Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur

Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/50645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

Summary

Therapeutische Verbindungen werden oft zunächst in vitro-Lebensfähigkeitstests untersucht. Blindzellzählungen durch einen menschlichen Betrachter sehr empfindlich auf kleine Änderungen in der Zellzahl, aber nicht beurteilen Funktion. Computergestützte Lebensfähigkeitstests, wie hier beschrieben, kann sowohl die Struktur und Funktion in einer objektiven Weise zu beurteilen.

Abstract

Manuelle Zellzahlen auf einem Mikroskop sind ein empfindliches Mittel zur Bewertung zelluläre Lebensfähigkeit aber zeitaufwendig und daher teuer. Computergestützte Lebensfähigkeitstests sind teuer in Bezug auf Ausrüstung, aber schneller und objektiver als die manuelle Zellzahlen sein. Der vorliegende Bericht beschreibt die Verwendung von drei solcher Lebensfähigkeitstests. Zwei dieser Assays sind Infrarot und einem lumineszierend. Beide Infrarot-Assays basieren auf einer 16-Bit-Odyssey Imager. Eine Infrarot-Assay verwendet den Farbstoff für DRAQ5 Kernen kombiniert mit dem Saphir-Färbung für Cytosol und in den Kanal 700 nm sichtbar gemacht. Die andere Infrarot-Assay, ein In-Cell Western nutzt Antikörper gegen Proteine ​​des Zytoskeletts (α-Tubulin-oder Mikrotubuli-assoziierten Protein 2) und kennzeichnet sie in der 800 nm-Kanal. Die dritte Lebensfähigkeitstest ist eine häufig verwendete Leucht Assay für ATP, aber wir verwenden ein Viertel der empfohlenen Volumens um Kosten zu sparen. Diese Messungen sind lineare und korrelieren mit der Anzahl von cells zogen, aber unterschiedlich in der Empfindlichkeit. Alle drei Tests zu umgehen zeitraub Mikroskopie und probieren Sie die gesamte Wohl, wodurch Stichprobenfehler zu reduzieren. Schließlich können alle Assays leicht innerhalb eines Tages nach dem Ende des Experiments durchgeführt werden, so dass eine größere Anzahl von Versuchen, um in kurzen Zeiträumen durchgeführt werden. Sie beruhen jedoch alle auf der Annahme, dass die Zellzahlen im Verhältnis zur Stärke Signal nach Behandlungen, eine Annahme, die manchmal nicht erfüllt, insbesondere für zelluläre ATP bleiben. Außerdem, wenn Zellen zu erhöhen oder zu verringern in der Größe nach der Behandlung, könnte dies die Signalstärke beeinflussen, ohne die Zellzahl. Wir schließen daraus, dass alle Lebensfähigkeitstests, einschließlich Handbuch zählt, leiden unter einer Reihe von Vorbehalten, aber, dass computergestützte Lebensfähigkeitstests sind auch die anfängliche Investition wert. Mit allen drei Assays zusammen ergibt sich ein umfassendes Bild der zellulären Struktur und Funktion.

Introduction

Die häufigste Lebensfähigkeitstest in den biologischen Wissenschaften beinhaltet Zellzahlen. Dies wird durch eine Analyse der Top (jüngste) 200 Publikationen, die in PubMed mit einem der Schlüsselwörter "in vitro" oder "Kultur" auf 2013.04.29 und 2013.04.30 erschien belegt. Von diesen Publikationen, 23,5% verwendeten Zellzahl-Assays, einschließlich der manuellen Zellzahl zählt, zählt die automatisierte Zellzahl mit Imaging-Software, und Trypanblau-Ausschluss. Die Live / Dead-Assay wurde in 1% dieser Publikationen verwendet. Die Anzahl von Publikationen mit dem MTT (3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay für metabolische Lebensfähigkeit betrug 11%. Dieser Überblick über die Literatur zeigt auch, dass die Anzahl von Publikationen mit dem MTT-Assays, wie in Verbindung mit der Zellzahl Assays war nur 3,5%. Trotz der Trend zu einer Lebensfähigkeitstest für sich zu nutzen, die Beurteilung zelluläre Funktion in Kombination mit der Zellzahl scheint die beste Wahl für die Beurteilung der Zell integrity. Zellzahlen allein nicht ausreichend, da die verbleibenden Zellen nicht funktionell oder gesund, obwohl sie in der gut 1,2 vorhanden sind. Umgekehrt kann die funktionelle Maßnahmen wie ATP erhöhen oder verringern in Abwesenheit von parallelen Veränderungen in der Anzahl der Zellen. Die Entkopplung von Stoffwechselanzeigen von Zellzahl zeigt, dass ATP und MTT-Assays sollten niemals als alleinige Lebensfähigkeitstest verwendet werden. In dem vorliegenden Bericht werden drei Lebensfähigkeitstests, die sowohl zelluläre Strukturen und Stoffwechselfunktion Umfrage beschrieben, für eine umfassendere Sicht der zellulären Integrität als einem Test von selbst leisten können.

Zwei unserer Tests erfordern eine Infrarotkamera, die Fluoreszenz misst in der 700 und 800 nm-Kanäle. Rauschen in dem Infrarot-Wellenlängen gering, was zu höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnisse 3. Die Odyssee, die wir verwenden Imager hat einen 4,5 log Dynamikbereich und eine Bit-Tiefe von 16, Translating bis 2 16 oder 65536 Schattierungen von Infrarot. Dies kann zu einer 8-Bit-Farbbilderzeugung, die nur liefert 2 8 oder 256 Farbtöne für jede Wellenlänge gegenübergestellt werden. So hat 16-Bit-Bild feinere Auflösung. Es sei angemerkt, daß die ursprünglichen Infrarotbilder werden oft grünen (800 nm) und roten (700 nm) in veröffentlichten Berichten zur Darstellung pseudocolored werden. Odyssey Bildkameras werden häufig sowohl für die Western-Blot-und In-Cell Western 4-7 verwendet. In-Cell Western auf Formaldehyd-fixierten Zellen verwenden primären Antikörper gegen jedes Protein von Interesse und beschriften Sie sie wiederum mit Infrarot-Fluoreszenzsekundärantikörper. Diese Technik ist besonders nützlich für die Phosphorylierung Endpunkte 6 sein. In unserer In-Cell Western, färben wir feste Zellen Proteine ​​des Zytoskeletts α-Tubulin oder die neuronale Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 (MAP2) in der 800 nm-Kanal. Diese Proteine ​​sind reich genug, um hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Wir unseren Platten in der 700 Fleck auchnm-Kanal für Kerne mit dem DRAQ5 Fleck und für das Cytoplasma mit der Sapphire Fleck. Sowohl die Proteine ​​des Zytoskeletts und die DRAQ5 + Sapphire Flecken spiegeln somit zelluläre Strukturen.

Die dritte Lebensfähigkeitstest misst metabolische Funktion und wird als "Zelltiters Glo". In diesem Luciferase-basierenden Assay werden Helligkeitswerte direkt proportional zu der ATP-Spiegel. ATP-Assays werden häufig verwendet, um lebensfähige Zellen zu quantifizieren 8-12. Einschließlich das Wort "Titer" im Namen des Assays ist jedoch etwas irreführend, da ATP Produktion pro Zelle als eine Funktion der Toxin-Behandlungen zu ändern und kann daher nicht immer im Verhältnis zu Zellzahl 8. ATP-Spiegel kann auch durch zirkadianen Rhythmen 13 und 14 durch Zellteilung und Zelldifferenzierung 15 betroffen sein. Dennoch ist die hier gezeigte ATP-Assay leicht durchzuführen und geeignet, da ATP ist ein robusteres Maß des metabolischenLebensfähigkeit 16-21, wenn nicht Nummer Zelle an sich. Verwendung dieses Tests als Ergänzung zu den Infrarot-In-Cell Western ergibt daher ein umfassenderes Bild der zellulären Integrität als jeder Test allein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eine schematische Darstellung der Protokolle ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Handy-Überzug

Platten Zellen in 96-Well-Platten in unterschiedlichen Beschichtungsdichten (Fig. 2). Für Linearitätsprüfungen auf der N2a Neuroblastom-Zelllinie, Platte 2.5k, 5k, 10k, 15k und Zellen pro Vertiefung in 3 oder 6 Wells / Gruppe. Für Linearitätsprüfungen in Ratten primären kortikalen Neuronen, Platte 25k, 50k, 100k, 200k und Zellen pro Vertiefung in 3 oder 6 Wells / Gruppe. Wenn die Zelllinien oder primäre Zellen von Interesse sehen gesund an verschiedenen Beschichtungsdichten Platte an und um die optimale Zelldichte für diesen Zelltyp.

Hinweis: In der vorliegenden Studie wurden N2a-Zellen in 100 ul Medien und primären kortikalen Neuronen in 200 ul Medien auf Platten, die für geringere Verdampfungs ausgelegt sind vergoldet. Für detaillierte Informationen über die Handhabung von Zellen, Medien, Seren, Antibiotika und Toxin-Behandlungen finden Sie Unnithan et al. für N2a cells 8 und Posimo et al. für primäre Rinde Kulturen 22.

    1. Wiederholen Sie die Beschichtung auf einer zweiten 96-Well-Platte. Eine Platte wird für ATP (2A) untersucht werden und das andere mit der Infrarot-Assays (Fig. 2B). Man kann die gleiche Platte nicht verwenden, für die ATP-und Infrarot-Assays, weil die Zellen müssen offen für die intrazelluläre ATP-Messungen lysiert werden.
    2. Achten Sie darauf, mindestens 3 zusätzliche Brunnen zur Grundabzug in der Infrarot-Assays auf die optimale Beschichtungs-Dichte (Spalte 2, 2B) plattieren.
  2. In Medien ohne Zellen oder, kostengünstig, steriles Wasser auf die äußeren Wells in den Reihen A und H und in den Spalten 1 und 12 auf. Verlassen Sie sich auf Daten von Brunnen entlang der Kanten, wie Rentabilität ist hier oft geringer aus Wirkung von Medien Verdunstung und Temperaturgradienten. Solche Probleme mit Mikroplatten werden gewöhnlich als Randeffekte 23,24. Diese Brunnen Bewahren Sie keine leerenweil dann Reihen B und G und Spalten 2 und 11 leiden an der Randeffekt.
    Kanteneffekte können durch Inkubation einer frisch angeimpft Platte bei Raumtemperatur unter Umgebungsbedingungen vor der Übertragung in die CO 2-Inkubator 24 reduziert werden. Weiterhin ist eine aktuelle Studie von Carralot beschreibt eine mathematische Korrekturverfahren für Mikrotiterplatten mit einem einzigen Steuersäule 23. Oliver und seine Kollegen verwendeten eine speziell entwickelte Druckluft Mikrotiterplatte Inkubator thermischen Gradienten 25 zu reduzieren. Wenn die Kanteneffekt ist von großer Sorge, können Mikrostabilitätskammern (z. B. BT & C Incorporated) gekauft werden, um eine homogene Mikroumgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit und sogar Temperaturgradienten erstellen.
  3. Wenn mehr als Brunnen in Abbildung 1 dargestellt sind notwendig, weil zusätzliches Reagenz-Verdünnungen oder mehrere Beschichtungsdichten getestet werden, verwenden Sie die Kante Brunnen für die Hintergrund-Subtraktion.
  4. Warten Sie, über Nacht zur BefestigungZellen und Assay am nächsten Morgen, wie unten beschrieben.

2. Leucht ATP-Assay

  1. Folgen Sie den Empfehlungen des Zell Titer Glo Herstellers zur Rekonstitution des Substrats mit Puffer und für Inkubationszeiten.
    1. Entfernen 50 oder 150 &mgr; l Medium von den 100 oder 200 ul Plattierungsmedien sind. Etwas weniger als 50 ul hinter in der gut bleiben. Hinzufügen von 25 &mgr; l der Reagentien (Substrat und Puffer), um Spalten 2-6 (2A) in einer Verdünnung von 1:2.
      Hinweis: Unterschiedliche Volumina der Medien hinter sich gelassen nach der Entfernung konnte die ATP-Assay-Reagenzien differentiell über Brunnen verdünnen oder konzentrieren. Achten Sie darauf, dass das Niveau der Flüssigkeit in allen Mehrkanal-Pipettenspitzen ist gleichwertig. Messung der restlichen Flüssigkeit in ausgewählten Vertiefungen in der Platte mit einer Pipette unmittelbar vor der Zugabe der ATP-Assay-Reagenzien, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Wenn hohe Variabilität aus unterschiedlichen Raten von Medien Evapor vorhandenation über die Oberfläche der Platte ist, entfernen Sie alle alten Medien und fügen Sie die gleiche Menge an frischem Medium oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in alle Vertiefungen unmittelbar vor der Zugabe von ATP-Assay-Reagenzien. Wenn die Platten leiden unter variablen Ebenen der Verdampfung, versuchen Sie es mit den niedrigen Verdampfungsplatten von Costar Corning. In den letzteren Platten, die 60 in Fig. 2 gezeigt Innen Vertiefungen leiden nur von durchschnittlich 0,995 ± 0,41% Medien Verdampfen über Nacht. Es ist somit vernachlässigbar Variabilität Medienvolumen zum Zeitpunkt des Assays.
    2. In den Spalten 7 bis 11, Zeilen B bis D, entfernen Sie genug Medien auf 50 ul hinter sich zu lassen, wie oben beschrieben, und 50 ul von Reagenzien in einer 1:1-Verdünnung.
    3. In den Spalten 7 bis 11, Reihen E bis G, lassen Zellen in 100 ul Medium und 100 &mgr; l von Reagenzien, wieder in einer 1:1-Verdünnung. Das Unternehmen empfiehlt, dass 100 ul Reagenzien 1.01 in 100 ul Medium verdünnt werden.
      Hinweis: Umum Kosten zu sparen, ist es möglich, diese Empfehlungen sowohl im Volumen und in Verdünnung geschnitten. Jedoch bevor diese Weise sicherzustellen, dass sie die Linearität und Empfindlichkeit des Assays nicht verringern.
    4. Sobald ein bestimmtes Volumen und Verdünnungsfaktor der Reagenzien sind als zufriedenstellend befunden, bleiben sie in allen nachfolgenden Experimenten. Die Kriterien für eine zufriedenstellende Daten sind im Abschnitt Ergebnisse beschrieben.
    5. Nicht verwendete rekonstituierte Reagenzien können wieder eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt verwendet werden, um Kosten zu sparen werden. Nach Angaben des Herstellers rekonstituiert Reagenzien bei -20 º C 21 Wochen lang mit ~ 3% Aktivitätsverlust gelagert werden.
  2. Legen Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler für 2 min oder einem Taumelschüttler für 10 min. Wenn ein Teil der Platte ist für eine andere Messung untersucht und es nicht erschüttert werden kann, bewegen die Medien mit einfachen Auf-und-Ab-Pipettieren nur in den Vertiefungen von Interesse. Allerdings wird übermäßiges Blasen in diesem Schritt erzeugt mit Leuchten störenzier ausgegeben.
    1. 10 min nach der Zugabe der Reagentien, Transfer 60 &mgr; l in den Wells in weiße 96-Well-Platten. Lumineszenz Werte sind höher als in weißen Platten in klar oder schwarz-Platten, weil sie das Licht reflektieren nach oben in Richtung des Detektors.
      Hinweis: Nach unserer Erfahrung Zellen überleben besser auf die niedrige Verdampfungs, klare Costar-Platten als andere Platten. Diese speziellen Platten nicht mit weißen Wänden verkauft. Zweitens sind die undurchsichtigen Wänden und Bodenplatten deutlich teurer als völlig klar Platten. Wenn man überträgt die lumineszierenden Flüssigkeit auf weiße Platten, können die weißen Platten gewaschen und wiederverwendet, spart über die Kosten der Verwendung von neuen weißen Platten für jedes Experiment werden. Übertragen von Flüssigkeit ist somit die kostengünstigere Option auf lange Sicht.
    2. Pop alle Luftblasen vor dem Ablesen der Platte mit einer Nadel oder vorzugsweise mit Zwangsluft aus einem Kunststoffüberführungspipettenkolben. Lesen Sie die Platte auf einem Luminometer mit einer 1 sec Integrationszeit (das Unternehmen empfnds 0,25-1 Sekunden als ausreichend Integrationszeit). Lesen Sie die Platte 10-12 min nach der Zugabe von ATP-Assay-Reagenzien. Timing ist entscheidend für den Vergleich zwischen verschiedenen Platten, weil die Leuchtsignal ist vorübergehend mit einer schnellen Zerfallsrate, wie von Gilbert und Kollegen 26 gezeigt.
  3. Mittelwert der Leuchtwerte aus den 3 oder 6 Vertiefungen in jeder Gruppe und Handlung als Funktion der Zellzahl in einem Streudiagramm (siehe Abbildung 3). Erste subtrahieren durchschnittliche Hinter Lumineszenz-Werte der entsprechenden leeren Brunnen (Brunnen 2B - 2G, Brunnen 11B - 11D, 11E und Brunnen - 11G) von jedem entsprechenden Datenpunkt. Es gibt drei verschiedene Gruppen für jede Beschichtungsdichte in diesem ersten Experiment (Fig. 2A) liegen. ATP-Werte linear mit Zelldichten in einem oder allen dieser Gruppen korreliert. Fahren Sie mit der höchsten Verdünnung von Reagenzien, die immer noch zufriedenstellende Ergebnisse auf Kosten zu sparen. Kriterien für zufriedenstellende Ergebnisse beschrieben in der Abschnitt Ergebnisse.
    Hinweis: Bei den in der vorliegenden Studie verwendeten Medien, Hintergrundwerte mit diesem Test sind nicht hoch und es ist möglich, um die leeren Brunnen zu springen. Allerdings, berichtet der Hersteller Promega Unterschiede in der Lumineszenz mit verschiedenen Kulturmedien. Die vorliegende Studie verwendet Hyclone Fetal Klon III, eine synthetische Version des fetales Rinderserum für N2a-Zellen und Kälberserum für primäre kortikale Kulturen. Laut Hersteller nimmt Kälberserum Helligkeitswerte aber nicht die Empfindlichkeit des Assays zu verringern. Dennoch, wenn dies von signifikanter Bedeutung, verdünnter ATP-Assay-Reagenzien in PBS anstelle von Medien zum Zeitpunkt des Assays.
    1. Wenn die Zellen scheinen ungleichmäßig über Spalten Nacht wachsen, versuchen Testen sie innerhalb von 6 Stunden der Beschichtung. Doch bedenken Sie, dass die Dichte an der üblichen Zeit von Assay (zum Beispiel, 24 Stunden nach der Behandlung) ist die Dichte, mit der Linearität muss erreicht werden.

3. Infrared Assays

  1. Der Morgen nach der Plattierung, fixieren die Zellen in der zweiten Platte bei Raumtemperatur in einem Abzug. Achten Sie darauf, Handschuhe für diesen Schritt tragen und entsorgen Sie das Fixiermittel als chemischer Abfall, weil Formaldehyd ist krebserregend. Hinzufügen von 4% Formaldehyd und 4% Saccharose in 0,1 M Phosphatpuffer in die bestehenden Medien in einer 1:1-Verdünnung. Die Medien können auch mit PBS vor der Befestigung in voller Stärke Fixiermittel gewaschen werden. Entweder Technik funktioniert gut.
    1. Inkubation in Fixiermittel für 20 min und dann die Fixiermittel und waschen 3x in 200 ul PBS.
  2. Bewahren Sie die Platte in PBS mit 0,2% Natriumazid bei 4 ° C, wenn der Test nicht am gleichen Tag statt. Andernfalls fahren mit dem Assay und setzen die Zellen in Blockierungslösung unspezifische Bindung von Antikörpern zu minimieren.
    1. Verdünnen Sie die Serum-Fisch Odyssey Block 1.01 in PBS und fügen 0,3% Triton X-100 als Durchlässigkeitszelle. Machen Sie genug Blockierungslösung sowie Primär-und Sekundär Antibody Lösungen, so dass 35 ul gut in jede pipettiert werden. Allerdings, wenn eine Menge von Blasen sind beim Pipettieren beobachtet, machen> 50 ul für jeden gut, da sonst die Luftblasen reichen bis in die Zellen-und Block Antikörper aus der Bindung. Übermäßige Seifenbläschen als ungefärbten kreisförmigen Fleck in der Mitte des gut erscheinen. Versuchen Sie, das Pipettieren anpassen, wenn dies geschieht.
    2. Inkubieren in dieser Blockierlösung für 30-60 min bei Raumtemperatur.
      Anmerkung: 5% Rinderserumalbumin oder normales Serum von der gleichen Spezies wie der sekundäre Antikörper kann auch als Blockierungslösungen auf Kosten des Fischserum Block speichern verwendet werden. Blocking-Lösungen kann die Leistung des Antikörpers beeinflussen. Somit ist der optimale Block für jeden Antikörper am besten empirisch bestimmt.
      Hinweis: Einige Forscher setzen In-Cell Western-Platten auf Schüttler bei Inkubationen. Dies ist jedoch nicht notwendig.
  3. Stellen Sie die primären Antikörper: 1:10.000-Verdünnung für Anti-α-Tubulin-(Maus-monoklonal, Tabelle 1) und 1:2000 Verdünnung anti-MAP2 (monoklonaler Maus, Tabelle 1). Diese Antikörper sind spezifisch für die interessierenden Proteine ​​in diesen zellulären Modellen; Spezifität ist für jede immunzytochemische Fleck.
    Hinweis: MAP2 ist ein Marker für Neuronen und neuronalen Misch / Gliakulturen geeignet ist. Die hier gezeigten postnatale Kulturen enthalten auch einige Glia (~ 25%), da Astrozyten erscheinen zuerst an embryonalen Tag 18, mit ihren Nummern Höhepunkt in der frühen Neugeborenenperiode 27,28. Man kann nicht zwischen Astrozyten und Neuronen in der ATP-und DRAQ5 + Sapphire Assays unterscheiden. Um Neuronen und Astrozyten getrennt zu messen, verwenden Sie gleichzeitige MAP2 und GFAP Färbung in den 800 und 700 nm Kanäle, wie Mullett 4,29 und Kollegen beschrieben, so dass sich DRAQ5 + Sapphire. Wenn jedoch alle Zellen in der Kultur möchte beurteilt werden, mit einem Schwenk-Zellmarker, wie zB α-Tubulin, β-Actin, GAPDH oder.
    Hinweis: Diese Verdünnungen wurden für die N2a und primären kortikalen Zellen optimiert und müssen nicht auf jedem Modell zu verallgemeinern. Daher versuchen die mindestens zwei primäre Antikörperverdünnungen, eine auf der linken Hälfte der Platte und eine auf der rechten Hälfte (siehe Fig. 2B). Alternativ versuchen 3-4 Verdünnungen der primären Antikörper auf jeweils 3 Brunnen. Zum Beispiel kann die empfohlene Verdünnung des Antikörpers Einlageblatt mit zweifachen Veränderungen flankiert werden. In anderen Worten, wenn die empfohlene Verdünnung für Immunzytochemie ist 1:500, 1:250 und auch versuchen 1:1.000 Verdünnungsfaktoren.
    1. Antikörper verdünnt in 1:1-Odyssey-Block: PBS und fügen 0,3% Triton-X. Um Kosten zu sparen, versuchen Sie, die Antikörper in der Blockierungslösung, die auf die Zellen in Schritt 3.2.1, indem diese Lösung am Ende der Inkubationszeit aufgetragen. Halten Sie die Zellen in PBS während dies zu tun, sie müssen nicht austrocknet.
    2. Inkubation in Primärantikörper entweder 1-2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C Für schwach binding Antikörper und Proteine, die nicht reich sind, können dazu beitragen, über Nacht Inkubationen Signal.
      Hinweis: Lassen Sie mindestens 3 Brunnen in Blocking-Lösung für die Hintergrund Subtraktion bei jedem sekundären Antikörperkonzentration (Brunnen 2B-2D und 2E-Brunnen 2G in Abbildung 2B). Sie nicht, diese Brunnen zu jedem primären Antikörper haupt aussetzen. Sie zeigen das Ausmaß der unspezifischen Bindung von dem sekundären Antikörper und sind nützlich für die Berechnung des Signal-Rausch-Verhältnisse. Wenn es ein Problem, dass die sekundären Antikörper zu hohen unspezifischen Bindung führen, sind: Kontrollvertiefungen, die nicht mit entweder primären oder sekundären Antikörper ausgesetzt werden, erhalten aber die gleiche Anzahl von Wäschen. Der Unterschied zwischen diesen Brunnen und den "Sekundär nur" Brunnen wird das Ausmaß der unspezifischen Bindung durch den sekundären Antikörper allein verursacht offenbaren. In unserem Test auf Maus N2a Zellen, Signalintensität mit Anti-Maus-Sekundärantikörper allein war 0,557 ± 0,032, Signal mit anti-Kaninchensekundären Antikörper allein war 0,533 ± 0,041, Signal ohne sekundäre Antikörper wurde 0,357 ± 0,003 und Signal mit Primär-und Sekundärantikörper war 11,867 ± 0,911. Damit haben wir nicht beobachtet hohe unspezifische Bindung auch bei Verwendung von Anti-Maus-Sekundärantikörper auf Mauszellen. Es gibt mehrere Hersteller für Infrarot-Sekundärantikörper, wir empfehlen nur den Kauf der hochQuer adsorbiert diejenigen. Beachten Sie, dass die Konzentration des sekundären IgG-Antikörper können in Abhängigkeit von der Quelle variieren.
  4. Abwaschen primären Antikörper mit 3 Waschungen von 200 ul PBS pro Vertiefung jeweils 10 min. Primäre Antikörper können bei 4 ° C für ein paar Wochen in 0,2% Natriumazid gespeichert und wiederverwendet, bis winzige Schmutzflecken werden deutlich, wenn die Lösungen bis zu Licht gehalten werden. Dies wird nur durchgeführt, um Kosten zu sparen. Wenn die Kosten nicht ein Problem ist, machen frische Antikörper für jeden Gebrauch.
  5. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper von 1:1000 oder 1:2000 in 1:1-Odyssey-Block: PBS mit 0,3% Trit-X (Fig. 2B). Fügen Sie die 1:1000 Verdünnung auf die obere Hälfte der Platte und 1:2.000 in die untere Hälfte der Platte. Diese Konzentrationen könnte weiter reduziert werden, um Kosten zu sparen, sondern prüfen Sie für Linearität, bevor sich auf diese.
    Hinweis: Achten Sie darauf, den entsprechenden sekundären Antikörperlösung auf die Hintergrund-Subtraktion Brunnen (Spalte 2 in 2B) hinzufügen.
    1. Wenn ein zweites Protein wird an Stelle von DRAQ5 + Saphir-, Etiketten-Zellen, die für α-Tubulin-oder MAP2 mit 700 nm Ziege-Anti-Maus-IgG und das zweite Protein in der 800 nm-Kanal mit primären Antikörpern aus einer anderen als der Maus-Spezies untersucht werden. Die 800 nm-Kanal hat weniger Hintergrund als die 700 nm-Kanal und sollte für die meisten kritischen Protein von Interesse reserviert werden.
    2. Inkubation in Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur in einer Schublade weg vom Licht.
  6. Abwaschen Sekundärantikörper mit 3 Waschungen von 200 ul PBS pro Vertiefung jeweils 10 min.
  7. Nehmen Sie die DRAQ5 + Saphir-Lösungen. Für die linke Hälfte der Platte verdünnt 1:10.000 DRAQ5 (0,5 &mgr; M Endkonzentration) und Saphir 1:1000 in PBS mit 0,3% Triton-X-(Spalten 3 - 6, Fig. 2B). Für die rechte Hälfte der Platte, verdünnte DRAQ5 1:20.000 (0,25 uM) und Sapphire 1:2000 (Spalten 7-10, Fig. 2B).
    Hinweis: DRAQ5 verwendet werden, um bei einer 1 mM Stamm statt einer 5 mM Lager verkauft werden. Einige bisher veröffentlichten Berichte daher verwendet werden, 1:4000 oder 1:2000 Verdünnungen DRAQ5 8.
    1. Um Kosten zu sparen, wenn zwei Platten gleichzeitig untersucht wird, kann der gleiche DRAQ5 + Sapphire Lösungen auf zwei Platten in der Reihenfolge verwendet werden, Pipettieren es von der ersten Platte und Hinzufügen zu der zweiten. Wenn die gleichen Lösungen werden zweimal in dieser Weise verwendet werden, verwenden Sie sie innerhalb von einem Tag. Verdünnt DRAQ5 + Sapphire Lösungen nicht bei 4 º C gespeichert werden oder zur späteren Verwendung eingefroren werden.
    2. Inkubation in diesen Lösungen für 30 Minuten bei Raumtemperatur weg from Licht. Wenn die Zeit knapp und die DRAQ5 + Sapphire Lösungen werden nicht auf anderen Platten mit verschiedenen Sekundärwiederverwendet werden, fügen Sie diese Flecken mit den Sekundärantikörperlösungen in Schritt 3,5 und Inkubation für 1 Stunde.
      Hinweis: Sie DRAQ5 + Sapphire Lösung für die Hintergrund-Subtraktion Brunnen (Spalte 2 in 2B) nicht hinzufügen, da diese Brunnen sollten nicht in der 700 nm-Kanal gefärbt werden.
  8. Waschen Sie die Platte 3x mit 200 ul PBS pro Vertiefung für jeweils 10 Minuten. Legen 0,2% Natrium-Azid in der letzten PBS waschen, wenn die Platte gehen, um mit anderen sichtbaren Bereich sekundären Antikörpern gefärbt nach der Infrarot-Bildgebung abgeschlossen ist.
  9. Scannen Sie die Platte auf einer Odyssee Imager. Beginnen Sie mit dem Scannen der Platten an Intensität 5 und 169 mm Auflösung. Entweder "mittlerer Qualität" oder Einstellungen "niedrige Qualität" ausreichend sind. Das Unternehmen gibt keine genauen Anregung / Emissionsfilter Informationen freizugeben. Jedoch sind die Emissionsfilter ungefähr 20 nm breit und etwa 7 zentriert20 und 820 nm, je nach Hersteller.
    Hinweis: Es ist möglich, Platten noch feucht scannen als Ermittler wollen sie weiterhin mit anderen Markern färben. Allerdings schlägt sich das Unternehmen in seinem Online-Protokoll, das Trockenplatten führen zu weniger wohl gut Signal verbreitet. Wenn Sie sie nass und dann trocken, um die Daten vergleichen zu scannen, sicher sein, alle die PBS zu entfernen aus dem Brunnen, weil verbleibende Salze nach der Verdampfung kann zu hohen Hintergrundfluoreszenz an den Rändern führen.
    1. Die Odyssey Imager scannt und durch den Boden der Platte. Platten von verschiedenen Herstellern können unterschiedliche Schwerpunktverschiebungen fordern, da der Boden der Vertiefungen können in ihrer Dicke und Tiefe in der Platte variieren. Versuchen Scannen mit unterschiedlichen Schwerpunktverschiebungen und sehen, wo die höchsten Signal-zu-Rausch-Verhältnis und schärfsten (die meisten im Fokus) Signals erreicht: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Versuchen Sie auch, um die Tiefe des Brunnens aus dem Boden einer Platte mit einem Lineal messen, um die findin bestätigengs auf der Odyssee. Denken Sie daran, dass der Kunststoff im Boden des Brunnens kann zusätzliche Höhe zu den Herrscher Messungen hinzuzufügen. Die in der vorliegenden Studie verwendet Costar-Platten erfordern ein Fokusversatz von 4,0 mm.
    2. Verwenden Sie die In-Cell Western-Funktion in der Software, um die passende Größe Gitter auf das Bild der Platte legen und exportieren Sie die Daten in Microsoft Excel. Untersuchen Sie die "integrierte Intensität" Werte der gleichen Brunnen in verschiedenen Schwerpunktverschiebungen, die höchsten Fluoreszenzwerte zu finden. Die Fokusversetzungs, die den höchsten Signal-zu-Rausch-Verhältnis (Signal in immun Vertiefungen versus "ohne primäre negative Kontrolle" wells) ergibt die man im folgenden zu wählen.
    3. Sobald ein Schwerpunkt Offset wird beschlossen, erneut zu scannen in kleineren Schritten. Zum Beispiel, wenn das hellste Signal war bei 3,5 und 4,0 mm, versuchen Abtastung bei 3,6, 3,7, 3,8 und 3,9 mm und sehen, ob es eine weitere Verbesserung in der Signalstärke. Wenn der Fokus-Verschiebung ist verkehrt, Signalintensitäten über die 12 Spalten auf einem leeren plaß (wenn alle Spalten gleich Signal haben) wird als U-förmige Kurve statt einer flachen Linie erscheinen. Wenn das so weiter geht, um ein Problem mit Kunststoffplatten, versuchen Glasbodenplatten.
  10. Ziehen Sie den Durchschnitt der integrierten Intensitäten in den Hintergrund Subtraktion Brunnen (2B; Brunnen 2B - 2D-oder Brunnen 2E - 2G) von jedem entsprechenden Datenpunkt in der 700 und 800 nm-Kanäle. Dann ist der Mittelwert der integrierten Signalintensitäten für jede Gruppe von Brunnen. Zeichnen Sie die Daten als Streudiagramm gegen Zelldichte (siehe Abbildung 3).
    1. Vergleichen der Ergebnisse der zwei verschiedenen Verdünnungen des primären und sekundären Antikörpern, und die Ergebnisse der zwei verschiedenen Verdünnungen DRAQ5 + Saphir auf jeder Verdünnung für nachfolgende Versuche zu regeln. Wenn Linearität nicht erreicht, versuchen Scannen mit einer anderen Intensität. Rescan mit Intensitäten 3 und 7 statt 5 und erneut analysieren die Daten. Wenn die Daten zu verbessern an einem dieser Intensität abersind immer noch nicht befriedigend, scannen in Schritten um diese Intensität.
    2. Seien Sie vorsichtig, nicht auf Bilder, wo die Software zeigt weiße Flecken in den Vertiefungen zu analysieren; diese Flecken bedeuten gesättigte Signal aus dem Bereich der Bildwandler. Scannen mit einer geringeren Intensität, wenn dies geschieht.
    3. Wenn Linearität nicht erreicht wird, auch versuchen, die Zellen innerhalb von 6 Stunden der Plattierung zu beheben, weil sie vielleicht zu wachsen oder sterben ungleichmäßig in verschiedenen Spalten über Nacht. Versuchen Sie auch verschiedene Beschichtungsdichten, verschiedene Scan-Intensitäten, weitere Optimierungen der Reagenz Verdünnungsfaktoren, Glasbodenplatten, DRAQ5 selbst als Kern-only-Färbung, oder andere als anti-α-Tubulin-oder anti-MAP2 verschiedenen Antikörpern.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Der limitierende Faktor bei diesen Versuchen ist die Infrarot-Färbung, wie die ATP-Assay ist in relativ kurzer Dauer. Für die Infrarot-Assays, erwarten wir, dass acht 96-Well-Platten können durch die Staffelung der zwei Gruppen von je vier Platten gefärbt und gescannt werden innerhalb eines Tages (siehe Abbildung 1). Diese Schätzung geht davon aus, 20 min der Fixierung, 30 min Waschen, 30 min zu blockieren, 2 h Inkubation primärer Antikörper, gefolgt von 30 min von Waschanlagen, 1 Stunde sekundären Antikörper-Inkubation, gefolgt von 30 min von Waschanlagen, 30 min DRAQ5 + Sapphire von 30, gefolgt min von Waschanlagen, und 34 min von Scanzeit für 4 Platten. Fünfzehn Minuten der in Fig. 1 für Waschungen, um die versetzten Pipettieren von vier einzelnen Platten entfallen berücksichtigt. Zeit für Datenanalysen ist in dieser Schätzung enthalten. Wenn ATP-Assay-Messungen werden parallel für jede Infrarotplatte auftreten, können zwölf Platten an einem Tag getestet werden - sechs für die Infrarot-Flecks und sechs für die ATP-Spiegel.

Kriterien für zufriedenstellende Daten in den Regressionsanalysen (Abbildung 3), die in dem Protokoll Abschnitt erwähnt, gehören eine signifikante Korrelation zwischen der Beschichtungs-Dichte und die Signalstärke (zwei tailed p ≤ 0,05). Die Größe der Änderungen in der Lumineszenz-oder Infrarot-Signal auch im Verhältnis zu den Veränderungen in der Anzahl von Zellen sein. Idealerweise sollte 5k Zellen etwa die Hälfte der Lumineszenz-oder ATP-Spiegel von 10k-Zellen haben, und 15k Zellen sollten etwa 50% größere Werte als 10k Zellen, etc haben. Diese Proportionalität spiegelt die Empfindlichkeit des Assays und unterscheidet sich von der R 2-Wert oder der Bestimmungskoeffizient. R 2 nur misst, wie gut die Regressionslinie annähert, die wahren Datenpunkten. Selbst wenn die Daten linear, können die relativen Änderungen in der Signalstärke nicht im Verhältnis zu der Größe der Änderungen der Zellzahl sein. Dies kann passieren, wHenne die Regressionslinie hat eine hohe R 2, aber eine geringe Steigung, was darauf hindeutet, dass der Test nicht sehr empfindlich. Somit sind die Kriterien der Verhältnismäßigkeit und signifikante Korrelation der Daten sollten beide zufrieden sein. Schließlich sollten Änderungen in der Signalstärke um die optimale Beschichtungs-Dichte in den Dynamikbereich des Instruments und den Test fallen. Der dynamische Bereich ist das Verhältnis zwischen der größten und kleinsten Werte möglich. Die Odyssee Bildkamera hat ein 4,5 log Dynamikbereich und gesättigte Signal zeigt sich als helle weiße Farbe anstelle des üblichen roten oder grünen Bild, um die Forscher, dass die Ergebnisse nicht mehr quantifizierbar zu alarmieren. Der Dynamikbereich während des Assays selbst ist schmaler, da Themen wie Maximal-und Minimal Beschichtungs-Dichte für einen bestimmten Zelltyp. Wenn man Platten bei steigenden Zelldichten, wird die Sättigungskurve für diese Tests die Beschichtungsdichten oberhalb dessen keine weiteren Unterschiede aufgelöst werden kann offenbaren, weil sie entweder aus sindBereich der Imager oder weil die Zellen nicht das Gedränge über Nacht überleben. Ebenso, wenn man Platten abnehmZellDichten, kann man die Mindestzelldichten, unter dem es keine weiteren Änderungen in der Signal messen. Der dynamische Bereich des Assays sind nur die Beschichtungsdichten zwischen der minimalen und der maximalen Anzahl der Zellen / Vertiefung, die aufgelöst werden können. Wir haben nicht den vollen Dynamikbereich für diese speziellen Tests gemessen, weil unsere Zellen nicht gut bei Dichten über diejenigen, die gemeldet werden überleben.

Nach der Optimierung nun Fleck N2a Maus-Neuroblastom-Zellen mit anti-α-Tubulin bei einer 1:10.000-Verdünnung, mit Anti-Maus-IgG bei einer Verdünnung von 1:2000 und mit DRAQ5 + Sapphire Lösungen bei 1:20.000 und 1:2.000, jeweils. Wir 25 ul der ATP-Assay-Reagenzien verwenden, auch in 50 ul Medien. Die Ergebnisse unter diesen Bedingungen sind in den 3A, B und C dargestellt sind und vor dem veröffentlichte 8. Signalstärke in allen drei Assays signifikant mit der Anzahl der Zellen pro Vertiefung korreliert. Obwohl alle drei Tests waren sehr linearen, waren sie nicht in der Empfindlichkeit gleichwertig. Zum Beispiel, wussten 5k Zellen pro Loch nicht genau die Hälfte der Menge von Infrarot-Färbung als 10k Zellen pro Vertiefung. Im Gegensatz zu den IR-Assays, die ATP-Assay war empfindlicher gegenüber Änderungen in Beschichtungs-Dichte. In anderen Worten, fiel Lumineszenz durch etwa die Hälfte von 10k bis 5k und von 5k 2.5k Zellen pro Vertiefung. Trotz dieser Erkenntnisse auf die höchste Empfindlichkeit des ATP-Assay, ist es am besten, alle drei Tests durchführen, um für die Lebensfähigkeit ein umfassenderes Bild der zellulären Gesundheit.

Wir Ratten primären neuronalen Kulturen mit Anti-MAP2 bei einer 1:2.000-Verdünnung, mit Anti-Maus-IgG bei einer Verdünnung von 1:1000 zu färben, und mit DRAQ5 + Sapphire Lösungen bei 1:10.000 und 1:1.000 bzw. 25 und mit &mgr; l der ATP-Assay-Reagenzien, die in 50 ul Medium (Figuren3D, E und F). Signalstärke in der DRAQ5 + Sapphire Assay war der mindestens linearen aller drei Tests, weil es kaum einen Unterschied zwischen 100k und 200k Zellen pro Vertiefung in 700 nm-Kanal. Allerdings, die Signalstärke bei 700 nm war auch im Verhältnis zur Zellzahl unter 100k Zellen pro Vertiefung und wir haben immer neuronalen Kulturen bei 100k Zellen pro Platte trotzdem. Dennoch haben wir ebenfalls beobachtet, dass die DRAQ5 + Saphir-Assay ist nicht so empfindlich gegen Toxin Behandlungen wie die beiden anderen Assays (siehe unten). Im Gegensatz zu DRAQ5 + Sapphire, war die Signalstärke in der besseren Verhältnis mit Überzug Dichten sowohl für die MAP2 und ATP-Assays. Es sei darauf hingewiesen, dass ein größeres Volumen des ATP-Assay-Reagenzien können die Ergebnisse bei 200k Zellen pro Vertiefung zu verbessern. In anderen Worten kann Lumineszenzabgabe genau 200% der Werte bei 100 K Zellen pro Vertiefung angehoben werden, weil es mehr Reagenz. Allerdings haben wir nie kortikalen Kulturen auf diesem hohen einer Beschichtungs-Dichte für experime Plattents. Wir haben auch festgestellt, dass MAP2 und ATP-Spiegel empfindlich auf 20% Veränderungen im Neokortex neuronalen Beschichtungs-Dichte, die von 20k Zellen pro Vertiefung zu 120k Zellen pro 22 sind. Dennoch, andere Forscher sollten diese Tests im eigenen Labor, anstatt die optimalen Bedingungen aus unseren Experimenten wegen der Inter-Labor Variabilität in der Gewebe-und Zell Handhabung zu testen.

Um die Nützlichkeit dieser Assays folgenden Behandlungen mit Toxinen zu illustrieren, zeigen wir Dosis-Wirkungs-Kurven von N2a Zellen mit MG132, ein Proteasom-Inhibitor (Fig. 4) behandelt. MG132 wurde in der Anwesenheit oder Abwesenheit des Glutathion-Vorläufer N-Acetylcystein aufgebracht. Diese Daten können auch in unserer jüngsten Veröffentlichung über die schützende Wirkung von N-Acetylcystein 30 gefunden werden. Die Zellen wurden 48 h untersucht folgende MG132 Behandlungen. MG132 dosisabhängig verringert DRAQ5 + Sapphire Signal (4A, D) und α-Tubulin-Signal ( 50-Werte in Abwesenheit oder in Gegenwart von N-Acetylcystein zu extrahieren. Die verwendete Gleichung war Y = 100 / (1 ​​+ 10 ^ ((Logik 50-X) * Hang))). Der IC 50-Wert für DRAQ5 + Sapphire betrug 1,64 uM MG132 (Logik 50 = 0,22 ± 0,03, R 2 = 0,9477, Hill Steigung = -1,26) und für die α-Tubulin-Ebenen betrug 1,96 uM MG132 (Logik 50 = 0,29 ± 0,04, R 2 = 0,9296, Hill Steigung = -1,349). N-Acetylcystein verschoben die Kurven nach rechts, was darauf hindeutet, dass mehr MG132 war erforderlich, um Zellen in Gegenwart dieser Schutz Verbindung zu töten. In Gegenwart von N-Acetyl-Cystein, die IC 50-Wert für DRAQ5 + Saphir betrug 4,64 uM MG132 (Logik 50 = 0,67 ± 0,05, R 2 = 0.8732, Hill Steigung = -1.06) und α-Tubulin war 6,35 um MG132 ( Logik 50 = 0,80 ± 0,04, R 2 = 0,8802, Hill Steigung = -10,382). Eine Studie von N2a Zellen durch Madeira und Kollegen berichteten etwa 50% Verlust der Lebensfähigkeit bei 10 uM MG132, wie durch den MTT-Assay 31 gemessen. Fioriti berichteten 60% Verlust der Lebensfähigkeit 4 h nach Behandlung mit 50 &mgr; M MG132, wieder mit dem MTT-Assay 32. Schließlich Zhang und Kollegen berichteten 60% Verlust der Lebensfähigkeit bei 10 uM MG132, mit Grafen von Hoechst-gefärbten Zellkernen 33. Diese IC 50-Werte sind höher als unsere. Allerdings untersuchen wir für die Lebensfähigkeit 48 Stunden nach Beginn der Behandlung, im Gegensatz zu diesen früheren Studien.

Gemäß der Zelltiters Glo Assay wurden ATP-Werte bei niedrigen Konzentrationen von MG132 (4C) erhöht, was zeigt, dass der ATP-Spiegel sind nicht notwendigerweise proportional zu Zelltiters nach Behandlung. Die ATP-Daten sind jedoch nützlich, da sie zeigen, dass N-Acetylcystein schützt auch Stoffwechselfunktion bei N2a Zellen mit MG132. Dies ist in t nachgewiesener in der IC-50-Wert von MG132 verschieben mit N-Acetyl-Cystein. Der IC 50-Wert für ATP 3,05 uM MG132 (Logik 50 = 0,48 ± 0,07, R 2 = 0,8616, Hill Steigung = -1.0) mit Fahrzeug-und 9,12 uM MG132 mit N-Acetyl-Cystein (Logik 50 = 0,96 ± 0,04, R 2 = 0,9261, Hill Steigung = -1.0). Beachten Sie, dass die Konzentrationen, die steigende ATP geführt wurden in dieser Analyse ausgeschlossen. Inklusive aller Werte in der Analyse senkte das Bestimmtheitsmaß und erhöhte die IC 50-Werte auf 4,03 uM MG132 (Logik 50 = 0,61 ± 0,09, R 2 = 0,7224, Hill Slope = -1,4) in Gegenwart von Fahrzeug und 9,24 uM MG132 (Logik 50 = 0,96 ± 0,07, R 2 = 0,6607, Hill Slope = -2.1) in Gegenwart von N-Acetyl-Cystein (Kontrast mit 4C).

Ein zweites Beispiel dieser drei Tests für Primärkulturen in Figur dargestelltene 5. Gewebe wurde aus Rattenhirnrinde und Allocortex mikrodisseziert, dissoziiert, bei 100k Zellen pro Vertiefung plattiert, und parallel mit H 2 O 2 behandelt. Wir testeten die Hypothese, dass diese beiden Hirnregionen würden im Umgang mit oxidativem Stress unterscheiden, wie sie unterschiedlich anfällig für neurodegenerative Erkrankungen 34-39 sind. Einige dieser Daten veröffentlicht worden, und die Ergebnisse werden in dieser Studie 22 diskutiert. Die IC 50-Werte für DRAQ5 + Sapphire waren 22,84 uM H 2 O 2 in Neocortex (Logik 50 = 1,36 ± 0,07, R 2 = 0,7552, Hill Steigung = -0,95) und 24,63 uM H 2 O 2 in Allocortex (Logik 50 = 1,39 ± 0,03, R 2 = 0,9379, Hill Steigung = -1,74). Die IC 50-Werte für MAP2 waren 11,66 uM H 2 O 2 in Neocortex (Logik 50 = 1,07 ± 0,04, R 2 = 0,9332, Hill Steigung = -2,13) ​​und 29,76 uM H 2 O 2 in Allocortex (Logik 50 = 1,47 ± 0,04, R 2 = 0,8934, Hill Steigung = -4.45). Die IC 50-Werte für ATP waren 23,82 uM H 2 O 2 in Neocortex (Logik 50 = 1,38 ± 0,03, R 2 = 0,8907, Hill Steigung = -2,56) und 44,5 uM H 2 O 2 in Allocortex (Logik 50 = 1,65 ± 0,03 , R 2 = 0,9204, Hill Steigung = -2,71). Allocortex deutlich widerstandsfähiger gegenüber oxidativem Stress als Neocortex bei Konzentrationen von H 2 O 2 unter 50 um, aber die DRAQ5 + Sapphire Assay war der am wenigsten empfindlich illustriert diesen Unterschied. Dies kann zu reflektieren, dass diese Bestimmung nicht zu unterscheiden von Glia-Neuronen, anders als MAP2. Wie bereits erwähnt, enthalten unsere Kulturen einige Gliazellen, wie sie aus postnatalen Gehirn 22 geerntet. Überraschenderweise bei hohen Konzentrationen von H 2 O 2 (75 &mgr; M und mehr), wenn alle MAP2 + in diesen Kulturen sind resistenter gegen H 2 O 2 als MAP2 +-Neuronen (nicht gezeigt), nehmen wir an, dass neocortical Astrozyten weniger anfällig für oxidative Schäden als allocortical Astrozyten sind. Dieses Muster kann in der DRAQ5 + Sapphire-Test aber nicht der ATP-Assay reflektiert werden, weil die oxidativ geschädigten Astrozyten sind nicht metabolisch lebensfähig. Was auch immer der Grund für diese markante Muster, diese Primärkultur Daten werden hier veranschaulicht nur zu zeigen, dass die Tests sind nicht immer einig.

Schließlich, um die Intravariabilität mit allen drei Tests veranschaulichen, aufgetragen wir den zweiten und dritten Brunnen "Rohdatenpunkte aus den oben genannten Dosis-Wirkungs-Kurven in den 6A-C und 6G-I >. In ähnlicher Weise, um die Zwischenplatte Variabilität illustrieren, aufgetragen wir die durchschnittliche Rohdatenpunkte (der Mittelwert von drei Vertiefungen) aus zwei Platten in 6D-F und L-6J. Signalstärke in Wiederholungsvertiefungen und über unabhängige Experimente zeigten signifikante Korrelationen für jede Maßnahme. Es gab eine gewisse Variabilität in rohen Werte in unabhängigen Experimenten in primären neuronalen Kulturen, vielleicht weil wir verwenden die alten Antikörper und DRAQ5 + Sapphire Lösungen und unbenutzt wieder einfrieren ATP-Assay-Reagenzien ein paar Mal. Ein weiterer Grund für die höhere Variabilität Zwischenplatte in Primärkulturen kann die Qualität der Kultur selbst sein. Unterschiedliche postmortalen Gewebeintervalle und Handhabung in den verschiedenen Versuchstagen kann, um die Varianz bei.

jpg "/>
Abbildung 1. Schematische Darstellung der drei Lebensfähigkeitstests (A) und Timeline für Infrarot-Assays (B). Dargestellt sind die empfohlenen Verfahren für N2a-Zellen. Wenn DRAQ5 + Sapphire Lösungen werden nicht auf anderen Platten, die mit verschiedenen sekundären Antikörpern gefärbt werden wieder verwendet werden, können sie mit dem Anti-Maus-Sekundärantikörperlösung für eine abschließende Inkubation 1 h kombiniert werden, wodurch das Verfahren um eine Stufe. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
2. Plattenformat des ATP-Assay (A) und der Infrarot-Assays (B), die in dem Verfahren beschrieben werden. Obwohl96-Well-Platte dargestellt, diese Tests können in andere Formate, wie beispielsweise 384-Well-Platten angepasst werden, um auf Reagenzien und Zellen speichern. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 3
3. Lineare Regressionen für alle drei Lebensfähigkeitstests in N2a Maus-Neuroblastom-Zellen (A, B, C) ​​oder primäre postnatalen Ratten neocortical Neuronen (D, E, F). Signalstärke für jeden Test wird als eine Funktion der Dichte der Schicht aufgetragen. Einschübe zeigen repräsentative Infrarotaufnahmen der DRAQ5 + Sapphire (A, D), α-Tubulin (B) oder MAP2 (E)-Färbung. Raw Intensitätswerte unter jedem Bild aufgeführt. Beachten Sie, dass Roh-Werte ineine einzelne Vertiefung kann von dem Mittelwert von 3 Vertiefungen für das Experiment und aus dem Durchschnitt von 3-4 unabhängigen Experimenten. Die Original-Infrarot-Bilder wurden pseudocolored Rot (700 nm) oder grün (800 nm). Jedes Experiment wurde in dreifachen Vertiefungen in beiden N2a Zellen und primären Neuronen für α-Tubulin, 4x für MAP2 für ATP in N2a-Zellen durchgeführt und wiederholt, 3x für DRAQ5 + Saphir, 3x, 3x und 4x für ATP in Neuronen. Die Daten aus den drei Vertiefungen wurden für eine endgültige Wert für jeden von 3-4 Experimenten gemittelt. Der Mittelwert und SEM dieser Endwerte 3-4 ist in dem Diagramm gezeigt. Beachten Sie, dass die DRAQ5 + Sapphire Werte zeigen geringe Standardabweichungen, so dass SEM Bars sind nicht sichtbar. Die R 2 Bestimmungskoeffizient und zwei seitiger p-Wert der Beurteilung der Bedeutung der Korrelation werden auch für jede Maßnahme veranschaulicht. Die Daten wurden in GraphPad Prism (Version 5.0) analysiert. Von Neurochemie International, 61, Nachdruck von Unnitheine et al: "Rettung aus einem Zwei getroffen High-Throughput-Modell der Neurodegeneration mit N-Acetyl-Cystein", S. 356-368, mit Genehmigung von Elsevier. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 4
4. Schutz N2a Zellen gegen MG132 Toxizität. N2a-Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen von Proteasom-Inhibitor MG132 in Gegenwart oder Abwesenheit des Antioxidationsmittel N-Acetyl-Cystein (, 3 mM NAC) behandelt. Alle drei Lebensfähigkeitstests wurden 48 Stunden später durchgeführt. Beachten Sie den Anstieg der ATP-Werte bei niedrigen Konzentrationen von MG132 (C). Keine parallele Anstieg der DRAQ5 + Sapphire-Färbung (A) or α-Tubulin (B) war erkennbar. Repräsentative Infrarotaufnahmen der DRAQ5 + Sapphire und α-Tubulin-Flecken wurden in D und E rot und grün pseudocolored sind. Jedes Experiment wurde in dreifachen Wells durchgeführt und wiederholt, 4x für DRAQ5 + Saphir, 4x für α-Tubulin und 3x für ATP. Die Daten aus den drei Vertiefungen wurden für eine endgültige Wert für jeden von 3-4 Experimenten gemittelt. Der Mittelwert und SEM dieser Endwerte 3-4 gezeigt. * P ≤ 0,05 für den Vergleich von N-Acetyl-Cystein gegen Wasser, Bonferroni Korrektur nach Zwei-Wege-ANOVA. Die Daten wurden in GraphPad Prism (Version 5.0) analysiert. Von Neurowissenschaften, 255 nachgedruckt, von Jiang et al: "N-Acetylcystein stumpft proteotoxicity in einem Hitzeschock-Protein-abhängige Weise", S. 19-32, mit Genehmigung von Elsevier. Clecken Sie hier, um eine größere Ansicht.

Figur 5
Abbildung 5. Differential Anfälligkeit der Neokortex und allocortical Kulturen zu Wasserstoffperoxid Toxizität. Mikrodissektionen der postnatalen primären motorischen und sensorischen Hirnrinde und des entorhinalen und piriformen Allocortex wurden dissoziiert und bei 100k Zellen pro Vertiefung beschichtet. An Tag 2 in vitro wurden die Zellen mit den angegebenen Konzentrationen an H 2 O 2 behandelt. Die Platten wurden 48 Stunden später untersucht. Beachten Sie, dass Allocortex überlebt diese Kultivierungsbedingungen besser als Neocortex und hat eine höhere Zellzahlen an der Grundlinie. Jedes Experiment wurde dreifach Vertiefungen durchgeführt und wiederholt 4x für DRAQ5 + Sapphire, 3x für MAP2 und 6x für ATP. Die Daten aus den drei Vertiefungen wurden gemitteltfür einen endgültigen Wert für jeden der Versuche 3-6. Der Mittelwert und SEM dieser Endwerte 3-6 gezeigt. * P ≤ 0,05 für den Vergleich der neo-versus Allocortex, Bonferroni Korrektur nach Zwei-Wege-ANOVA. Die Daten wurden in GraphPad Prism (Version 5.0) analysiert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 6
6. Intrazwischenplatte und Korrelationen für MG132 und H 2 O 2-Dosis-Antwort-Kurven in N2a Zellen und kortikalen Neuronen. Alle einzelnen Versuche wurden in dreifacher Brunnen laufen. Raw-Daten aus der zweiten zwei Brunnen innerhalb jeder Gruppe wurden aufgetragen als repliziert 1 und 2, um die Reproduzierbarkeit innerhalb der Platten (A zu messen, C für N2a Zellen und G, H und I für Cortex). Daten aus den gleichen Gruppen in zwei unabhängigen Experimenten (der Mittelwert der dreifachen Vertiefungen) wurden als Platte 1 und Platte 2 aufgetragen, um die Reproduzierbarkeit zu messen über die Platten (D, E und F für N2a Zellen und J, K, L für Cortex). Die R 2 Bestimmungskoeffizient und zwei seitiger p-Wert der Beurteilung der Bedeutung der Korrelation werden auch für jede Maßnahme veranschaulicht. Die Daten wurden in GraphPad Prism (Version 5.0) analysiert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wir haben gefunden, dass die Signalstärke in allen drei Lebensfähigkeitstests ist linear und mit Beschichtungs-Dichte korreliert. Jedoch nicht alle Assays sind gleichermaßen empfindlich auf das 2-fache bzw. 1,5-fache Veränderungen Plattierungsdichte. Für N2a-Zellen, die Infrarot-Tests sind weniger empfindlich als die ATP-Assay, insbesondere bei niedrigeren Beschichtungsdichten. Obwohl die Infrarot-Tests sind weniger empfindlich als ATP, die DRAQ5 + Sapphire-Assays und die α-Tubulin-Assays sind in guter Übereinstimmung, da sie die hohe Schutz Auswirkungen der N-Acetyl-Cystein zu offenbaren. Es war Dosis-abhängigen Verlust an Infrarot-Signal mit beiden Assays und alle drei Lebensfähigkeit Kurven wurden auf der rechten Seite mit N-Acetylcystein verschoben. Diese Überschneidung ist nicht immer für alle Arten von Behandlungen von N2a Zellen beobachtet, wie die α-Tubulin-und ATP-Assays scheint empfindlicher Verbindungen wie Ammoniumchlorid als der DRAQ5 + Saphir-Assay (siehe Fig. 4 in Unnithan et al. 8 ). So Lebensfähigkeit Phänotypes sind nicht immer gleich von allen drei Assays vertreten. Obwohl die ATP-Assay wurde in besseren Verhältnis Anzahl der N2a Zellen ausplattiert als der α-Tubulin und DRAQ5 + Sapphire Assays der Annahme, dass Stärke reflektiert Zellzahlen Signal nicht immer nach Toxinbehandlung erfüllt. ATP-Spiegel stieg Toxin-Konzentrationen, die nicht zu entlocken hat einen ähnlichen Anstieg des Signals in den Infrarot-Assays. Diese Daten zeigen, Ausgleichs metabolischen Veränderungen in N2a Zellen in Reaktion auf Proteasom-Hemmung und sind in ihrem eigenen Recht. Der U-förmige ATP-Dosis-Wirkungs-Kurve ist charakteristisch für das Phänomen hormesis. Hormesis als günstige biologische Reaktionen auf Low-Level-Forderungen an Toxine und andere Stressoren 40-42 definiert.

Für Neuronen, die DRAQ5 + Sapphire Fleck war weniger empfindlich als die MAP2-und ATP-Assays bei hohen Dichten Beschichtung. Doch die DRAQ5 + Sapphire, MAP2 und ATP-Assays waren gut im Verhältnis zu cell Zahl in primären kortikalen Neuronen bei oder unter 100k Zellen pro Vertiefung. Wir Platte Neuronen bei 100k Zellen pro Vertiefung. Neuronen aus Rinde sind nicht bekannt zu replizieren, daher waren wir mehr besorgt über die Linearität bei 100k oder niedriger Beschichtungsdichten. Die DRAQ5 + Sapphire Assay war weniger empfindlich auf Unterschiede zwischen Neocortex und Allocortex als MAP2 entweder ATP oder bei Konzentrationen unter 50 &mgr; M H 2 O 2. Darüber hinaus hat der ATP-Spiegel nicht so dramatisch fallen auf H 2 O 2-Behandlung als Infrarot-Signal in den anderen beiden Tests, vielleicht wieder was auf Ausgleichssteigerungen ATP-Ausgang. Die Diskrepanzen zwischen den drei Tests in N2a-Zellen und primäre Neuronen spiegeln, dass zelluläre Funktionen zu ändern, bevor Brutto anatomischen Strukturen betroffen sind, und dass die Zellstrukturen, einschließlich Proteine ​​des Zytoskeletts, können betroffen sein, lange bevor die Zellen sich selbst verloren sind. Jüngste Daten auf Multiplex-Assays Lebensfähigkeit von Gilbert und Kollegen überzeugendveranschaulichen, dass verschiedene Maßnahmen, wie die Lebensfähigkeit Hoechst Kernfärbung und ATP-Messungen liefern Informationen über spezifische zelluläre Merkmale, die nur teilweise und indirekt Lebensfähigkeit reflektieren als Ganzes 26. Wir empfehlen daher gleichzeitig und nicht auf der Bühne, alle drei Tests die sich auf einem einzigen Assay für die Stoffwechselfähigkeit, wie viele Publikationen zu tun. Für weitere Informationen zu einem dieser Maßnahmen, empfehlen wir das Zählen einzelner Zellen und dann die Beurteilung Zytoskelett-Protein-Expression und ATP-Spiegel in Abhängigkeit von der Zellzahl.

Obwohl es andere Assays für metabolische Lebensfähigkeit, wie MTT, der Vorteil der ATP-Assay liegt in ihrer Empfindlichkeit und Dynamikbereich. Der MTT-Assay kann die Anzahl der lebensfähigen Zellen im Vergleich zu ATP-Messungen überschätzen und zeigt eine IC 50, die zwei 43-fach höher ist. Außerdem Petty und Kollegen berichtet, dass die ATP-Assay konnteerkennen die untere Grenze der 1563 Zellen pro Vertiefung während die MTT-Test konnte nicht weniger als 25k Zellen / 12 zu erkennen. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis (Signal von Vertiefungen mit lebenden Zellen im Vergleich zu Vertiefungen ohne Zellen) ist nur 7 MTT aber 230 für ATP 44. Ein weiterer Vorteil von ATP Lumineszenz-Assays über MTT ist, dass die Inkubationszeit ist viel kürzer. Darüber hinaus ist die MTT-Assays von Promega kostet 0,28 Cent pro gut, während die Zell Titer Glo Assay vom gleichen Hersteller kostet 0,09 Cent pro auch auf unsere empfohlenen Verdünnungen. Es gibt jedoch Einschränkungen für alle Stoffwechseltests; metabolischen Aktivität kann entkoppelt Überleben sein, insbesondere während der Nekrose. Wenn dies ein Problem ist, können die Tests im vorliegenden Bericht mit Messungen der Lactat-Dehydrogenase Release kombiniert werden, um den Verlust der Membranintegrität zu ermitteln. Dies würde nicht zu einer zusätzlichen Platten, wie Lactatdehydrogenase Messungen sind einfach in das extrazelluläre Medium hergestellt.

Obwohl wir stellen diese Assays als Alternative zu manuellen Zählungen am Mikroskop kann dieser ein hochempfindliches und genaues Mittel zur Stichprobenzellennummer, wenn richtig durchgeführt. Tatsächlich erwarten wir, dass Grafen von Hoechst-gefärbten Zellkernen würden empfindlicher auf kleine Änderungen in N2a Zellzahl als die DRAQ5 + Sapphire Assay sein. Wenn alle Tests nicht die Linearität Test, sind manuelle Zählungen von wesentlicher Bedeutung. Ein gutes Beispiel dafür ist unser kultivierten primären Astrozyten-Modell, auf die wir durchführen desto mühevoller Hand zählt 45. Allerdings müssen die inhärenten Verzerrungen der manuellen Zählungen bei der Interpretation Zellzahl Daten bestätigt werden, ebenso wie die inhärenten Mängel des computergestützten Tests dürfen nicht beiseite geschoben werden. Eine Reihe von Stärken und Schwächen der Lebensfähigkeitstests werden daher im Folgenden beschrieben.

Erstens, wenn DAPI oder Hoechst Flecken verwendet werden, geschrumpft und kondensiert Kerne werden häufig als bezeichnetapoptotischen ein. , Zellgröße und Kondensation der Kerne liegen jedoch entlang einer glatten Kontinuums. Im Gegensatz dazu, Leben und Tod gegenseitig aus, Binär-Phänomene. Es sei denn, zwei sehr unterschiedliche Gruppen von Live-oder sterbenden Zellen beobachtet werden, scheint es am besten, um alle Zellen unterhalb eines Schwellenkerndurchmesser wie apoptotische mit Imaging-Software wie MetaMorph oder ImageJ als durch Augen zählen. Natürlich ist die Wahl für einen Schwellenwert Durchmesser willkürlich, da wir nicht wissen, an welchem ​​Punkt ein irreversibler Apoptosekaskade ausgelöst wird. Ferner kann durch Definition, auch Zellen mit aktivierten Caspase 3 nicht notwendigerweise auf dem Weg zum Tod und sollte vielleicht noch am Leben zu der Zeit der Fixierung 46 gezählt werden. Unsere Infrarot-Assays zu vermeiden, indem man solche Bedenken alle Zellen, die auf die Platte zum Zeitpunkt der Fixierung angebracht werden als noch zu leben. Nur Zellen, die weg schwamm, werden als tot gezählt. Dies stellt Zellen in eine von zwei Kategorien und vermeidet die Gefahren der Verwendung eines Complex, kontinuierliche Funktion wie Kerndurchmesser.

Zweite, manuelle Zählungen Probe typischerweise einen kleinen Bruchteil der gesamten gut. Dies kann zu Sampling Bias führen und gelegentlich, hohe Standardfehler des Mittelwerts. Mit unserer Lebensfähigkeitstests wird die gesamte Stichprobe und für ATP und nah an der gesamten gut mit den Infrarot-Assays abgetastet. Dieses Probenahmeschema erhöht Stichprobengröße und vermeidet die manchmal willkürliche Entscheidung, wo in der auch ein Foto für die manuelle Zählungen einrasten. Wenn Fotos werden von der Mitte des gut gemacht, muss man bedenken, dass diese Region ist, wo die meisten Abwaschen der Zellen auftritt, was zu möglichen Überschätzung der Toxizität. Im Gegensatz dazu ist die Infrarot-Untersuchungen werfen ein Gitter auf dem Bild der 96-Well-Platte, schließt nur die äußersten Ecken der Wells. Falls gewünscht, können die Ecken der Vertiefungen durch den Durchmesser der Kreise in der Tabelle enthalten sein.

Drittens sollte der Fotograf und der Zellzähler sowohl bei der manuellen Zählungen geblendet werden. Allerdings, wenn die Zellen mit Giftstoffen behandelt sie oft davon ausgehen, morphologische Veränderungen, die sogar zu einem ungeschulten Auge ganz offensichtlich sind. Dadurch ist es viel schwieriger, unvoreingenommen zu bleiben. Blindheit ist keine Voraussetzung für unsere Tests.

Viertens sind manuelle Zählungen zeit-und kosten den Hauptforscher in mehr Gehalt. Die Gehälter sind eine der höchsten Kosten für die Durchführung der Forschung. Die Scan-Zeit für eine Platte auf der Odyssee ist nur 8 min lang auf der "mittlere Qualität"-Einstellung und kann weiter auf die "niedrige Qualität"-Einstellung abgesenkt werden. Es sei darauf hingewiesen, dass die Odyssey Imager ist teuer, selbst wenn man ein gebrauchtes Demoversion kauft, es ist jedoch eine einmalige Fixkosten werden. Auf der anderen Seite, muss man auch investieren in relativ teuer Epi-Fluoreszenz-Mikroskope für die manuelle Zellzahlen der DAPI-oder Hoechst-gefärbten Zellkernen. Trotz der anfänglichen Kosten, ist die Odyssee Imager ein Mehrzweck-Maschine, die auch Maßnahmen in West Immunoblots quantitativ 47,48. Wir haben von der Odyssey für Quantifizierungen der Immunfärbung in makroskopischen Gehirnstrukturen wie dem Ratten-oder Maus-Striatum und Kortex telencephalic angepasst. Dieser Ansatz wurde auch von anderen 49 verwendet worden. Eine Schwäche des Odyssey Imager für Tissue Imaging ist, dass die höchste Auflösung ist nur 21 um. Daher ist es nicht zählen können einzelne Zellen und ist nicht für die feinere anatomische Details sichtbar zu machen.

Schließlich können die Infrarot-Assays nicht so empfindlich auf kleine Änderungen in der Zellzahl als manuelle Zählungen sein. Die IC 50-Werte können daher nicht als die die Konzentration, die gerade 50% Verlust an Zellzahlen löst betrachtet werden, sondern nur als die Konzentration, die 50% Verlust der Infrarotsignal auslöst. Diese Einschränkung trifft wahrscheinlich auch aufAlle Tests, die Rentabilität einzelner Zellzahlen umgehen durch Mikroskopie und probieren Sie die gesamte Wohl auf einmal. Die Ungenauigkeit bei solchen Assays verbunden sind, können eine Funktion der Hypertrophie, Atrophie oder andere Veränderungen im Aussehen, die Signalstärke beeinflussen. Beispielsweise mit einigen Toxine, α-Tubulin-Immunreaktivität in jeder Zelle als eine Funktion der Toxizität erhöhen. Wir haben dieses Phänomen in N2a Zellen mit sehr hohen Konzentrationen von MG132 8 behandelt wurden. Wenn dies von Bedeutung ist, können andere Zytoskelett-Markerproteine, wie z. B. β-Actin und GAPDH verwendet werden. Darüber hinaus betonte N2a Zellen dazu neigen, bipolare Prozesse 8,50,51 bilden. Mit Änderungen in der Zellgröße, werden fluoreszierende Signalausgang pro Zelle auch über Behandlungsgruppen. Wir empfehlen, dass Toxin-behandelten Zellen durch Standardhochauflösende Mikroskopie folgenden Immunzytochemie für die gleichen Marker wie in der In-Cell-Western-sucht werden. Wenn das Zytoplasma stark ändert in der Größe auf, aber die BehandlungKern nicht, wir empfehlen die Verwendung der DRAQ5 Fleck ohne Sapphire nur quantifizieren Kernen. Zukünftige Studien mit verschiedenen Farbstoffen und mit anderen Zytoskelett-oder andere vorkommenden Proteine ​​sind gerechtfertigt, um diese Hindernisse zu überwinden.

Wir schließen daraus, dass alle Proben leiden unter Einschränkungen und haben Bedenken über die Empfindlichkeit, Linearität, Stichprobenfehler, Signal-zu-Rausch-Verhältnisse, Menschen Bias oder Subjektivität, Zeit und Kosten erhöht. Darüber hinaus verlassen sich alle Proben, die auf Annahmen, die nicht immer erfüllt werden. Daher wird empfohlen, dass mindestens zwei Assays verwendet, um die Wirkung der Behandlung auf die Zellkulturen zu beschreiben, die eine metabolische Gesundheit und eine, die auf anatomischen Lebensfähigkeit stützt misst. Auf diese Weise kann eine effektiv festzustellen, ob therapeutische Verbindungen zu schützen, sowohl Struktur und Funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Keiner der Autoren haben alle Konflikte offen zu legen.

Acknowledgments

Wir erkennen Juliann Jaumotte für die Idee des Sparens auf die Volumina der Reagenzien in der ATP-Assay. Wir sind zutiefst dankbar für die hervorragende administrative Unterstützung der Maria Caruso, Deb Willson, und Jackie Farrer und an die Mylan Schule der Apotheke für die finanzielle Unterstützung für diese Studien. Dank gebührt auch den Hunkele gefürchtete Krankheiten Stiftung und die Parkinson und Bewegungsstörungen Stiftung für die finanzielle Unterstützung der primären neuronalen Studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Titer Glo Promega G7572 Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin Thermo-Shandon 9990244 Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block LI-COR 927-40003 This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 21568 We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic Fisher S468 One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic Fisher S373 See above
Sodium Azide (250x) Ricca Chemical Company 7144.8-16 Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin Sigma-Aldrich T5168 This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2 Sigma-Aldrich M9942 This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG LI-COR 926-32210 Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5 Biostatus DR50200 This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire LI-COR 928-40022
Luminometer PerkinElmer VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager LI-COR 9201-01
Shaker/Mixer Research Products International 248555

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
  2. Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
  3. Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
  4. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
  5. Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
  6. Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
  7. Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
  8. Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
  9. Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
  10. Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
  11. Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
  12. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  13. Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
  14. Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
  15. Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
  16. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
  17. Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
  18. Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
  19. Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
  20. Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
  21. Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
  22. Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
  23. Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
  24. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
  25. Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
  26. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
  27. Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
  28. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
  29. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
  30. Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
  31. Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
  32. Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
  33. Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
  34. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
  35. Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
  36. Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
  37. Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
  38. Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
  39. Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
  40. Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
  41. Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
  42. Mattson, M. P. Hormesis defined. Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
  43. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
  44. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  45. Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
  46. McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
  47. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
  48. Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
  49. Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
  50. Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
  51. Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).

Tags

Cellular Biology Ausgabe 83 In-Zell-West- DRAQ5 Saphir Cell Titer Glo ATP primären kortikalen Neuronen Toxizität Schutz- N-Acetyl-Cystein hormesis
Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Posimo, J. M., Unnithan, A. S.,… More

Posimo, J. M., Unnithan, A. S., Gleixner, A. M., Choi, H. J., Jiang, Y., Pulugulla, S. H., Leak, R. K. Viability Assays for Cells in Culture. J. Vis. Exp. (83), e50645, doi:10.3791/50645 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter