Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kültür hücreleri için Canlılık Tahliller

Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/50645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

Summary

Terapötik bileşikler genellikle ilk canlılığı deneyleri ile in vitro incelenmiştir. Bir insan gözlemci tarafından kör hücre sayımları hücre sayısındaki küçük değişikliklere son derece hassas olabilir ama fonksiyonunu değerlendirmek yok. Bilgisayarlı canlılığı deneyleri, burada açıklandığı gibi, objektif bir şekilde yapı ve fonksiyon hem de değerlendirebilir.

Abstract

Bir mikroskop Manual hücre sayımları hücre canlılığının değerlendirilmesinde hassas bir yoludur, ancak zaman alıcı ve bu nedenle pahalıdır. Bilgisayarlı canlılığı deneyleri ekipman açısından pahalı ama daha hızlı ve daha objektif manuel hücre sayımları daha olabilir. Bu rapor, bu tür üç canlılığı tahlillerin kullanımını tarif eder. Bu tahlillerin ikisi kızılötesi ve bir parlak olan. Her iki kızılötesi tahlilleri bir 16 bit Odyssey Imager güveniyor. Bir kızılötesi deney sitosol için safir leke ile kombine çekirdekleri için DRAQ5 leke kullanır ve 700 nm kanalında görüntülenmiştir. Diğer kızılötesi deney, bir In-Cell Western, sitoskeletal proteinler (α-tubulin veya mikrotübül ilişkili protein 2) karşı antikorlar kullanır ve 800 nm kanal bunları etiketler. Üçüncü canlılık deneyi ATP için yaygın olarak kullanılan bir ışıldayan deney, ama biz maliyet tasarruf için önerilen hacminin dörtte kullanın. Bu ölçümler her doğrusaldır ve ce sayısı ile ilişkiliLLS kaplama, ancak duyarlılık değişir. Tüm deneyler üç zaman alıcı mikroskobu aşmak ve tüm kaynak örnek, bu şekilde, örnekleme hatasının azaltılması. Son olarak, bütün deneylerde kolayca kısa zaman dilimleri içinde yapılması gereken deney daha fazla sayıda izin veren, deney sonunda bir gün içinde tamamlanabilir. Ancak, hepsi hücre sayıları tedaviler, bazen özellikle hücresel ATP için bir araya geldi değil, bir varsayım sonra sinyal gücü orantılı kalması varsayımına dayanmasıdır. Hücreler artırmak veya tedavi sonrası boyutunda azalma Ayrıca, eğer, bu hücre sayısı etkilemeden sinyal gücünü etkileyebilir. Biz manuel sayıları dahil tüm canlılığı deneyleri, uyarılar bir dizi muzdarip olduğu sonucuna, ancak bilgisayarlı canlılığı deneyleri ilk yatırım değer. Her üç deneyleri kullanılarak birlikte hücresel yapısı ve fonksiyonu kapsamlı bir görünümünü verir.

Introduction

Biyolojik bilimlerde en yaygın canlılığı tahlil hücre sayıları içerir. Bu 2013/04/29 ve 2013/04/30 üzerinde anahtar kelime ya "in vitro" veya "kültür" ile PubMed'de çıktı üst (en son) 200 yayınların analizi ile kanıtlanır. Bu yayınların, manuel hücre sayısı sayımı dahil olmak üzere% 23.5 kullanılan hücre sayımı tahlilleri, otomatik hücre sayısı görüntüleme yazılımı ile sayar ve Trypan mavi dışlama. Canlı / Ölü deney, bu yayınların% 1 kullanılmıştır. MTT (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür) kullanılarak yayın sayısı metabolik canlılığı için tahlil% 11 idi. Edebiyat Bu anket aynı zamanda hücre sayımı tahlilleri ile birlikte böyle MTT gibi analizleri kullanılarak yayın sayısı sadece% 3.5 olduğunu göstermektedir. Hücre sayısı ile birlikte hücresel fonksiyonunun değerlendirilmesinde, tek başına bir canlılık deneyi kullanmak için eğilim hücresel i değerlendirmek için iyi bir seçim gibi görünüyor rağmenntegrity. Geriye kalan hücreler fonksiyonel ya da 1,2 kuyu içinde mevcut olmasına rağmen sağlıklı olmayabilir, çünkü kendi başına hücre sayımları yeterli değildir. Bunun tersine, ATP gibi fonksiyonel önlemler artırmak veya hücre sayısındaki paralel değişikliklerle yokluğunda azaltabilir. Hücre sayısı metabolik okumalanna ayrılması ATP ve MTT testleri tek canlılık deneyi olarak asla kullanılmamalıdır gerektiğini göstermektedir. Bu raporda, hücresel yapılar ve metabolik fonksiyonu hem de anket üç canlılığı deneyleri gelemez kendisi tarafından herhangi bir tahlil daha hücresel bütünlüğü daha kapsamlı bir görünüm için, tarif edilmektedir.

Bizim deneylerinin iki 700 ve 800 nm kanallarda floresan ölçen bir enfraruj görüntüleyici gerektirir. Gürültü daha yüksek sinyal-gürültü oranı 3 yol açan, kızılötesi dalga boyu düşüktür. Kullandığımız Odyssey kamera, 4.5 günlük dinamik aralık ve 16, TRANSLATIN bir bit derinliğe sahipkızılötesi 2 16 veya 65.536 tonları g. Bu sadece her dalga boyu için renk 2 8 veya 256 tonunu tanıyor 8-bit renk görüntüleme, tezat olabilir. Böylece, 16-bit görüntüleme ince çözünürlüğe sahiptir. Bu orijinal kızılötesi genellikle görsel sunumu için yayınlanmış olan raporlarda (800 nm) ve kırmızı (700 nm), yeşil yalancı olduğu not edilmelidir. Odyssey kameralar genellikle Western blot ve In-Hücre Batılıların 4-7 hem de kullanılmaktadır. In-Cell formaldehit sabit hücreleri üzerinde Western ilgi duyulan herhangi bir protein karşı birincil antikor kullanımı ve kızıl ötesi floresan ikincil antikorlarla da etiketleyin. Bu teknik, fosforilasyon uç noktalar 6 için özellikle yararlı olduğu da bilinmektedir. Bizim In-Cell Western olarak, sitoskeletal proteinler α-tübülin ya da 800 nm kanalda nöronal mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2) için sabit hücreleri boyamak. Bu proteinler yüksek sinyal-gürültü oranı elde etmek için yeteri kadar bol miktarda bulunmaktadır. Biz de 700 yılında bizim plakaları lekeDRAQ5 leke ile ve safir leke ile sitoplazmada için çekirdekleri için nm kanalı. Sitoskeletal proteinler ve DRAQ5 + Sapphire lekeleri Hem böylece hücresel yapılarını yansıtmaktadır.

Üçüncü canlılığı deneyi, metabolik fonksiyonu büyüklüğüne ve adı "Hücre Titer Glo.", Bu lusiferaz bazlı tahlilde, parlaklık değerleri ATP seviyeleri doğrudan orantılıdır. ATP tahliller genel olarak canlı hücreler 8-12 ölçmek için kullanılır. Hücre başına ATP çıkış toksin tedaviler bir fonksiyonu olarak değişebilir Ancak, tahlilin adına kelime "titre" da dahil olmak üzere bir yanlış isim biraz ve hücre sayısı 8 ile orantılı olarak, bu nedenle her zaman değil. ATP düzeyleri de sirkadyan ritim 13 ve 14, hücre bölünmesi ve hücre farklılaşması 15 etkilenebilir. ATP metabolik sağlam bir ölçüsüdür çünkü Bununla birlikte, burada gösterilen ATP deneyi gerçekleştirmek için basit ve faydalıdırcanlılığı 16-21, başına numara hücre değilse. Batılıların bu nedenle tek başına herhangi bir deneyde daha hücresel bütünlüğün daha kapsamlı bir resmini verir In-Cell kızılötesi tamamlamak için bu tahlil kullanma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollerin bir şematik Şekil 1 'de gösterilmiştir.

1.. Hücre Kaplama

Farklı kaplama yoğunlukları (Şekil 2), 96 oyuklu plakalar içinde Plate hücreler. N2a nöroblastom hücre hattı, plaka 2.5K, 5K, 10K, ve 3 veya 6 kuyu / grubunda kuyu başına 15k hücreleri üzerinde doğrusallık kontroller için. Birincil fare kortikal nöronlarda, plaka 25k, 50k, 100K, ve 3 veya 6 kuyu / grubunda kuyu başına 200k hücrelerinde doğrusallık kontroller için. Hücre hatları ya da ilgi duyulan birincil hücre, farklı kaplama yoğunlukları, levha bu hücre tipi için en uygun hücre yoğunluğunda ve çevresinde sağlıklı bakarsak.

Not: Bu çalışmada, N2a hücreler daha düşük buharlaşma için tasarlanmış tabakalarına 200 ul ortam içerisinde 100 ul ortam ve birincil kortikal nöronlarda kaplandı. Hücre işleme, medya, serum, antibiyotik ve toksin tedavisi hakkında ayrıntılı bilgi için, Unnithan ark bakın. N2a cel içinls 8 ve posimo et al. Birincil kültürler 22 korteks için.

    1. Ikinci bir 96-yuvalı plaka üzerine kaplama tekrarlayın. Bir plaka ATP (Şekil 2A) için analiz edilmiş ve kızılötesi deneyleri (Şekil 2B) ile diğer olacaktır. Hücreler, hücre içi ATP ölçümleri için açık lize edilmesi gerekir, çünkü bir ATP ve kızılötesi deneyleri için aynı plaka kullanamaz.
    2. Optimum kaplama yoğunluğu (; Şekil 2B sütun 2) de kızılötesi deneylerinde arka plan çıkarma için en az 3 ekstra kuyu plaka emin olun.
  2. Satırlar A ve H ve sütun 1 ve 12'de dış oyuklara daha ucuz hücreleri olmadan ortam ya da steril su ekleyin. Canlılığı ortam buharlaştırma ve sıcaklık değişimleri etkilerinden daha düşük burada sık sık olduğu gibi, kenarları boyunca kuyulardan verilere dayanarak kaçının. Mikroplakalara ile bu tür sorunlar genellikle kenar efektleri 23,24 denir. Boş bu kuyuların tutmayınDaha sonra satır B, G ve sütunlar 2 ve 11 kenar etkisine maruz için.
    Kenar etkileri CO2 inkübatöründe 24 içine transfer edilmeden önce ortam koşullarında, oda sıcaklığında taze tohumlanmış plaka inkübe edilerek azaltılabilir. Ayrıca, Carralot tarafından yeni bir çalışma, tek bir kontrol sütun 23 mikrotitre plakaları için matematiksel bir düzeltme yöntem açıklanır. Oliver ve arkadaşları termal değişim 25 azaltmak üzere özel olarak tasarlanmış bir cebri hava mikrotitarasyon plaka inkübatör kullanılmıştır. Kenar etkisi önemli endişe ise, mikro stabilite odaları (örneğin BT & C Incorporated), yüksek nem ve hatta sıcaklık değişimleri ile homojen bir mikro-ortam yaratmak için satın alınabilir.
  3. Ek reaktif seyreltme ya da daha fazla kaplama yoğunlukları, test edilecek için, Şekil 1 'de gösterilen daha fazla kuyu ihtiyaç varsa, arka plan çıkarma için kenar kuyu kullanın.
  4. Eki için bir gece bekleyinhücreler ve deneyi, aşağıda tarif edildiği gibi bir sonraki sabah.

2. Lüminesans ATP Deneyi

  1. Tampon maddesi ile alt-tabakanın yeniden oluşturulması ve inkübasyon sürelerinde Hücre Titer Glo imalatçının tevsiyelerini izleyin.
    1. Sırasıyla, kaplama medyanın 100 veya 200 ul 50 veya 150 ul ortamı çıkarın. Biraz daha az 50 ul daha iyi geride kalır. Bir 1:02 seyreltide sütunlar 2-6 (Şekil 2A) için reaktifler (substrat artı tampon) 25 ul ekle.
      Not: kaldırma diferansiyel kuyuları karşısında ATP tahlil belirteçlerinin sulandırmak veya konsantre olabilir sonra medyanın değişen hacimleri geride bıraktı. Tüm çok kanallı pipet uçları sıvı seviyesi eşit olduğundan emin olmak için özen gösterin. Hemen doğruluğunu sağlamak için ATP deney reaktifler ilave edilmeden önce bir pipet ile plaka üzerinde seçme kuyu kalan sıvı ölçün. Yüksek değişkenlik medya Evapor diferansiyel oranları varsaLevhanın yüzeyi boyunca ation, tüm eski ortamını çıkarın ve hemen ATP tahlil belirteçlerin ilave edilmeden önce, tüm oyuklara taze ortam ya da fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde aynı miktarda ekleyin. Plakalar buharlaşma değişken seviyeleri muzdarip, Costar Corning'ten düşük buharlaşma plakaları geçmeyi deneyin. Ikinci plakalar, Şekil 2'de gösterilen 60 iç oyukları, sadece% 0,995 arasında bir ortalama 0.41 ± gece boyunca ortam buharlaşma muzdarip. Deneyin zamanında ortam hacmi içinde önemsiz değişkenlik duyulmaktadır.
    2. Yukarıda ayrıntılı olarak sütunlardaki 7'den 11'e kadar, satırlar B D yoluyla, geride 50 ul bırakmak için yeterli ortamı çıkarın ve 1:1 seyreltme reajanların 50 ul ekleyin.
    3. Sütunlarında 7 11 aracılığıyla, G, E ile satır, 100 ul ortam içinde hücreler bırakın ve 1:1 'lik bir seyreltme yine, reaktiflerin 100 ul ilave edin. Şirket reaktiflerin 100 ul ortam içinde 100 ul içinde 1:1 seyreltilmiştir gerektiğini önerir.
      Not: amacıylamaliyet tasarrufu için, bu hacim ve seyreltme hem de bu öneriler kesmek mümkündür. Bununla birlikte, bunu yapmadan önce, bu deneyinin doğrusallığını ve duyarlılığı azaltmaz emin olun.
    4. Belirli bir hacmi ve reaktiflerin seyreltme faktörü Tatmin edici olduğu bulunan sonra, daha sonraki tüm deneylerde sopa ile. Tatmin edici veriler için kriterler Sonuçlar bölümünde tarif edilmektedir.
    5. Kullanılmayan yeniden reaktifler refrozen ve maliyet tasarrufu için daha sonraki bir tarihte kullanılabilir. Üreticiye göre, yeniden reaktifler aktivitesinin ~% 3 ​​kaybı ile 21 hafta boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
  2. 2 dakika ya da 10 dakika boyunca bir çalkalayıcı için sallanan bir orbital çalkalayıcıda plakası yerleştirin. Plaka bir parçası farklı ölçüm için tahlil edilmektedir ve çalkalandı olamaz, yalnızca ilgilenilen kuyularda basit aşağı yukarı ve pipetleme ile ortam ajite. Ancak bu adım sırasında oluşan aşırı kabarcıklar Lumi müdahale edeceknescent çıkışı.
    1. 10 dakika sonra, reaktifler ilave edildikten sonra, beyaz 96-yuvalı plakalar içine de içeriğinin 60 ul transfer. Onlar yukarı dedektörün doğru ışığı yansıtır çünkü Lüminesans değerler berrak veya siyah plakalar daha beyaz plakalar yüksektir.
      Not: Bizim tecrübelerimize göre, hücreler, diğer levhalara göre daha net costar plakaları düşük buharlaşma daha iyi hayatta. Bu özel plakalar beyaz duvarlar ile satılmaz. İkincisi, duvarlı-opak ve şeffaf dipli plakaları tamamen açık plakalara göre daha pahalıdır. Biri beyaz plakalar ışıldayan Sıvıyı eğer, beyaz plakalar yıkanabilir ve her deney için yeni beyaz plakalar kullanarak maliyet tasarrufu, yeniden. Sıvının aktarılması ve böylece uzun vadede daha ucuz bir seçenektir.
    2. Önce plastik bir transfer pipeti ampulden gelen basınçlı hava ile, tercihen bir iğne ile plaka okuma ya da herhangi bir hava kabarcığı pop. 1 sn entegrasyon süresi (şirket, önerile ile bir lüminometre üzerinde plaka okuyunnds 0.25-1 sn yeterli entegrasyon zamanı). ATP deneyi, reaktifler ilave edildikten sonra plaka 10-12 dk okuyun. Gilbert ve arkadaşları 26 ile gösterildiği gibi, lüminesan sinyal, biri hızlı boşalma oranı ile geçici olduğu için zamanlama, farklı plakalar arasında karşılaştırma için çok önemlidir.
  3. (Bakınız Şekil 3) bir saçılım hücre sayısının bir fonksiyonu olarak, her bir grup ve bir arsa içindeki 3 veya 6 kuyu lüminesan değerlerinin ortalamasını alın. Her gelen veri noktasından (11G - 2G, kuyular 11B - - 11D ve 11E kuyular kuyular 2B) birinci ortalama uygun boş kuyu arka plan aydınlığı değerleri çıkarmak. Bu deney, ilk (Şekil 2A) her bir plaka yoğunluğunda için üç farklı grup olacaktır. ATP seviyeleri, bu grupların doğrusal ya da her bir hücre yoğunluğu ile ilişkili olabilir. Hala maliyet tasarrufu için tatmin edici sonuçlar vermektedir reaktiflerin yüksek seyreltme ile devam edin. Tatmin edici sonuçlar elde etmek için kriterleri açıklanmıştır in Bulgular bölümü.
    Not: Bu çalışmada kullanılan ortam ile, bu testte arka plan değerleri yüksek değildir ve bu boş bir kuyu atlamak mümkündür. Ancak, üretici Promega farklı kültür ortamı ile photoiletkenliğin farklılıkları raporlar. Bu çalışma, Hyclone Fetal Clone III, N2a pil ve kortikal kültürlerde için buzağı serumu için fetal sığır serumu sentetik bir versiyonunu kullanır. Üreticiye göre, dana serum parlaklık değerlerini azaltır ama tahlilin hassasiyetini azaltamaz. Bu önemli bir endişe kaynağıdır Yine de, eğer, deneme zamanına PBS yerine ortam içinde ATP deney reaktif maddelerin seyreltilmesi.
    1. Hücreler gecede sütunlar arasında dengesiz büyümeye görünüyorsa, kaplama 6 saat içinde onları tahlil deneyin. Ancak, testin olağan zamanında (tedaviden sonra örneğin 24 saat) de yoğunluk doğrusallık elde edilmelidir hangi yoğunluk olduğunu akılda tutmak.

3. Infrared Tahliller

  1. Kaplama sonra sabah, çeker ocak içinde, oda sıcaklığında, ikinci plaka içindeki hücreleri düzeltmek. Formaldehit kanserojen çünkü bu adım için eldiven giymek ve kimyasal atık olarak fiksatif imha emin olun. 1:1 'lik bir seyreltme var olan ortama 0.1 M fosfat tampon maddesi içinde% 4 formaldehit ve% 4 sukroz ekleyin. Medya da tam güç sabitleştirici sabitleme önce PBS ile yıkanarak olabilir. Ya tekniği iyi çalışıyor.
    1. 20 dakika süreyle tespit sıvısı içerisinde inkübe edin ve daha sonra fiksatif çıkarın ve 200 ul PBS içinde 3 kez yıkayın.
  2. Tahlil, aynı gün böyle olmaz ise 4 ° C'de% 0.2 sodyum azid ile PBS içinde plaka saklayın. Aksi takdirde, deneyi devam etmek ve antikorların spesifik olmayan bağlanma en aza indirmek için bloke etme çözeltisi hücreleri yerleştirin.
    1. PBS içinde balık serum Odyssey blok 1:01 seyreltin ve bir hücre permeabilizer olarak% 0.3 Triton-X-100 ilave edin. Yeterince engelleme çözüm yanı sıra birincil ve ikincil Antibo olundy çözelti, 35 | il her bir oyuğa pipetle böylece. Baloncuklar bir sürü pipetleme sırasında gözlenen Ancak, aksi kabarcıklar aşağı bağlama gelen hücre ve blok antikorların içine ulaşmak, her bir kuyu için> 50 ul olun. Aşırı sabunlu kabarcıklar kuyunun ortasında bir boyanmamış dairesel nokta olarak görünür. Bu oluşursa pipetlenmesini ayarlamak için deneyin.
    2. Oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca bu çözelti içinde bloke inkübe edin.
      Not: İkincil antikor olarak aynı türden% 5 sığır serumu albümini ya da normal sera aynı zamanda balık serum bloğun maliyet tasarrufu için çözüm olarak bloke kullanılabilir. Çözümleri engellemek antikorun performansını etkileyebilir. Bu durumda, her bir antikor için uygun blok iyi şekilde ampirik olarak belirlenir.
      Not: Bazı araştırmacılar inkubasyon sırasında sarsıcıların In-Hücre Batı plakaları yerleştirin. Ancak, bu gerekli değildir.
  3. Anti-α-tubulin için 1:10,000 seyreltme: Birincil antikor yapmak(Fare monoklonal, Tablo 1) ve anti-MAP2 (fare monoklonal, Tablo 1) için 1:2,000 seyreltme. Bu antikorlar, bu hücresel modellerinde ilgi proteinlere özgü, bir özgüllük immünositokimyasal leke için gereklidir.
    Not: MAP2 nöronlar için bir gösterge ve karışık glial / nöronal kültürler için uygundur. Astrositler sayıları erken neonatal dönemde 27,28 zirve ile, embriyonik gün 18 ilk görünür, çünkü burada gösterilen doğum sonrası kültürleri de bazı glia (~% 25) içerir. Bir astrositlerde ve nöronların ATP ve DRAQ5 + Sapphire tahliller arasında ayrım yapamaz. , Ayrı ayrı nöronlar ve astrositleri ölçmek Mullett ve arkadaşları 4,29 tarafından açıklandığı gibi, 800 ve 700 nm kanallarda eşzamanlı MAP2 ve GFAP boyama kullanırım, DRAQ5 + Sapphire bırakarak için. Kültürdeki tüm hücreler değerlendirilmelidir isteyen, ancak bu gibi α-tubulin, β-aktin ya da GAPDH gibi bir pan-hücre işaretleyici kullanın.
    Not: Bu seyreltikleri N2a ve birincil kortikal hücreler için optimize edilmiş ve her model için genelleme değil. Bu nedenle, en az iki primer antikor dilüsyonları, plakanın sol yarısında bir ve sağ yarısında bir (Şekil 2B) deneyin. Alternatif olarak, 3 kuyu her primer antikorların 3-4 dilüsyonlarını deneyin. Örneğin, antikor, uç levha üzerinde tavsiye edilen bir seyreltme iki kat değişiklikleri ile çevrili olabilir. İmmünositokimya için tavsiye edilen seyreltme 1:500 olacaktır, başka bir deyişle, aynı zamanda 1:250 ve 1:1000 seyreltme faktörleri deneyin.
    1. PBS ve% 0.3 Triton-X ekleyin: 01:01 Odyssey blokta antikorlar seyreltin. Maliyet tasarrufu için, inkübasyon sonunda, bu çözelti kaldırarak adım 3.2.1 hücrelere uygulandı bloke çözeltisi içinde antikorların üretilmesi deneyin. Bunu yaparken PBS içinde hücreleri tutun; kurumasını gerekir.
    2. Ya da 1-2 saat oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C 'de primer antikor içinde inkübe Zayıf b içinantikorları ve bol olmayan proteinleri inding, gecede inkubasyon sinyali artırmak yardımcı olabilir.
      Not: her bir ikincil antikor konsantrasyonu (kuyu 2B-2B ve kuyu Şekil 2B'de 2E-2G) ile arka plân çıkarma için bloke etme çözeltisi olarak en az 3 kuyu bırakın. Herhangi bir primer antikor için bu kuyuların maruz bırakmayın. Bu ikincil antikor ile spesifik olmayan bağlama kapsamını ortaya çıkarmak ve sinyal-gürültü oranı hesaplamaları için yararlıdır. İkincil antikorlar, spesifik olmayan bağlanma yüksek düzeyde yol açacaktır bir endişe var ise, aynı zamanda, birincil veya ikincil antikoruna maruz ama yıkama ile aynı sayıda değildir alma kontrol kuyuları içermektedir. Bu kuyu ve "ikincil tek" kuyu arasındaki fark, tek başına ikincil antikor ile spesifik olmayan bağlanma neden olduğu ölçüde ortaya çıkaracaktır. Fare N2a hücreleri üzerindeki testte, tek başına olan anti-fare ikincil antikoru ile sinyal yoğunluğu 0.557 ± 0.032, anti-tavşan ile sinyalyalnız ikincil antikor ikincil antikor ile sinyal, 0.357 ± 0.003 0.533 ± 0.041 idi ve primer ve sekonder antikor ile sinyal 11.867 ± 0.911 idi. Fare hücreleri üzerinde anti-fare ikincil antikorlar kullanılarak bile Dolayısıyla spesifik olmayan bağlanma yüksek düzeyde gözlenmiştir değil. Birçok üretici kızılötesi ikincil antikorlar için vardır, biz sadece yüksek düzeyde çapraz emdirilmiş olanları satın öneririz. İkinci IgG antikorlarının konsantrasyonu kaynağına bağlı olarak farklı olabileceğini not edin.
  4. Iyi, 10 dakika her biri başına 200 ul PBS 3 yıkar primer antikorlar yıkayınız. Birincil antikorlar% 0,2 sodyumazid birkaç hafta boyunca 4 ° C'de kaydedilir ve çözümleri ışığa tutulduğunda enkaz küçük lekeler belirgin hale gelene kadar tekrar edilebilir. Bu sadece maliyet tasarrufu için yapılır. Maliyeti bir sorun değilse, her kullanım için taze antikorlar yapmak.
  5. 01:01 Odyssey blok 1:1,000 veya 1:2,000 ile ikincil antikor seyreltin:% 0.3 Tri ile PBSton-X (Şekil 2B). Plakanın alt yarısına plaka ve 1:2,000 üst yarısına 1:1000 seyreltme ekleyin. Bu konsantrasyonlar daha fazla maliyet tasarrufu, ancak bu işlemeden önce doğrusallık kontrol etmek için azaltılmış olabilir.
    Not: Arka plan çıkarma kuyuları (Şekil 2B sütun 2) için uygun ikincil antikor çözüm eklemek için emin olun.
    1. Ikinci bir protein DRAQ5 + safir, fare dışında başka bir türden primer antikorlar ile 800 nm kanal 700 nm keçi anti-fare IgG ve ikinci protein ile α-tübülin ya da MAP2 için etiket hücreleri yerine tahlil edilecektir. 800 nm kanal 700 nm kanaldan daha az bir geçmişe sahiptir ve ilgi en kritik protein için ayrılmış olmalıdır.
    2. Işıktan uzakta bir çekmece içerisinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikorlar inkübe edin.
  6. Iyi, 10 dakika her biri başına 200 ul PBS 3 yıkar ile ikincil antikorlar yıkayınız.
  7. DRAQ5 + Sapphire çözümler olun. Plakanın sol yarısında, DRAQ5 1:10,000 (0.5 uM nihai konsantrasyon) seyreltilmesi ve PBS içinde 1:1000 safir% 0.3 Triton-X ile (sütunlar 3-6, Şekil 2B). Plakanın sağ yarısında, DRAQ5 1:20,000 (0.25 mikron) sulandırmak ve Sapphire 1:2000 (sütunlar 7-10; Şekil 2B).
    Not: yerine 5 mM stok 1 mM stok satılacak kullanılır DRAQ5. Bazı raporlar, bu nedenle daha önce yayınlanmış DRAQ5 8 1:4,000 veya 1:2,000 seyreltilmiş numuneleri kullanılır.
    1. Iki tabak aynı anda test ediliyor ise, maliyet tasarruf etmek için, aynı DRAQ5 + Sapphire çözümleri ilk plaka kapalı pipetleme ve ikinci ekleyerek, sırayla iki tabak kullanılabilir. Aynı çözümleri bu şekilde iki defa kullanılacak ise, bir gün içinde onları kullanabilirsiniz. Sulandırılmış DRAQ5 + Safir çözümleri 4 ° C'de kaydedilen veya daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir olamaz.
    2. Uzak f oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bu çözeltilerde inküberom ışığı. Zaman kısa ve DRAQ5 + Sapphire çözümler adımda 3,5 sekonder antikor çözümleri bu lekeleri ekleyin ve 1 saat boyunca inkübe, farklı secondaries diğer plakalar üzerinde yeniden olmayacak eğer.
      Not: Bu kuyular 700 nm kanalda lekeli olmamalıdır gibi arka plan çıkarma kuyuları (Şekil 2B sütun 2) için DRAQ5 + Sapphire çözüm katmayın.
  8. 10 dakika her biri için, oyuk başına 200 ul PBS ile levha 3 kez yıkayın. Plaka kızılötesi görüntüleme tamamlandıktan sonra diğer görünür menzilli sekonder antikor ile boyandı olacak ise son PBS yıkama% 0.2 sodyum azidi koydu.
  9. Odyssey Imager üzerinde plaka tarayın. Yoğunluğu 5 ve 169 mm çözünürlükte plakaları tarayarak başlayın. "Orta kalite" veya "düşük kalite" ayarları Ya yeterlidir. Şirket detaylı uyarma / emisyon filtresi bilgi bırakmaz. Fakat, emisyon filtreleri yaklaşık 20 nm çapında olan ve yaklaşık 7 ortalanırÜreticiye göre, 20 ve 820 nm.
    Not: müfettişler diğer belirteçler ile onlara leke devam etmek isteyebilirsiniz gibi hala ıslak iken plakaları taramak mümkündür. Ancak şirket, kuru plakalar daha az iyi-iyi sinyal yayılımına sebep kendi online protokol göstermektedir. Eğer verileri karşılaştırmak için ıslak ve daha sonra kuru hem de bunları taramak ise, buharlaştırma sonra kalan tuzlar kenarlarında yüksek eşiğe yol açabilir, çünkü kuyudan tüm PBS kaldırmak emin olun.
    1. Odyssey Imager kadar tarar ve plaka altından geçerek. Kuyuların alt plakadaki kalınlıklarına ve derinliği değişebilir, çünkü farklı üreticilerin levhalar farklı odak uzaklıklar talep edebilir. Farklı odak uzaklıklar taramayı deneyin ve bakın nerede en yüksek sinyal-gürültü oranı ve crispest (odak çoğu) sinyali elde edilir: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Findin onaylamak için bir cetvel ile bir plakanın alttan oyuk derinliğini ölçülmesi de deneyinOdyssey gs. Kuyunun dibinde plastik cetvel ölçümlere ek yükseklik ekleyebilirsiniz unutmayın. Bu çalışmada kullanılan costar plakaları 4.0 mm'dir bir odak talep ediyoruz.
    2. Plaka resmin üzerine sağ-boy ızgara yerleştirin ve Microsoft Excel'e veri aktarmak için yazılım In-Hücre Batı işlevini kullanın. Yüksek floresans değerleri bulmak için farklı odak uzaklıklar boyunca aynı kuyuların "entegre yoğunluk" değerleri inceleyin. ("Birincil Negatif kontrol" oyuklara karşı immüno kuyularda sinyali) en yüksek sinyal-gürültü oranı veren ofset odak bundan sonra seçmek için biridir.
    3. Offset bir odak üzerine karar verildikten sonra, küçük artışlarla yeniden tarayın. Parlak sinyal 3.5 ve 4.0 mm idi Örneğin, 3.6, 3.7, 3.8 taramayı deneyin, ve 3.9 mm ve sinyal gücü başka gelişme olup olmadığını görmek. Offset odak yanlış ise, boş bir pl 12 sütun üzerinde sinyal yoğunluklarıyerine düz bir çizgi bir U-biçimli bir eğri gibi görünür (tüm sütunlar eşit bir sinyal olmalıdır zaman) yedik. Bu plastik plakalar ile ilgili bir sorun olmaya devam ederse, altı cam plakalar deneyin.
  10. 700 ve 800 nm kanallarda karşılık gelen her bir veri noktasından, arka plan çıkarma oyuklara (2G - - 2D veya kuyu 2E kuyu 2B Şekil 2B) 'de entegre edilmiş yoğunluklarının ortalamasını çıkarın. Daha sonra kuyu her grup için entegre sinyal yoğunluklarını ortalama. Hücre yoğunluğuna karşı bir saçılım olarak veri alanı (Şekil 3).
    1. Birincil ve ikincil antikorlar ve daha sonraki deneyler için, bir seyreltme her yerleşmek DRAQ5 + Safir iki farklı dilüsyon sonuçlarının iki farklı dilüsyon sonuçlarını karşılaştırın. Doğrusallık elde değilse, farklı bir yoğunlukta taramayı deneyin. Yoğunlukları 3 ve 5 yerine 7 ile yeniden taramak ve veriyi tekrar analiz. Veriler bu şiddetlerinde birinde geliştirmek ama eğer, yine de tatmin edici olmadığını yoğunluğu çevresindeki artışlarla yeniden tarayın.
    2. Yazılım kuyularda beyaz lekeler gösteren görüntüleri analiz için dikkatli olun, bu noktalar görüntüleyici aralığının dışında doymuş sinyali anlamına gelir. Bu durumda daha düşük bir yoğunlukta tarayın.
    3. Doğrusallık elde değilse, büyümek ya da bir gecede farklı sütunlarda dengesiz ölebilir çünkü kaplama 6 saat içinde hücreleri düzeltmek için de deneyin. Aynı zamanda farklı kaplama yoğunlukları, farklı tarama yoğunlukları, reaktif seyreltme faktörler, cam tabanlı plakalar, bir çekirdek yalnızca leke olarak kendi DRAQ5, ya da anti-α-tübülin ya da anti-MAP2 dışında farklı antikorların daha iyi duruma deneyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu deneylerde oran sınırlayıcı bir faktör ATP deney süresi nispeten kısa olduğu için, kızılötesi boyama olduğunu. Kızılötesi tahlilleri için, sekiz 96-yuvalı plakalar (bkz. Şekil 1) dört plakaların her biri iki seri tarafından şaşırtıcı bir gün içinde, lekeli ve taranabilir tahmin ediyoruz. Bu tahmin, tespit bölgesinin 20 dakika varsayar, yıkama 30 dakika, yıkama 30 dakika, ardından 2 saat primer antikor inkübasyon bloke 30 dakika, yıkama 30 dakika süre ile 1 saat kuluçka ikincil antikor, 30 dakika DRAQ5 + safir 30, ardından yıkar ve 4 plakalar için tarama süresi 34 dk dk. Onbeş dakika ek dört ayrı plakaların sendeleyerek pipetleme için hesap için yıkama için Şekil 1 çarpanlarına vardır. Veri analizleri için zamanı bu tahmine dahil değildir. ATP deneyi ölçümleri, her plaka için kızılötesi paralel olarak meydana olacaksa, on iki plakalar bir gün içinde tahlil edilebilir - kızılötesi leke altıs ve ATP seviyeleri için altı.

Regresyon analizleri tatmin edici veriler (Şekil 3) için kriterleri, Protokol bölümünde belirtildiği gibi, kaplama yoğunluk ve sinyal gücü (0.05 ≤ iki uçlu p) arasında anlamlı bir ilişki bulunmaktadır. Parlaklık veya kızılötesi sinyal değişikliklerin boyutu da hücrelerin sayısındaki değişiklikler ile orantılı olmalıdır. İdeal olarak, 5k hücrelerin yaklaşık yarısı ya da lüminesans 10k hücre ATP seviyeleri olmalıdır ve 15k hücreler vb 10k hücrelerine göre yaklaşık olarak% 50 daha büyük değerlere sahip olmalıdır. Bu orantı, tahlilin hassasiyetini yansıtır ve kararlılık R2 değeri ya da katsayısı ayrıdır. Regresyon doğrusu gerçek veri noktalarını yaklaşan ne kadar iyi R2, sadece önlemler. Veri doğrusal bile, sinyal gücü göreceli değişiklikler, hücre sayısındaki değişiklikler büyüklüğü ile orantılı olmayabilir. Bu w olabilirtavuk regresyon çizgisi tahlil çok hassas olmadığını düşündüren, yüksek R 2 ancak düşük bir eğime sahiptir. Bu durumda, önemli korelasyon ve verilerin orantılılık kriterinin her ikisi de yerine getirilmesi gerekmektedir. Son olarak, en uygun kaplama yoğunluğu yaklaşık olarak sinyal gücü olarak değişiklik alet ve tahlilinin dinamik aralığında olmalıdır. Dinamik büyük ve küçük olası değerler arasındaki orandır. Odyssey kamera, 4.5 günlük dinamik aralığı vardır ve doymuş sinyal sonuçları artık ölçülebilir vardır araştırmacı uyarmak amacıyla normal kırmızı veya yeşil görüntü yerine parlak beyaz renk olarak gösterir. Deneyde kendisi sırasında dinamik aralığı, çünkü bu tür herhangi bir belirli hücre tipi için maksimum ve minimum kaplama yoğunluğu gibi sorunların dardır. Hücre sayısı arttıkça az bir plakaları onlar üzerinden olduğu için, bu deneyler için doyma eğri ya da, başka bir fark çözülebilir yukarıda kaplama yoğunlukları ortaya çıkaracaktıraralık görüntüleyici nedeniyle ya da hücreler gece kalabalığı hayatta yok. Plakalar bir hücre yoğunlukları azaltılması, benzer şekilde, bir sinyal başka değişiklikler vardır altında olan minimum hücre yoğunlukları ölçebilir. Analizin dinamik, sadece minimum ve çözülebilir hücre / oyuk maksimum sayısı arasındaki kaplama yoğunluklarını içerir. Bizim hücreleri rapor olanlar ötesinde yoğunluklarda de hayatta yok çünkü bu belirli tahliller için tam dinamik aralık ölçülen değil.

Optimizasyon sonra, artık, bir 1:2000 seyreltmede anti-fare IgG'si ile, 1:10,000 seyreltmede anti-α-tubulin ile N2a fare nöroblastoma hücreleri boyamak ve 1:20,000 ve 1:2,000 ile DRAQ5 + Safir çözümler, sırasıyla. Ayrıca, 50 ul ortam içindeki ATP tahlil belirteçlerin 25 ul kullanın. Bu şartlar altında Sonuçlar Şekil 3A, B ve C 'de gösterilen ve befor yayınlanmıştıre 8. Her üç deneylerde sinyal gücü önemli ölçüde oyuk başına hücre sayısı ile ilişkiliydi. Tüm deneyler üç yüksek ölçüde doğrusal olmasına rağmen, bu hassasiyet eşdeğer değildi. Örneğin, oyuk başına 5 k hücre, oyuk başına 10 k hücreleri gibi kızılötesi lekelenme tam olarak yarısı miktarda yoktu. Kızılötesi deneylerinde aksine, ATP deney kaplama yoğunluğundaki değişikliklere daha duyarlıydı. Diğer bir deyişle, ışıldama 5k dan iyi başına 2.5k hücrelere 5k ve 10k kabaca yarı yarıya düştü. ATP testinin yüksek duyarlılığı bu bulgulara rağmen, hücre sağlığı daha geniş bir resim elde etmek için canlılığı için üç deneylerini gerçekleştirmek için en iyisidir.

Şimdi bir 1:1,000 seyreltmede anti-fare IgG'si ile, bir 1:2,000 seyreltmede, anti-MAP2 ile sıçan primer nöron hücreleri leke ve sırasıyla 1:10,000 ile 1:1,000, en DRAQ5 + Safir çözümlerle ve 25 kullanımı 50 ul medya (Şekil olarak ATP tahlil belirteçlerin ul3B, E, ve F). 700 nm kanalda 100k ve oyuk başına 200 k hücreler arasında çok az fark olduğu için DRAQ5 + Safir tahlilinde sinyal gücü her üç deneyden en az lineer profil gösterdi. Ancak, 700 nm sinyal gücü kuyunun başına 100k hücrelerin altındaki hücre sayısına orantılı olarak iyi oldu ve biz her zaman yine de başına 100k hücrelerinin nöronal kültürlerin plaka. Bununla birlikte, aynı zamanda DRAQ5 + Safir deneyi (aşağıya bakınız), diğer iki tahlilleri gibi toksin tedavilere duyarlı olmadığını gözlemledik. DRAQ5 + safir aksine, sinyal gücü MAP2 ve ATP deneyleri hem de kaplama yoğunluğu ile orantılı olarak daha iyi idi. Bu ATP tahlil belirteçlerin daha büyük bir hacmi, oyuk başına 200 k hücre sonuçlarını geliştirmek için dikkat edilmelidir. Daha reaktif olduğu için başka deyişle, lüminesan çıkış göz başına 100 K hücre değerleri tam olarak% 200 yükseltilebilir. Ancak, experime için yüksek bir plaka yoğunluğunda kortikal kültürleri plaka hiçbirNTS. Ayrıca, MAP2 ve ATP seviyeleri göz başına 20K hücrelerinden oyuk başına 22 120k hücrelere değişen neokortikal nöronal kaplama yoğunluğunda% 20 değişikliklere karşı duyarlı olduğunu bulduk. Bununla birlikte, diğer araştırmacılar oldukça çünkü doku ve hücre işleme arası laboratuvar değişkenlik bizim deneyler optimal koşulları kullanarak daha kendi laboratuvarında bu deneyleri test etmelisiniz.

Toksinler ile tedavi, aşağıdaki Bu tahlillerin yararlılığını göstermek amacıyla, MG132, bir proteazom önleyicisi (Şekil 4) ile muamele N2a hücrelerin doza cevap eğrileri gösterir. MG132 glutatyon ön N-asetil sistein varlığında ya da yokluğunda uygulanmıştır. Bu veriler ayrıca, N-asetil sistein 30 koruyucu etkileriyle ilgili son yayında bulunabilir. Hücreler, MG132 tedavisi takip eden 48 saat analiz edilmiştir. MG132 doza bağlı olarak DRAQ5 + safir sinyal (Şekil 4A, D) ve α-tubulin sinyali (azalmış varlığında, IC50 değerlerini elde etmek için bir doğrusal olmayan regresyon analizi yapıldı. Kullanılan denklemi Y = 100 / idi () 1 + 10 ^ ((Logic 50-X * Yamaç))). DRAQ5 + Sapphire için IC 50 değeri (Logic 50 = 0.22 ± 0.03, R 2 = 0,9477, Tepesi yamaç = -1.26) ve α-tubulin düzeyi için 1.96 mcM MG132 (Logic 50 = 0.29 ± 0.04, R idi 1.64 iM MG132 oldu = 0,9296 2, Tepesi eğim = -1,349). N-asetil sistein daha MG132 bu koruyucu bileşiğin mevcudiyetinde hücrelerini öldürmek için gerekli olduğunu düşündüren, sağa doğru eğrileri kaymıştır. N-asetil sistein varlığında, DRAQ5 + Safir için IC50 değeri 4.64 uM MG132 (lojik 50 = 0.67 ± 0.05, R2 = 0,8732 Hill eğimi = -1.06) ve α-tubulin için 6.35 uM MG132 (oldu Mantık 50 = 0.80 ± 0.04, R = 0,8802 2, Tepesi eğim = -1.382). MTT testi 31 ile ölçülen Madeira ve meslektaşları tarafından N2a hücrelerinin bir çalışma, 10 uM MG132 de canlılığı yaklaşık% 50 zarar bildirdi. Fioriti MTT deneyi ile tekrar 32, 50 uM MG132 ile muamele edildikten sonra, 4 saat canlılığı% 60 zarar bildirdi. Son olarak, Zhang ve arkadaşları Hoechst-lekeli çekirdeklerinin 33 sayıları kullanılarak, 10 uM MG132 de canlılığı% 60 zarar bildirdi. Bu IC 50 değerleri bizimkinden daha yüksektir. Ancak, bu daha önceki çalışmalarda farklı olarak, tedavinin başlatılmasından sonra canlılığı, 48 saat boyunca tahlil.

Hücre Titer Glo tahlile göre, ATP seviyeleri ATP seviyeleri tedaviden sonra hücre titre orantılı olması gerekmez gösteren, MG132 (Şekil 4C), düşük konsantrasyonlarda yükseltildi. ATP veriler, N2a MG132 hücreleri ile tedavi edildiklerinde, N-asetil sistein, aynı zamanda metabolik fonksiyonu koruduğunu göstermektedir olmasıyla yine de yararlıdır. Bu t kanıtlanıro N-asetil sistein ile MG132 IC50 değeri kayması. ATP için IC 50 değeri 3.05 uM MG132 oldu (Logic 50 = 0.48 ± 0.07, R 2 = 0.8616, Tepesi yamaç = -1.0) araç ve N-asetil sistein (Logic 50 = 0.96 ± 0.04, R 2 ile 9.12 mcM MG132 ile = 0,9261, Tepesi yamaç = -1.0). ATP artışlar neden konsantrasyonlar bu analizde dışlandı unutmayın. Analizde tüm değerlerin belirlenmesi dahil katsayısını düşürdü ve aracın varlığında, ve 9.24 uM MG132 için 4.03 uM MG132 (lojik 50 = 0.61 ± 0.09, R2 = 0,7224 Hill eğimi = -1.4) için IC50 değerleri artmış (lojik 50 = 0.96 ± 0.07, R2 = 0,6607, = tepe eğimidir -2,1) N-asetil sistein (Şekil 4C ile kontrast) mevcudiyetinde.

Bu üç tahlillerin İkinci bir örnek Figür primer kültürler için görüntülenmiştire 5. Doku, oyuk başına 100 k hücre kaplama, ayrışmış, sıçan ve neokorteks allocortex mikro-kesim ve H2O 2 paralel olarak işlemden geçirildi. Biz nörodejeneratif hastalıklar 34-39 değişik şekillerde savunmasız olarak bu iki beyin bölgelerinde oksidatif stres onların alınmasında farklı olacaktır hipotezini test. Bu verilerin bazıları daha önce yayınlanmış olan ve sonuçları bu çalışmada 22 daha fazla tartışılmaktadır. DRAQ5 + Sapphire için IC 50 değerleri (Logic 50 = 1.36 ± 0.07, R 2 = 0.7552, Tepesi yamaç = -0.95) neokorteks 22.84 iM H 2 O 2 ve allocortex yılında 24.63 iM H 2 O 2 (Logic 50 = 1.39 0,03 ±, R 2 = 0,9379, Tepesi yamaç = -1.74). MAP2'nin için IC 50 değerleri neokorteks 11.66 iM H 2 O 2 idi (Logic 50 = 1.07 ± 0.04, R 2 = 0,9332, Tepesi yamaç = -2.13) ve 29.76 iM H allocortex 2 O 2 (Logic 50 = 1.47 ± 0.04, R 2 = 0,8934, Tepesi yamaç = -4.45). ATP için IC 50 değerleri (Logic 50 = 1.38 ± 0.03, R 2 = 0,8907, Tepesi yamaç = -2.56) neokorteks 23.82 iM H 2 O 2 ve allocortex 44.5 iM H 2 O 2 (Logic 50 = 1.65 ± 0.03 , R 2 = 0,9204, Tepesi yamaç = -2.71). Allocortex H2O 2 uM 50 altındaki konsantrasyonlarda önemli ölçüde daha neokorteks oksidatif strese karşı daha dirençli olduğunu, ancak DRAQ5 + Safir deney, bu farkı gösteren en az duyarlıydı. Bu ikinci tahlil MAP2'nin aksine, nöronlar glia ayırt edemediklerini yansıtıyor olabilir. Daha önce belirtildiği gibi, bunlar, doğum sonrası beyin 22 hasat edilir, bizim kültürler, bir glia içerir. Şaşırtıcı bir şekilde, H, 2 O 2 (75 uM ve yukarıda), her MAP2 yüksek konsantrasyonlarda + astrocytes MAP2'nin + nöronlar daha H 2 O 2 daha dayanıklıdır bizim ön bulgulara dayanarak (gösterilmemiştir), biz Neokortikal astrocytes allocortical astrositlerde daha oksidatif hasara karşı daha savunmasız olduğunu öngörmekteyiz. Oksidatif hasar astrocytes metabolik uygulanabilir değildir, çünkü bu model DRAQ5 + Sapphire tahlilde ancak ATP deneyde değil yansıyabilir. Nedeni bu çarpıcı desenleri, bu birincil kültür veri burada gösterilmektedir olursa olsun sadece tahliller anlaşmaya her zaman olmadığını ortaya çıkarmak için.

Son olarak, tüm üç deneyleri ile Levha içi değişkenliği göstermek amacıyla, Şekil 6A ve 6G-C-I 'de yukarıda sözü edilen doz tepki eğrilerinden ikinci ve üçüncü Wells'in ham veri noktaları çizilen >. Benzer şekilde, açıklarda oluşan değişkenliği göstermek için, biz, Şekiller 6D-F ve 6J-L iki plakalarından ham veri noktalarının ortalaması (üç kopya halindeki gözlerin ortalama) çizilmiştir. Suret kuyularda ve bağımsız deneyler genelinde sinyal gücü her tedbir için önemli pozitif korelasyon sergiledi. Birincil nöronal kültürlerin bağımsız deneyler genelinde çiğ değerlerindeki bazı değişkenlik biz eski antikor yeniden ve DRAQ5 + Sapphire çözümleri ve kullanılmayan ATP tahlil birkaç kez reaktifler dondurursam, belki de yoktu. Primer kültürlerinde yüksek açıklarda oluşan değişkenliğin bir başka nedeni kültürün kendisi kalitesi olabilir. Farklı deneysel gün arasında değişen postmortem aralıkları ve doku taşıma varyans katkıda bulunabilir.

jpg "/>
Gösterilen kızılötesi deneyleri (B) için üç canlılığı deneyleri (A) ve zaman çizelgesi Şekil 1.. Şematik gösterimi. N2a hücreler için önerilen işlemlerdir. DRAQ5 + Safir çözüm, farklı ikincil antikor ile boyandı diğer tabakalarına yeniden olacak değildir, bunlar bir adım prosedürü azaltılması, nihai 1 saat kuluçkalama için anti-fare ikincil antikoru çözeltisiyle birleştirilebilir. tıklayın Daha büyük resmi görmek için.

Şekil 2,
ATP deneyi (A) ve Procedures eserinde ilave olarak açıklanmaktadır kızılötesi deneyleri (B) Şekil 2. Plaka formatı. Rağmen96-plaka bu deneyler reaktifler ve hücreler üzerinde tasarruf etmek, bu tür 384 sıra tabak gibi diğer biçimlere, adapte edilebilir, gösterilmektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
Şekil 3,. N2a fare nöroblastom hücrelerinde üç canlılığı deneyleri (A, B, C) ​​ya da primer postnatal fare neokortikal nöronların (D, E, F) için lineer regresyon. Her bir deney için sinyal gücü kaplama yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak çizilir. Insets DRAQ5 + Sapphire (A, D), α-tubulin (B), ya da MAP2 (E) leke temsilcisi kızılötesi görüntüleri göstermek. Ham yoğunluk değerleri her görüntü aşağıda listelenmiştir. Bu ham değerler içinde NotTek bir de bu deney için 3 kuyuların ortalama 3-4 bağımsız deneyin ortalama farklı olabilir. Orijinal kızılötesi görüntüleri (700 nm) veya yeşil (800 nm) kırmızı yalancı edildi. Her deney üçlü kuyucuklara gerçekleştirilen ve DRAQ5 + safir için 3 kez tekrar N2a pil ve hem de nöronlar, 3x α-tubulin, 4x için MAP2'nin için, ATP 3x için N2a hücrelerinde edilmiş ve nöronlar için 4x ATP. Üç kopya halindeki gözlerin elde edilen veriler, 3-4 deneylerin her biri için, bir son değeri için ortalaması alındı. Bu 3-4 nihai değerlerin ortalama ve SEM grafikte gösterilmiştir. SEM çubuklar görünmez böylece DRAQ5 + Sapphire değerleri düşük standart sapma gösterirler unutmayın. Kararlılık ve korelasyon önemini değerlendirirken iki kuyruklu p değeri R2 katsayısı da her tedbir için gösterilmiştir. Veriler, GraphPad Prism (versiyon 5.0) içinde analiz edilmiştir. Unnith tarafından Neurochemistry International, 61, yayımlanmaktadırBir ark: Elsevier izni ile p 356-368, "N-asetil sistein ile nörodejenerasyonda bir iki hit yüksek verim modelinden Kurtarma". resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
MG132 toksisitesine karşı N2a hücre Şekil 4.. Koruma. N2a hücreleri antioksidan N-asetil sistein (, 3 mM NAC) varlığında ya da yokluğunda, MG132 proteazom inhibitörü arasında belirtilen konsantrasyonları ile muamele edildi. Tüm deneyler üç canlılığı 48 saat sonra yapıldı. MG132 (C), düşük konsantrasyonlarda ATP seviyelerinde artış not edin. DRAQ5 + Sapphire boyama (A) o paralel bir artışr α-tubulin (B) belli oldu. DRAQ5 + Safir ve α-tubulin lekeleri Temsilcisi kızılötesi görüntüleri, sırasıyla, D ve E, kırmızı ve yeşil yalancı edildi. Her deney üçlü kuyularda yapılan ve α-tubulin DRAQ5 + Sapphire, 4x için 4x tekrarlanan ve ATP için 3x edildi. Üç kopya halindeki gözlerin elde edilen veriler, 3-4 deneylerin her biri için, bir son değeri için ortalaması alındı. Bu 3-4 nihai değerlerin ortalama ve SEM gösterilir. * P ≤ su karşı N-asetil sistein karşılaştırılması için 0.05, iki-yönlü ANOVA aşağıdaki Bonferroni düzeltmesi. Veriler, GraphPad Prism (versiyon 5.0) içinde analiz edilmiştir. Neuroscience, 255 'den yeniden basılmıştır, Jiang ve diğ:. Elsevier izniyle, s 19-32 "N-asetil sistein, bir ısı şoku proteini-bağlı bir şekilde proteotoxicity hafifleten" CDaha büyük resmi görmek için buraya yalamak.

Şekil 5,
Şekil 5,. Hidrojen peroksit toksisitesine ve allocortical neokortikal kültürler diferansiyel güvenlik. Postnatal birinci motor ve duyu neokorteks ve entorhinal ve piriform allocortex Microdissections içinde göz başına 100 k hücre ayrılmış ve ekildi. In vitro olarak 2 gün, hücreler, 2 H, O 2'nin belirtilen konsantrasyonları ile muamele edildi. Plakalar 48 saat sonra analiz edilmiştir. Bu allocortex neokorteks daha iyi bu kültürleme şartları hayatta ve başlangıçta yüksek hücre numaraları vardır unutmayın. Her deney üçlü kuyularda yapılan ve MAP2'nin için DRAQ5 + Sapphire, 3x için 4x tekrarlanan ve ATP için 6x edildi. Üç kopya halindeki gözlerin gelen veriler ortalandı3-6 Deneylerin her biri için, bir son değer. Bu 3-6 nihai değerlerin ortalama ve SEM gösterilir. * P ≤ neo-versus allocortex, iki-yönlü ANOVA ve Bonferroni düzeltmesi aşağıdaki karşılaştırılmasında 0.05. Veri GraphPadPrizmasındaki (Version 5.0) analiz edildi. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 6,
Şekil 6,. MG132 ve H 2 N2a hücreleri ve kortikal nöronlarda O 2 doz yanıt eğrileri için Levha içi ve açıklarda oluşan korelasyon. Bütün deneyler üç kopya halindeki gözlerin ayrı olarak yürütülmüştür. Plakaları (A içinde tekrarlanabilirliği ölçmek için 1 ve 2 çoğaltır gibi, her grup içinde, ikinci iki kuyulardan elde edilen ham veriler, çizildi G, H, C, ve korteks için Şekil I). Iki bağımsız deney (üç kopya halindeki gözlerin ortalama) 'de elde edilen veriler aynı gruptan levhalar arasındaki tekrarlanabilirliği ölçmek için plakanın 1 ve 2 olarak işaretlenmiştir plakası (D, E ve N2a hücreleri ve J, K, L korteks için F) edilmiştir. Kararlılık ve korelasyon önemini değerlendirirken iki kuyruklu p değeri R2 katsayısı da her tedbir için gösterilmiştir. Veri GraphPadPrizmasındaki (Version 5.0) analiz edildi. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tüm üç canlılığı deneylerde sinyal gücü, doğrusal ve kaplama yoğunluğu ile ilişkili olduğunu bulmuşlardır. Ancak, tüm deneyler, 2-kat veya kaplama yoğunluğu 1.5 kat değişikliklere karşı eşit ölçüde hassastır. N2a hücreleri için, kızılötesi deneyler özellikle düşük kaplama yoğunluklarında, ATP deneyi daha az duyarlıdır. Kızılötesi deneyler ATP daha az duyarlı olan, ancak DRAQ5 + Safir deneyler ve α-tubulin deneyleri ki bunlar, N-asetil sistein ve yüksek ölçüde koruyucu bir etki ortaya iyi bir uyum içindedir. Orada her iki deneyleri ile kızıl ötesi sinyalin doz-yanıt kaybı ve tüm üç canlılığı eğrileri, N-asetil sistein ile sağa kaydırılmıştır. Α-tubulin ve ATP deneyler DRAQ5 + Safir deneyi (Unnithan ark Şekil 4 daha amonyum klorür gibi bileşiklere karşı daha duyarlı olması gibi, her zaman olduğu gibi bu üst üste binme, N2a hücre tedaviler her türlü gözlenmemiştir. 8 .) Bu nedenle, canlılığı fenotipinines her zaman eşit üç tahlilleri ile temsil edilmemektedir. ATP deneyi α-tubulin ve DRAQ5 + safir deneyleri, hücre sayıları ışınım yansıtan sinyal varsayımına göre kaplama N2a hücre sayısı ile orantılı olarak daha iyi olmasına rağmen, her zaman toksin muameleden sonra bir araya değildi. ATP seviyeleri, kızılötesi deneylerde sinyal benzer bir artışa neden olmamıştır toksin konsantrasyonlarda yükseldi. Bu veriler, proteazom inhibisyonuna yanıt olarak N2a hücrelerde telafi metabolik değişiklikleri ortaya çıkarmak ve kendi başlarına yararlı olmaktadır. U-şekilli ATP doz-yanıt eğrisi hormesis denilen fenomen özelliğidir. Hormesis toksinleri ve diğer stres 40-42 düşük düzeyli pozlarla olumlu biyolojik reaksiyonlar olarak tanımlanır.

Nöronlar için, DRAQ5 + Sapphire leke yüksek kaplama yoğunluklarında MAP2'nin ve ATP testleri daha az duyarlı oldu. Ancak, DRAQ5 + Sapphire, MAP2 ve ATP deneyleri ce orantılı iyi idioyuk başına 100k hücre ya da birincil kortikal nöronlarda ll sayısı. Biz kuyunun başına 100k hücreleri nöronların plaka. Korteks nöronlar çoğaltmak için bilinmemektedir, bu nedenle, biz 100k veya alt kaplama yoğunluklarında doğrusallığa hakkında daha fazla endişe vardı. DRAQ5 + Safir deney 50 uM, H2O 2 nin altındaki konsantrasyonlarda MAP2 ya da ATP ya da daha neokorteks ve allocortex arasındaki farklılıklara daha az duyarlı idi. Ayrıca, ATP düzeyleri H üzerine dramatik düşmedi 2 O belki de tekrar ATP üretimindeki artışlar telafi düşündüren diğer iki tahlillerde kızılötesi sinyali olarak 2 tedavi. N2a hücreleri ve primer nöronlar üç tahliller arasındaki tutarsızlıklar brüt anatomik yapıları etkilenen önce hücresel fonksiyonları değiştirebilirsiniz yansıtıyor olabilir ve hücre iskeleti proteinleri içeren bu hücre yapıları, hücreler kendilerini kayıp olan uzun önce etkilenebilir. Inandırıcı multipleks canlılığı Gilbert tarafından tahlillerinde ve meslektaşları hakkında yeni verilerBöyle Hoechst nükleer boyanma ve ATP ölçümleri gibi farklı canlılığı tedbirler sadece kısmen ve dolaylı olarak bir bütün 26 olarak canlılığını yansıtan spesifik hücresel özellikleri hakkında bilgi verim olduğunu göstermektedir. Bu nedenle birçok yayınlar yapmak metabolik canlılık için tek bir tahlil dayanarak aynı anda ve tüm üç analizler yapmak öneririz. Bu önlemlerin herhangi birine hakkında daha fazla bilgi için, tek tek hücrelerin sayılması ve sonra hücre sayısının bir fonksiyonu olarak, hücre iskeleti protein ekspresyonu ve ATP seviyelerini değerlendirmek önerilir.

Örneğin MTT metabolik olarak canlılığı için başka deneyler, olmasına rağmen, ATP tahlilin avantajı duyarlılığı ve dinamik aralığında yer almaktadır. MTT deneyi, ATP ölçümlere kıyasla canlı hücrelerin sayısını olduğundan fazla ve 43, iki kat daha yüksek olduğu bir IC 50 sergiler olabilir. Ayrıca, Petty ve arkadaşları bildirdi ATP tahlil olabilirMTT deneyi, daha az 25k hücre / oyuk 12 tespit değil ise, oyuk başına 1563 hücre alt sınırı olarak algılar. Sinyal-gürültü oranı (hücre bulunmayan oyuklara karşı canlı hücreleri ile kuyudan sinyali) ATP 44 için sadece 7 MTT için değil, 230 olan. MTT üzerinde parlak ATP tahlillerin diğer bir avantajı, inkübasyon süresi çok daha kısa olmasıdır. Buna ek olarak, Promega'dan MTT deneyi aynı üreticinin Cep Titer Glo tahlil bizim tavsiye edilen seyreltmelerde kuyu başına 0.09 ¢ maliyeti ise kuyu başına 0.28 ¢ maliyeti. Ancak, tüm metabolik deneylere sınırlamalar vardır, metabolik aktivite, özellikle nekroz sırasında hayatta kalma bağlanmamış olabilir. Bu bir sorun ise, bu raporda deneyler, membran bütünlüğünün kaybını tespit etmek için laktat dehidrojenaz Yayım ölçümleri ile kombine edilebilir. Laktat dehidrogenaz ölçümler sadece hücre dışı ortamı içinde yapılır, bu durum herhangi bir ek plakaları dahil değildir.

Biz mikroskop üzerinde elle sayıma alternatif olarak bu deneyleri mevcut olmasına rağmen düzgün yürütüldüğü takdirde, ikinci örnekleme hücre sayısının son derece hassas ve doğru araç olabilir. Nitekim, biz Hoechst-lekeli çekirdeklerin sayımları DRAQ5 + Sapphire tahlilinde daha N2a hücre sayısındaki küçük değişikliklere daha duyarlı olacağını bekliyoruz. Tahlillerin tüm doğrusallık testi başarısız olduğunda, manuel sayıları önemlidir. Bunun iyi bir örneği daha zahmetli elle 45 sayar gerçekleştirdiğiniz bizim kültüre birincil astrocyte modelidir. Hücre sayımı verileri yorumlarken Ancak, elle sayım doğasında önyargıları bilgisayarlı tahlillerin doğasında kusurları kenara olmamalıdır gibi, akılda olmalıdır. Canlılık testlerinin güçlü ve zayıf bir dizi nedenle aşağıda açıklanmıştır.

DAPI veya Hoechst lekeler istihdam Öncelikle, eğer çekmiş ve yoğunlaştırılmış çekirdekler sık ​​olarak belirlenmişapoptotik 1. Ancak, hücre boyutu ve çekirdeklerinin yoğunlaşma düzgün bir süreklilik boyunca yer alır. Buna karşılık, hayat ve ölüm birbirini dışlayan ikili olgulardır. Canlı veya ölen hücrelerin çok farklı iki grup görülmektedir sürece, bu tür MetaMorph veya ImageJ gibi ziyade gözü tarafından görüntüleme yazılımı gibi apoptotik bir eşik nükleer çapı altındaki tüm hücreleri saymak için iyi görünüyor. Biz geri dönülemez bir apoptotik kaskad başlatılır hangi noktada olduğunu bilmiyorum çünkü Tabii ki, bir eşik çapı için seçim keyfidir. Ayrıca, tanımı gereği, aktif kaspaz 3 ile bile hücreler ölüme giderken mutlaka değildir ve belki de tespitin 46 anda hayatta olarak sayılmalıdır. Bizim kızılötesi deneyleri tespitin zamanda da kalıp için hala canlı bağlı olan tüm hücrelerin işlemden geçirilmesi ile bu tür kaygılar kaçının. Sadece uzakta yüzmekte olan hücreler ölü olarak sayılır. Bu iki ayrı kategoriden birine hücrelere yerleşir ve bir co kullanarak tuzaklar önlermplex, nükleer çapı gibi sürekli işlev.

İkinci olarak, el ile sayıları tipik olarak tüm kuyu küçük bir kısmını örnek. Bu örnekleme önyargıya yol ve ortalamanın vesilesiyle, yüksek standart hataları olabilir. Bizim canlılığı deneyleri ile, tüm iyi ATP için örneklenir ve tüm çukuruna yakın kızılötesi deneyleri ile örneklenir. Bu örnekleme model örnek boyutunu artırır ve manuel sayım için bir fotoğraf yakalamak için nereye kuyunun içinde bazen keyfi kararı önler. Fotoğraf kuyunun merkezinde alınırsa, bir hücre en yıkama-off toksisite potansiyeli overestimates yol, meydana geldiği bu bölge olduğunu akılda tutmak gerekir. Buna karşılık, enfraruj deneyler sadece kuyuların uç köşeleri hariç 96 oyuklu plakanın görüntü üzerine bir ızgara atmak. Bu şekilde istenmesi halinde, kuyuların köşeleri kılavuzunda çevrelerin çapını arttırarak dahil edilebilir.

Üçüncü olarak, fotoğrafçı ve hücre sayacı hem manuel sayımları sırasında kör olmalıdır. Hücreler toksinler ile tedavi edilir Ancak, bir kez, genellikle hatta eğitimsiz göze oldukça açıktır morfolojik değişiklikler varsayıyorum. Bu çok daha zorlu tarafsız kalması vermektedir. Körlük bizim tahliller için bir gereklilik değildir.

Dördüncü, manuel sayım zaman alıcı ve daha fazla maaş baş araştırmacısı maliyet. Maaşlar araştırma en yüksek maliyetleri vardır. Odyssey tek plaka tarama zamanı ayarı "orta kalite" uzun sadece 8 dk ve "düşük kaliteli" ayarda daha düşürülebilir. Bu Odyssey Imager bir el demo sürümünü satın bile, pahalı, ama bu bir kerelik bir sabit maliyet olduğuna dikkat edilmelidir. Öte yandan, bir de DAPI-H ya da elle hücre sayımları için nispeten pahalı epifloresans mikroskoplar yatırım zorundadırçekirdek oechst-boyandı. Başlangıç ​​maliyeti rağmen, Odyssey Imager de nicel bir şekilde 47,48 Batı imünoblotlarının ölçen çok amaçlı bir makinedir. Biz, sıçan veya fare striatumunda veya telencephalic korteks olarak makroskopik beyin yapılarında immunosteyn quantifications için Odyssey'in kullanımı adapte edilmiştir. Bu yaklaşım, aynı zamanda diğerleri tarafından 49 kullanılmıştır. Doku görüntüleme için Odyssey Imager bir zayıflığı yüksek çözünürlük sadece 21 mikron olmasıdır. Bu nedenle bireysel hücreler sayılmaz ve ince anatomik ayrıntıları görselleştirmek için tasarlanmamıştır.

Son olarak, kızılötesi deneyler manuel sayımlar olarak hücre sayısındaki küçük değişikliklere duyarlı olmayabilir. IC50 değerleri, bu nedenle sadece kızıl ötesi sinyalin% 50 kayıp ortaya çıkaran konsantrasyon olarak, hücre sayıları tam da% 50 kayıp ortaya çıkaran konsantrasyonunu gösteren olarak kabul edilemez. Bu ihtar muhtemelen geçerlidirbütün canlılığı mikroskobu ile tek tek hücre sayıları aşmak ve bir kerede tüm kuyu örnek tahliller. Bu tür deneylerde ile ilişkili belirsizlik hipertrofi, atrofi ya da sinyal gücünü etkileyen görünüşte diğer değişikliklerin bir fonksiyonu olabilir. Örneğin, bazı toksinler ile, α-tubulin, her hücrede imünoreaktivite toksisite bir fonksiyonu olarak yükselebilir. Biz, MG132 8 çok yüksek konsantrasyonları ile muamele N2a hücrelerde bu olay gözlemledik. Bu endişe ise, bu β-aktin ya da GAPDH gibi sito-iskelet proteinleri işaretleyici kullanılabilir. Ayrıca, N2a hücreler bipolar süreçlerini 8,50,51 oluşturma eğilimindedir vurguladı. Hücre boyutu değişiklikleri ile, hücre başına flüoresan sinyal çıkışı da tedavi grupları arasında farklılık gösterir. Biz, toksin ile muamele edilmiş hücreler, hücre içi Batı kullanılan aynı belirteçler için imünosito kimyasal olarak aşağıdaki standart yüksek çözünürlüklü mikroskopla incelenmiş önerilir. Sitoplazma işlenmesi üzerine boyut olarak büyük ölçüde değişir, ancak varsaçekirdek, sadece çekirdeklerini ölçmek için Sapphire olmadan DRAQ5 leke kullanmanızı öneririz değildir. Farklı boyalarla ve diğer hücre iskeleti veya diğer bol proteinleri ile Gelecek çalışmalar bu engelleri aşmak için garanti edilir.

Hepimiz deneyleri uyarılar muzdarip ve duyarlılığı ile ilgili endişeleri, doğrusallık, örnekleme hatası, sinyal-gürültü oranı, insan önyargı ya da öznelliği, zaman ve maliyet artırdı sonucuna varıldı. Ayrıca, tüm tahlilleri her zaman yerine değil varsayımlara dayanan. Bu nedenle, biz, en azından iki tahlilleri hücre kültürleri üzerinde tedavisinin etkilerini tanımlamak için kullanılan metabolik sağlık ve anatomik canlılığı dayanır birini ölçen bir tavsiye. Bu şekilde, daha etkili bir tedavi edici bileşikleri, yapı ve fonksiyon hem de koruma olmadığını belirleyebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların hiçbiri ifşa herhangi çatışmalar var.

Acknowledgments

Biz ATP deneyinde reaktiflerin hacimleri üzerindeki tasarruf fikri Juliann Jaumotte kabul. Biz bu çalışmalar için mali destek sağlayan Mary Caruso, Deb Willson ve Jackie Farrer ve Eczacılık Mylan Okulu muhteşem idari destek için gönülden teşekkür ederiz. Teşekkür de Hunkele korkunç Hastalıkları Vakfı ve Parkinson ve Hareket Bozuklukları birincil nöronal çalışmaların mali destek Vakfı kaynaklanmaktadır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Titer Glo Promega G7572 Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin Thermo-Shandon 9990244 Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block LI-COR 927-40003 This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 21568 We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic Fisher S468 One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic Fisher S373 See above
Sodium Azide (250x) Ricca Chemical Company 7144.8-16 Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin Sigma-Aldrich T5168 This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2 Sigma-Aldrich M9942 This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG LI-COR 926-32210 Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5 Biostatus DR50200 This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire LI-COR 928-40022
Luminometer PerkinElmer VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager LI-COR 9201-01
Shaker/Mixer Research Products International 248555

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
  2. Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
  3. Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
  4. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
  5. Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
  6. Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
  7. Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
  8. Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
  9. Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
  10. Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
  11. Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
  12. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  13. Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
  14. Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
  15. Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
  16. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
  17. Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
  18. Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
  19. Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
  20. Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
  21. Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
  22. Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
  23. Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
  24. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
  25. Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
  26. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
  27. Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
  28. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
  29. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
  30. Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
  31. Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
  32. Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
  33. Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
  34. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
  35. Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
  36. Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
  37. Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
  38. Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
  39. Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
  40. Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
  41. Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
  42. Mattson, M. P. Hormesis defined. Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
  43. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
  44. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  45. Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
  46. McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
  47. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
  48. Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
  49. Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
  50. Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
  51. Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 83 In-hücre Batı DRAQ5 Safir Hücre Titer Glo ATP birincil kortikal nöronlar toksisite koruma N-asetil sistein hormesis
Kültür hücreleri için Canlılık Tahliller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Posimo, J. M., Unnithan, A. S.,… More

Posimo, J. M., Unnithan, A. S., Gleixner, A. M., Choi, H. J., Jiang, Y., Pulugulla, S. H., Leak, R. K. Viability Assays for Cells in Culture. J. Vis. Exp. (83), e50645, doi:10.3791/50645 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter