Summary
多くの治療用途は、体内の細胞の壁を越え薬物担体とその貨物の安全かつ効率的な輸送を必要とする。この記事では、胃腸(GI)上皮のような細胞壁を越えた薬物ナノキャリア(NCS)の輸送速度とメカニズムを評価するために確立された方法の適応を説明します。
Abstract
サブマイクロキャリア(ナノキャリアは、NCは)は、溶解性、安定性、循環時間、ターゲティング、および放出を向上させることによって薬物の効力を高める。また、体内で細胞の障壁を横断することは、介入が必要とされる組織への血液から循環と輸送への治療NCの両方の経口送達のために重要である。材料は、エンドサイトーシスによって内在細胞体を通過して輸送され、分泌される一過性の隣接するセルを連動ジャンクションの破壊、または(ii)経細胞経路を介して(I)傍細胞経路、、:携帯の壁を越えたNC輸送はによって達成される反対細胞表面(transyctosis)で。細胞の障壁を横切る送達は、輸送に関与する細胞表面マーカーに特異的に結合するターゲティング剤と治療薬またはそれらのキャリアを結合することによって容易にすることができる。ここでは、WHIのモデル細胞関門を越えて広がりとNC輸送のメカニズムを測定する方法を提供CHはトランスウェルインサートにあり、多孔質膜上に成長した胃腸の単層(GI)上皮細胞で構成されています。透過障壁の形成は経上皮電気抵抗(TEER)、対照物質の経上皮輸送、および密着結合の免疫染色を測定することによって確認される。一例として、〜200nmのポリマーのNCは、治療貨物を運び、細胞表面決定基を標的とする抗体で被覆され、使用されている。抗体または治療の貨物は、放射性同位体の追跡とラベルされたNCのために125 Iで標識されている時間の変化期間の細胞単層を介して上部チャンバーに追加されます。 NCは、細胞に関連したおよび/または下にあるチャンバに搬送を検出することができる。無料の125 Iの測定は、劣化した分を差し引くことができます。傍細胞経路は、上述したバリアパラメータNC輸送による電位の変化を測定することにより評価される。経細胞輸送iをエンドサイトーシスおよびトランスサイトーシス経路を調節する効果に対処することによって決定されよ。
Introduction
外部環境と内部区画の間のゲートウェイとしてのボディの行為中の細胞の障壁。これは、胃腸(GI)管および血流1-3の外部露出面を分離する上皮層の場合である。携帯の障壁はまた、血流と実質および組織や臓器の細胞成分との間のインタフェースを表す。体内でこれらの細胞障壁を横断する能力は、治療薬および診断薬の効率的な送達のために重要である1これは、血液などの肺関門、血液脳関門のような血管内皮の内側ライニングの場合である循環へと介入が必要とされる組織/器官。
治療薬または診断薬の送達を改善するために、これらの化合物は、サブミクロンナノキャリア(NCS)にロードすることができる。これらの薬物送達ビヒクルは、様々な製剤化することができる薬物の溶解性、保護、薬物動態、リリース、および代謝4,5を最適化するための化学的性質と構造。 NCはまた、治療上の処置が必要とされる2,6身体の領域への接着を容易にするために、親和性またはターゲティング部分( 例えば、抗体、ペプチド、糖、アプタマーなど )で官能基化することができる。携帯障壁の表面に発現決定にNCの標的化は、さらに2,6におよび/ またはこれらのライニングを横切る輸送を容易にすることができる。
選択的に2環境の間の物質の輸送の役割は、細胞層の中で、特定のユニークな機能を必要とします。一つのこのような特徴は、キャビティの内腔に面する頂端膜は、膜の形態および脂質、トランスポーター、および受容体2の組成物に関して、組織の間質に向かって配向基底膜まで変化することにより、細胞極性である。もう一つの特徴は、細胞間を必要とするjunctio隣接するセル間を接続NS。タイトジャンクションを形成するタンパク質の制御、特に接合部接着分子(JAM)、オクルディン、およびクローディン、選択的傍細胞輸送として知られている細胞、間の物質の輸送を可能にするかどうバリア機能を調節し、内腔から材料の許可通過に基底外側のスペース3。体内の細胞の障壁に多くの天然および合成の要素(白血球、分子、粒子、および薬物送達システム)の結合はのアクセスの危険なので、一過性で比較的無害またはより長期であってもよい細胞ジャンクションの開口を誘導することができバリア2,5,7-9全体の不要物。したがって、この経路は、アミンの電流または増加傍漏れに対する抵抗を減少することにより、経上皮電気抵抗(TEER)及び(本明細書傍漏れと呼ばれる)分子の受動傍細胞拡散を測定することによって評価することができる基底外側空間にRT化合物は、それぞれ5,10,11、細胞間結合の開放を示している。染色はすべての細胞周辺5,10,12の周囲に細胞-細胞境界に集中して表示される場所、これらの方法を補完するために、上記のタイトジャンクションタンパク質のいずれかは、それらの完全性を評価するために染色することができる。
あるいは、クラスリン被覆ピットやカベオラと呼ばフラスコ状の膜陥入に関連するものなどの特定の細胞表面決定基を標的とする薬物送達システムは、細胞内区画5への薬物送達のための道を提供し、エンドサイトーシスによって細胞に小胞の取り込みをトリガすることができる13。また、エンドサイトーシスは、側底側のリリースのために細胞体全体に小胞の人身売買にtransyctosis、または経細胞輸送14と呼ばれる現象を引き起こすことがあります。そのため、エンドサイトーシスの動態とメカニズムについての知識は、細胞内のAを活用するために用いることができる傍細胞経路に比べて納期の比較的安全かつ制御モードを提供していますND経薬物送達、。エンドサイトーシスの機構は、古典的経路の調節因子(クラスリンとカベオリン媒介エンドサイトーシス、およびマクロピノ)または(例えば、細胞接着分子(CAM)を介したエンドサイトーシスの場合のような)非古典的ルートに評価することができる5,13,15 。
細胞内輸送は、多くの場合、標準的なウェルまたはカバースリップで研究されているのに対し、基底外側コンパートメントの不在は、細胞極性と細胞層を横断する輸送を研究する能力を妨げる。この障害を克服するために、細胞単層を横切る輸送は、長いトランスウェルの上部(頂端)チャンバ、細胞が付着し、タイトな単層を形成する多孔性透過膜で構成され、10,11,16,17が挿入され、下部用いて研究されている(基底外側)室( 図1)。この構成では、輸送は、で測定することができる上部チャンバーに処置を施す細胞単層とその下の多孔質膜を通って輸送を次の、そして最終的に輸送され、材料の定量化のための下部チャンバー内の媒体を収集することにより、頂端から側底方向。側底から頂端方向への輸送は、上部チャンバー5,10,12,16から下室とその後のコレクションに最初の投与によって測定することができる。上記のように様々な技術が、TEERおよび傍細胞輸送アッセイを含む、トランスウェル上で透過障壁の形成を確認するために存在する。また、細胞が培養された通気フィルタは、さらに、細胞単層モデルの検証ならびに輸送のメカニズムとして、(蛍光、共焦点顕微鏡、電子顕微鏡法により)イメージング分析のために除去することができる。異なる孔サイズ、材料、および表面エリアで利用可能である膜型の選択は、種々のファクトに依存する例えば、輸送される物質または物体の大きさ、細胞型、及び撮像方法としてrsを16,18-20。トランスウェルインサートはまた、チャンバーおよび細胞表面領域のボリュームは既知の定数であり、哺乳動物のような複雑なシステムと比較して、輸送の制御された正確な定量化を容易にする。 in vivo送達に関与する多くの要因が、腸の粘液の存在を含む、せん断応力、消化酵素、免疫細胞などを排除しているが、 インビトロモデルでのこの小さな規模は、輸送に関する有用な予備情報を提供しています。
携帯障壁10,11,16,17間でのNCの輸送を研究するため、これらの方法の適応を説明するための例として、ここでは消化管上皮を通過するのNC輸送の可能性は、モデル薬物送達の通過を評価することによりモデル化した場合について説明ヒト上皮結腸直腸腺癌(のCaco-2)細胞の単層を介してシステム。この目的のためにあり、cのエルは透明であり、顕微鏡イメージングのために使用することができる0.8μmの細孔ポリエチレンテレフタレート(PET)フィルター(6.4ミリメートル直径)上で、トランスウェルインサートで培養した。透過障壁の状態がTEER、コントロール物質、アルブミン、タイトジャンクションの元素の蛍光顕微鏡可視化、オクルディンタンパク質の頂端から側底輸送を測定することによって検証される。標的ポリマーNCのモデルを100nm、非生分解性ポリスチレンナノ粒子からなる、使用される。 NCは、表面だけでは標的とする抗体との吸着または標的とする抗体の組み合わせの成分のいずれかが放射性同位元素のトレースのための125 Iで標識することができる治療貨物によってコーティングされている。選択された例では、抗体は、細胞間接着分子-1(ICAM-1)を認識し、タンパク質が細胞内および経細胞輸送oをを促進することが示されているGI上皮(および他の)細胞の表面上に発現 F薬物担体とその貨物21。カーゴは、α-ガラクトシダーゼ(α-ガラクトシダーゼ)、ファブリー病、遺伝リソソーム貯蔵障害22の治療のために使用治療用酵素である。
サイズが約200nmのコーティングされたNCのは、上のNC 125 Iは、細胞単層に関連するおよび/ または検出することができ、その後、細胞単層上に先端チャンバーに添加し、そして様々な時間にわたって37℃でインキュベートし細胞下の側底室に搬送される。無料の125 Iの追加の決定は、コーティングされたNC輸送の劣化した分と推定の減算を可能にする。経細胞輸送は、エンドサイトーシスおよびトランスサイトーシスの経路を調節する際の輸送の変化を調べることによって決定される輸送の機構はさらに、上述のパラメータを介して、傍細胞経路に関連する透過障壁の変化を調べることにより評価される。
ontent ">これらの方法は、完全に細胞の障壁を横切る薬物送達のための潜在性の評価を可能にする、貴重なセルラバリア·モデルに関する情報、薬物送達システムの輸送の程度と速度、およびそのような輸送の機構を提供する。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。トランスウェルインサート中の細胞単層を培養
- 無菌のバイオセーフティーレベル2の細胞培養フードでは、0.8ミリメートルのPETは、鉗子で(統計的有意性のために、条件あたり4ウェル)を24ウェルプレートへの挿入をトランスウェル細孔置く。フードに入るすべての材料は、エタノールで消毒しなければならない。
注:フィルターの孔径は、NCの平均サイズに合った選択する必要が膜を横切る輸送を可能にするために、用いられる。また、統計学的に有意な結果を得るため、各実験条件は、同一実験内で4リピート(井戸)の最小値を必要とし、3つの独立した実験の最小値。
- 水浴中で4.5g / Lグルコース、15%ウシ胎児血清および1%ペニシリンストレプトマイシン、37℃まで熱を補充したDMEM培地を含む細胞培養培地を調製する。
- 細胞培地および代わりにヒト上皮結腸直腸腺癌(のCaco-2)細胞を希釈1.5×10 5細胞/ cm 2の密度でトランスウェルインサートの上部(頂端)チャンバ内に細胞溶液の200〜400μlの。細胞培地900μlの - 700と下(基底外側)室を埋める。
- ステップ1.3に示されているボリュームを使用して37℃、5%CO 2、および3〜4日ごとに上部及び下部チャンバーに培地を交換16-21日間、湿度95%、少なくとも培養細胞。細胞単層(むしろ下記より)上記の圧力を維持するには、次の順序でメディアを交換してください。、下室からメディアを吸引上部チャンバーからの培地を吸引、新鮮な培地で上室を満たし、かつと下室を埋める新鮮な培地。
2。タイトジャンクションの経上皮電気抵抗(TEER)および免疫染色を使用して、GI上皮透過性障壁の検証
- 短期保存(2週間未満)については、電解質ソリューションでSTX100電極水没たTiON(0.1〜0.15 MのKClまたはNaCl)。システムは、内部で短絡して、電極の対称性が維持されるようにEVOM電圧抵抗計の電極端子に電極ケーブルを接続します。長期保存の場合は、D.H. 2 Oで洗浄し、乾燥した、暗い状態で保管してください。
- 、電極を殺菌15分間エタノールに浸し、15秒間空気乾燥できるようにする。あるいは、電極はUVフードに格納することができる。各抵抗測定の前に、無菌電解質溶液(リン酸緩衝生理食塩水、PBS)または0.1から0.15 MのKClまたはNaCl溶液に電極を洗浄します。
- 電圧抵抗計は、抵抗の設定に設定すると、垂直方向に上室短い電極とウェルの底に触れて下室で長い電極と、うまくトランスウェルインサートを含む、電極を配置。各ウェルについて、EVOMの指示が安定したら、(Ωオームで与えられる)抵抗値を記録します。
- 抵抗率を計算する(RESISTAN面積に対して標準化のce;Ω×cm 2)の試料のバックグラウンド抵抗(細胞を含まないトランスウェルインサートのTEER)を減算し、膜面積を掛けることによって。抵抗率の値は、ほとんどの場合、文献に報告されている。 (説明を参照してください)
- TEERは、典型的には、細胞plattingの瞬間から2〜3週間かかり透過障壁の形成を示し、最大値と高原に上昇値まで1〜2日ごとに測定を繰り返します。プラトーTEER値とバリアの完全性を達成するのに必要な時間は、細胞の継代数に応じて変化し得る。
- (バリア形成のための閾値以上等しい)高いTEERを有する細胞単層に密着結合の存在を確認するために、15分間、冷2%パラホルムアルデヒドとのインキュベーションにより細胞を固定。次いで、1μg/ mlの抗オクルディンと共に室温で30分間、それらをPBSで細胞を洗浄し、インキュベートする。再びPBSで細胞を洗浄し、7.5μg/ mlのfで室温で30分間、それらをインキュベートするluorescentlyで標識した二次抗体。バリア形成の陰性対照として低TEERでウェルを使用してください。
注:抗オクルディンの代替として、代替のタイトジャンクションタンパク質に対する抗体を使用することができる。
- 慎重に固定された単層が取り付けられたフィルター膜を切除し、エピ蛍光または共焦点顕微鏡を用いて撮像するためのスライド上にマウントする。
3。ターゲットキャリアの経上皮輸送を評価
- 先に説明したように07、125 Iで標的とする抗体(この例では、ICAM-1に対するマウスモノクローナル抗体、抗ICAMなど)を標識する。次いで、標識された抗体(CPM)/ mgのカウント毎分で比活性を算出し、抗体上の125 I含有量を決定し、タンパク質濃度、ガンマカウンターを推定するためにブラッドフォードアッセイを使用する。
注:特異性を制御するには、再非標的コーティングされたNCを調製するために使用される標識マウスIgGによる手順を泥炭。治療の貨物の輸送を研究するために、この例では、貨物にラベルを付ける手順、例えば、α-ガラクトシダーゼ(α-GAL)を繰り返します。代替物はターゲッティング剤、非特異的対照、または治療貨物のために使用することができる。代替の方法はまた、化合物を標識し、標識された対応物の濃度を推定するために使用することができる。
- 夫婦NCの表面に抗体(この例では抗ICAM)を標的ラベル。この例では、07のように、表面吸着を可能にするために125 I-抗ICAMとともに室温で1時間ポリスチレンナノビーズ(100 nmの直径)をインキュベートする。
注:非固有のコントロールを使用する125 I-IgGについて。貨物の輸送をトレースするには、抗体と125 I標識貨物(この例ではα-GAL)を標的とを組み合わせて使用します。
- 3分間13,000×gで遠心分離し、吸引によって、上清中の非塗工の対応を削除します。ピペッティングによりPBS中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いてコーティングされたNCを含むペレットを、潜在的な粒子凝集(20-30短いパルス)を破壊するために低電力で超音波処理を再懸濁する。
- NCの特性評価のために、大きさ、多分散性、および動的光散乱(ベンダーの指示に従って)を使用して、コーティングされた粒子のζ電位を測定し、数を定量化する125使用して粒子表面に抗体分子( 例えば抗ICAM)を標的I標識ガンマカウンター。
注:これらの方法は、非特異的および治療 的対応物について繰り返すことができる。コーティングされた粒子のサイズは約200 nmの範囲である。
- ( 例えば 125 I-抗ICAMのNC; 56をnCi / ml)を、125 I-抗体のNCを追加TEER&でコンフルエントのCaco-2単層上の上部チャンバーに#8805;背景上のCM 2×350Ω(説明を参照)(16〜21日後に播種)。 1つまたは複数の所望の時間間隔で37℃で培養する。透過障壁に対するNCの効果を評価するために、インキュベーションの前と後のTEER(セクション2.3)を測定します。
注:この手順は、非特異的および治療 的対応物について繰り返すことができる。
- 上下のチャンバーからの培地を回収し、37℃(上室)で0.5ミリリットルDMEMまたは1ミリリットルのdH 2 O(下室)で一回、それらを洗ってください。ガンマカウンターを用いて放射性同位元素の合計含有量の測定のための洗浄を集める。
- 細胞画分の測定には、通気フィルタを切除し、 例えば、(細胞内容物を放出する)エッジの周りに切断し、10分間、1%トリトンX-100でガンマ計数管でインキュベートし、カミソリの刃を使用して、セルの測定を行う前総放射能の関連。
- 私は再度125を測定するには潜在的な劣化、最初のミックスPBS中の3%BSAを700μlの200μlのトリクロロ酢酸(TCA)で(、上下、または細胞画分から)の試料300μlに輸送中のNCからまたはリース。 15分間室温でインキュベートする。一方今回は、ガンマカウンターでこのサンプルの全放射能を測定します。
- 劣化したタンパク質または125 I画分(上清)から完全なタンパク質(ペレット)を分離するために、5分間3000×gで遠心分離TCAサンプル。無料の125 I画分の放射能を定量化し、遠心分離前に測定した全放射能からこの値を減算します。これは、劣化していない標識されたタンパク質の量を提供する。
4。ターゲットナノキャリアの経上皮輸送のメカニズム
- ラベル以前のセクション3.1に記載されているような、私は125とアルブミンは、7を報告した。
注:アルブミンは66.5であるkDaタンパク質、従って、比較的大きな物質。より大きな物体の受動輸送のための有効な制御(例えば、200nmでのNCは、ここで使用される)ものの、より小さな薬物担体の輸送を研究するときに、より小さな不活性トレーサー分子で置換されるべきである(説明を参照)。
- アルブミン傍漏出、上記のようにトランスウェルインサート上で培養されたCaco-2単層を使用して傍細胞輸送を評価する。
- 細胞単層上の上部チャンバー媒体に、125 I-アルブミン単独(漏れの基礎レベルを示すネガティブコントロール)、または125 I-アルブミンと非放射性標識された抗体標的NCS(セクション3.5を参照)のいずれかを追加します。 NC輸送をテストするときに検討したものと一致する必要があり、選択した時間間隔(秒)、37℃でインキュベートする。前、間、TEER(セクション2.3)を測定し、示されているようにインキュベートした後、その合計125 Iで無料の125 I測定のためのすべての画分を収集第3節では注意してください:125 I-アルブミンと非放射性標識されたコントロールのIgG NCの併用に加え、コントロールとして使用することができる。
- 間接合部を開放するための陽性対照として、トランスウェルインサートの上部及び下部チャンバーに5mMのH 2 O 2を含有する細胞培地を追加し、30分間37℃でインキュベートする。その後、TEER(セクション2.3)を測定し、選択した時間間隔で上室への125 I-アルブミンを追加します。細胞間結合のH 2 O 2誘導性開口によって引き起こさTEER値の減衰を同定するために、インキュベーションを通して様々な時点でTEERを測定する。
- 平行実験において、50μMのモノダンシルカダベリン(MDC、クラスリン依存性エンドサイトーシスの阻害剤)のいずれかでコンフルエントのCaco-2単層をインキュベートすることにより、125 Iを標的とNCのもトランスサイトと呼ばれる細胞間輸送を、評価し、1μg/ mlのフィリピン(カベオラの阻害剤媒介性エンドサイトーシス)、0.5μMのwortmann内、または20μMの[5 - (N-エチル-N-イソプロピル)アミロ](ホスファチジルイノシトール3マクロピノサイトーシスに関与するキナーゼ[PI3K]の阻害剤)(マクロピノサイトーシスとCAMを介したエンドサイトーシス15の阻害剤EIPA)。
注:125 I-NCのIgGを125 I-アルブミンは、これらの阻害剤の効果についてのネガティブコントロールとして使用することができる、他の方法(例えば、siRNAの技術)は、より選択的阻害を提供することができる。
- 単層透過性に対する阻害剤の効果のための追加コントロールとして、その間、および阻害剤および放射性標識された物質で細胞をインキュベートした後、前にTEER(セクション2.3)を測定します。
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Representative Results
目標とNCの経上皮輸送を研究する私たちの細胞モデルの検証として、 図2は 、Caco-2細胞単層を、合流〜12日目に到達した1.5×10 5細胞/ cm 2の密度でプレートし、18日目までの単層の完全性を維持していることを示していますTEER( 図2A)で示される。これは、低TEER苦手タイトジャンクション標識(CM 2×17Ω、5日目と比較して高いTEER(CM 2日目14×390Ω)と単層でオクル陽性タイトジャンクション( 図2B)の存在によって検証された)。
NC要素の放射性標識のトレースは、これらのコンポーネント(NC標的とする抗体又は貨物)の合計量は、最初に、頂端チャンバに、それらの細胞関連画分を添加決定、およびその画分は、側底側へ搬送される。これらの値は、ノースカロライナ輸送を記述する様々なパラメータを計算するために使用することができるより関連性の高い方法で、特に劣化した対応を示して各分画の自由125 Iの内容を差し引いた後。例えば、横方向の細胞単層である抗体分子、カーゴ分子、または関連NCの個数は絶対的な輸送を推定するために計算することができる。また、細胞単層に関連する分子またはNCの総数に対して基底外側に搬送される前記分子またはNCの割合は、効率を推定する輸送は言った。最後に、見かけの透過係数(P アプリ )、輸送の速度のための標準的なパラメータが、推定することができる。それは次のようにこれらのパラメータを算出する。
輸送される分子またはNCSは(分子が追加されたり、NCは、CPMが追加 / 追加 )= CPM 基底外側 ×を輸送
%の分子またはNCSは= 100×[CPM(/ 基底外側のCPM 基底外側 + CPM輸送細胞分画)]
P アプリ (CM / S)=(CPM 側底 ×体積)/(A×T×CPM 追加されました )
CPMは125、私はカウント·パー·ミニッツの上室(CPMが追加された )、細胞単層画分(CPMcell画分)、または下室(インプレッション側底 )に追加され、NCは追加または分子が追加された場合、NCの数であるまたは最初に上部チャンバーに添加分子は、Aはフィルター膜の表面積(cm 2)で 、巻ある。上部チャンバ(ml)中の培地の体積は、tはインキュベーション時間(秒)である。
放射性同位体は、標的抗体を標識したときの例では、この分析は、細胞単層関連抗体又はNCの細胞および百分率あたり搬送抗体またはNCの観点から輸送の程度と効率性を明らかに輸送されたこと( 図3Aおよび3B )、我々としてP アプリ ( 図3D)の点で輸送速度としてLL。 125 I-抗-ICAMのNCのためにこの例で推定されたこれらのパラメータは、非標的化対応物( 図3Cおよび3D)への輸送効率を相対的に示すために、コントロールIgGを125 I-NCのものと比較した。
放射性標識は、NC貨物に組み込まれる場合、記載されたパラメータは、ファブリー病( 表1)としても知られている遺伝リソソーム貯蔵障害の治療に使用されるこの例ではα-Galを酵素であった貨物の輸送を反映している。前記貨物をトレースすることによりNC輸送を計算することに加えて、この治療用酵素の経上皮送達は、細胞当たりのα-Galを搬送さの分子又は塊としてそれを発現させることによって、例えば 、推定することができる。
最後に、このメソッドは、傍細胞経路に輸送経路を属性または経細胞ルート。 MDC、フィリピン、およびウォルトマンは、制御条件(インヒビターなしに対して搬送レベルを低下させなかったのに対し、例えば、この例では、EIPAは、Caco-2細胞単層( 図4A)を越え、125 I-抗ICAM NCの輸送を削減)。これは抗ICAM NCSを経細胞輸送のために、CAMを介したエンドサイトーシスを利用することを示唆しているではなく、クラスリン、-カベオラ、またはマクロピノ関連のトランスサイト。また、傍細胞輸送はTEERの減少および抗ICAM NCの輸送中の下室へのアルブミン傍細胞漏出の増加がなければならない、それによって、TEER( 図4B)の測定値とアルブミン受動輸送( 図4C)を使用して、除外された間接合部の破壊を示した。しかし、抗ICAMのNCとのインキュベーションは、TEERまたは輸送されないのIgGのNCを制御するのに似て48時間かけて125 I-アルブミン傍細胞漏出を、変化させなかった。として細胞間結合の開放および傍細胞輸送のための陽性対照、H 2 O 2は、基礎レベルにTEERを減少し、著しく側底室への125 I-アルブミン漏出を高めた。
図1。経上皮輸送を研究するためのプラットフォームとして、消化管上皮モデル。(A)全体の目標とナノキャリアの経上皮輸送の概略タイトな単層が形成されるまで、Caco-2細胞単層をトランスウェルインサート上で培養される(16〜21日後に播種、TEER ≥350背景上Ω×cm 2)で。例えば、125 I-抗-ICAMのNCのような薬物送達ビヒクルの例は、セルの両端に、基礎となる多孔質膜を通って輸送を研究するために細胞単層上の上部(頂端)チャンバーに加える。下(基底外側)チャンバー内の媒体は、その後輸送材料の定量化のために収集されます。細胞単層から(B)の輸送は、傍細胞または経細胞/トランスサイトーシス経路のいずれかを介して行われます。 Ghaffarianらからの再生、J.はのRelを制御した。163(1)、25-33(2012)。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください
図2。経上皮輸送のためのモデルとしてのCaco-2単層。のCaco-2細胞を1.5×10 5細胞/ cm 2でトランスウェルインサート上で成長させた。 (A)経上皮電気抵抗(TEER)は、単層の完全性を評価するために測定された。データは、平均±SEMとして示されているが、N = 3。 (B)タイトジャンクションの蛍光顕微鏡)は、それぞれ、高いTEER値に対して5または14(低日には、抗オクルディンおよびテキサスレッド標識二次抗体で免疫標識。 Ghaffarianらからの再生、J.はのRelを制御した。163(1)、25-33(2012)。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください
図3。 Caco-2細胞単層を通過する抗ICAMナノキャリアの輸送は。トランスウェルインサート上で成長させたコンフルエントのCaco-2単層を、125 I-抗-ICAMのNCまたは125 I-NCのIgGを頂端チャンバーに添加してインキュベートした。 (AC)125側底チャンバ内のIコンテンツはNCのTRANSPの量を計算し、示した時点で測定したセル当たりorted(代表的な結果を参照してください)。搬送NCの(B)パーセントを合わせ、側底および細胞画分中のものと側底画分に見出されるキャリアの比として計算した。代表的な結果に記載されるように(D)見かけの透過係数(P アプリ ) は、125 I-抗-ICAMのNCまたは125 I-NCのIgGの輸送速度を反映して計算した。データは平均±SEMとして示されているが、n = 4である。 Ghaffarianらからの再生、J.はのRelを制御した。163(1)、25-33(2012)。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください
図4。の輸送のメカニズムのCaco-2単層を通過するNTI-ICAMナノキャリア(A)コンフルエントのCaco-2単層を通過する125 I-抗ICAM NCの経細胞輸送を20μmEIPAの存在下または非存在下で24時間後に評価し、1μg/ mlのフィリピン、 50μMのMDC、または0.5μMのワートマニン。 (B)TEERは傍細胞輸送を評価するために、のCaco-2単層を通過する125 I-抗ICAM NCの輸送の間に測定した。 NCの不存在下におけるTEER値(破線の間隔が平均値のSEMをマーク)を対照として示す。 5 mMのH 2 O 2とのインキュベーションは、細胞間ジャンクションの開放のためのポジティブコントロールである。 5mMのH 2 O 2、IgGのNCの、または抗ICAM NCの存在下または非存在下で細胞単層を横断する125 I-アルブミンの見かけの透過係数(パップ)として測定(C)傍細胞タンパク質漏れを測定し、そして図3のように計算された。データはすべて表示するN±SEMを手段として、N≥4。 Ghaffarianらからの再生、J.はのRelを制御した。163(1)、25-33(2012)。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください
総NCSは関連する/ セル | 細胞内NCS /セル | 輸送NCS /セル | %輸送さ | 輸送α-GAL分子/ セル×10 5 | PG輸送/ セル×10 -3 | パップ(×10 -8 cm /秒) | |
3時間 | 663.4±116.0 | 434.0±76.8 | 243。6±15.4 | 44.4±6.7 | 1.8±0.2 | 9.7±1.2 | 8.1±1.1 |
24時間 | 2024.8±409.3 | 1218.9±255.6 | 806.9±164.1 | 40.6±2.0 | 3.9±0.5 | 21.3±2.5 | 1.9±0.4 |
NCは=ナノキャリア、α-GAL =α-ガラクトシダーゼ;合計のNC関連する/セル=細胞内NCS /セル+ NCSは/セルを輸送。%輸送さ= 100×(NCSは/合計NCの、関連の輸送)、P アプリ =見かけの透過係数(CM /秒)。これらのパラメータのさらなる説明のための方法を参照してください。 (-TNF-αのCaco-2細胞);データが±SEM(nは8ウェル)を意味するものとして示されている。 |
表1。抗ICAMナノキャリアによるα-GALの経上皮輸送。CONにわたる抗ICAM / 125 I-α-GAL NCの経細胞輸送流暢なのCaco-2単層を3時間および24時間で評価した。代表的な結果に記載されるように、頂端側底、および細胞画分の放射性同位体含有量は、輸送に関連する種々の値に変換した。 Ghaffarianらからの再生、J.は、(1)、25-33(2012)の Rel。163を 制御 し た 。
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Discussion
上述の方法を用いて、細胞壁を越え標的NCの輸送を研究するための細胞モデルは、このような場合には血液中にGI管腔から輸送を評価することに関連したCaco-2上皮細胞を、示した例のように、確立することができる経口薬物送達システム。トランスウェルインサート中のGI上皮細胞単層の培養は、細胞透過性障壁の形成を確認するために、タイトジャンクションのTEERおよび蛍光免疫染色の測定を可能にした。その後、125でターゲットとし、治療薬の放射能標識は、私は、消化管細胞単層へと渡ってターゲットを絞ったNCの迅速かつ高感度な定量を提供した。最後に、機構研究は、トランスポートは傍細胞経路に対する水疱性経路を介して生じるかどうかを評価するために、エンドサイトーシス阻害剤、TEERおよび傍細胞アルブミン漏出アッセイを用いて塗布した。
私は同様のモデルを確立する上で重要なパラメータ細胞型の選択は、研究対象の細胞のバリアの生理的性質を反映すべき、だ。ヒトまたは動物起源からの様々な上皮細胞および内皮細胞が16,18-20市販されている。これらは、16,18-20ここで説明するように、単一の培養物として増殖させ、単独で、または(例えば粘液分泌細胞、免疫細胞、周皮細胞)、他の細胞型でのこれらの細胞の共培養などすることができる。このような共培養の形態では、トランスウェルインサート条件は、細胞培地16,18-20における分化因子に対するそれぞれの成長率および要件を調整するために調節することができる。例えば、血液脳関門モデルでは、多孔質フィルターの反対側の面に脳微小血管内皮細胞および星状細胞又は周皮細胞との共培養を含んでもよいし、各細胞型のためのそれぞれの培地を各チャンバー19内に配置されるべきである。また、細胞株に依存して、細胞外マトリックス成分はreqはされてもよい多孔質膜18〜20に有効な細胞付着のためにuired。これは、各特定のモデルは、したがって、制御値が得られ、これらの方法は、それぞれの状況のために最適化される必要がある、透過障壁パラメータおよび輸送速度および機構に関して異なる基底レベルをレンダリングすることを考慮することが重要である。
トランスウェルは、ここで説明するもののように挿入され、広く頂端から側底コンパートメントまたはその逆 5,10-12,16,17に、細胞単層を横切って物質の輸送を研究するために使用されてきた。彼らは二つの独立したコンパートメントを提供していないので、細胞選別の現実的なビューを提供しない可能性があるようなシステムは、トランスポートは、このフォームを排除するためで、古典的な井戸やカバースリップ上の細胞を培養することによって達成することができません。例えば、天然に側底膜からの放出宛ての材料が困難共振すること、カバースリップモデル内の他の細胞区画に分流することができる経細胞輸送のメカニズムをLVE。また、カバースリップとは対照的に、トランスウェルの構成は、細胞分化および膜の極性10,11,16-19関連付けられた生理学的に関連する特徴を生じさせる。例えば、トランスウェル上で成長させたCaco-2細胞は、微絨毛の存在およびタイトジャンクション、ドーム形成、および刷子縁酵素10,11,17の産生を含む成熟した腸細胞の特性を示す。他のパラメータは、GI上皮細胞攪拌を用いてトランスウェルに適用されるか、10をポンプすることができる( 例えば粘液の流れと収縮運動)および血管内皮細胞( 例えば 、血流)の場合、せん断応力などのより生理学的に関連する表現型を誘導することができますある種の細胞型16,18-20に必要な増殖因子および分化因子を生成する、16、および共培養物。それにもかかわらず、一つの細胞株は、しばしば、身体組織中の細胞から電子が異なることを考慮しなければならない。グラム。彼らはさまざまなレベルで、特定の決定基を表現し、それ故、本様々な機能や規制があります。例えば、のCaco-2細胞は、CYP3A4、薬物代謝酵素10,17,23 インビボでの経口治療薬の活性化および輸送に必要なすべてのトランスポータータンパク質および酵素を含有しない。これらの場合において、細胞株のサブクローンを、トランスフェクション、または転写剤の添加は、より良好な生理的条件17,23,24を反映するように細胞株を調節に使用することができる。
最適なトランスウェル·モデルを選択する際に、通気フィルタの様々な特徴を考慮しなければならない。透過フィルターは、異なる孔径で使用できる0.4から8ミクロンの範囲であり、輸送貨物のサイズに対応しなければなりません。細孔3μm以上が細胞浸潤、チェのために使用されるが、例えば、より小さな細孔サイズ(0.4-3μm)は、典型的には、小さな化学化合物の輸送の研究のために使用されているmotaxis、及び運動性の研究はその微生物は、免疫、および移行細胞が輸送される。いくつかの細胞が単層形成を妨げる、播種時に細孔を通って移動できるように細孔サイズおよび密度はまた、細胞密度および分化に影響を与える。また、透過性細胞の生存率および単層形成の評価のための支持影響撮像明瞭さ、及び細胞付着の材料。ポリエチレンテレフタレート(PET)フィルタは、半透明のポリカーボネートフィルターとは対照的に、位相差顕微鏡下で可視性を可能にする、透明である。強化された細胞の付着のために、コラーゲンやフィブロネクチンでプレコート透過性支持体は、市販されている。さらに、異なるウェルプレートのために調整されたフィルタの直径は、大きな直径( 例えば、6ウェルプレート中)を細胞単層の傍細胞漏出を増加させる傾向があることにより、透過性に影響を及ぼし得る。
トランスウェルモデルはappropria含め、確立されると、細胞型、培地組成、および通気フィルタのteの選択、細胞単層の状態は、TEERを用いて培養し、実験の段階で評価することができる。 2)培養条件、例えば上記のトランスウェル特性が、播種密度、培養、培地の組成およびpHの日数として; 3)物理的な要因が、TEER値は、細胞の種類、ソース、および継代数に関連付けられた1)の生得的な生物学的要因によって変化、温度のような、メディアボリューム、サンプリングスケジュール、攪拌/洗浄の程度、4)細胞間結合の完全性( 例えば 、サイトカイン、免疫細胞は、酸化的ストレス、薬理学的な添加剤など )10調節する病理学的および/ または化学的因子、 16,17。 TEERにより、障壁形成が定期的に培養期間中および実験操作後のTEERを監視することにより、各システム用に確立されなければならないことを示す最小のベースライン値に影響を与える様々な生物学的要因と環境要因である。 VA150-1,600Ω×cmの2〜16の範囲であり得る障壁形成のために十分なものとみなされる梅毒も、輸送される物質のサイズに依存し、その物質の受動的な傍細胞拡散が制限されるように、TEER≥350Ω×ながらCM 2は、ここに示すもののような比較的大規模なNCS(200 nm)での受動拡散を排除するようで、これは(CM 2×700Ω 例えば ≥)小さい薬物送達システムでは、より緊密な単層の場合とできない場合が必要です。このベースライン値はまた、H 2 O 2、ペプチドを貫通し、カルシウムキレート剤( 例えば EDTA)、プロテインキナーゼおよびホスファターゼ、および様々な他の調節分子を含む25-27、透過障壁を破壊するためのコントロールを使用して評価することができる。
TEERに相補的な、多数の透過性アッセイは、単層の完全性を検証し、傍細胞航空便を評価するために存在するRT。アルブミンのような、そのような測定は、公知に透水率(P app)を比較するために、蛍光UV、または放射性標識と結合することができるマンニトール、ルシファーイエロー、イヌリン、およびデキストランなどの種々のサイズの他の膜不透過性トレーサー分子、これらの溶質の値。傍細胞輸送を評価する場合には、研究中の化合物搬送さよりも小さいトレーサー分子を用いることが重要である。例えば、200nmの粒子の傍細胞輸送は、このような例で使用されるアルブミンのような小さいが、それでも比較的大きな分子の傍細胞漏出を引き起こすのに十分間接合部を開くであろう。対照的に、デンドリマー(〜5nm程度)のような小さな薬物送達ビヒクルの傍細胞輸送は、マンニトールなどの分子<5nmとを用いて評価されるべきである。傍漏れ試験は、従って、細胞接合用開口のサイズを示す、まだ、長いインキュベーション時間のために、それらは、細胞接合部の一時的中断を識別することができないtions。
障壁の完全性を評価する別のモードは、画像に隣接するセルを接続するタイトジャンクションである。本研究では、蛍光顕微鏡用のオクルディンを免疫染色し、まだ、タイトジャンクションに存在する種々の他のタンパク質は、接合接着分子(JAM)、クローディンおよびオクルディンファミリーの膜貫通タンパク質を含む、この分析のために使用することができる。ここでは、透過処理手順を省略して細胞外ドメインを染色し、まだ細胞内ドメインも染色することができる。この附則非特異的染色のための対照の使用、蛍光二次抗体のみ、タイトジャンクションが存在しない場合(ここでは、我々は低TEERを示す単層で細胞を使用)、またはタイトジャンクションの破壊記載されているジャンクション調節剤を使用しての使用です上記の。
経上皮輸送の例では、ICAM-1標的のNCを使用するが、トランスウェルシステムはまた、他の薬物ビヒクル処方物の輸送を収容する臨床研究や基礎的な経路を理解するための貴重な意味を持つS、治療および診断化合物、体内に見られる先天性の化合物、または上記の組み合わせ、。我々は、細胞単層は、NCコートにおけるターゲティング剤または治療貨物の放射性同位体標識を伴う、まだこの戦略はまた、直鎖状または分岐ポリマーを含む多様な化学的性質及び構造とのNCを追跡するために使用することができる横切る輸送を定量化するために記述した方法、デンドリマー、粒子、ミセル、リポソームなど 4,5,28,29。異なる同位体( 例えば 125 I、3 H、32 P など ) が小及び大分子の広範囲の輸送を定量化するために利用可能である:薬物担体も化学的および生物学的治療のみならず、機能的又は構造的完全性に影響を与えずにかさばる蛍光標識とは異なり化合物。放射性標識は、比較さより定量的な感度と速度を提供します例えば、ゲル電気泳動、PCR、質量分析、HPLC、および蛍光分光法などの輸送を測定する他の方法に関する。このラベルはまた、UV分光光度法およびウエスタンブロットを含む代替タンパク質活性アッセイと比較して、高速かつ正確である遊離ヨウ素含有量を評価することによって、劣化度(この例では、例えば 、タンパク質標的化剤および貨物)を決定するために使用することができる。遊離のヨウ素は、完全タンパク質のコンホメーションまたは分解の非存在下で生じ得る活性の変化を反映していないので、上記の代替の方法は、さらに、搬送材料の完全性を評価するために使用することができる。頂端室に無料の放射性同位元素との化合物を投与する場合にも、それは細胞単層および輸送の分画で見つかったラベルは、実際のタンパク質の分解や根尖空間から遊離ヨウ素の拡散に起因するかどうかは不明である。この制限を回避するために、頂端NC濃度月新鮮な培地と交換に頂端媒体を除去し、続いて細胞単層、および輸送を評価するための追跡期間の関連付けを可能にするために短い時間間隔に適用される。元のプールからの遊離放射性同位体の量は、最初に他の画分に漏れることがあるが、この値は無チェイス期間にサンプルから決定され、追跡期間が関与する状態から差し引くことができる。
輸送機構を評価するという点で、単層の完全性(TEER、漏れアッセイ、およびタイトジャンクション染色)を検証するために記載したのと同じ方法は、傍細胞経路を評価するために使用することができる。経細胞輸送は、細胞内輸送に関与する決定因子の薬理学的阻害剤( 例えば 、トランスフェリンクラスリン経路に関連する、カベオラ経路、 等に関連したコレラ毒素B)を使用することができ、これにより、具体的には、これらの決定因子を阻害するのに有効な濃度は、tは必要Oシステムごとに解明さ。私たちの研究で用いた阻害剤の代替はカベオラ媒介取り込み30の具体的なクロルプロマジン、カリウムの枯渇、クラスリン依存性エンドサイトーシスのための具体的な、およびゲニステインおよびメチル-β-シクロデキストリン(MβCD)を含む。薬理学的阻害の潜在的な非特異的効果を回避することができる他の戦略は、蛍光又は放射性同位体標識、コントロールなどの特異的リガンドの使用( 例えば、トランスフェリンまたはコレラ毒素B、上述したように)を使用して、これらの決定基を有する貨物輸送の共局在化、およびsiRNAを含むこれらの経路の調節要素の発現をノックダウンする。
本研究では、経上皮輸送に関する主要予備情報を提供する様々なパラメータに放射能データを変換するための方程式を示す。例えば、経上皮輸送の程度は、細胞当たりのNC又は輸送される分子で表される細胞に結合するか、または入射コンテンツ輸送効率を搬送細胞関連のNCまたは分子のパーセンテージで表され、異なる溶質との間の透過性の比較を可能にする輸送速度は、P アプリケーションによって示される。治療薬の大規模送達( 例えば、インビボ投与に必要な用量)のための標的NCの可能性を理解するために、これらの方程式は、巨視的スケールでの輸送の値を推定するために修飾することができる。例えば、単位面腸組織の面積量(mg / cm 2)と同様に、患者のGI管の両端の電位送達当たり搬送治療貨物の量は、次式から推定することができる
大量貨物輸送/ cm 2の組織=(CPM固有/ 基底外側活動)/ A
小腸= [(インプレッション側底 /比活性)が×TA] / Aを横切って輸送大量の貨物
トランスウェルインサートの進行、良好な輸送の生理学的複雑性を反映したモデルは、「ウッ」チャンバおよび動的流体流および血管のように、空気との接触を最小限に抑えることが含まれているチャンバを提供するマイクロ流体デバイスを含む。これらのモデルはまた、組織外植片が生体 17,18 内の前の検証にex vivoでの研究のために培養することができます。
結論として、この研究で使用される方法は、efficieの観点から、モデル薬物送達システムの輸送に関する有益な予備情報を提供しているNCY、細胞単層を通過する。この細胞培養モデルを用いて、我々は、in vivo試験の後続のための道を開く、経口薬物送達の文脈でICAM-1を標的とするナノキャリアプラットフォームの可能性を示し、まだにおいて見出さ細胞の障壁を横切る輸送を必要とする他のシステムのために修飾することができるボディ。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、RGのハワード·ヒューズ医学研究所と国立科学財団のフェローシップでサポートされ、資金は米国国立衛生研究所(助成R01-HL98416)および米国心臓協会(グラント09BGIA2450014)によって、SMに授与されました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
Pen Strep | Gibco | 15140 | |
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
Filipin | Sigma | F9765 | |
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
Wortmannin | Sigma | W1628 | |
Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
References
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