymer 10,11,17. Andre parametre kan fremkalde en mere fysiologisk relevant fænotype, såsom forskydningsspænding i tilfælde af gastrointestinale epitelceller (f.eks slim flow og kontraktile bevægelser) og vaskulære endotelceller (f.eks blodgennemstrømning), som kan anvendes i Transwells hjælp agitation eller pumper 10 , 16 og co-kulturer til at producere den nødvendige vækst og differentiering faktorer for visse celletyper 16,18-20. Ikke desto mindre må man overveje, at cellelinier afviger ofte fra celler i kroppens væv, e. Gram. De kan udtrykke visse determinanter på forskellige niveauer og dermed nuværende varierede funktioner og regler. For eksempel behøver Caco-2-celler indeholder ikke alle transportproteiner proteiner og enzymer, der kræves for aktivering og transport af orale lægemidler in vivo, såsom CYP3A4, et lægemiddel-metabolizing enzym 10,17,23. I disse tilfælde kan cellelinje sub-kloner, transfektion, eller tilsætning af transkriptionale midler skal bruges modulere cellelinje som bedre afspejler fysiologiske betingelser 17,23,24.
Ved udvælgelse af en optimal transwell model, skal de forskellige funktioner i den permeable filter tages i betragtning. Permeable filtre findes i forskellige pore størrelser, lige 0,4-8 um, og skal rumme størrelsen af transporterede gods. For eksempel er mindre porestørrelser (0,4-3 um), der typisk anvendes til undersøgelser af transport af små kemiske forbindelser, mens porerne 3 um eller større anvendes til celleinvasion, chemotaxis og motilitet undersøgelser, hvor mikrobiel, er immune, og migrerende celler transporteres. Porestørrelse og tæthed påvirker også celle tæthed og differentiering, da nogle celler kan migrere gennem porer på såning, er til hinder monolag dannelse. Hertil kommer, at materialet af permeable support påvirkninger billeddannelse klarhed, til vurdering af cellelevedygtighed og monolag-dannelse og cellebinding. Polyethylenterephthalat (PET) filtre er gennemsigtige, så sigtbarhed under fasekontrastmikroskopi, i modsætning til gennemsigtig polycarbonatfiltre. For at forbedre cellevedhæftning, gennemtrængelige understøtninger belagt med collagen eller fibronectin er kommercielt tilgængelige. Endvidere kan filterdiameter, som justeres til forskellige brønds plader påvirke permeabilitet, hvorved større diametre (fx i 6-brønds plader) har en tendens til at forøge paracellulær utæthed af cellemonolaget.
Når en transwell model er etableret, herunder bevillingerte udvælgelse af celletype, medier sammensætning og gennemtrængelige filter kan status cellemonolaget vurderes under dyrkningen og eksperimentelle stadier hjælp TEER. Men TEER værdier varierer med 1) medfødte biologiske faktorer forbundet med celletype, kilde og passage nummer, 2) dyrkningsbetingelser, såsom de førnævnte Transwell egenskaber, podningstæthed, dage i kultur, medier sammensætning og pH, 3) fysiske faktorer , såsom temperatur, medier volumen, tidsplan for prøvetagning, og graden af omrøring / vask og 4) patologiske og / eller kemiske faktorer, der modulerer celle junction integritet (f.eks cytokiner, immunceller, oxidativt stress, farmakologiske tilsætningsstoffer etc.) 10, 16,17. På grund af de forskellige biologiske og miljømæssige faktorer, der påvirker TEER, et minimum basisværdi angiver skal etableres barriere dannelse for hvert system ved regelmæssigt at overvåge TEER i kultur periode, og efter eksperimentelle manipulationer. Values, der anses for tilstrækkelig til barrieredannelse, som kan variere mellem 150-1,600 Ω × cm 2 16, også afhænge af størrelsen af det stof, der skal transporteres således, at passiv paracellulær diffusion af dette stof er begrænset, mens TEER ≥ 350 Ω × cm 2 synes at udelukke passiv diffusion af relativt store NCs som dem vist her (200 nm), kan dette ikke være tilfældet for mindre drug delivery-systemer, hvor strammere monolag (fx ≥ 700 Ω × cm 2) er påkrævet. Denne baseline værdi kan også vurderes ved hjælp af kontrollerne til at forstyrre permeabilitetsbarrieren, herunder H 2 O 2, gennemtrængende peptider, calciumchelatorer (fx EDTA), protein kinaser og fosfataser og forskellige andre regulatoriske molekyler 25-27.
Som supplement til TEER findes mange permeabilitet assays til at verificere monolag integritet og vurdere paracellulær transport. Ligesom albumin andre membran-uigennemtrængelige tracer molekyler af forskellige størrelser, såsom mannitol, lucifer gul, inulin og dextraner, som kan kobles med en UV-fluorescerende eller radioaktivt mærke at måle og sammenligne permeabilitet satser (P app) til kendte værdierne for disse opløste stoffer. Ved evalueringen paracellulær transport, er det vigtigt at anvende et sporstof molekyle, der er mindre end den transporterede forbindelse under undersøgelse. For eksempel ville paracellulær transport af 200 nm partikler åbne intercellulære junctions nok til at forårsage paracellulær lækage af mindre, men stadig relativt store molekyler, såsom albumin, der anvendes i vores eksempel. Derimod bør paracellulære transport af mindre drug delivery køretøjer såsom dendrimers (~ 5 nm) vurderes ved hjælp af molekyler <5 nm, såsom mannitol. Paracellulær lækage undersøgelser tyder derfor størrelsen af cellen vejkryds åbning, men på grund af lange inkubationstider de ikke kan identificere forbigående forstyrrelser af celle junctioner.
En anden form for evaluering barriere integritet er at billedet af de tætte forbindelser, der forbinder tilstødende celler. I denne undersøgelse har vi immunfarvet occludin til fluorescensmikroskopi, men forskellige andre proteiner til stede i tight junction kan anvendes til denne analyse, herunder transmembrane proteiner af krydset adhæsionsmolekyle (JAM) claudin og occludin familier. Her har vi farvede det ekstracellulære domæne at omgå en permeabilization skridt, men alligevel intracellulære domæner kan også farves. Foruden dette er brugen af kontrol for ikke-specifik farvning, ved hjælp af fluorescerende sekundære antistoffer kun fravær af stramme vejkryds (her brugte vi cellerne med et monolag viser lav TEER) eller afbrydelse af stramme vejkryds ved hjælp af krydset-modulerende stoffer, der er opført ovenfor.
I vores eksempel på transepithelial transport bruger vi ICAM-1-målrettede NCS men transwell systemet også plads til transport af andre lægemiddelformulering køretøjs, terapeutiske og diagnostiske forbindelser, medfødte forbindelser fundet i kroppen, eller en kombination af ovenstående, med værdifulde konsekvenser for kliniske studier eller forståelse for grundlæggende veje. De metoder, vi beskriver at kvantificere transport over cellemonolag involverer radioisotop mærkning af targetingmidlet eller terapeutisk last i NC pels, men denne strategi kan også bruges til at spore NCs med forskellige kemier og strukturer, herunder lineære eller forgrenede polymerer, dendrimerer, partikler miceller, liposomer osv. 4,5,28,29. Forskellige isotoper (fx 125I, 3H, 32P, etc.) er tilgængelige til at kvantificere transport af en lang række små og store molekyler: ikke kun lægemiddelbærere men også kemiske og biologiske terapi, uden at det påvirker funktionel eller strukturel integritet forbindelsen, i modsætning til voluminøse fluorescerende mærker. Radiomærkning giver større kvantitativ følsomhed og hastighed i forholdtil andre strategier, der måler transport, såsom gel elektroforese, PCR, massespektrometri, HPLC og fluorescens-spektrometri. Dette mærke kan også anvendes til at bestemme graden af nedbrydning (fx protein targetingmidlet og fragt i vores eksempel) ved at vurdere fri jodindholdet, som er hurtig og præcis i forhold til alternative protein aktivitetsassays, herunder UV-spektrofotometri og Western blot. Men da frit iod ikke fuldstændigt afspejle ændringer i protein-konformation eller aktivitet, som kan forekomme i fravær af nedbrydning, de ovennævnte alternative metoder kan anvendes til yderligere at evaluere integriteten af transporterede materialer. Også, når administration forbindelser med gratis radioisotoper i det apikale kammer, er det uklart, hvorvidt mærkningen findes i cellemonolaget og transporteret fraktioner skyldes reelle protein nedbrydning eller diffusion af fri jod fra den apikale rum. For at omgå denne begrænsning, den apikale NC koncentration kananvendes i et kort tidsinterval for at tillade associering med cellemonolaget, efterfulgt af fjernelse af det apikale medium til gengæld for frisk medium, og en chase periode for at vurdere transporten. Selv om en mængde gratis radioisotoper fra den oprindelige pulje i første omgang kan lække ind i de andre fraktioner, kan denne værdi bestemmes ud fra prøver uden chase periode og trækkes fra vilkår, der indebærer en chase periode.
Med hensyn til vurderingen af den mekanisme af transport, beskrev de samme metoder for validering af monolag integritet (TEER, lækage assays og tight junction farvning) kan bruges til at evaluere paracellulære rute. For transcellulær transport farmakologiske inhibitorer af determinanter involveret i intracellulær transport (f.eks transferrin forbundet med clathrin veje, koleratoksin B forbundet med caveolar veje, etc.) kan anvendes, hvorved effektive koncentrationer til specifikt inhiberer disse determinanter brug for to blive belyst for hvert system. Alternativer til de inhibitorer, der anvendes i vores undersøgelse omfatter chlorpromazin og kaliummangel specifikke for clathrin-afhængig endocytose og genistein og methyl-β-cyclodextrin (MβCD) specifikke for caveolae-medieret optagelse 30. Andre strategier, som kan undgå potentielle non-specifikke effekter af farmakologiske inhibitorer involverer co-lokalisering af transporteret gods med disse determinanter ved hjælp af fluorescens eller radioisotop mærkning udnyttelse af specifikke ligander som kontroller (f.eks transferrin eller koleratoksin B, som anført ovenfor) og siRNA at Knockdown udtryk for regulatoriske elementer af disse veje.
I denne undersøgelse, vi demonstrere ligninger til konvertering radioaktivitet data til forskellige parametre, der giver nøglen foreløbige oplysninger vedrørende transepithelial transport. For eksempel er graden af transepitelial transport ved NCs eller molekyler, der transporteres per celle, effektiviteten af transport af indhold, der binder eller trænger ind i celler er repræsenteret ved procentdelen af celleassocierede NCs eller molekyler transporteres, og satsen for transport, som giver mulighed for sammenligning af gennemtrængelighed mellem forskellige opløste stoffer, er tilkendegivet ved P app. For at forstå de potentielle målrettede NCs til storstilet levering af terapeutika (f.eks nødvendige dosis til in vivo-administration), kan disse ligninger kan modificeres til at estimere transport værdier på en makroskopisk skala. For eksempel kan mængden af et terapeutisk last transporteret pr overfladeareal tarmvæv (mg / cm 2) samt den potentielle levering i hele mave-tarmkanalen af en patient vurderes ud fra de følgende ligninger,
Mass last transporteret / cm 2 væv = (CPM basolateral / specifik aktivitet) / A
Masse last transporteret på tværs af tyndtarmen = [(CPM basolateral / specifik aktivitet) × TA] / A
Fremme fra Transwell skær, modeller, der bedre afspejler den fysiologiske kompleksitet transport omfatte "Ussing" kamre og mikrofluidenheder, som giver flydende flow dynamik og en indeholdt kammer, der minimerer kontakt med luft, som i blodkarrene. Disse modeller også tillade vævseksplantater at dyrkes for ex vivo-undersøgelser forud for validering in vivo 17,18.
Som konklusion har de metoder, der anvendes i denne undersøgelse givet værdifuld foreløbige oplysninger om transport af en model drug delivery system i form af efficieNCY tværs cellemonolag. Ved hjælp af denne cellekultur model vi demonstreret potentialet i ICAM-1-målrettet nanocarrier platform i forbindelse med oral drug delivery, hvilket banede vejen for de efterfølgende in vivo-undersøgelser, men kan ændres til andre systemer, der kræver transport over cellulære barrierer fundet i krop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et fællesskab af Howard Hughes Medical Institute og National Science Foundation til RG, og midlerne tildeles SM af National Institutes of Health (Grant R01-HL98416) og American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
References
- Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
- Mrsny, R. J. Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Torchilin, V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).
- Sadekar, S., Ghandehari, H. Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).
- Muro, S. Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems. J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).
- Volkheimer, G. Persorption of particles: physiology and pharmacology. Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).
- Dejana, E. Endothelial cell-cell junctions: happy together. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).
- Jung, T., et al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).
- Bareford, L. M., Swaan, P. W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).
- Tuma, P. L., Hubbard, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).
- Muro, S., et al. A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1. J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).
- Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).
- Delie, F., Rubas, W. A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).
- Kuhnline Sloan, C. D., et al. Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier. Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).
- Kasper, J., et al. Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).
- Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1. J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).
- Hsu, J., et al. Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease. J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).
- Schmiedlin-Ren, P., et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).
- Hughes, J., Crowe, A. Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics. J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).
- Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport. J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).
- Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).
- Kapus, A., Szaszi, K. Coupling between apical and paracellular transport processes. Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).
- Hood, E. D., et al. Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo. J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).
- Simone, E., et al. Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124. Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).
- Vercauteren, D., et al. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
