Summary
कई चिकित्सीय अनुप्रयोगों के शरीर में सेलुलर बाधाओं को पार दवा वाहक और उनके सामानों की सुरक्षित और कुशल परिवहन की आवश्यकता होती है. यह लेख ऐसे जठरांत्र (सैनिक) उपकला के रूप में सेलुलर बाधाओं को पार दवा nanocarriers (NCS), के परिवहन की दर और तंत्र का मूल्यांकन करने के तरीकों की स्थापना के एक अनुकूलन का वर्णन करता है.
Abstract
उप सुक्ष्ममापी वाहक (nanocarriers, NCS) विलेयता, स्थिरता, परिसंचरण समय, लक्ष्यीकरण, और रिलीज में सुधार के द्वारा दवाओं की प्रभावकारिता बढ़ाने के लिए. साथ ही, शरीर में सेलुलर बाधाओं से गुजर हस्तक्षेप की जरूरत है जहां ऊतकों में रक्त से रक्त परिसंचरण और परिवहन में चिकित्सीय NCS के दोनों मौखिक प्रसव के लिए महत्वपूर्ण है. सन्निकट कक्षों, या (ii) transcellular सेल शरीर के पार पहुँचाया माल endocytosis से भली भाँति रहे हैं जहां मार्ग,,, और स्रावित गूंथ कि जंक्शनों की क्षणिक व्यवधान के माध्यम से (i) paracellular मार्ग: सेलुलर बाधाओं को पार नेकां परिवहन द्वारा हासिल की है विपरीत कोशिका की सतह (transyctosis) पर. सेलुलर बाधाओं को पार डिलिवरी परिवहन में शामिल सेल सतह मार्करों के लिए विशेष रूप से है कि बाँध को लक्षित एजेंटों के साथ चिकित्सा विज्ञान या उनके वाहक युग्मन द्वारा मदद की जा सकती. यहाँ, हम whi एक मॉडल सेल बाधा पार हद और नेकां के परिवहन की व्यवस्था है, को मापने के लिए तरीके प्रदानचर्चा एक transwell डालने में स्थित एक झरझरा झिल्ली पर हो जठरांत्र की एक monolayer (सैनिक) उपकला कोशिकाओं के होते हैं. एक पारगम्यता बाधा के गठन transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तीर), एक नियंत्रण पदार्थ के transepithelial परिवहन, और तंग जंक्शनों के immunostaining को मापने के द्वारा की पुष्टि की है. एक उदाहरण के रूप में, ~ 200 एनएम बहुलक NCS एक चिकित्सकीय माल ले और एक सेल सतह निर्धारक कि लक्ष्य एक एंटीबॉडी के साथ लेपित हैं, जो उपयोग किया जाता है. एंटीबॉडी या चिकित्सकीय कार्गो रेडियो आइसोटोप पता लगाने के लिए 125 मैं के साथ लेबल है और लेबल NCS समय के अलग अवधि के लिए सेल monolayer के ऊपर ऊपरी सदन में जुड़ जाते हैं. अंतर्निहित कक्ष तक ले जाया कोशिकाओं और / या करने के लिए संबद्ध NCS पता लगाया जा सकता है. नि: शुल्क 125 मैं के मापन अपमानित अंश का घटाव की अनुमति देता है. paracellular मार्ग ऊपर वर्णित बाधा मापदंडों को नेकां परिवहन की वजह से संभावित परिवर्तनों के निर्धारण से मूल्यांकन किया है. Transcellular परिवहन मैंendocytosis और transcytosis रास्ते modulating के प्रभाव को संबोधित द्वारा निर्धारित है.
Introduction
बाहरी वातावरण और आंतरिक डिब्बों के बीच एक प्रवेश द्वार के रूप में शरीर अधिनियम में सेलुलर बाधाओं. यह जठरांत्र (सैनिक) पथ और खून 1-3 की बाह्य उजागर सतह को अलग उपकला अस्तर के लिए मामला है. सेलुलर बाधाओं को भी खून और पैरेन्काइमा और ऊतकों और अंगों के सेलुलर घटकों के बीच इंटरफेस का प्रतिनिधित्व करते हैं. शरीर में इन सेलुलर बाधाओं को पार करने की क्षमता चिकित्सीय और नैदानिक एजेंटों के कुशल प्रसव के लिए महत्वपूर्ण है 1 इस तरह के आदि रक्त फेफड़ों बाधा, रक्त मस्तिष्क बाधा के रूप में रक्त वाहिकाओं में आंतरिक endothelial अस्तर के लिए मामला है हस्तक्षेप की जरूरत है जहां परिसंचरण और ऊतकों / अंगों में.
चिकित्सीय या नैदानिक एजेंटों के वितरण में सुधार करने के लिए, इन यौगिकों उप सुक्ष्ममापी nanocarriers (NCS) में लोड किया जा सकता है. ये दवा वितरण वाहनों एक किस्म के साथ तैयार किया जा सकता हैchemistries और दवा विलेयता, सुरक्षा, फार्माकोकाइनेटिक्स, रिहाई, और चयापचय 4,5 अनुकूलन करने के लिए संरचनाओं. NCS भी चिकित्सकीय कार्रवाई 2,6 आवश्यक है जहां शरीर के क्षेत्रों के लिए आसंजन की सुविधा के लिए आत्मीयता या (आदि जैसे एंटीबॉडी, पेप्टाइड्स शक्कर, aptamers,) moieties को निशाना बनाने के साथ क्रियाशील किया जा सकता है. सेलुलर बाधाओं की सतह पर व्यक्त निर्धारकों को NCS का लक्ष्य निर्धारण आगे 2,6 में और / या इन अस्तर भर में परिवहन सुविधा कर सकते हैं.
चुनिंदा दो वातावरण के बीच पदार्थों के परिवहन की भूमिका सेल परतों के बीच कुछ अनूठी विशेषताओं की आवश्यकता है. Cavities के लुमेन का सामना करना पड़ शिखर झिल्ली झिल्ली आकारिकी और लिपिड, ट्रांसपोर्टरों, और रिसेप्टर्स 2 की संरचना के संबंध में, ऊतक interstitium की ओर उन्मुख basolateral झिल्ली से भिन्न होता है जिससे एक ऐसी सुविधा है, सेल polarity है. एक अन्य विशेषता कहनेवाला सन्धि शामिलआसन्न कोशिकाओं को जोड़ने एनएस. तंग जंक्शनों, विशेष रूप से junctional आसंजन अणुओं (जाम), occludins, और claudins कि फार्म प्रोटीन का नियमन करने के लिए लुमेन से सामग्री के पारित होने की अनुमति चुनिंदा paracellular परिवहन के रूप में जाना जाता है कोशिकाओं के बीच पदार्थों के परिवहन की अनुमति है या नहीं करने के लिए बाधा समारोह मिलाना basolateral अंतरिक्ष 3. शरीर में सेलुलर बाधाओं को कई प्राकृतिक और सिंथेटिक तत्वों (leukocytes, अणु, कण, और दवा वितरण प्रणाली) की बाइंडिंग, इसलिए, के उपयोग के साथ असुरक्षित क्षणिक और अपेक्षाकृत अहानिकर या अधिक लंबे समय तक हो सकता है और हो सकता है, जो सेल जंक्शन खोलने के लिए प्रेरित कर सकते हैं बाधा 2,5,7-9 भर अवांछित पदार्थ. नतीजतन, इस मार्ग transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) और अणुओं के निष्क्रिय paracellular प्रसार (यहाँ बुलाया paracellular रिसाव) को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, जिसके तहत एक बिजली के वर्तमान या एक ine की वृद्धि की paracellular रिसाव के लिए प्रतिरोध की कमी हुईbasolateral अंतरिक्ष में आर टी यौगिक सेल जंक्शनों के उद्घाटन से संकेत मिलता है, क्रमशः 5,10,11. धुंधला सभी सेल परिधि 5,10,12 के आसपास सेल सेल सीमाओं पर ध्यान केंद्रित प्रदर्शित होना चाहिए जहां इन तरीकों के पूरक हैं, ऊपर सूचीबद्ध तंग जंक्शन प्रोटीन के किसी भी, उनकी ईमानदारी का आकलन करने के लिए कलंकित किया जा सकता है.
वैकल्पिक रूप से, इस तरह के क्लैथ्रिन लेपित गड्ढ़े या caveolae बुलाया कुप्पी के आकार झिल्ली invaginations, के लिए जुड़े लोगों के रूप में विशेष सेल सतह निर्धारकों, लक्ष्य है कि दवा वितरण प्रणाली, intracellular डिब्बों से 5 दवा वितरण के लिए एक अवसर प्रदान करने, endocytosis द्वारा कोशिकाओं में vesicular तेज गति प्रदान कर सकते 13. इसके अलावा, endocytosis basolateral पक्ष में रिलीज, transyctosis के रूप में जाना जाता घटना, या transcellular परिवहन के लिए 14 सेल शरीर भर vesicles की तस्करी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए, endocytosis के कैनेटीक्स और तंत्र का ज्ञान intracellular एक का फायदा उठाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैएन डी paracellular मार्ग की तुलना में प्रसव के एक अपेक्षाकृत सुरक्षित और नियंत्रित मोड प्रदान करता है जो transcellular दवा वितरण के लिए. endocytosis के तंत्र शास्त्रीय रास्ते (क्लैथ्रिन और caveolin की मध्यस्थता endocytosis, और macropinocytosis) या गैर शास्त्रीय मार्गों की modulators के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है (जैसे कोशिका आसंजन अणु के मामले के रूप में (सीएएम) की मध्यस्थता endocytosis) 5,13,15 .
Intracellular तस्करी अक्सर मानक कुओं या coverslips में अध्ययन किया है, जबकि एक basolateral डिब्बे के अभाव सेल ध्रुवीकरण और सेल परतों में परिवहन अध्ययन करने की क्षमता अलग करता है. इस बाधा को दूर करने के लिए, सेल monolayers भर में परिवहन लंबे transwell एक ऊपरी (शिखर) कक्ष, कक्षों देते हैं और एक तंग monolayer फार्म जहां एक झरझरा पारगम्य झिल्ली से मिलकर जो, 10,11,16,17 सम्मिलित करता है, और एक कम उपयोग कर अध्ययन किया गया है (basolateral) कक्ष (चित्रा 1). इस विन्यास में, परिवहन में मापा जा सकता हैशिखर करने वाली basolateral, ऊपरी सदन में एक इलाज के प्रशासन सेल monolayer और अंतर्निहित झरझरा झिल्ली के माध्यम से परिवहन के बाद, और अंत में पहुँचाया माल की मात्रा का ठहराव के लिए निचले सदन में मध्यम इकट्ठा करके दिशा. Basolateral करने वाली शिखर दिशा में परिवहन भी ऊपरी सदन 5,10,12,16 से निचले सदन और बाद में संग्रह करने के लिए प्रारंभिक प्रशासन द्वारा मापा जा सकता है. विभिन्न तकनीकों से ऊपर वर्णित के रूप में, तीर और paracellular परिवहन assays सहित transwells, पर पारगम्यता बाधा के गठन को सत्यापित करने के लिए मौजूद हैं. इसके अलावा, कोशिकाओं सुसंस्कृत हैं, जिस पर पारगम्य फिल्टर, (प्रतिदीप्ति, confocal, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा जैसे) इमेजिंग विश्लेषण के लिए हटाया जा सकता है आगे सेल monolayer मॉडल के सत्यापन के साथ ही परिवहन के तंत्र के रूप में. विभिन्न ताकना आकार, सामग्री, और सतह के क्षेत्रों में उपलब्ध है जो झिल्ली प्रकार, का चयन, विभिन्न वास्तविक पर निर्भर करता हैऐसे पदार्थों का आकार या जाया जाएगा वस्तुओं, सेल प्रकार, और इमेजिंग विधि 16,18-20 रुपये. Transwell आवेषण भी कक्षों और कोशिका की सतह क्षेत्र की मात्रा स्थिरांक में जाना जाता है के रूप में जटिल स्तनधारी प्रणालियों की तुलना में परिवहन के नियंत्रण में है और सही मात्रा का ठहराव की सुविधा. Vivo में वितरण में शामिल कई कारकों आदि आंत्र बलगम की उपस्थिति, कतरनी तनाव, पाचन एंजाइमों, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, सहित, समाप्त हो जाते हैं, वहीं इन विट्रो मॉडल में यह छोटे पैमाने पर परिवहन के संबंध में उपयोगी प्रारंभिक जानकारी प्रदान करता है.
सेलुलर बाधाओं 10,11,16,17 भर नेकां परिवहन अध्ययन करने के लिए इन तरीकों का अनुकूलन वर्णन करने के लिए एक उदाहरण के रूप में, हम यहां सैनिक उपकला भर में नेकां के परिवहन के लिए संभावित एक मॉडल दवा वितरण के पारित होने का आकलन करने से मॉडलिंग की थी, जहां एक मामले का वर्णन मानव उपकला कोलोरेक्टल ग्रंथिकर्कटता (Caco -2) कोशिकाओं की एक monolayer के माध्यम से प्रणाली. इस उद्देश्य, सी के लिएएल्स पारदर्शी है और माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक 0.8 माइक्रोन रोमकूप पॉलीथीन terephthalate (पीईटी) फिल्टर (6.4 मिमी व्यास), पर, transwell आवेषण में सुसंस्कृत थे. पारगम्यता बाधा की स्थिति तीर, एक नियंत्रण पदार्थ, albumin, और तंग जंक्शनों, occludin प्रोटीन का एक तत्व के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी दृश्य के शिखर से basolateral परिवहन मापने के द्वारा मान्य है. लक्षित बहुलक नेकां के एक मॉडल 100 एनएम, nonbiodegradable polystyrene नैनोकणों से मिलकर प्रयोग किया जाता है. NCS सतह अकेले एक को लक्षित एंटीबॉडी के साथ सोखना या एक को लक्षित एंटीबॉडी का एक संयोजन और घटक या तो रेडियो आइसोटोप पता लगाने के लिए 125 मैं के साथ लेबल किया जा सकता है, जहां एक चिकित्सकीय कार्गो, द्वारा लेपित हैं. चयनित उदाहरण में, एंटीबॉडी कहनेवाला आसंजन अणु -1 (ICAM-1) को पहचानता है, एक प्रोटीन सैनिक उपकला की सतह पर व्यक्त की है (और अन्य) intracellular और transcellular परिवहन ओ सुविधाजनक बनाने के लिए दिखाया गया है जो कोशिकाओं, च दवा वाहक और उनके सामानों 21. कार्गो अल्फा galactosidase (α-लड़की), फेब्री रोग, एक आनुवंशिक lysosomal भंडारण विकार 22 के उपचार के लिए प्रयोग किया जाता एक चिकित्सकीय एंजाइम है.
आकार में लगभग 200 एनएम का लेपित NCS,, समय के अलग अवधि के लिए सेल monolayer के ऊपर शिखर चैम्बर के लिए जोड़ा गया है और 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated हैं, जिसके बाद 125 NCS पर मैं सेल monolayer और / या करने के लिए जुड़ा पाया जा सकता है कोशिकाओं नीचे basolateral कक्ष में पहुंचा दिया. नि: शुल्क 125 मैं के अतिरिक्त दृढ़ संकल्प लेपित नेकां परिवहन के अपमानित अंश और आकलन के घटाव की अनुमति देता है. परिवहन की व्यवस्था है और आगे transcellular परिवहन endocytosis और transcytosis के रास्ते modulating जब परिवहन में परिवर्तन का परीक्षण करके निर्धारित किया जाता है, जबकि ऊपर वर्णित मापदंडों के माध्यम से, paracellular मार्ग से संबंधित पारगम्यता बाधा में परिवर्तन का परीक्षण करके मूल्यांकन किया है.
"ontent> इन तरीकों को पूरी तरह सेलुलर बाधाओं को पार दवा वितरण के लिए क्षमता के मूल्यांकन की अनुमति, मूल्यवान सेलुलर बाधा मॉडलों के बारे में जानकारी, एक दवा वितरण प्रणाली के परिवहन की हद और दर, और इस तरह के परिवहन के तंत्र प्रदान करते हैं.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transwell आवेषण में एक सेल monolayer संवर्धन
- एक बाँझ, जैव सुरक्षा स्तर 2 सेल संस्कृति हुड में, 0.8 मिमी पीईटी संदंश के साथ (सांख्यिकीय महत्व के लिए, हालत प्रति 4 कुओं) 24 अच्छी तरह से थाली में सम्मिलित transwell ताकना जगह है. हुड में प्रवेश सभी सामग्री इथेनॉल के साथ निष्फल होना चाहिए.
नोट: फिल्टर के छेद के आकार नेकां प्रयोग किया जाता का मतलब आकार के लिए समझौते में चयनित होने की जरूरत है, झिल्ली भर में परिवहन की अनुमति है. इसके अलावा, सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम के लिए, प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत ही प्रयोग के भीतर चार दोहराता (वेल्स) की एक न्यूनतम, और 3 स्वतंत्र प्रयोगों की एक न्यूनतम आवश्यकता है.
- एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेल संस्कृति 4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज, 15% भ्रूण गोजातीय सीरम, और 1% पेन Strep के साथ पूरक DMEM मध्यम युक्त मध्यम, और गर्मी की तैयारी.
- सेल मध्यम और जगह में (Caco -2) कोशिकाओं मानव उपकला कोलोरेक्टल ग्रंथिकर्कटता पतला/ 2 सेमी 1.5 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर transwell डालने के ऊपरी (शिखर) चेंबर में सेल के समाधान के 200-400 μl,. सेल के माध्यम से 900 μl - 700 के साथ कम (basolateral) चैम्बर भरें.
- 1.3 चरण में संकेत दिया संस्करणों का उपयोग कर, हर 3-4 दिनों के ऊपरी और निचले सदन में मध्यम की जगह 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, और 16-21 दिनों के लिए 95% नमी में संस्कृति कोशिकाओं,. , निचले सदन से मध्यम महाप्राण ऊपरी सदन से मध्यम महाप्राण, ताजा माध्यम से ऊपरी सदन को भरने, और निचले सदन से भरना: सेल monolayer (बल्कि नीचे से) ऊपर दबाव बनाए रखने के लिए निम्न क्रम में मध्यम बदलें ताजा मध्यम.
2. तंग जंक्शनों के सैनिक उपकला पारगम्यता Transepithelial विद्युत प्रतिरोध का उपयोग बैरियर (तीर) और immunostaining के मान्यकरण
- अल्पकालिक भंडारण (कम से कम 2 सप्ताह) के लिए, एक इलेक्ट्रोलाइट समाधान में STX100 इलेक्ट्रोड डूबtion (0.1-0.15 एम KCl या NaCl). प्रणाली आंतरिक शॉर्ट सर्किट है और इलेक्ट्रोड समरूपता बनाए रखा है कि इतनी EVOM वाल्ट ओम मीटर पर इलेक्ट्रोड बंदरगाह के लिए इलेक्ट्रोड केबल से कनेक्ट करें. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, DH 2 हे के साथ कुल्ला और एक सूखी, अंधेरे हालत में दुकान.
- , इलेक्ट्रोड बाँझ 15 मिनट के लिए इथेनॉल में विसर्जित और 15 सेकंड के लिए शुष्क हवा की अनुमति देने के लिए. वैकल्पिक रूप से, इलेक्ट्रोड एक यूवी हुड में संग्रहित किया जा सकता है. प्रत्येक प्रतिरोध माप से पहले, एक बाँझ समाधान इलेक्ट्रोलाइट (फॉस्फेट बफर खारा, पीबीएस) या 0.1-0.15 एम KCl या NaCl समाधान में इलेक्ट्रोड कुल्ला.
- वाल्ट ओम मीटर प्रतिरोध सेटिंग के लिए सेट के साथ, खड़ी ऊपरी सदन में कम इलेक्ट्रोड और अच्छी तरह से नीचे छू निचले सदन में लंबी इलेक्ट्रोड के साथ, एक अच्छी तरह से transwell डालने युक्त में इलेक्ट्रोड जगह. प्रत्येक के लिए अच्छी तरह; EVOM पढ़ने स्थिर एक बार, (Ω ओम में दी गई) प्रतिरोध मूल्य रिकॉर्ड.
- प्रतिरोधकता (resistan की गणनाCE क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत; Ω × 2 सेमी) पृष्ठभूमि प्रतिरोध कोशिकाओं के बिना transwell आवेषण के (तीर) को घटाकर और झिल्ली सतह क्षेत्र से गुणा करके नमूनों की. प्रतिरोधकता मूल्यों सबसे अक्सर साहित्य में रिपोर्ट कर रहे हैं. (चर्चा देखें)
- तीर आमतौर पर सेल platting के क्षण से 2-3 सप्ताह लगते हैं जो एक पारगम्यता बाधा के गठन का संकेत है, एक अधिकतम और पठार को जन्म मूल्यों तक हर 1-2 दिनों माप दोहराएँ. पठार तीर मूल्यों और बाधा अखंडता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय सेल बीतने संख्या के अनुसार भिन्न हो सकते हैं.
- उच्च तीर (बाधा गठन के लिए मूल्य सीमा को या इसके बाद के बराबर) के साथ सेल monolayers में तंग जंक्शनों की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए, 15 मिनट के लिए ठंडे 2% paraformaldehyde के साथ ऊष्मायन द्वारा कोशिकाओं को ठीक. फिर, 1 ग्राम / एमएल विरोधी occludin के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए उन्हें पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने और सेते हैं. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को फिर से धो लें और 7.5 ग्राम / मिलीलीटर च के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए उन्हें सेतेluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी. बाधा गठन के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कम तीर के साथ कुओं का प्रयोग करें.
नोट: विरोधी occludin के लिए एक विकल्प के रूप में, वैकल्पिक तंग जंक्शन प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जा सकता है.
- सावधानी से तय monolayer जुड़ा हुआ है जिस पर फिल्टर झिल्ली आबकारी, और epifluorescence या confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग के लिए स्लाइड पर माउंट.
3. लक्षित वाहक के Transepithelial परिवहन का मूल्यांकन
- पहले 7 वर्णित के रूप में, 125 मैं के साथ लक्षित एंटीबॉडी (इस उदाहरण में ICAM-1 के खिलाफ माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, विरोधी ICAM,) लेबल. लेबल एंटीबॉडी के एंटीबॉडी पर 125 मैं सामग्री का निर्धारण करने के लिए प्रोटीन एकाग्रता और एक गामा काउंटर अनुमान लगाने के लिए ब्रैडफोर्ड परख का प्रयोग करें, तो मिनट (सीपीएम) प्रति मायने में विशिष्ट गतिविधि गणना / मिलीग्राम.
नोट: विशिष्टता के लिए नियंत्रित करने के लिए, फिर सेगैर लक्षित लेपित NCS तैयार करने के लिए उपयोग किया जाएगा जो लेबलिंग माउस आईजीजी, द्वारा प्रक्रिया पीट. एक चिकित्सकीय माल के परिवहन का अध्ययन करने के लिए, इस उदाहरण में कार्गो लेबलिंग प्रक्रिया, जैसे, अल्फा galactosidase (α-लड़की) को दोहराएँ. वैकल्पिक लक्ष्यीकरण एजेंट, गैर विशिष्ट नियंत्रण, या चिकित्सकीय कार्गो के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक तरीकों को भी यौगिकों लेबल और लेबल समकक्षों की एकाग्रता का अनुमान किया जा सकता है.
- युगल NCS की सतह के लिए एंटीबॉडी (हमारे उदाहरण में विरोधी ICAM) को लक्षित लेबल. इस उदाहरण में, 7 वर्णित के रूप में, सतह सोखना अनुमति देने के लिए 125 मैं विरोधी ICAM साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए polystyrene nanobeads (100 एनएम व्यास) सेते हैं.
नोट: गैर विशिष्ट नियंत्रण 125 मैं आईजीजी का उपयोग करें. एक कार्गो के परिवहन का पता लगाने के लिए, एंटीबॉडी और 125 मैं लेबल कार्गो (हमारे उदाहरण में α-लड़की) को निशाना बनाने का एक संयोजन का उपयोग करें.
- 3 मिनट के लिए 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र और आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला में गैर लेपित समकक्षों को हटा दें. संभावित कण समुच्चय (20-30 संक्षिप्त दालों) को बाधित करने के लिए कम बिजली में 1% गोजातीय सीरम pipetting द्वारा पीबीएस में albumin (BSA), और sonicate का उपयोग लेपित NCS युक्त गोली Resuspend.
- नेकां लक्षण वर्णन के लिए, आकार, polydispersity, और गतिशील प्रकाश बिखरने (विक्रेता निर्देशों का पालन) का उपयोग लेपित कणों की ζ क्षमता को मापने, और की संख्या यों 125 का उपयोग कण सतह पर प्रतिरक्षी अणुओं (जैसे विरोधी ICAM) को लक्षित मैं लेबल गामा काउंटर.
नोट: इन तरीकों गैर विशिष्ट और चिकित्सकीय समकक्षों के लिए दोहराया जा सकता है. लेपित कणों का आकार 200 एनएम के आसपास चलाता है.
- तीर और साथ मिला हुआ Caco -2 monolayers ऊपर ऊपरी सदन के लिए, 125 मैं एंटीबॉडी NCS, (56 NCI / एमएल जैसे 125 मैं विरोधी ICAM NCS) जोड़ें# 8805; पृष्ठभूमि पर 350 Ω × 2 सेमी (चर्चा देखने के लिए) (16-21 दिनों के बाद बोने). एक या एक से अधिक वांछित समय अंतराल के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. पारगम्यता बाधा पर NCS के प्रभाव का आकलन करने के लिए ऊष्मायन पहले और बाद में तीर (धारा 2.3) उपाय.
नोट: यह प्रक्रिया गैर विशिष्ट और चिकित्सकीय समकक्षों के लिए दोहराया जा सकता है.
- ऊपरी और निचले कक्षों से मध्यम लीजिए और 37 डिग्री सेल्सियस (ऊपरी सदन) या 1 मिलीलीटर DH 2 हे (निचले सदन) में 0.5 मिलीलीटर DMEM के साथ एक बार उन्हें धोने. एक गामा काउंटर का उपयोग कर कुल रेडियो आइसोटोप सामग्री की माप के लिए washes लीजिए.
- सेल अंश की माप के लिए, किनारों के आसपास कटौती, और सेल को मापने से पहले 10 मिनट (सेल सामग्री जारी करने के लिए), के लिए 1% ट्राइटन X-100 के साथ एक गामा काउंटर ट्यूब में सेते एक रेजर ब्लेड का उपयोग जैसे, पारगम्य फिल्टर आबकारी कुल रेडियोधर्मिता से जुड़े.
- मैं फिर से 125 को मापने के लिएकारण संभावित गिरावट, पहले मिश्रण पीबीएस में 3% BSA के 700 μl और 200 μl Trichloroacetic एसिड (टीसीए) के साथ (ऊपरी कम, या सेल भागों से) नमूना के 300 μl को परिवहन के दौरान NCS से या काम पर रखा. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. इस बीच इस समय, एक गामा काउंटर में इस नमूने की कुल रेडियोधर्मिता मापने.
- अपमानित प्रोटीन या 125 मैं अंश (सतह पर तैरनेवाला) से बरकरार प्रोटीन (गोली) अलग करने के लिए 5 मिनट के लिए 3000 XG पर अपकेंद्रित्र टीसीए नमूनों. नि: शुल्क 125 मैं अंश की रेडियोधर्मिता यों और centrifugation से पहले मापा कुल रेडियोधर्मिता से इस मूल्य घटाना. यह अपमानित नहीं है कि लेबल प्रोटीन की राशि प्रदान करेगा.
4. लक्षित nanocarriers के Transepithelial परिवहन तंत्र
- लेबल पहले से धारा 3.1 में वर्णित है और मैं के रूप में 125 के साथ albumin 7 की सूचना दी.
नोट: Albumin एक 66.5 हैइसलिए केडीए प्रोटीन और, एक अपेक्षाकृत बड़े पदार्थ. छोटे दवा वाहक के परिवहन का अध्ययन करते समय बड़ा वस्तुओं (जैसे 200 एनएम NCS यहां इस्तेमाल) के निष्क्रिय परिवहन के लिए एक वैध नियंत्रण, यह (चर्चा देखें) छोटे निष्क्रिय ट्रेसर अणुओं के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए यद्यपि.
- एल्बुमिन paracellular रिसाव, जैसा कि ऊपर वर्णित transwell आवेषण पर संस्कृति Caco -2 monolayers का उपयोग paracellular परिवहन आकलन करने के लिए.
- सेल monolayer ऊपर ऊपरी सदन मध्यम करने के लिए, (धारा 3.5 में वर्णित है) 125 मैं एल्बुमिन लड़की (रिसाव के बेसल स्तर दिखा नकारात्मक नियंत्रण), या 125 I-albumin और गैर radiolabeled एंटीबॉडी लक्षित NCS या तो जोड़ने. नेकां परिवहन जब परीक्षण की जांच की उन मैच चाहिए जो चयनित समय अंतराल (ओं), के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. पहले के दौरान तीर (धारा 2.3) को मापने, और संकेत के रूप में ऊष्मायन के बाद, तो कुल 125 मैं और फ्री 125 मैं मापन के लिए सभी भिन्न इकट्ठा. धारा 3 में नोट: 125 I-albumin और गैर radiolabeled नियंत्रण आईजीजी NCS के सहवर्ती अलावा एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- कहनेवाला जंक्शनों खोलने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, सेल मीडिया transwell डालने के ऊपरी और निचले कक्षों के लिए 5 मिमी एच 2 2 हे युक्त जोड़ने, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. फिर, तीर (धारा 2.3) को मापने और चयनित समय अंतराल के लिए ऊपरी सदन के लिए 125 मैं एल्बुमिन जोड़ें. एच 2 सेल जंक्शनों के ओ 2 प्रेरित खुलने के कारण Teer मूल्य क्षय की पहचान करने के लिए ऊष्मायन के दौरान विभिन्न बिंदुओं पर समय Teer उपाय.
- समानांतर प्रयोगों में, 50 माइक्रोन monodansylcadaverine किसी के साथ मिला हुआ Caco -2 monolayers incubating द्वारा 125 मैं लक्षित NCS की, भी transcytosis कहा जाता है, transcellular परिवहन मूल्यांकन (एमडीसी, क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis के अवरोध करनेवाला), 1 ग्राम / एमएल filipin (caveolar का अवरोध करनेवाला मध्यस्थता endocytosis), 0.5 माइक्रोन WORTMANNमें, या 20 माइक्रोन [5 - (एन एथिल-N-आइसोप्रोपिल) amiloride] (phosphatidylinositol 3 macropinocytosis में शामिल kinase [PI3K], का अवरोध करनेवाला) (macropinocytosis और सीएएम की मध्यस्थता endocytosis 15 के अवरोध करनेवाला EIPA,).
नोट: 125 मैं आईजीजी NCS और 125 मैं एल्बुमिन इन inhibitors के प्रभाव के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और अन्य तरीकों (जैसे siRNA तकनीक) और चयनात्मक अवरोध प्रदान कर सकता है.
- Monolayer पारगम्यता पर inhibitors के प्रभाव के लिए एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में, तीर दौरान पहले (धारा 2.3), और inhibitors और radiolabeled सामग्री के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन के बाद उपाय.
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Representative Results
लक्षित NCS की transepithelial परिवहन अध्ययन करने के लिए अपने सेल मॉडल की मान्यता के रूप में, चित्रा 2, Caco -2 सेल monolayers संगम ~ 12 दिन तक पहुँच 1.5 × 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी की एक घनत्व पर चढ़ाया और दिन 18 तक monolayer अखंडता को बनाए रखा है कि पता चलता है तीर (2A चित्रा) ने संकेत दिया है. यह कम तीर पर गरीब तंग जंक्शन लेबलिंग (17 Ω × 2 सेमी, 5 दिन की तुलना में, उच्च तीर (390 Ω × 2 सेमी, 14 दिन) के साथ monolayers में occludin पॉजिटिव तंग जंक्शनों की उपस्थिति चित्रा (2 बी) द्वारा मान्य किया गया था ).
नेकां तत्वों पर रेडियोधर्मी लेबल की ट्रेसिंग basolateral पक्ष के लिए ले जाया शुरू में शिखर कक्ष में जोड़ा इन घटकों की कुल राशि (नेकां एंटीबॉडी या कार्गो को लक्षित), उनके सेल जुड़े अंश, और उनके अंश निर्धारित करता है. इन मूल्यों को एक में नेकां परिवहन का वर्णन है कि विभिन्न मापदंडों की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैअधिक प्रासंगिक तरीके से, विशेष रूप से अपमानित समकक्षों का प्रतिनिधित्व करता है जो प्रत्येक अंश, से मुक्त 125 मैं सामग्री के घटाव के बाद. उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षी अणु, कार्गो अणु, या अनुप्रस्थ सेल monolayer निरपेक्ष परिवहन अनुमान लगाने के लिए गणना की जा सकती हैं जो एसोसिएटेड NCS की संख्या. इसके अलावा, सेल monolayer के लिए जुड़े अणुओं या NCS की कुल संख्या के संबंध में basolateral ओर ले जाया जाता है ने कहा कि अणुओं या NCS का प्रतिशत की दक्षता का अनुमान परिवहन कहा. अंत में, स्पष्ट पारगम्यता गुणांक (पी एपीपी), परिवहन की दर के लिए एक मानक पैरामीटर, अनुमान लगाया जा सकता है. यह इस प्रकार के रूप में इन मापदंडों गणना कर रहे हैं:
अणु जाया या NCS = सीपीएम basolateral × जाया (अणुओं जोड़ या नेकां / सीपीएम गयी गयी)
% अणुओं या NCS = 100 एक्स [सीपीएम (/ basolateral सीपीएम basolateral + सीपीएम पहुँचायासेल अंश)]
पी अनुप्रयोग (सेमी / एस) = (सीपीएम basolateral × वॉल्यूम.) / (ए × टी × सीपीएम गयी)
सीपीएम 125 मैं मायने रखता प्रति मिनट (सीपीएम) जोड़ा ऊपरी सदन में जुड़ जाते हैं, जहां, सेल monolayer अंश (CPMcell अंश), या निचले सदन (सीपीएम basolateral), और नेकां गयी या गयी अणु NCS की संख्या में हैं या शुरू में ऊपरी सदन के लिए जोड़ा अणुओं, एक फिल्टर झिल्ली की सतह क्षेत्र (2 सेमी), खंड है. ऊपरी सदन (एमएल) में मध्यम की मात्रा है, और टी ऊष्मायन के समय (ओं) है.
रेडियोधर्मी आइसोटोप को लक्षित एंटीबॉडी लेबलिंग है जब हमारे उदाहरण में, इस विश्लेषण एंटीबॉडी या सेल और सेल monolayer जुड़े एंटीबॉडी या पहुँचाया गया कि NCS का प्रतिशत प्रति जाया NCS के संदर्भ में डिग्री और परिवहन की दक्षता (चित्रा 3 ए और 3 बी का पता चलता है ), के रूप में हमपी अनुप्रयोग (चित्रा 3 डी) के संदर्भ में परिवहन की दर के रूप में करूँगा. 125 मैं विरोधी ICAM NCS के लिए हमारे उदाहरण में अनुमान के अनुसार इन मानकों, यह भी एक गैर लक्षित समकक्ष (चित्रा -3 सी और 3 डी) के लिए परिवहन दक्षता सापेक्ष प्रदर्शित करने के लिए नियंत्रण 125 मैं आईजीजी NCS के उन लोगों की तुलना में थे.
रेडियोधर्मी लेबल नेकां कार्गो पर शामिल किया जाता है, वर्णित मापदंडों फेब्री रोग (तालिका 1) के रूप में जाना एक आनुवंशिक lysosomal भंडारण विकार के उपचार के लिए प्रयोग किया जाता है हमारे उदाहरण में α-लड़की एंजाइम था जो कार्गो, के परिवहन को दर्शाते हैं. अनुरेखण द्वारा नेकां परिवहन की गणना करने के अलावा इस चिकित्सकीय एंजाइम का माल, transepithelial वितरण सेल प्रति जाया α-लड़की के अणुओं या जन के रूप में इसे व्यक्त करने से उदा, अनुमान लगाया जा सकता है.
अंत में, इस विधि paracellular मार्ग या करने के लिए परिवहन मार्ग का श्रेयtranscellular मार्ग. एमडीसी, filipin, और wortmannin (नियंत्रण हालत के संबंध में कोई अवरोध करनेवाला परिवहन के स्तर को कम नहीं किया था, जबकि उदाहरण के लिए, हमारे उदाहरण में, EIPA, Caco -2 सेल monolayers भर में 125 मैं विरोधी ICAM NCS (चित्रा -4 ए) के परिवहन कम ). यह विरोधी ICAM NCS transcellular परिवहन के लिए सीएएम की मध्यस्थता endocytosis उपयोग पता चलता है कि, लेकिन नहीं क्लैथ्रिन, caveolar, या macropinocytosis से संबंधित transcytosis. इसके अलावा, paracellular परिवहन Teer में कमी और विरोधी ICAM NCS के परिवहन के दौरान निचले सदन में एल्बुमिन paracellular रिसाव में वृद्धि होगा, जिसके तहत तीर (चित्रा 4 बी) के माप और एक एल्बुमिन निष्क्रिय परिवहन (चित्रा 4C) का उपयोग की संभावना से इनकार किया गया था कहनेवाला जंक्शनों के संकेत विघटन. हालांकि, विरोधी ICAM NCS साथ ऊष्मायन तीर या बदल जाया नहीं कर रहे हैं कि आईजीजी NCS नियंत्रित करने के लिए इसी तरह की 48 घंटे की अवधि में 125 I-एल्बुमिन paracellular रिसाव नहीं था. जैसासेल जंक्शनों के उद्घाटन और paracellular परिवहन के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण, एच 2 ओ 2 बेसल स्तर को तीर की कमी हुई और स्पष्ट रूप से basolateral चैम्बर के लिए 125 मैं एल्बुमिन रिसाव बढ़ाया.
चित्रा 1. एक तंग monolayer (16-21 दिनों के बाद बोने, तीर का गठन किया है जब तक एक जठरांत्र उपकला मॉडल पर लक्षित nanocarriers के transepithelial परिवहन के योजनाबद्ध. (ए) transepithelial परिवहन अध्ययन करने के लिए एक मंच के रूप में, Caco -2 सेल monolayers transwell आवेषण पर सुसंस्कृत हैं ≥ 350 पृष्ठभूमि पर Ω × 2 सेमी). इस तरह 125 मैं विरोधी ICAM NCS के रूप में एक दवा वितरण वाहन का एक उदाहरण है, कोशिकाओं के पार और अंतर्निहित झरझरा झिल्ली के माध्यम से परिवहन अध्ययन करने के लिए सेल monolayer ऊपर ऊपरी (शिखर) के चैम्बर में जोड़ा जाता है.कम (basolateral) कक्ष में मध्यम तो पहुँचाया सामग्री की मात्रा का ठहराव के लिए इकट्ठा किया जाता है. सेल monolayer के माध्यम से (बी) के परिवहन एक paracellular या transcellular / transcytosis मार्ग या तो के माध्यम से होता है. Ghaffarian एट अल से reproduced., जे रिलायंस नियंत्रित. 163 (1), 25-33 (2012). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए क्लिक करें
चित्रा 2. Transepithelial परिवहन के लिए एक मॉडल के रूप में Caco -2 monolayers. Caco -2 कोशिकाओं 1.5 × 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी पर transwell सम्मिलित करता है पर बड़े हो रहे थे. (ए) Transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) monolayer अखंडता का आकलन करने के लिए मापा गया था. डाटा ± SEM मतलब है के रूप में दिखाए जाते हैं, n = 3. (बीतंग जंक्शनों) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी) (उच्च Teer मूल्यों की तुलना में कम, क्रमशः दिन 5 या 14 पर, विरोधी occludin और टेक्सास रेड लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ immunolabeled. Ghaffarian एट अल से reproduced., जे रिलायंस नियंत्रित. 163 (1), 25-33 (2012). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए क्लिक करें
चित्रा 3. Caco -2 सेल monolayers भर विरोधी ICAM nanocarriers के परिवहन. Transwell आवेषण पर हो मिला हुआ Caco -2 monolayers 125 मैं विरोधी ICAM NCS या 125 मैं आईजीजी NCS शिखर कक्ष में जोड़ा साथ incubated रहे थे. Basolateral कक्ष में (एसी) 125 मैं सामग्री NCS transp की राशि की गणना करने के लिए, संकेत समय बिंदुओं पर मापा गया थासेल प्रति orted (प्रतिनिधि परिणाम देखें). पहुँचाया NCS (बी) प्रतिशत संयुक्त basolateral और सेल भागों में है कि करने के लिए basolateral अंश में पाया वाहकों के अनुपात के रूप में गणना की गई. प्रतिनिधि परिणाम के रूप में वर्णित (डी) स्पष्ट पारगम्यता गुणांक (पी एपीपी) 125 मैं विरोधी ICAM NCS या 125 मैं आईजीजी NCS के परिवहन की दरों को दर्शाती है, गणना की गई. डाटा ± SEM मतलब है के रूप में दिखाए जाते हैं, n = 4. Ghaffarian एट अल से reproduced., जे रिलायंस नियंत्रित. 163 (1), 25-33 (2012). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए क्लिक करें
चित्रा 4. एक के परिवहन के तंत्रCaco -2 monolayers भर NTI-ICAM nanocarriers. (ए) मिला हुआ Caco -2 monolayers भर में 125 मैं विरोधी ICAM NCS की Transcellular परिवहन 20 माइक्रोन EIPA की अनुपस्थिति या उपस्थिति में 24 घंटे में मूल्यांकन किया गया था, 1 ग्राम / एमएल filipin, 50 माइक्रोन एमडीसी, या 0.5 माइक्रोन wortmannin. (बी) के तीर paracellular परिवहन का आकलन करने के लिए, Caco -2 monolayers भर में 125 मैं विरोधी ICAM NCS के परिवहन के दौरान मापा गया था. NCS के अभाव में तीर मूल्यों नियंत्रण (धराशायी अंतराल मतलब मूल्य के SEM अंक) के रूप में दिखाया गया है. 5 मिमी एच 2 ओ 2 के साथ ऊष्मायन कहनेवाला जंक्शनों के उद्घाटन के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण है. (सी) 5 मिमी एच 2 ओ 2, आईजीजी NCS, या विरोधी ICAM NCS की अनुपस्थिति या उपस्थिति में सेल monolayer पार कर 125 I-albumin का स्पष्ट पारगम्यता गुणांक (पैप) के रूप में मापा Paracellular प्रोटीन रिसाव, मापा गया था चित्रा 3 में गणना के रूप में. डेटा बताते हैंn ± SEM मतलब है के रूप में, n ≥ 4. Ghaffarian एट अल से reproduced., जे रिलायंस नियंत्रित. 163 (1), 25-33 (2012). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए क्लिक करें
| कुल NCS जुड़े / सेल | Intracellular NCS / सेल | पहुँचाया NCS / सेल | % पहुँचाया | पहुँचाया α-लड़की अणुओं / सेल × 10 5 | पीजी जाया / सेल × 10 -3 | पैप (× 10 -8 सेमी / सेक) | |
| 3 घंटा | 663.4 ± 116.0 | 434.0 ± 76.8 | 243.6 ± 15.4 | 44.4 ± 6.7 | 1.8 ± 0.2 | 9.7 ± 1.2 | 8.1 ± 1.1 |
| 24 घंटा | 2024.8 ± 409.3 | 1218.9 ± 255.6 | 806.9 ± 164.1 | 40.6 ± 2.0 | 3.9 ± 0.5 | 21.3 ± 2.5 | 1.9 ± 0.4 |
| NCS = nanocarriers, α-लड़की = α-galactosidase, कुल NCS जुड़े / सेल = Intracellular NCS / सेल + NCS / सेल जाया;% जाया = 100 × (NCS / कुल NCS एसोसिएटेड जाया), पी एप्लिकेशन = स्पष्ट पारगम्यता गुणांक (सेमी / एस). इन मापदंडों के आगे विवरण के लिए तरीके देखें. (TNF-α Caco -2 कोशिकाओं), डेटा ± SEM (एन = 8 कुओं) का अर्थ है के रूप में दिखाया गया है. | |||||||
तालिका 1. विरोधी ICAM nanocarriers द्वारा α-लड़की के Transepithelial परिवहन चुनाव में विरोधी ICAM / 125 I-α-लड़की NCS की. Transcellular परिवहनधाराप्रवाह Caco -2 monolayers 3 घंटा और 24 घंटे में मूल्यांकन किया गया था. प्रतिनिधि परिणाम में वर्णित के रूप में, शिखर basolateral, और सेल अंशों की रेडियोआइसोटोप सामग्री, परिवहन के लिए प्रासंगिक विभिन्न मूल्यों में परिवर्तित किया गया. Ghaffarian एट अल से reproduced., जे (1), 25-33 (2012) रिलायंस. 163 नियंत्रित.
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Discussion
ऊपर चर्चा की विधियों का प्रयोग, सेलुलर बाधाओं को पार लक्षित NCS के परिवहन के अध्ययन के लिए एक सेल मॉडल इस तरह के मामले में रक्त में सैनिक लुमेन से परिवहन के मूल्यांकन के लिए प्रासंगिक है जो Caco -2 उपकला कोशिकाओं, के लिए दिए गए उदाहरण के रूप में स्थापित किया जा सकता है मौखिक दवा वितरण प्रणाली की. Transwell आवेषण में सैनिक उपकला सेल monolayers के संवर्धन एक सेल पारगम्यता बाधा के गठन की पुष्टि करने के लिए तीर का माप और तंग जंक्शनों की प्रतिदीप्ति immunostaining सक्षम होना चाहिए. इसके बाद 125 के साथ लक्षित और चिकित्सीय एजेंट के radiolabeling मैं सेल monolayers में और सैनिक भर में लक्षित NCS का तेजी से और संवेदनशील मात्रा का ठहराव प्रदान की. अंत में, यंत्रवत अध्ययनों परिवहन एक paracellular मार्ग बनाम एक vesicular मार्ग के माध्यम से होता आकलन है कि endocytic निरोधक, तीर, और एक एल्बुमिन paracellular रिसाव परख का उपयोग कर लागू किया गया.
इसी तरह के मॉडल स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर मैंअध्ययन के तहत सेलुलर बाधा के शारीरिक प्रकृति को प्रतिबिंबित करना चाहिए जो एक सेल प्रकार का चयन करें,. मानव या जानवर मूल से विभिन्न उपकला और endothelial कोशिकाओं 16,18-20 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. यहाँ वर्णित के रूप में ये अकेले ही संस्कृतियों के रूप में विकसित किया जा सकता है, या अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ इन कोशिकाओं के रूप में सह संस्कृतियों 16,18-20 (जैसे कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, pericytes, आदि बलगम स्रावित). ऐसे सह संस्कृति के रूप में, transwell डालने शर्तों सेल मीडिया 16,18-20 में भेदभाव कारकों के लिए संबंधित विकास दर और आवश्यकताओं को समायोजित करने के लिए modulated किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल झरझरा फिल्टर के विपरीत सतह पर मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं और astrocytes या pericytes की सह खेती शामिल हो सकता है, और प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए संबंधित मीडिया प्रत्येक कक्ष 19 में रखा जाना चाहिए. इसके अलावा, सेल लाइन पर निर्भर करता है, बाह्य मैट्रिक्स घटकों अनुरोध किया जा सकता हैझरझरा झिल्ली 18-20 को प्रभावी सेल लगाव के लिए uired. यह एक विशेष मॉडल इसलिए मूल्यों को प्राप्त किया है और इन तरीकों का प्रत्येक स्थिति के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता पर नियंत्रण, पारगम्यता बाधा मानकों और परिवहन दरों और तंत्र के संबंध में अलग बेसल स्तर प्रस्तुत करना होगा कि विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है.
ऐसे में यहाँ वर्णित वाले के रूप में transwell सम्मिलित करता है, व्यापक रूप से शिखर से एक basolateral डिब्बे में या ठीक इसके विपरीत 5,10-12,16,17, सेल monolayers भर में माल के परिवहन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. वे दो स्वतंत्र डिब्बों प्रस्ताव नहीं है और इसलिए सेल छँटाई के एक यथार्थवादी दृष्टिकोण नहीं दे सकता है के रूप में इस तरह के सिस्टम परिवहन के इस रूप को रोकना है क्योंकि यह शास्त्रीय कुओं या coverslips पर संवर्धन कोशिकाओं द्वारा प्राप्त नहीं किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, स्वाभाविक रूप से basolateral झिल्ली से रिहाई के लिए किस्मत सामग्री यह मुश्किल reso के लिए बना एक coverslip मॉडल में अन्य सेल के डिब्बों को दरकिनार किया जा सकता हैtranscellular परिवहन की व्यवस्था है lve. इसके अलावा, coverslips के विपरीत, transwell विन्यास सेल भेदभाव और झिल्ली ध्रुवता 10,11,16-19 के साथ जुड़े physiologically प्रासंगिक सुविधाओं को जन्म देता है. उदाहरण के लिए, transwells पर हो Caco -2 कोशिकाओं माइक्रोविली की उपस्थिति और तंग जंक्शनों, गुंबद गठन, और ब्रश बॉर्डर एंजाइमों 10,11,17 के उत्पादन सहित परिपक्व enterocytes की विशेषताओं, दिखा रहे हैं. अन्य मापदंडों ऐसे सैनिक उपकला कोशिकाओं आंदोलन का उपयोग transwells में लागू या 10 पंप किया जा सकता है (जैसे बलगम के प्रवाह और सिकुड़ा आंदोलनों) और संवहनी endothelial कोशिकाओं (जैसे रक्त प्रवाह), के मामले में कतरनी तनाव के रूप में एक और अधिक physiologically प्रासंगिक phenotype, पैदा कर सकते हैं , 16, और सह संस्कृतियों कुछ प्रकार की कोशिकाओं 16,18-20 के लिए आवश्यक विकास और भेदभाव कारकों का उत्पादन करने के लिए. फिर भी, एक सेल लाइनों अक्सर ई, शरीर के ऊतकों में कोशिकाओं से अलग करने पर विचार करना चाहिए. जी. वे विभिन्न स्तरों पर कुछ निर्धारकों को व्यक्त करने और, इसलिए, वर्तमान विभिन्न कार्यों और विनियमों सकता है. उदाहरण के लिए, Caco -2 कोशिकाओं CYP3A4, एक दवा metabolizing एंजाइम 10,17,23 के रूप में vivo में मौखिक चिकित्सा, की सक्रियता और परिवहन के लिए आवश्यक सभी ट्रांसपोर्टर प्रोटीन और एंजाइमों शामिल नहीं है. बेहतर शारीरिक स्थितियों 17,23,24 को प्रतिबिंबित करने के रूप में इन मामलों में, सेल लाइन उप क्लोन, अभिकर्मक, या ट्रांसक्रिप्शनल एजेंटों के अलावा सेल लाइन मिलाना इस्तेमाल किया जा सकता है.
एक इष्टतम transwell मॉडल के चयन में, पारगम्य फिल्टर के विभिन्न सुविधाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए. पारगम्य फिल्टर, अलग ताकना आकार में उपलब्ध हैं 0.4-8 मीटर से लेकर, और पहुँचाया माल के आकार को समायोजित करना होगा. Pores 3 माइक्रोन या बड़ा सेल आक्रमण, चे के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि उदाहरण के लिए, छोटे आकार ताकना (0.4-3 मीटर) आम तौर पर, छोटे रासायनिक यौगिकों के परिवहन की पढ़ाई के लिए उपयोग किया जाता हैmotaxis, और गतिशीलता का अध्ययन करता है माइक्रोबियल में, प्रतिरक्षा, और पलायन कोशिकाओं जाया जाता है. कुछ कोशिकाओं monolayer गठन precluding, बोने पर छिद्रों के माध्यम से विस्थापित हो सकता है के रूप में छेद के आकार और घनत्व भी, सेल घनत्व और भेदभाव को प्रभावित करता है. इसके अलावा, पारगम्य सेल व्यवहार्यता और monolayer गठन के आकलन के लिए समर्थन प्रभावों इमेजिंग स्पष्टता, और सेल लगाव की सामग्री. Polyethylene terephthalate (पीईटी) फिल्टर इसके विपरीत चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत दृश्यता, पॉली कार्बोनेट फिल्टर पारदर्शी करने की इजाजत दी, पारदर्शी हैं. बढ़ाया सेल लगाव के लिए, कोलेजन या fibronectin साथ precoated पारगम्य समर्थन करता है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. (उदाहरण के लिए 6 अच्छी तरह प्लेटें में) बड़ा व्यास सेल monolayer के paracellular leakiness वृद्धि करते हैं जिससे इसके अलावा, विभिन्न अच्छी तरह से प्लेटों के लिए निकाला जाता है जो फिल्टर व्यास,,, पारगम्यता को प्रभावित कर सकते हैं.
एक transwell मॉडल appropria सहित, स्थापित हो जाने के बादसेल प्रकार, मीडिया रचना, और पारगम्य फिल्टर के ते चयन, सेल monolayer की स्थिति तीर का उपयोग संवर्धन और प्रयोगात्मक चरणों के दौरान मूल्यांकन किया जा सकता. 2) संवर्धन शर्तों, ऐसे aforementioned transwell विशेषताओं, बोने घनत्व, संस्कृति, मीडिया रचना और पीएच में दिन के रूप में, 3) भौतिक कारकों हालांकि, तीर मूल्यों सेल प्रकार, स्रोत, और बीतने संख्या के साथ जुड़ा हुआ 1) जन्मजात जैविक कारकों के साथ अलग अलग , जैसे तापमान के रूप में, मीडिया मात्रा नमूना अनुसूची, और आंदोलन / वाशिंग की डिग्री है, और 4) सेल जंक्शन अखंडता (जैसे साइटोकिन्स, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, oxidative तनाव, औषधीय additives, आदि) 10 मिलाना कि रोग और / या रासायनिक कारकों, 16,17. कारण Teer, बाधा गठन नियमित रूप से संस्कृति की अवधि के दौरान और प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के बाद तीर निगरानी के द्वारा प्रत्येक प्रणाली के लिए स्थापित किया जाना चाहिए का संकेत एक न्यूनतम आधारभूत मूल्य को प्रभावित करने वाले विभिन्न जैविक और पर्यावरणीय कारकों के लिए. VA150-1,600 Ω × 2 सेमी 16 के बीच लेकर कर सकते हैं जो बाधा गठन के लिए पर्याप्त माना जाता है कि लूस, भी जाया जा सकता पदार्थ के आकार पर निर्भर करते हैं कि पदार्थ के निष्क्रिय paracellular प्रसार प्रतिबंधित है कि इस तरह के, तीर ≥ 350 Ω × जबकि 2 सेमी ऐसे यहाँ (200 एनएम) दिखाया वाले के रूप में अपेक्षाकृत बड़े NCS के निष्क्रिय प्रसार रोकना लगता है, इस कड़ी monolayers (जैसे ≥ 700 Ω × 2 सेमी) की आवश्यकता होती है, जिसमें छोटे दवा वितरण प्रणाली, के लिए मामला नहीं हो सकता. यह आधारभूत मूल्य भी एच 2 ओ 2, पेप्टाइड्स मर्मज्ञ, कैल्शियम chelators (जैसे EDTA), प्रोटीन kinases और फास्फेटेजों, और विभिन्न अन्य नियामक अणुओं 25-27 सहित पारगम्यता बाधा बाधा पहुँचा के लिए नियंत्रण का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता.
तीर करने के लिए पूरक, कई पारगम्यता assays monolayer अखंडता को सत्यापित करने और paracellular परिवहन उद्योग का आकलन करने के लिए मौजूदRT. एल्बुमिन की तरह, इस तरह के उपाय और ज्ञात करने के लिए पारगम्यता दर (पी एपीपी) की तुलना करने के लिए एक फ्लोरोसेंट यूवी,, या रेडियोधर्मी लेबल के साथ मिलकर किया जा सकता है जो mannitol, लूसिफ़ेर पीला, inulin, और dextrans, के रूप में विभिन्न आकार के अन्य झिल्ली अभेद्य ट्रेसर अणुओं, इन विलेय के लिए मान. Paracellular परिवहन मूल्यांकन, यह अध्ययन के तहत जाया परिसर से छोटी है कि एक ट्रेसर अणु उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, 200 एनएम कणों की paracellular परिवहन जैसे हमारे उदाहरण में प्रयुक्त एल्बुमिन के रूप में छोटे, फिर भी अभी भी अपेक्षाकृत बड़े अणुओं के paracellular रिसाव का कारण पर्याप्त कहनेवाला जंक्शनों खुलेंगे. इसके विपरीत, dendrimers (~ 5 एनएम) के रूप में छोटे दवा वितरण वाहनों की paracellular परिवहन ऐसे mannitol के रूप में अणुओं <एनएम 5, का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाना चाहिए. Paracellular रिसाव पढ़ाई इसलिए सेल जंक्शन खोलने के आकार से संकेत मिलता है, अभी तक कारण लंबी ऊष्मायन बार वे सेल Junc की क्षणिक अवरोधों की पहचान नहीं कर सकतेमाहौल.
बाधा अखंडता के मूल्यांकन का एक और मोड छवि को सन्निकट कक्षों कनेक्ट कि तंग जंक्शनों है. इस अध्ययन में, हम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए occludin immunostained, अभी तक तंग जंक्शन में उपस्थित विभिन्न अन्य प्रोटीन जंक्शन आसंजन अणु (जाम), claudin, और occludin परिवारों की transmembrane प्रोटीन सहित, इस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम एक permeabilization कदम बायपास करने के लिए बाह्य डोमेन दाग, अभी तक intracellular डोमेन भी कलंकित किया जा सकता है. इस के लिए अनुपूरक गैर विशिष्ट धुंधला के लिए नियंत्रण का उपयोग, फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी केवल, तंग जंक्शनों की अनुपस्थिति (यहाँ, हम कम तीर दिखा एक monolayer साथ कोशिकाओं का इस्तेमाल किया), या तंग जंक्शनों के विघटन सूचीबद्ध जंक्शन का नियमन करने एजेंटों का उपयोग का उपयोग कर रहा है ऊपर.
Transepithelial परिवहन के हमारे उदाहरण में हम ICAM-1-लक्षित NCS उपयोग करें, लेकिन transwell प्रणाली भी अन्य दवा वाहन तैयार करने की परिवहन accommodatesएस, चिकित्सीय और नैदानिक यौगिकों, नैदानिक अध्ययन या मौलिक रास्ते में से समझने के लिए मूल्यवान प्रभाव के साथ शरीर, या ऊपर का एक संयोजन में पाया सहज यौगिकों. हम सेल monolayers भर में परिवहन यों तो वर्णन तरीकों नेकां कोट में लक्षित एजेंट या चिकित्सकीय कार्गो के रेडियो आइसोटोप लेबलिंग शामिल है, अभी तक यह रणनीति भी रेखीय या branched पॉलिमर सहित विभिन्न chemistries और संरचनाओं, dendrimers, कणों के साथ NCS ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है , मिसेल्स, liposomes, आदि 4,5,28,29. के कार्यात्मक या संरचनात्मक अखंडता को प्रभावित किए बिना, दवा वाहक बल्कि रासायनिक और जैविक चिकित्सा विज्ञान ही नहीं: विभिन्न आइसोटोप (जैसे 125 मैं, 3 एच, 32 पी, आदि) छोटे और बड़े अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला के परिवहन यों के लिए उपलब्ध हैं भारी फ्लोरोसेंट लेबल के विपरीत परिसर,. Radiolabeling तुलना में अधिक से अधिक मात्रात्मक संवेदनशीलता और गति प्रदान करता हैऐसी जेल वैद्युतकणसंचलन, पीसीआर, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, HPLC, और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में परिवहन उपाय है कि अन्य रणनीतियों, के लिए. इस लेबल भी यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री और पश्चिमी धब्बा सहित वैकल्पिक प्रोटीन गतिविधि assays, की तुलना में तेजी से और सही है, जो नि: शुल्क आयोडीन सामग्री, आकलन करने से गिरावट की डिग्री (हमारे उदाहरण में जैसे प्रोटीन को निशाना बनाने एजेंट और कार्गो) निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नि: शुल्क आयोडीन पूरी तरह प्रोटीन रचना या गिरावट के अभाव में हो सकता है कि गतिविधि में परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं करता है हालांकि, बाद से, ऊपर वैकल्पिक तरीकों आगे ले जाया सामग्री की अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. शिखर चेंबर में मुफ्त radioisotopes के साथ यौगिकों प्रशासन इसके अलावा, जब यह सेल monolayer और पहुँचाया भागों में पाया लेबल असली प्रोटीन गिरावट या शिखर अंतरिक्ष से मुक्त आयोडीन की प्रसार से परिणाम स्पष्ट नहीं है कि. इस सीमा को नाकाम करने के लिए, शिखर नेकां एकाग्रता हो सकता हैताजा माध्यम के बदले में शिखर मध्यम हटाने के बाद सेल monolayer,, और परिवहन के मूल्यांकन के लिए एक पीछा अवधि तक संघ की अनुमति के लिए एक संक्षिप्त समय के अंतराल के लिए लागू किया जा. मूल पूल से मुक्त radioisotopes की राशि शुरू में अन्य भागों में रिसाव हो सकता है, इस मूल्य में कोई चेस अवधि के साथ नमूनों से निर्धारित होता है और एक पीछा अवधि को शामिल स्थितियों से घटाया जा सकता है.
परिवहन की व्यवस्था का आकलन करने के संदर्भ में, एक ही तरीके (Teer, रिसाव assays, और तंग जंक्शन धुंधला) paracellular मार्ग का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता monolayer अखंडता मान्य के लिए वर्णित है. Transcellular परिवहन के लिए, intracellular तस्करी में शामिल निर्धारकों के औषधीय inhibitors (जैसे transferrin क्लैथ्रिन रास्ते के लिए जुड़े, caveolar रास्ते, आदि के लिए जुड़े हैजा विष बी) का इस्तेमाल किया जा सकता है, जिससे विशेष रूप से उन निर्धारकों को बाधित करने के लिए प्रभावी सांद्रता टी की जरूरतओ हर सिस्टम के लिए elucidated किया. हमारे अध्ययन में इस्तेमाल inhibitors के लिए विकल्प caveolae की मध्यस्थता तेज 30 के लिए विशिष्ट chlorpromazine और पोटेशियम की कमी, क्लैथ्रिन पर निर्भर endocytosis के लिए विशिष्ट, और genistein और मिथाइल β-cyclodextrin (MβCD), शामिल हैं. औषधीय inhibitors के संभावित गैर विशिष्ट प्रभाव से बच सकते हैं कि अन्य रणनीतियों प्रतिदीप्ति या रेडियो आइसोटोप लेबलिंग, नियंत्रण के रूप में विशिष्ट ligands का उपयोग (जैसे transferrin या हैजा विष बी, ऊपर संकेत के रूप में) का उपयोग कर इन निर्धारकों के साथ पहुँचाया माल की सह स्थानीयकरण, और siRNA शामिल इन रास्ते के नियामक तत्वों की अभिव्यक्ति पछाड़ना है.
इस अध्ययन में, हम transepithelial परिवहन के संबंध में कुंजी प्रारंभिक जानकारी प्रदान करने वाले विभिन्न मापदंडों को रेडियोधर्मिता डेटा परिवर्तित करने के लिए समीकरण प्रदर्शित करता है. उदाहरण के लिए, transepithelial परिवहन की डिग्री, NCS या सेल प्रति जाया अणुओं का प्रतिनिधित्व करती है कोशिकाओं बांधता है या प्रवेश करती है कि सामग्री के परिवहन की दक्षता जाया सेल जुड़े NCS या अणुओं का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती है, और अलग विलेय के बीच पारगम्यता की तुलना के लिए अनुमति देता है जो परिवहन की दर, पी app द्वारा signified है. चिकित्सा विज्ञान की बड़े पैमाने पर वितरण (जैसे vivo में प्रशासन के लिए आवश्यक खुराक) के लिए लक्षित NCS की क्षमता को समझने के लिए, इन समीकरणों एक macroscopic पैमाने पर परिवहन मूल्यों अनुमान को संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, इकाई सतह आंतों के ऊतकों के क्षेत्र (मिलीग्राम / 2 सेमी) के रूप में एक मरीज की सैनिक पथ भर में संभावित प्रसव प्रति जाया एक चिकित्सकीय कार्गो की राशि, निम्न समीकरण से अनुमान लगाया जा सकता है
मास कार्गो जाया / 2 सेमी ऊतक = (सीपीएम basolateral / विशिष्ट गतिविधि) / ए
छोटी आंत = [(सीपीएम basolateral / विशिष्ट गतिविधि) × टीए] / A पार पहुँचाया मास कार्गो
Transwell आवेषण से आगे बढ़ाने, बेहतर परिवहन के शारीरिक जटिलता को प्रतिबिंबित मॉडल है कि गतिशील द्रव का प्रवाह और रक्त वाहिकाओं के रूप में, हवा के साथ संपर्क कम करता है कि एक निहित कक्ष प्रदान जो "ussing" चेम्बर्स और microfluidic उपकरणों, शामिल हैं. इन मॉडलों को भी ऊतक explants पूर्व विवो 17,18 में मान्यता के लिए पूर्व vivo अध्ययन के लिए संवर्धित किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं.
अंत में, इस अध्ययन में इस्तेमाल किया तरीकों के कुशल संचालन के मामले में, एक मॉडल दवा वितरण प्रणाली के परिवहन के बारे में मूल्यवान प्रारंभिक सूचना प्रदान की हैncy, सेल monolayers भर में. हम बाद में vivo अध्ययन के लिए जिस तरह फ़र्श, मौखिक दवा वितरण के संदर्भ में ICAM-1-लक्षित nanocarrier मंच की क्षमता का प्रदर्शन किया, अभी तक में पाया सेलुलर बाधाओं को पार परिवहन की आवश्यकता होती है अन्य प्रणालियों के लिए संशोधित किया जा सकता है इस सेल संस्कृति मॉडल का उपयोग करना शरीर.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस काम हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन आरजी के लिए, और स्वास्थ्य (अनुदान R01-HL98416) के राष्ट्रीय संस्थानों और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (अनुदान 09BGIA2450014) द्वारा एस एम सम्मानित करने के लिए धन का एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
References
- Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
- Mrsny, R. J. Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Torchilin, V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).
- Sadekar, S., Ghandehari, H. Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).
- Muro, S. Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems. J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).
- Volkheimer, G. Persorption of particles: physiology and pharmacology. Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).
- Dejana, E. Endothelial cell-cell junctions: happy together. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).
- Jung, T., et al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).
- Bareford, L. M., Swaan, P. W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).
- Tuma, P. L., Hubbard, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).
- Muro, S., et al. A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1. J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).
- Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).
- Delie, F., Rubas, W. A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).
- Kuhnline Sloan, C. D., et al. Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier. Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).
- Kasper, J., et al. Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).
- Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1. J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).
- Hsu, J., et al. Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease. J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).
- Schmiedlin-Ren, P., et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).
- Hughes, J., Crowe, A. Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics. J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).
- Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport. J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).
- Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).
- Kapus, A., Szaszi, K. Coupling between apical and paracellular transport processes. Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).
- Hood, E. D., et al. Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo. J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).
- Simone, E., et al. Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124. Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).
- Vercauteren, D., et al. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
