Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מבחני כדאיות לתאים בתרבית

Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/50645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

Summary

תרכובות טיפוליות לעתים קרובות נבחנות ראשון במבחנה עם מבחני כדאיות. ספירת תאים עיוורת על ידי צופה אנושי יכולה להיות רגישה מאוד לשינויים קטנים במספר תאים, אבל לא להעריך את התפקוד. מבחני כדאיות ממוחשבים, כפי שמתואר כאן, יכולים להעריך גם מבנה ותפקוד באופן אובייקטיבי.

Abstract

ספירת תאים ידנית על מיקרוסקופ הם אמצעי רגיש להערכת כדאיות סלולרית אבל הם גוזלים זמן ולכן יקר. מבחני כדאיות ממוחשבים הם יקרים במונחים של ציוד, אבל יכולים להיות מהיר יותר ואובייקטיבי יותר מספירת תאים ידנית. הדו"ח הנוכחי מתאר את השימוש בשלושה מבחני כדאיות כזה. שניים ממבחנים אלה הם אינפרא אדום ואחד הוא זורח. שני מבחני אינפרא אדום להסתמך על Imager אודיסיאה 16 קצת. assay אינפרא אדום אחת משתמש כתם DRAQ5 לגרעינים בשילוב עם כתם ספיר לcytosol והיא דמיינו בערוץ 700 ננומטר. Assay אינפרא אדום האחר, ב- Cell מערבי, משתמש בנוגדנים כנגד חלבוני cytoskeletal (החלבון קשור α-טובולין או microtubule 2) ומתייג אותם בערוץ 800 ננומטר. Assay הכדאיות השלישי הוא assay זורח נפוץ עבור ה-ATP, אבל אנחנו משתמשים ברבע מהנפח המומלץ לחסוך בעלויות. מדידות אלה הן כל ליניארי ולתאם עם מספר ceLLS מצופה, אבל להשתנות ברגישות. כל שלושה מבחני לעקוף מיקרוסקופיה זמן רב ולדגום את כולו היטב, ובכך להפחית טעות דגימה. לבסוף, כל מבחני יכולים בקלות להסתיים בתוך יום אחד של סוף הניסוי, המאפשר למספר גדול יותר של ניסויים להתבצע בתוך פרקים זמן קצרים. עם זאת, כולם מסתמכים על ההנחה שמספרי תאים להישאר בפרופורציה לעוצמת אות לאחר טיפולים, מתוך הנחה שהוא לפעמים לא פגש, במיוחד עבור ה-ATP הסלולרית. יתר על כן, אם תאי גידול או קיטון בגודל לאחר טיפול, זה עשוי להשפיע על עוצמת אות מבלי להשפיע על מספר תא. אנו מסיקים כי כל מבחני הכדאיות, כוללים ספירה ידנית, סובלים ממספר האזהרות, אבל שמבחני הכדאיות ממוחשבים הם שווים את ההשקעה הראשונית. שימוש בכל שלושת מבחני יחד מניב תצוגה מקיפה של מבנה ותפקוד תאיים.

Introduction

Assay הכדאיות הנפוץ ביותר במדעים הביולוגיים כרוך בספירת תאים. עדות לכך הוא על ידי ניתוח של 200 הפרסומים (האחרונים) העליונים שהופיעו בPubMed עם אחת ממילות המפתח "במבחנה" או "תרבות" ב2013/04/29 ו2013/4/30. פרסומים אלה, מבחני 23.5% משמשים ספירת תאים, כוללים ספירת מספר תאים ידנית, מספר תאים אוטומטי סופרים עם תוכנת הדמיה, והדרה כחולה Trypan. Assay חי / המלח שימש ב1% מפרסומים אלה. מספר הפרסומים באמצעות MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) ברומיד -2,5-diphenyltetrazolium) assay לכדאיות טבולים היה 11%. סקר זה של הספרות גם מראה כי מספר הפרסומים באמצעות מבחני כגון MTT בשיתוף עם מבחני ספירת תאים היה רק ​​.3.5%. למרות המגמה להשתמש assay כדאיות אחד בפני עצמו, הערכת תפקוד תאי בשילוב עם מספר תא נראית הבחירה הטובה ביותר להערכתי סלולריתntegrity. ספירת תאים על ידי עצמם אינן מספיקות, כי התאים שנותרו לא יכולים להיות פונקציונליים או בריאים, למרות שהם נמצאים בבאר 1,2. לעומת זאת, אמצעי פונקציונלי, כגון ATP עשוי להגדיל או להקטין בהיעדר שינויים מקבילים במספר התאים. שחרר את הסוגר של צגי בקרת חילוף חומרים ממספר התא עולה כי אף פעם לא צריכים לשמש מבחני ה-ATP וMTT כassay הכדאיות הבלעדי. בדו"ח הנוכחי, שלושה מבחני כדאיות שיסקרו שני מבנים תאיים ותפקוד מטבולים מתוארים, לתמונה מקיפה יותר של יושרה סלולרית מכל assay אחד בפני עצמו יכול להרשות לעצמו.

שניים מהמבחנים שלנו דורשים תרמי אינפרא אדום שמודדת הקרינה ב700 ו800 ערוצי ננומטר. רעש הוא נמוך באורכי הגל אינפרא אדום, מה שמוביל ליחסי אות לרעש גבוהים יותר 3. תרמי אודיסיאה שאנחנו משתמשים יש טווח דינמי 4.5 יומן וקצת מעמיקה של 16, translatinגרם ל2 16 או 65,536 גוונים של אינפרא אדום. זה יכול להיות בניגוד להדמיה בצבע של 8 ביט, אשר רק מאפשרת 2 8 או 256 גוונים של צבע לכל אורך גל. לפיכך, יש הדמיה 16 סיביות רזולוציה עדינה. יש לציין שהתמונות אינפרא אדומות המקוריות לעתים קרובות pseudocolored ירוק (800 ננומטר) ואדום (700 ננומטר) בדוחות שפורסמו למצגת. הדמית אודיסיאה משמשות בדרך כלל גם למערבי סופג ובתוך תא המערבונים 4-7. ב- Cell מערבונים על תאים קבוע פורמלדהיד להשתמש נוגדנים ראשוניים כנגד כל חלבון של עניין ולתייג אותם בתורו עם נוגדנים משני ניאון אינפרא אדום. טכניקה זו ידועה להיות שימושי במיוחד עבור נקודות קצה זירחון 6. ב- Cell המערבונים שלנו, אנחנו להכתים תאים קבועים לחלבוני cytoskeletal α-טובולין או microtubule העצבי החלבון קשור 2 (MAP2) בערוץ 800 ננומטר. חלבונים אלה נמצאים בשפע מספיק כדי להניב יחס אות לרעש גבוה. אנחנו גם להכתים הצלחות שלנו ב700ערוץ ננומטר לגרעינים עם כתם DRAQ5 ולציטופלסמה עם כתם ספיר. שני חלבוני cytoskeletal וDRAQ5 + כתמי ספיר ובכך משקפים את המבנים הסלולר.

Assay הכדאיות השלישי מודד תפקוד מטבולים והוא נקרא "תא כייל Glo". ב assay מבוסס לוציפראז זה, ערכי הארה הם ביחס ישירים לרמות ה-ATP. מבחני ה-ATP משמשים בדרך כלל כדי לכמת תאי קיימא 8-12. עם זאת, כולל את המילה "כייל" בשמו של assay הוא קצת מטעה, כי פלט ה-ATP לכל תא יכול להשתנות כפונקציה של טיפולי רעל ולכן הוא לא תמיד באופן יחסי לתא מספר 8. יכולות גם להיות מושפעות רמות ה-ATP על ידי מקצבי היממה 13 ועל ידי חלוקת תא ותא 14 בידול 15. אף על פי כן, assay-ATP שמוצג כאן הוא פשוט לביצוע ושימושי כי ה-ATP הוא מדד חזק של חילוף חומריםכדאיות 16-21, אם לא מספר סלולרי כשלעצמה. שימוש assay זה כדי להשלים את האינפרא אדום ב- Cell מערבונים לכן מניב תמונה מקיפה יותר של יושרה סלולרית מכל assay אחד בלבד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

סכמטי של הפרוטוקולים מודגם באיור 1.

1. תא ציפוי

פלייט תאים בצלחות 96, גם בצפיפויות ציפוי שונות (איור 2). לבדיקות ליניאריות בשורת תאי נוירובלסטומה N2a, 2.5k צלחת, 5k, 10k, 15k ותאים לכל טוב ב3 או 6 בארות / קבוצה. לבדיקות ליניאריות בתאי עצב בקליפת המוח עכברוש עיקרי, 25k צלחת, 50k, 100k, 200k ותאים לכל טוב ב3 או 6 בארות / קבוצה. אם שורות תאים או תאים ראשוניים של עניין נראים בריאים בצפיפויות שונות ציפוי, צלחת ובסביב צפיפות תאים האופטימלית עבור אותו סוג התא.

שים לב: במחקר הנוכחי, תאי N2a היו מצופים ב100 תקשורת μl ונוירונים בקליפת המוח עיקרי ב200 תקשורת μl על צלחות המיועדות לאידוי נמוך יותר. למידע מפורט על טיפול בתא, תקשורת, סרה, אנטיביוטיקה, וטיפולי רעל, נא עיין Unnithan et al. עבור טלפונים סלולר N2als 8 וPosimo et al. לתרבויות קליפת המוח עיקריות 22.

    1. חזור על ציפוי בצלחת 96, גם שנייה. צלחת אחת תהיה assayed ל( איור 2 א) ה-ATP ואחר עם מבחני אינפרא אדום (איור 2). אף אחד לא יכול להשתמש באותה הצלחת ה-ATP ומבחני אינפרא אדום, כי התאים חייבים להיות lysed פתוחים למדידות ATP תאיים.
    2. הקפד צלחת לפחות 3 בארות נוספות לחיסור רקע במבחני אינפרא אדום בצפיפות ציפוי האופטימלית (עמודת 2; איור 2).
  2. הוסף מדיה ללא תאים או יותר ביוקר, מים סטריליים לבארות החיצוניות בשורות ו-H ובעמודות 1 ו 12. הימנע מהסתמכות על נתונים מבארות בשולי, כפי שהכדאיות היא לעתים קרובות נמוך כאן מהשפעות של שיפועי אידוי תקשורת וטמפרטורה. בעיות מסוג זה עם microplates נקראות בדרך כלל השפעות קצה 23,24. אל תשמרו את הבארות הללו ריקיםכי אז שורות B ו-G ועמודות 2 ו -11 סובלים מאפקט הקצה.
    השפעות קצה עשויות להיות מופחתות על ידי דוגרים צלחת טרי שנזרעה בטמפרטורת חדר בתנאי סביבה לפני ההעברה לCO 2 באינקובטור 24. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה על ידי Carralot מתאר שיטת תיקון מתמטית לצלחות microtiter באמצעות עמודת שליטה יחידה 23. אוליבר ועמיתיו השתמשו תוכננה במיוחד חממת צלחת microtitration האוויר נאלצה לצמצם את שינויי הטמפרטורה 25. אם אפקט הקצה הוא דאגה משמעותית, תאי יציבות microplate (למשל BT & Incorporated C) ניתן לרכוש כדי ליצור microenvironment הומוגנית עם לחות גבוהה ואפילו הדרגתיים בטמפרטורה.
  3. אם יותר מאשר בארות מוצגים באיור 1 יש צורך כי דילולים מגיב נוספים או יותר צפיפות ציפוי ייבחנו, השתמש בבארות הקצה לחיסור רקע.
  4. חכה לילה עבור קובץ מצורףשל תאים וassay למחרת בבוקר, כמתואר להלן.

2. אור פלורסנט ATP Assay

  1. עקוב אחר ההמלצות של תא יצרן כייל Glo לכינון מחדש של המצע עם חיץ ולפעמי דגירה.
    1. הסר 50 או 150 תקשורת μl משל מדיה ציפוי 100 או 200 μl, בהתאמה. מעט פחות מ50 μl יישאר מאחור בבאר. הוסף 25 μl של חומרים כימיים (מצע בתוספת חיץ) לעמודים 2-6 (איור 2 א) בדילול 1:2.
      הערה: היקפים שונים של מדיה שנותרו לאחר ההסרה יכולה לדלל או לרכז את חומרים כימיים assay ATP באופן דיפרנציאלי על פני בארות. תשמור על עצמך, כדי להבטיח כי רמת נוזל בכל טיפים פיפטה רבות היא שווה ערך. מדוד את הנוזל שנשאר בבארות בחרו על פני הצלחת עם טפטפת באופן מיידי לפני שמוסיף את ריאגנטים assay ATP כדי להבטיח דיוק. אם קיימת שונות גבוהות משיעורי ההפרש של evapor התקשורתation על פני השטח של הצלחת, להסיר את כל המדיה הישנה ולהוסיף את אותו הנפח של תקשורת טרי או שנאגרו מלוח פוספט (PBS) לכל הבארות באופן מיידי לפני תוספת של חומרים כימיים assay-ATP. אם הצלחות סובלות מרמות המשתנה של אידוי, נסה לעבור לצלחות אידוי נמוכות משחקן המשנה קורנינג. בלוחות האחרונים, 60 בארות פנים שמוצגים באיור 2 סובלות רק מממוצע של 0.995% ± לילה אידוי 0.41 תקשורת. יש אפוא השתנות זניחות בתקשורת קול בזמן של assay.
    2. בטורים 7 עד 11, שורות ב 'עד ד', להסיר את התקשורת מספיק לעזוב 50 μl מאחור, כמפורט לעיל, ולהוסיף 50 μl של חומרים כימיים בדילול 1:1.
    3. בטורים 7 עד 11, שורות E עד G, לצאת מתאים באמצעי תקשורת 100 μl ולהוסיף ריאגנטים 100 μl, שוב בדילול 1:1. החברה ממליצה לשל חומרים כימיים 100 μl צריך להיות מדולל 1:1 באמצעי תקשורת 100 μl.
      הערה: על מנתכדי לחסוך בעלות, זה אפשרי לקצץ בהמלצות אלה הן בנפח והן בדילול. עם זאת, לפני עושה את זה, ודא שהוא אינו מפחית את הליניאריות והרגישות של assay.
    4. ברגע שנפח ספציפי אחד וגורם לדילול של חומרים כימיים הנמצאים להיות משביע רצון, להישאר עם אותם בכל הניסויים הבאים. הקריטריונים לנתונים מספקים מתוארים בסעיף התוצאות.
    5. ניתן refrozen ריאגנטים מחדש שאינו בשימוש ושימוש במועד מאוחר יותר כדי לחסוך בעלויות. לדברי היצרן, ניתן לאחסן חומרים כימיים מחדש ב -20 מעלות צלזיוס במשך 21 שבועות עם אובדן ~ 3% מפעילות.
  2. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 2 דקות או שייקר nutating 10 דקות. אם חלק מהצלחת הוא להיות assayed למדידה שונה ולא יכול להיות מזועזע אותו, להתסיס את התקשורת עם pipetting למעלה ולמטה פשוט רק בבארות של עניין. עם זאת, בועות מוגזמות שנוצרו במהלך שלב זה יפריעו לומיםפלט nescent.
    1. 10 דקות אחרי תוספת של חומרים כימיים, להעביר 60 μl של התוכן גם לתוך צלחות 96, גם לבנה. ערכי הארה גבוהים יותר בצלחות הלבנות מאשר בצלחות שקופות או שחורות משום שהם משקפים את האור כלפי מעלה לכיוון הגלאי.
      הערה: מניסיוננו, תאים לשרוד טוב יותר באידוי הנמוך, צלחות שחקן משנה ברורות מצלחות אחרות. צלחות ספציפיות אלה אינן נמכרים עם קירות לבנים. שנית, הצלחות אטומות דופן ובעל תחתית ברורה יקרות יותר צלחות ברורות לחלוטין. אם אחד מעביר את הנוזל זורח לצלחות הלבנות, ניתן לכבס את הצלחות הלבנות ושימוש חוזר, חסכון בעלות של שימוש בצלחות הלבנות חדשות עבור כל ניסוי. העברת נוזל היא אפוא האפשרות זולה יותר בטווח הארוך.
    2. פופ כל בועות אוויר לפני שקרא את הצלחת עם מחט או, עדיף, עם אוויר מאולץ מנורת פיפטה העברה פלסטיק. קראו את הצלחת על luminometer עם 1 שניות זמן אינטגרציה (recomme החברה0.25-1 שניות זמן אינטגרציה מספיק כnds). קראו את דקות 10-12 הצלחת לאחר תוספת של חומרים כימיים assay-ATP. עיתוי הוא קריטי להשוואה על פני צלחות שונות, משום שהאות זורח היא חולפת עם קצב דעיכה מהיר, כפי שמוצג על ידי גילברט ועמיתים 26.
  3. ממוצע הערכים זורח מ3 או 6 בארות בכל קבוצה ועלילה כפונקציה של מספר התאים בscatterplot (ראה איור 3). לחסר ראשון ערכים ממוצע רקע הארה של הבארות המתאימות הריקות (בארות 2B - 2G, בארות 11B - 11D, ובארות 11E - 11G) מכל נקודת נתונים מתאימה. תהיינה שלוש קבוצות שונות עבור כל צפיפות ציפוי ב( איור 2 א) ניסוי הראשוני הזה. רמות ה-ATP עשויות להיות מתואמות באופן ליניארי עם צפיפות תאים באחת או את כל הקבוצות האלה. להמשיך עם הדילול הגבוה ביותר של חומרים כימיים שעדיין נותן תוצאות משביעות רצון לחסוך בעלויות. קריטריונים לתוצאות משביעות רצון מתוארים in סעיף התוצאות.
    שים לב: עם התקשורת השתמשה במחקר הנוכחי, ערכי רקע עם assay זה אינם גבוהים וזה אפשרי לדלג על הבארות ריקות. עם זאת, יצרנית Promega מדווח הבדלים בהארה עם תקשורת ותרבות שונה. המחקר הנוכחי משתמש Hyclone העוברי Clone III, גרסה סינתטית של סרום שור עוברי לתאי N2a ועגל בסרום שור לתרבויות בקליפת המוח עיקריות. לדברי היצרן, נסיוב העגל קטן של ערכי הארה אבל לא להפחית את הרגישות של assay. עם זאת, אם זה של דאגה משמעותית, לדלל ריאגנטים assay-ATP בPBS במקום תקשורת בזמן של assay.
    1. אם התאים נראים לגדול בצורה לא אחידה על פני עמודות לילה, נסה מנסה לאמוד אותם תוך 6 שעות של ציפוי. עם זאת, לזכור כי הצפיפות בזמן הרגיל של assay (לדוגמא, 24 שעות לאחר טיפול) היא הצפיפות שבה חייבת להיות מושגת ליניאריות.

3. Infrareמבחני ד

  1. בבוקר שלאחר ציפוי, לתקן את התאים בצלחת השנייה בטמפרטורת חדר במנדף. הקפד ללבוש כפפות לצעד זה ולהשליך מקבע כפסולת כימית כי פורמלדהיד הוא חומר מסרטן. הוספת פורמלין 4% וסוכרוז 4% בחיץ פוספט 0.1 M לתקשורת הקיימת בדילול 1:1. התקשורת יכולה להיות גם לשטוף עם PBS לפני תיקון במקבע כוח מלא. כך או טכניקה עובדת היטב.
    1. דגירה במקבעת עבור 20 דקות ולאחר מכן להסיר את מקבע ולשטוף 3x ב200 μl PBS.
  2. אחסן את הצלחת ב-PBS עם 0.2% אזיד הנתרן על 4 מעלות צלזיוס אם assay לא יתקיים באותו היום. אם לא, המשך עם assay ולמקם את התאים בחסימת פתרון כדי למזער ספציפי מחייב של נוגדנים.
    1. לדלל את 01:01 בלוק דגי סרום אודיסיאה בPBS ולהוסיף 0.3% Triton-X 100 כpermeabilizer תא. הפוך פתרון חסימה מספיק כמו גם antibo הראשוני והמשניפתרונות dy, כך ניתן pipetted 35 μl לכל אחד. עם זאת, אם הרבה בועות שנצפו במהלך pipetting, לעשות> 50 μl עבור כל טוב, אחרת הבועות להגיע לתוך התאים והנוגדנים בלוק מכריכה. בועות סבון מוגזמות תופיע ככתם עגול בלא כתם באמצע הבאר. נסה להתאים את pipetting אם זה מתרחש.
    2. דגירה בפתרון חסימה זו ל30-60 דקות בטמפרטורת חדר.
      שים לב: גם 5% אלבומין בסרום שור או סרה רגיל מאותו המין כמו נוגדנים משני יכול לשמש כחסימת פתרונות לשמור על עלות של בלוק סרום דגים. חסימת פתרונות יכול להשפיע על ביצועים של הנוגדן. לפיכך, הבלוק האופטימלי לכל נוגדן הוא הטוב ביותר שנקבע באופן אמפירי.
      הערה: חוקרי מקום כלשהו ב- Cell לוחות מערביים שבייקרים בincubations. עם זאת, זה לא הכרחי.
  3. הפוך את הנוגדנים העיקריים: 1:10,000 דילול אנטי α-טובולין(עכבר חד שבטי, טבלת 1) ו1:2,000 דילול אנטי MAP2 (עכבר חד שבטי, טבלת 1). נוגדנים אלה הם ספציפיים לחלבונים של עניין בדגמי הסלולר אלה; סגוליות הוא חיוני לכל כתם immunocytochemical.
    הערה: MAP2 הוא סמן לנוירונים ומתאים לתרבויות עצביות / גליה מעורבות. התרבויות לאחר הלידה מוצגות כאן גם מכילות כמה גליה (~ 25%) כי האסטרוציטים מופיעים לראשונה ביום עוברי 18, עם המספרים שלהם הגיעו לשיא בתקופת הילוד מוקדם 27,28. אי אפשר שלא להבחין בין האסטרוציטים ונוירונים בATP ומבחני DRAQ5 + ספיר. על מנת למדוד את הנוירונים והאסטרוציטים בנפרד, השתמש MAP2 בו זמנית ומכתים GFAP ב800 ו700 ערוצי ננומטר, כפי שתואר על ידי Mullett ועמיתים 4,29, עוזב את DRAQ5 + ספיר. עם זאת, אם כל התאים בתרבות רוצים להיות מוערכים, להשתמש בסמן הפאן סלולארי כגון α-טובולין, β-אקטין, או GAPDH.
    הערה: דילולים אלה עברו אופטימיזציה עבור N2a ותאים בקליפת המוח ראשוניים וייתכן שלא להכליל לכל דגם. לכן, נסה לפחות שני דילולים עיקריים נוגדנים, אחד במחצית השמאלית של צלחת ואחד על החצי הימני (ראו איור 2). לחלופין, נסה 3-4 דילולים של נוגדנים ראשוניים על 3 בארות כל אחת. למשל, הדילול המומלץ בגיליון להוסיף נוגדן יכול להיות מוקף בשינויים כפול. במילים אחרות, אם הדילול המומלץ לimmunocytochemistry הוא 1:500, גם לנסות 1:250 ו1:1,000 גורמי דילול.
    1. מדולל נוגדנים ב1:01 בלוק אודיסיאה: PBS ולהוסיף 0.3% Triton-X. כדי לחסוך בעלויות, נסה לעשות את הנוגדנים בפתרון החסימה שהיה מוחל על התאים בשלב 3.2.1 על ידי הסרת פתרון זה בסוף הדגירה. שמור את התאים ב-PBS בעת עושה את זה, אסור שהם יתייבשו.
    2. דגירה בנוגדנים ראשוניים או 1-2 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C. לחולשה בinding נוגדנים וחלבונים שהם לא בשפע, incubations הלילה יכולה לעזור להגביר את האות.
      הערה: השאר לפחות 3 בארות בחסימת פתרון לחיסור רקע בכל ריכוז נוגדנים משני (בארות 2B-2D ובארות 2E-2G באיור 2 ב). אל תחשפו בארות אלה לכל נוגדן ראשוני כלשהו. הם חושפים את המידה ספציפי מחייב על ידי הנוגדנים משני ושימושיים לחישובים של יחסי אות לרעש. אם יש חשש שהנוגדנים משני יביאו לרמות גבוהות של כריכה ספציפי, כולל גם בארות שליטה שאינם נחשפות לנוגדן ראשוני או המשני אבל מקבלות את אותו המספר של שוטף. ההבדל בין בארות אלה ובארות "המשני בלבד" יגלה כריכה נגרמת על ידי הנוגדנים משני לבד את המידה ספציפיות. בבדיקה שלנו על תאי N2a עכבר, לאותת בעוצמה עם שני נוגדנים אנטי עכבר לבד היה 0.557 ± 0.032, אות עם נגד ארנבנוגדנים משני לבדו היו 0.533 ± 0.041, לאותת שאין נוגדנים משני היו 0.357 ± 0.003, ואות עם נוגדנים ראשוניים ומשניים הייתה 11.867 ± 0.911. יש לנו ובכך לא נצפו רמות גבוהות של ספציפי מחייב גם בעת השימוש משני נוגדנים אנטי עכבר על תאי עכבר. יש יצרן של כמה נוגדנים משניים אינפרא אדום, אנחנו ממליצים לקנות רק מאוד חוצי adsorbed אלה. שים לב שהריכוז של נוגדני IgG משניים עשוי להשתנות בהתאם למקור.
  4. לשטוף את הנוגדנים ראשוניים עם 3 שוטף של 200 μl PBS לכל טוב, 10 דקות כל אחד. ניתן לשמור נוגדנים ראשוניים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות ב0.2% אזיד הנתרן ושימוש חוזר עד כתמים זעירים של הפסולת לעין כאשר הפתרונות מתקיימים עד אור. זה נעשה רק כדי לחסוך בעלויות. אם העלות היא לא בעיה, לעשות נוגדנים טריים לכל שימוש.
  5. לדלל את הנוגדנים משני על ידי 1:1,000 או 1:2,000 ב1:01 בלוק אודיסיאה: PBS עם 0.3% Triטון X (איור 2). מוסיף את דילול 1:1,000 למחצית העליונה של הצלחת ו1:2,000 למחצית התחתונה של הצלחת. ריכוזים אלה יכולים להיות מופחתים עוד יותר כדי לחסוך בעלות, אלא לבדוק ליניאריות לפני שאתחייב לכך.
    הערה: הקפד להוסיף את פתרון נוגדנים משני המתאים לבארות רקע החיסור (עמודה 2 באיור 2).
    1. אם חלבון שני יהיה מאושר במקום של DRAQ5 + ספיר, תאי תווית עבור α-טובולין או MAP2 עם עז 700 ננומטר אנטי העכבר IgG והחלבון השני בערוץ 800 ננומטר עם נוגדנים ראשוניים ממינים אחרים מאשר עכבר. ערוץ ננומטר 800 יש פחות רקע מערוץ 700 ננומטר וצריך להיות שמורה לחלבון הקריטי ביותר של עניין.
    2. דגירה בנוגדנים משני במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר במגירה מהאור.
  6. לשטוף את נוגדנים משני עם 3 שוטף של 200 μl PBS לכל טוב, 10 דקות כל אחד.
  7. הפוך את פתרונות DRAQ5 + ספיר. במחצית השמאלית של הצלחת, לדלל DRAQ5 1:10,000 (0.5 מיקרומטר ריכוז סופי) וספיר 1:1000 ב-PBS עם 0.3% Triton-X (עמודות 3 - 6; איור 2). למחצית הימנית של הצלחת, לדלל DRAQ5 1:20,000 (0.25 מיקרומטר) והספיר 1:2000 (עמודות 7-10; איור 2).
    הערה: DRAQ5 משמש להימכר במניות 1 מ"מ במקום מניית 5 מ"מ. חלק מהדיווחים שפורסמו בעבר ולכן משמשים 1:4,000 או 1:2,000 דילולים של DRAQ5 8.
    1. כדי לחסוך בעלות, אם שתי צלחות נמצאים assayed בו זמנית, באותו DRAQ5 + פתרונות ספיר ניתן להשתמש בשתי צלחות ברצף, pipetting אותו מהצלחת הראשונה והוספתו לשנייה. אם אותו הפתרונות ישמשו פעמיים באופן זה, השתמש אותם בתוך יום אחד. לא ניתן לשמור פתרונות DRAQ5 המדולל + ספיר על 4 מעלות צלזיוס או קפוא לשימוש מאוחר יותר.
    2. דגירה בפתרונות אלה עבור 30 דקות בטמפרטורת חדר, הרחק from אור. אם הזמן הוא קצר ו+ פתרונות ספיר DRAQ5 לא לעשות שימוש חוזרים בצלחות אחרות עם גרורות שונות, להוסיף כתמים אלה לפתרונות נוגדנים משני בשלב 3.5 דגירה במשך שעה 1.
      שים לב: אל תוסיף DRAQ5 + פתרון ספיר לבארות רקע החיסור (עמודה 2 באיור 2) שלא צריכה להיות מוכתמות בארות אלה בערוץ 700 ננומטר.
  8. לשטוף 3x הצלחת עם 200 μl PBS לכל גם ל10 דקות כל אחד. שים 0.2% אזיד הנתרן בכביסה PBS הסופי אם הצלחת הולכת להיות מוכתמת עם נוגדנים משני גלוי טווח אחרים לאחר ההדמיה אינפרא אדום היא מלאה.
  9. סרוק את הצלחת על Imager אודיסיאה. בגין על ידי סריקת הלוחות בעוצמה 5 ו169 רזולוציה מ"מ. כך או "איכות בינונית" או הגדרות "באיכות נמוכה" מספיקות. החברה אינה משחררת מידע מסנן עירור / פליטה מפורטת. עם זאת, מסנני הפליטה הם ברוחב של כ 20 ננומטר והם התרכזו סביב 720 ו820 ננומטר, על פי היצרן.
    הערה: ניתן לסרוק צלחות ועדיין רטוב כחוקרים ייתכן שירצו להמשיך ולהכתים אותם עם סמנים אחרים. עם זאת, החברה מציעה בפרוטוקול האינטרנט שלה, כי צלחות יבשות לגרום פחות אות התפשט להיטב היטב. אם תסרוק את שניהם רטובים ולאחר מכן יבש כדי להשוות את הנתונים, כדי להיות בטוח כדי להסיר את כל PBS מן הבאר, כי מלחים שנותר לאחר ההתאדות יכול להוביל לקרינת רקע גבוהה לאורך הקצוות.
    1. אודיסיאה Imager סורק למעלה ודרך החלק התחתון של הצלחת. צלחות מיצרנים שונים עשויות לדרוש קיזוז פוקוס שונה, כי החלק התחתון של הבארות יכול להשתנות בעובי והעומק שלהם בצלחת. נסה סריקה בקיזוז מוקד שונה ולראות בו את היחס הגבוה ביותר אות לרעש וcrispest (רובם בפוקוס) אות מושגת: 2.5 מ"מ, 3.0 מ"מ, 3.5 מ"מ, 4.0 מ"מ. נסה גם כדי למדוד את העומק של הבאר מהחלק התחתון של צלחת עם שליט כדי לאשר שתמצאgs על האודיסיאה. זכור כי הפלסטיק בתחתית הבאר יכול להוסיף גובה נוסף למדידות השליט. צלחות שחקן המשנה ששמשו במחקר הנוכחי דורשות התמקדות קיזוז 4.0 מ"מ.
    2. השתמש בפונקציה המערבית ב- Cell בתוכנה כדי למקם את הרשת בגודל הנכונה על גבי התמונה של הצלחת ולייצא את הנתונים ל-Microsoft Excel. בדוק את הערכים "משולבים בעוצמה" של אותו בארות על פני קיזוז מוקד שונה כדי למצוא את ערכי הקרינה הגבוהים ביותר. מוקד קיזוז שמניב היחס הגבוה ביותר אות לרעש (אות בבארות immunostained לעומת "אין שליטה שלילית עיקריות" בארות) הוא אחד לבחור להלן.
    3. ברגע שאחד ממוקדים של קיזוז יוחלט על, לסרוק שוב במרווחים קטנים יותר. לדוגמא, אם האות הבהירה ביותר הייתה ב3.5 ו4.0 מ"מ, נסה לסרוק ב3.6, 3.7, 3.8, ו3.9 מ"מ ותראה אם ​​יש שיפור נוסף בעוצמת אות. אם מיקוד הקיזוז הוא לא נכון, עוצמות אות על פני 12 העמודות בpl ריקאכלתי (כאשר כל העמודות צריכה אות שווה) יופיע כעקומה בצורת U, במקום קו שטוח. אם זה ממשיך להיות בעיה עם צלחות פלסטיק, נסה צלחות עם רצפת זכוכית.
  10. הפחת את הממוצע של העוצמות משולבות בבארות רקע החיסור (איור 2; בארות 2B - 2D או בארות 2E - 2G) מכל נקודת נתונים מקבילה ב700 ו800 ערוצי ננומטר. ואז בממוצע עוצמות אות המשולבת עבור כל קבוצה של בארות. להתוות את הנתונים כscatterplot נגד צפיפות תאים (ראה איור 3).
    1. השווה את התוצאות של שני דילולים השונים של נוגדנים ראשוניים ומשניים ואת התוצאות של שני דילולים השונים של DRAQ5 + ספיר להתיישב על דילול אחד עבור כל הניסויים הבאים. אם ליניאריות לא תושג, נסה סריקה בעוצמה שונה. לסרוק מחדש עם עוצמות 3 ו 7 במקום 5 ולנתח מחדש את הנתונים. אם הנתונים לשפר באחת מהעוצמות האלה, אבלהם עדיין אינו משביעת רצון, לסרוק מחדש במרווחים סביב עוצמה ש.
    2. היזהר שלא לנתח את התמונות שבו התוכנה מראה כתמים לבנים בבארות; כתמים אלה מסמנים אות רוויות מחוץ לטווח של תרמי. סרוק בעוצמה נמוכה יותר, אם זה מתרחש.
    3. אם ליניאריות לא תושג, תנסה גם לתקן את התאים בתוך 6 שעות של ציפוי, כי הם עלולים לגדול או למות בצורה לא אחידה בעמודות שונות בין לילה. נסה גם צפיפויות שונות ציפוי, עוצמות סריקה שונות, אופטימיזציות נוספות של גורמים מגיב דילול, צלחות עם רצפת זכוכית, DRAQ5 על ידי עצמו ככתם גרעין בלבד, או נוגדנים שונים אחרים מאשר אנטי α-טובולין או אנטי MAP2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הגורם המגביל בריבית בניסויים אלה הוא הכתמים אדום, כמו assay ATP הוא יחסית קצר משך. למבחני אינפרא אדום, אנו צופים כי יכולים להיות מוכתמים שמונה צלחות 96 היטב וסרקו בתוך יום אחד על ידי שתי קבוצות מדהימות של ארבע צלחות כל אחד (ראה איור 1). הערכה זו מבוססת על ההנחה 20 דקות של קיבעון, 30 דקות של כביסה, 30 דקות של חסימה, 2 דגירה נוגדן ראשוני שעה ואחריו 30 דקות של שוטף, דגירה נוגדנים משני שעה 1 ואחריו 30 דקות של שוטף, 30 DRAQ5 דקות + ספיר ואחריו 30 דקות של שוטף, ו34 דקות של זמן סריקה ל4 צלחות. חמישה עשר דקות נוספות נלקחות בחשבון באיור 1 לשטיפה על מנת להסביר את pipetting המדורג של ארבע צלחות בודדות. זמן לנתונים ניתוח אינו כלול בהערכה זו. אם מדידות assay ATP יתרחשו במקביל לכל צלחת אינפרא אדום, יכולות להיות assayed עשר צלחות ביום אחד - שישה לכתם אדוםים ושש לרמות ה-ATP.

קריטריונים לנתונים מספקים בניתוחי רגרסיה (איור 3), כאמור בסעיף הפרוטוקול, כוללים מתאם משמעותי בין צפיפות ציפוי ועוצמת אות (שני עמ 'זנב ≤ 0.05). הגודל של שינויים בהארה או אות אינפרא אדום צריך להיות גם ביחס לשינויים במספר התאים. באופן אידיאלי, צריכים להיות לי תאי 5k כמחצית הארה או רמות ה-ATP של 10k תאים, ותאים 15k צריכים להיות ערכים כ 50% יותר מאשר 10k תאים, וכו '. מידתיות זו משקפת את הרגישות של assay ושונה מהערך או מקדם R 2 של נחישות. R 2 צעדים רק כמה טוב הקו הרגרסיה אומדן של נקודות נתונים האמיתיים. גם אם נתונים הם ליניארי, השינוי היחסי בעוצמת אות לא יכול להיות בפרופורציה לגודל של השינויים במספר תאים. זה יכול לקרות wתרנגולת יש הקו הרגרסיה R גבוה 2 אבל שיפוע נמוך, מה שמרמז כי assay הוא לא מאוד רגיש. לכן, הקריטריונים של מתאם ומידתיות של נתונים משמעותיים צריכים גם להיות מרוצים. לבסוף, שינויים בעוצמת אות סביב צפיפות ציפוי האופטימלית צריכים ליפול בטווח הדינמי של המכשיר וassay. הטווח הדינמי הוא היחס בין הערכים האפשריים הגדולים ביותר והקטנים ביותר. יש תרמי אודיסיאה טווח דינמי 4.5 יומן ואות רוויה מופיעה כצבע לבן בוהק במקום של התמונה אדומה או ירוקה הרגילה על מנת להתריע לתחקירן, כי התוצאות הן כבר לא לכימות. הטווח הדינמי במהלך assay עצמו הוא צר יותר בגלל בעיות כגון מקסימאלי וצפיפות ציפוי מינימאלית לכל סוג תא נתון. אם אחד צלחות בהגדלת צפיפות תאים, עקומת הרוויה עבור מבחני אלה תחשוף את צפיפויות ציפוי שמעליו ניתן לפתור אין הבדלים נוספים, או בגלל שהם נמצאים מחוץמגוון תרמי או בגלל התאים אינם שורדי צפיפות הלילה. באופן דומה, אם אחד צלחות הפחתת צפיפות תאים, אפשר למדוד את צפיפות תאי המינימום שמתחתיו אין שינויים נוספים באות. הטווח הדינמי של assay כולל רק את צפיפויות ציפוי בין המינימום והמספר מרבי של תאים / טוב שיכול להיפתר. לא מדדנו את הטווח הדינמי המלא עבור מבחני אלה בפרט, כי התאים שלנו לא ישרדו גם בצפיפויות מעבר לאלה שדווחו.

אחרי אופטימיזציה, עכשיו אנחנו להכתים תאי נוירובלסטומה עכבר N2a עם אנטי α-טובולין בדילול 1:10,000, עם אנטי העכבר IgG בדילול 1:2000, ועם פתרונות DRAQ5 + ספיר ב1:20,000 ו1:2,000, בהתאמה. בנוסף, אנו משתמשים 25 μl של ריאגנטים assay-ATP ב50 תקשורת μl. התוצאות בתנאים אלה באים לידי ביטוי בציורים A3, B ו-C ופורסמו beforדואר 8. עוצמת אות בכל שלושת מבחני הייתה בקורלציה משמעותית עם מספר תאים לכל טוב. למרות שכל שלושת מבחני היו ליניארי מאוד, הם לא היו שווי ערך ברגישות. לדוגמא, תאי 5k לכל גם לא היו לי הסכום בדיוק מחצית מהכתמת אינפרא אדום כמו 10k תאים לכל טוב. בניגוד למבחני אינפרא אדום, assay ATP היה רגיש יותר לשינויים בצפיפות ציפוי. במילים אחרות, הארה נפלה על ידי כמחצית מ10k ל5k ומ5k 2.5k לתאים לכל טוב. למרות ממצאים אלה על הרגישות הגבוהה ביותר של assay-ATP, עדיף לבצע את כל שלושת מבחני לכדאיות כדי לקבל תמונה רחבה יותר של בריאות הסלולר.

עכשיו אנחנו להכתים תרבויות עצביות עיקריות עכברוש עם אנטי MAP2 בדילול 1:2,000, עם אנטי עכבר IgG בדילול 1:1,000, ועם פתרונות DRAQ5 + ספיר ב1:10,000 ו1:1,000, בהתאמה, ולהשתמש 25 μl של ריאגנטים assay-ATP ב50 תקשורת μl (איורים3D, E, ו-F). עוצמת אות בDRAQ5 + assay ספיר הייתה ליניארי ופחות מכל שלושת מבחני כי לא היה הבדל קטן בין 100k 200k ותאים לכל גם בערוץ 700 ננומטר. עם זאת, עוצמת אות ב700 ננומטר הייתה טובה באופן יחסי למספר תא מתחת 100k תאים לכל טוב, ואנחנו תמיד צלחת תרבויות עצביות ב100k תאים לכל היטב בכל מקרה. יחד עם זאת, יש לנו גם ציינו כי DRAQ5 + assay ספיר אינו רגיש כמו לטיפולי רעלן כשני מבחני האחרים (ראה להלן). בניגוד לDRAQ5 + ספיר, עוצמת אות הייתה בפרופורציה טובה יותר עם צפיפות ציפוי עבור שני MAP2 ומבחני ה-ATP. יש לציין שנפח גדול יותר של חומרים כימיים assay ATP יכול לשפר את התוצאות ב200k תאים לכל טוב. במילים אחרות, תפוקה זורח ניתן להעלות ל% בדיוק 200 של הערכים ב100k תאים לכל גם כי יש יותר מגיב. עם זאת, אנחנו אף פעם לא צלחת תרבויות קליפת המוח שבצפיפות ציפוי גבוהה עבור experimeNTS. יש לנו גם מצא כי רמות ה-ATP MAP2 ורגישות לשינויי 20% בצפיפות ציפוי עצבית שבמוח, הנעים בין 20k לכל תאים היטב ל120k תאים לכל היטב 22. עם זאת, חוקרים אחרים צריכים לבדוק מבחני אלה במעבדה שלהם ולא באמצעות התנאים אופטימליים מהניסויים שלנו בגלל מעבדה בין השתנות ברקמות וטיפול תא.

כדי להמחיש את התועלת של מבחני אלה לאחר טיפולים עם רעלים, אנו מראים מנת תגובה עקומות של תאי N2a טופלו MG132, מעכב הפרוטאזום (איור 4). MG132 יושם בנוכחותו או היעדריו של N-אצטיל ציסטאין מבשר גלוטתיון. ניתן למצוא גם נתונים אלה בפרסום האחרון שלנו על ההשפעות המגנות של N-אצטיל ציסטאין 30. תאים היו assayed 48 שעות לאחר טיפולי MG132. MG132 מינון dependently ירד אות DRAQ5 + ספיר (איורים 4 א, ​​ד) ואות α-טובולין ( 50 ערכים בהעדר או הנוכחות של N-אצטיל ציסטאין. המשוואה הייתה Y = 100 / (1 ​​+ 10 ^ ((היגיון 50 X-) * ​​HillSlope))). IC 50 הערך עבור DRAQ5 + ספיר היה 1.64 מיקרומטר MG132 (היגיון 50 = 0.22 ± 0.03, R 2 = 0.9477, מדרון גבעה = -1.26) ולרמות α-טובולין היו 1.96 מיקרומטר MG132 (היגיון 50 = 0.29 ± 0.04, R 2 = .9296, מדרון גבעה = -1.349). N-אצטיל ציסטאין העביר את העקומות לימין, מה שמראה כי יותר MG132 נדרש כדי להרוג תאים בנוכחות של תרכובת מגן זה. בנוכחותם של N-אצטיל ציסטאין, ערך IC 50 לDRAQ5 + ספיר היה 4.64 מיקרומטר MG132 (היגיון 50 = 0.67 ± 0.05, R 2 = 0.8732, מדרון גבעה = -1.06) ועבור α-טובולין היה 6.35 מיקרומטר MG132 ( היגיון 50 = 0.80 ± 0.04, R 2 = .8802, מדרון גבעה = -1.382). מחקר אחד של תאי N2a ידי דיירה ועמיתיו דיווח על ירידת 50 כ% מכדאיות ב10 מיקרומטר MG132, כפי שנמדד על ידי assay MTT ביום 31. Fioriti דיווח אובדן 60% משעת 4 כדאיות לאחר טיפול עם 50 מיקרומטר MG132, שוב עם assay MTT 32. לבסוף, ז'אנג ועמיתיו דיווחו על ירידת 60% מכדאיות ב10 מיקרומטר MG132, תוך שימוש בסעיפים של גרעינים צבעוניים Hoechst 33. IC 50 ערכים אלה הם גבוהים יותר משלנו. עם זאת, אנו assay עבור שעות 48 כדאיות לאחר תחילת טיפול, בניגוד למחקרים הקודמים אלה.

לדברי assay כייל Glo הסלולרי, רמות ה-ATP הועלו בריכוזים נמוכים של MG132 (איור 4C), הוכחת כי רמות ה-ATP הן לא בהכרח באופן יחסי לכייל תא על טיפול. נתוני ה-ATP הם בכל זאת שימושיים בכך שהם ממחישים כי N-אצטיל ציסטאין גם מגן על תפקוד מטבולים כאשר מטופלים תאי N2a עם MG132. עדות לכך הוא בtהוא יעבור בשווי IC 50 של MG132 עם N-אצטיל ציסטאין. IC 50 הערך עבור ה-ATP היה 3.05 מיקרומטר MG132 (היגיון 50 = 0.48 ± 0.07, R 2 = 0.8616, מדרון גבעה = -1.0) עם רכב ו9.12 מיקרומטר MG132 עם N-אצטיל ציסטאין (היגיון 50 = 0.96 ± 0.04, R 2 = .9261, מדרון גבעה = -1.0). שים לב שהריכוזים שהובילו לעליות בATP לא נכללו בניתוח זה. כוללים את כל הערכים בניתוח הוריד את המקדם של נחישות והגדיל את IC 50 ערכים ל4.03 מיקרומטר MG132 (היגיון 50 = 0.61 ± 0.09, R 2 = 0.7224, סלופ היל = -1.4) בנוכחותו של רכב ו9.24 מיקרומטר MG132 (היגיון 50 = 0.96 ± 0.07, R 2 = .6607, סלופ היל = -2.1) בנוכחותו של N-אצטיל ציסטאין (לעומת איור 4C).

דוגמא שנייה משלושת מבחני אלה בא לידי ביטוי לתרבויות עיקריות בfigurדואר 5. רקמה הייתה microdissected מקליפת מוח החולדה וallocortex, ניתק, מצופה ב 100k תאים לכל טוב, וטופלה במקביל עם H 2 O 2. בחנו את ההשערה ששני אזורי המוח אלה היו שונים בטיפולם של סטרס חמצונים כמו שהם באופן דיפרנציאלי פגיעים למחלות ניווניות 34-39. חלק מנתונים אלה שפורסמו לפני והתוצאות נידונו בהרחבה במחקר ש22. IC 50 הערכים לDRAQ5 + ספיר היו 22.84 מיקרומטר H 2 O 2 בקליפת המוח (היגיון 50 = 1.36 ± 0.07, R 2 = .7552, מדרון גבעה = -0.95) ו24.63 מיקרומטר H 2 O 2 בallocortex (היגיון 50 = 1.39 ± 0.03, מדרון גבעת R 2 = .9379, = -1.74). IC 50 הערכים לMAP2 היו 11.66 מיקרומטר H 2 O 2 בקליפת המוח (היגיון 50 = 1.07 ± 0.04, R 2 = 0.9332, מדרון גבעה = -2.13) ו29.76 מיקרומטר H 2 O 2 בallocortex (היגיון 50 = 1.47 ± 0.04, R 2 = 0.8934, מדרון גבעה = -4.45). IC 50 הערכים עבור ה-ATP היו 23.82 מיקרומטר H 2 O 2 בקליפת המוח (היגיון 50 = 1.38 ± 0.03, R 2 = 0.8907, מדרון גבעה = -2.56) ו44.5 מיקרומטר H 2 O 2 בallocortex (היגיון 50 = 1.65 ± 0.03 , R 2 = .9204, מדרון גבעה = -2.71). Allocortex היה באופן משמעותי יותר עמיד ללחץ חמצוני מאשר קליפת מוח בריכוזים של H 2 O 2 להלן 50 מיקרומטר, אבל DRAQ5 + assay ספיר היה רגיש לפחות הבממחיש את ההבדל הזה. זה עשוי לשקף כי assay זה האחרון לא מבחינים בין גליה מתא העצב, שלא כמו MAP2. כפי שהוזכר קודם לכן, התרבויות שלנו מכילות כמה גליה, כפי שהם נקטפו מהמוח לאחר הלידה 22. באופן מפתיע, בריכוזים גבוהים של H 2 O 2 (75 מיקרומטר ומעלה), כאשר כל MAP2 + בתרבויות אלה הם עמידים יותר בפני H 2 O 2 מ MAP2 + נוירונים (לא מוצג), אנו משערים כי האסטרוציטים שמוח הם פחות פגיעים לנזק חמצוני מהאסטרוציטים allocortical. דפוס זה עשוי לבוא לידי ביטוי בDRAQ5 + assay ספיר אך לא assay ATP כי האסטרוציטים פגומים oxidatively אינם קיימא מטבולית. לא משנה מה הסיבה לדפוסים הבולטים אלה, נתונים התרבות העיקריים אלה מומחשים כאן רק כדי לגלות שהמבחנים לא תמיד בהסכמה.

לבסוף, על מנת להמחיש את שונות intraplate עם כל שלושת מבחני, אנו זממו נקודות נתונים גולמיות 'הבארות השניה ושלישית מעקומות מינון התגובה הנ"ל בדמויות 6A-C ו-6G >. בדומה לכך, על מנת להמחיש את שונות interplate, אנו זממו הממוצע של נקודות נתונים גולמיות (הממוצעת של הבארות בשלושה עותקים) משתי צלחות במספרים 6D-F ו6J-L. עוצמת אות בבארות לשכפל ועל פני ניסויים עצמאיים הציגה מתאם משמעותי לכל מידה. היו שם כמה השתנות בערכי גלם על פני ניסויים בלתי תלויים בתרבויות עצביות עיקריות, אולי בגלל שאנחנו שימוש חוזר נוגדנים ישנים ופתרונות DRAQ5 + ספיר ונקפיא assay-ATP שאינו בשימוש ראקטיבים כמה פעמים. סיבה נוספת לשונות interplate גבוהות יותר בתרבויות עיקריות עשויה להיות באיכות של התרבות עצמה. מרווחים משתנים נתיחה שלאחר המוות וטיפול ברקמות על פני ימי ניסויים שונים עשויים לתרום לשונות.

jpg "/>
איור 1. איור סכמטי של כל שלושת מבחני הכדאיות () וציר הזמן עבור מבחני אינפרא אדום (ב '). מוצגים הם הנהלים מומלצים לתאי N2a. אם פתרונות DRAQ5 + ספיר לא הולכים לעשות בה שימוש על צלחות אחרות שהם מוכתמים נוגדנים משני שונים, הם יכולים להיות בשילוב עם פתרון נוגדנים משני אנטי עכבר לדגירת שעה סופית 1, הפחתת ההליך על ידי צעד אחד. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. פורמט פלייט של assay-ATP () ומבחני אינפרא אדום (ב) המתוארות בסעיף הנהלים. למרותצלחת 96 היטב היא מאוירת, ניתן להתאים במבחנים אלה לפורמטים אחרים, כגון 384 צלחות היטב, כדי לחסוך בחומרים כימיים ותאים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. רגרסיות לינארי לכל שלושת מבחני הכדאיות בתאי נוירובלסטומה עכבר N2a (A, B, C) ​​או נוירונים עיקריים לאחר לידה עכברים שמוח (D, E, F). עוצמת אות לכל assay היא להתוות כפונקציה של צפיפות ציפוי. ריבועי להראות תמונות אינפרא אדומות נציג DRAQ5 + ספיר (A, D), α-טובולין (ב '), או כתם MAP2 (E). ערכי עוצמת גלם מופיעים מתחת לכל תמונה. שימו לב שערכי הגלם בגם פרט עשוי להיות שונים מן הממוצע של 3 בארות לניסוי ושמהממוצע של 3-4 ניסויים בלתי תלויים. התמונות אינפרא אדומות המקוריות pseudocolored אדום (700 ננומטר) או ירוק (800 ננומטר). כל ניסוי בוצע בבארות בשלושה עותקים וחזר 3x עבור DRAQ5 + ספיר בשני תאי N2a ונוירונים עיקרי, 3x עבור α-טובולין, 4x לMAP2, 3x עבור ה-ATP בתאי N2a, ו4x עבור ה-ATP בתאי עצב. נתונים מהבארות בשלושה עותקים היו בממוצע לערך סופי אחד לכל אחד מהניסויים 3-4. הממוצע וSEM של 3-4 ערכים הסופיים אלה מוצגים בגרף. שים לב שערכי DRAQ5 + ספיר מציגים סטיות תקן נמוכות, כך שברי SEM אינם נראים לעין. R 2 המקדם של נחישות ושני ערך p זנב הערכת המשמעות של המתאם גם מאויר לכל מידה. הנתונים נותחו בGraphPad פריזמה (גרסת 5.0). נדפס מן neurochemistry הבינלאומי, 61, על ידי Unnithואח': "הצלה משני מודל תפוקה גבוהה פגע של ניוון מוחיים עם N-אצטיל ציסטאין", עמ '356-368, באישור Elsevier. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4
איור 4. הגנה של תאי N2a נגד רעילות MG132. תאים שטופלו N2a עם ריכוזים מצויינים של MG132 מעכב הפרוטאזום בנוכחותו או היעדריו של ציסטאין החמצון N-אצטיל (NAC; 3 מ"מ). כל שלושה מבחני הכדאיות בוצעו 48 שעות מאוחר יותר. שים לב לעלייה ברמות ה-ATP בריכוזים נמוכים של MG132 (C). גידול מקביל לא בצביעת DRAQ5 + ספיר () or α-טובולין (ב ') היה ברור. תמונות אינפרא אדומות נציג DRAQ5 + ספיר וכתמי α-טובולין היו pseudocolored אדום וירוקות בD ו-E, בהתאמה. כל ניסוי בוצע בבארות בשלושה עותקים וחזר על 4x לDRAQ5 + ספיר, 4x עבור α-טובולין, ו3x עבור ה-ATP. נתונים מהבארות בשלושה עותקים היו בממוצע לערך סופי אחד לכל אחד מהניסויים 3-4. הממוצע וSEM של 3-4 הערכים הסופיים האלה מוצגים. * P ≤ 0.05 להשוואה של N-אצטיל ציסטאין לעומת מים, תיקון Bonferroni הבא דו סטרי ANOVA. הנתונים נותחו בGraphPad פריזמה (גרסת 5.0). נדפס מן Neuroscience, 255, על ידי ג'יאנג ואח': "N-אצטיל ציסטאין מקהה proteotoxicity בצורה חלבון תלוי הלם חום", עמ '19-32, באישור Elsevier. Cללקק כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5
איור 5. פגיעות דיפרנציאלי של תרבויות שמוח וallocortical לרעילות מי חמצן. Microdissections של מנוע עיקרי לאחר לידה וקליפת מוח התחושתית ושל allocortex entorhinal ואגסים היו ניתק ומצופית ב 100k תאים לכל טוב. ביום במבחנה 2, בתאים שטופלו עם הריכוזים מצויינים של H 2 O 2. צלחות היו assayed 48 שעות מאוחר יותר. הערה allocortex ששורד בתנאים אלה culturing טובים יותר מקליפת המוח ויש לו מספרים סלולריים גבוהים יותר בתחילת המחקר. כל ניסוי בוצע בבארות בשלושה עותקים וחזר על 4x לDRAQ5 + ספיר, 3x לMAP2, ו6x עבור ה-ATP. נתונים מהבארות בשלושה עותקים היו בממוצעעבור ערך סופי אחד לכל אחד מהניסויים 3-6. הממוצע וSEM של 3-6 הערכים הסופיים האלה מוצגים. * P ≤ 0.05 להשוואה של ניאו לעומת allocortex, תיקון Bonferroni הבא דו סטרי ANOVA. הנתונים נותחו בGraphPad פריזמה (גרסת 5.0). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 6
איור 6. מתאמי Intraplate וinterplate לMG132 וH 2 O עקומות תגובת 2 מינון בתאי N2a ונוירונים בקליפת המוח. כל הניסויים הבודדים היו לרוץ בבארות בשלושה עותקים. נתונים גולמיים משתי הבארות השניה בתוך כל קבוצה היו זממו כמשכפל 1 ו -2 כדי למדוד שחזור בתוך הצלחות (, ו-C עבור תאי N2a וG, H, ואני לקליפת מוח). נתונים מאותו הקבוצות בשני ניסויים בלתי תלויים (הממוצע של הבארות בשלושה עותקים) היו זממו כצלחת 1 וצלחת 2 למדוד שחזור פני צלחות (D, E, ו-F לתאי N2a וJ, K, L לקליפת מוח). R 2 המקדם של נחישות ושני ערך p זנב הערכת המשמעות של המתאם גם מאויר לכל מידה. הנתונים נותחו בGraphPad פריזמה (גרסת 5.0). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מצאנו כי עוצמת אות בכל שלושת מבחני הכדאיות היא ליניארי ומתואם עם צפיפות ציפוי. עם זאת, לא כל מבחני הם לא פחות רגישים לפי 2 או שינויים 1.5 פי בצפיפות ציפוי. לתאי N2a, מבחני אינפרא אדום רגישים פחות assay-ATP, במיוחד בצפיפויות ציפוי נמוכות יותר. למרות שמבחני אינפרא אדום רגישים פחות מאשר ה-ATP, מבחני DRAQ5 + ספיר ומבחני α-טובולין הם בהסכם טוב בכך שהם חושפים את ההשפעה המגנה ביותר של N-אצטיל ציסטאין. היה ירידה במינון תגובה של אות אינפרא אדום עם שני מבחני וכל שלוש עקומות הכדאיות הוזזו לימין עם N-אצטיל ציסטאין. חפיפה זו לא תמיד נצפתה עבור כל סוגי טיפולים של תאי N2a, כפי שנראים מבחני α-טובולין ו-ATP להיות יותר רגיש לתרכובות כגון אמוניום כלוריד מ DRAQ5 + assay ספיר (ראה איור 4 בUnnithan et al. 8 ). לפיכך, phenotyp כדאיותes לא תמיד מיוצג באופן שווה על ידי כל שלושת מבחני. למרות assay ATP היה בפרופורציה טובה יותר למספר של תאי N2a מצופים מ α-טובולין וDRAQ5 + מבחני ספיר, בהנחה שעוצמת האות משקפת מספרים סלולריים לא תמיד נפגש לאחר טיפול הרעלן. רמות ה-ATP עלו בריכוזים רעלן שלא לעורר עלייה דומה באות במבחני אינפרא אדום. נתונים אלה מראים שינויים מטבוליים מפצים בתאי N2a בתגובה לעיכוב הפרוטאזום ושימושיים בזכות עצמם. עקומת מנת התגובה בצורת U-ATP היא אופיינית לתופעה הנקראת hormesis. Hormesis מוגדר כתגובות ביולוגיות חיוביות לחשיפה ברמה הנמוכה לרעלים וגורמי לחץ אחרים 40-42.

לתאי עצב, DRAQ5 + כתם ספיר היה רגיש פחות MAP2 ומבחני ה-ATP בצפיפויות ציפוי גבוהות. עם זאת, DRAQ5 + ספיר, MAP2, ומבחני ה-ATP היו גם באופן יחסי לceמספר ll בנוירונים בקליפת המוח העיקרי בבית או מתחת 100k תאים לכל טוב. אנו צלחת הנוירונים ב100k תאים לכל טוב. נוירונים מקליפת המוח אינם ידועים לשכפל, ולכן, היינו מודאגים יותר ליניאריות ב100k או נמוך צפיפות ציפוי. DRAQ5 + assay ספיר היה פחות רגיש להבדלים בין קליפת המוח וallocortex מאשר כל אחד MAP2 או ה-ATP בריכוזים מתחת 50 H 2 O 2 מיקרומטר. יתר על כן, רמות ה-ATP לא נפלו באופן דרמטי על H 2 O 2 טיפול כאות אינפרא אדום בשני מבחני האחרים, מה שמרמז אולי שוב עליות מפצות בפלט ה-ATP. הפערים בין שלושה מבחני בתאי N2a ונוירונים עיקרי עשויים לשקף כי תפקודים תאיים יכולים לשנות לפני מבנים אנטומיים גולמי מושפעים, וכי מבני תא, כוללים חלבוני cytoskeletal, יכולים להיות מושפעים הרבה לפני שהתאים עצמם הולכים לאיבוד. נתונים אחרונים במבחני כדאיות זמנית על ידי גילברט ועמיתיו בצורה משכנעתלהמחיש כי צעדי כדאיות שונים כגון צביעה גרעינית Hoechst ומדידות ATP להניב מידע על מאפיינים תאיים ספציפיים שרק באופן חלקי ובאופן עקיף משקפים כדאיות בכללות 26. לכן אנו ממליצים לבצע את כל שלושת מבחני בו זמנית ולא להסתמך על assay יחיד לכדאיות טבולי פרסומים כפי שעושים רבים. לקבלת מידע נוסף על כל אחד מהאמצעים אלה, אנו ממליצים ספירת תאים בודדים ולאחר מכן הערכת ביטוי חלבון cytoskeletal ורמות ה-ATP כפונקציה של מספר תא.

אמנם יש מבחני אחרים לכדאיות חילוף חומרים, כגון MTT, היתרון של assay ATP טמון ברגישות שלו וטווח דינמי. Assay MTT יכול להעריך את מספר תאי קיימא בהשוואה למדידות ה-ATP ותערוכות IC 50 שהוא פי שתיים גבוה יותר 43. יתר על כן, פטי ועמיתים דיווחו כי assay ATP יכוללזהות את הגבול התחתון של 1563 תאים לכל טוב ואילו assay MTT לא יכל לזהות פחות מ 25k תאים / היטב 12. יחס אות לרעש (אות מבארות עם תאי חיים מול בארות ללא תאים) הוא רק 7 לMTT אבל 230 עבור ה-ATP 44. יתרון נוסף של מבחני ה-ATP זורח מעל MTT הוא שזמן הדגירה הוא הרבה יותר קצר. בנוסף, assay MTT מPromega עולה 0.28 ¢ לכל טוב ואילו תא assay כייל Glo מאותו היצרן עולה 0.09 ¢ לכל טוב בדילולים המומלץ שלנו. עם זאת, יש מגבלות לכל מבחני חילוף החומרים; פעילות המטבולית יכולה להיות מנותקת מהישרדות, במיוחד בנימק. אם זה חשש, מבחני בדו"ח הנוכחי ניתן לשלב עם מדידות של שחרור לקטט דהידרוגנז לברר אובדן שלמות הממברנה. זה לא יגרום לשום צלחות נוספות, כמו מדידות לקטט דהידרוגנז פשוט עשו במדיום תאי.

למרות שאנו מציגים מבחני אלה כחלופות לספירה ידנית על המיקרוסקופ, האחרון יכול להיות אמצעי רגיש ומדויק מאוד של מספר תא דגימה אם נערך כראוי. ואכן, אנו צופים כי סעיפים של גרעינים צבעוניים Hoechst יהיו רגישים יותר לשינויים קטנים במספר תא N2a מ DRAQ5 + assay ספיר. כאשר כל מבחני נכשלים במבחן ליניאריות, ספירה ידנית הן חיוניות. דוגמא טובה לכך היא המודל שלנו בתרבית הראשונית astrocyte, שבו אנו מבצעים את הוראות מייגע יותר סופרים 45. עם זאת, ההטיות הטבועות של ספירה ידנית חייבים לזכור בעת פירוש נתוני ספירת תאים, בדיוק כמו הפגמים הטבועים של מבחני ממוחשבים לא חייבים להיות מוברשות בצד. מספר היתרונות והחסרונות של מבחני כדאיות לכן הם יתוארו להלן.

ראשית, אם כתמי DAPI או Hoechst מועסקים, גרעינים מצומקים ומהווים לעתים קרובות כאזוראפופטוטיים 1. עם זאת, גודל תא ועיבוי של גרעינים לשקר לאורך רצף חלק. לעומת זאת, חיים ומוות הם תופעות סותרות, בינארי. אלא אם כן שתי קבוצות מאוד מובחנות של תאי חיים או מתים הם נצפו, נראה הטובים ביותר כדי לספור את כל התאים מתחת לקוטר גרעין סף אפופטוטיים כמו עם תוכנת הדמיה כגון MetaMorph או ImageJ ולא על ידי העין. כמובן, בחירת קוטר סף היא שרירותית, כי אנחנו לא יודעים באיזה שלב מפל אפופטוטיים בלתי הפיך הוא יזמה. יתר על כן, על פי הגדרתו, גם תאים עם caspase הופעל 3 הם לא בהכרח בדרך למוות וצריכים אולי להיות נחשב עדיין בחיים בעת הקיבוע 46. מבחני אינפרא אדום שלנו למנוע חששות אלה על ידי טיפול בכל התאים המחוברים לצלחת בעת הקיבוע כעדיין לחיות. רק תאים שרחפו משם נספרים כמת. זה מציב את תאים לתוך אחד משתי קטגוריות נפרדות ונמנע מהמלכודות של שימוש בשיתוףmplex, פונקציה רציפה כמו קוטר גרעיני.

שנית, ספירה ידנית בדרך כלל לטעום חלק קטן מכל טוב. זה יכול להוביל להטית דגימה, ולעתים, שגיאות ברמה גבוהה של הממוצע. עם מבחני הכדאיות שלנו, כולו גם ידגם עבור ה-ATP וקרוב לכל גם ידגם עם מבחני אינפרא אדום. דפוס דגימה זו מגדיל את גודל מדגם וימנע את ההחלטה לפעמים השרירותית של איפה בבאר כדי לצלם לספירה ידנית. אם תמונות נלקחות מהמרכז כן, יש לזכור כי אזור זה הוא מקום שבי את לשטוף-רוב התאים מתרחש, מה שמוביל למגזים בהערכת פוטנציאל של רעילות. לעומת זאת, מבחני אינפרא אדום לזרוק רשת על גבי התמונה של צלחת 96 היטב שרק אינה כוללת את הפינות הקיצוניות של הבארות. אם כך רצוי, פינות הבארות יכולות להיכלל על ידי הגדלת הקוטר של החוגים ברשת.

שלישית, הצלם ודלפק התא צריך גם להיות עיוור בספירה ידנית. עם זאת, ברגע שהם תאים שטופלו עם רעלים, הם מניחים לעתים קרובות שינויים מורפולוגיים כי הם די ברורים גם לעין בלתי מנוסה. זה הופך את זה הרבה יותר מאתגר להישאר בלתי משוחד. עיוורון הוא לא דרישה למבחנים שלנו.

הרביעית, ספירה ידנית גוזל זמן ותעלה החוקר הראשי יותר במשכורת. משכורות הן אחת העלויות הגבוהות ביותר של מחקר. זמן הסריקה לצלחת אחת באודיסיאה הוא רק 8 דקות ארוכות על "האיכות בינונית" הגדרה וניתן להוריד עוד יותר על ההגדרה "באיכות נמוכה". יש לציין כי Imager אודיסיאה הוא יקר, גם כאשר אחד קונה גרסת הדגמה משומשת, אבל זה עלות קבועה חד פעמית. מצד השני, אחד יש גם להשקיע במיקרוסקופי epifluorescence יקרים יחסית לספירת תאים ידנית של DAPI או Hoechst צבעוני גרעינים. למרות העלות הראשונית, Imager אודיסיאה הוא מכונה רב תכליתי שמודד גם immunoblots המערבי באופן כמותי 47,48. יש לנו להתאים שימוש באודיסיאה לquantifications של immunostaining במבנים מוחיים מקרוסקופיים כגון חולדה או סטריאטום עכבר או telencephalic קליפת המוח. גישה זו שימשה גם על ידי אחרים 49. חולשה אחת של Imager אודיסיאה להדמית רקמות היא שהרזולוציה הגבוהה ביותר היא רק 21 מיקרומטר. לכן זה לא יכול לספור תאים בודדים ולא נועד כדי להמחיש פרטים עדינים אנטומיים.

לבסוף, מבחני אינפרא אדום לא יכולים להיות רגישים כמו לשינויים קטנים במספר תא כספירה ידנית. IC 50 ערכים ולכן לא יכולים להיחשב כמראים את הריכוז שמעורר אובדן דווקא 50% ממספרים סלולריים, אבל רק כריכוז שמעורר אובדן 50% מאות אינפרא אדום. אזהרה זו כנראה חלה עלכל מבחני הכדאיות כי לעקוף ספירת תאים בודדת על ידי מיקרוסקופ ולדגום את כולו גם בבת אחת. חוסר הדיוק הקשורים למבחנים כאלה עשוי להיות פונקציה של היפרטרופיה, ניוון, או שינויים אחרים במראה המשפיעים על עוצמת אות. לדוגמא, עם כמה רעלים, α-טובולין immunoreactivity בכל תא עשוי לעלות כפונקציה של רעילות. יש לנו בתופעה זו, בתאים שטופלו בN2a ריכוזים גבוהים מאוד של MG132 8. אם זה של דאגה, חלבונים אחרים cytoskeletal סמן, כגון β-אקטין או GAPDH ניתן להשתמש. יתר על כן, הדגיש תאי N2a נוטים ליצור תהליכים דו קוטביים 8,50,51. עם שינויים בגודל תא, פלט אות ניאון לכל תא יהיה גם שונה בכל קבוצות טיפול. אנו ממליצים כי תאים שטופלו ברעלן ייבחנו על ידי מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה הסטנדרטי הבאה immunocytochemistry עבור אותו סמנים כפי שהוא משמש ב- Cell המערבי. אם הציטופלסמה משנה באופן משמעותי בגודלם על טיפול, אךגרעין לא, אנו ממליצים להשתמש בכתם DRAQ5 בלי ספיר לכמת גרעינים בלבד. מחקרים עתידיים עם צבעים שונים ועם חלבונים בשפע cytoskeletal או אחרים אחרים הם ערובה כדי להתגבר על המכשולים הללו.

אנו מסיקים כי כל מבחני סובלים מאזהרות והעלו חששות לגבי רגישות, ליניאריות, טעות דגימה, יחס אות לרעש, הטיה או הסובייקטיביות אנושית, זמן ועלות. יתר על כן, כל מבחני מסתמכים על הנחות שלא תמיד מתקיימות. לכן, אנו ממליצים להשתמש לפחות בשני מבחני כדי לתאר את ההשפעות של טיפול בתרביות תאים, אחד המודד את בריאות חילוף חומרים ואחד שמסתמך על יכולת קיום אנטומי. בדרך זו, ניתן באופן יעיל יותר לבדוק אם תרכובות טיפוליות להגן הן על מבנה ותפקוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אף אחד מהמחברים יש התנגשויות לחשוף.

Acknowledgments

אנו מכירים Juliann Jaumotte לרעיון של שמירה על הכרכים של חומרים כימיים בassay-ATP. אנחנו אסירי תודה לתמיכה ניהולית המעולה של מרי קארוזו, דב ווילסון וג'קי Farrer ולבית הספר לרוקחות Mylan למתן תמיכה כספית למחקרים אלו. תודה גם למחלות Hunkele המפחיד הקרן ופרקינסון והפרעות תנועת קרן לתמיכה הכספית שלהם מהמחקרים עצביים העיקריים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Titer Glo Promega G7572 Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin Thermo-Shandon 9990244 Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block LI-COR 927-40003 This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 21568 We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic Fisher S468 One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic Fisher S373 See above
Sodium Azide (250x) Ricca Chemical Company 7144.8-16 Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin Sigma-Aldrich T5168 This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2 Sigma-Aldrich M9942 This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG LI-COR 926-32210 Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5 Biostatus DR50200 This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire LI-COR 928-40022
Luminometer PerkinElmer VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager LI-COR 9201-01
Shaker/Mixer Research Products International 248555

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
  2. Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
  3. Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
  4. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
  5. Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
  6. Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
  7. Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
  8. Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
  9. Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
  10. Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
  11. Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
  12. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  13. Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
  14. Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
  15. Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
  16. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
  17. Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
  18. Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
  19. Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
  20. Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
  21. Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
  22. Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
  23. Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
  24. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
  25. Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
  26. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
  27. Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
  28. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
  29. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
  30. Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
  31. Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
  32. Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
  33. Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
  34. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
  35. Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
  36. Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
  37. Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
  38. Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
  39. Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
  40. Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
  41. Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
  42. Mattson, M. P. Hormesis defined. Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
  43. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
  44. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  45. Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
  46. McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
  47. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
  48. Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
  49. Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
  50. Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
  51. Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 83 מערבי DRAQ5 ספיר תא כייל Glo ATP תאי עצב בקליפת המוח עיקרי רעיל הגנה N-אצטיל ציסטאין hormesis בתוך התא
מבחני כדאיות לתאים בתרבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Posimo, J. M., Unnithan, A. S.,… More

Posimo, J. M., Unnithan, A. S., Gleixner, A. M., Choi, H. J., Jiang, Y., Pulugulla, S. H., Leak, R. K. Viability Assays for Cells in Culture. J. Vis. Exp. (83), e50645, doi:10.3791/50645 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter