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Biology

Les analyses de viabilité de cellules en culture

Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/50645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

Summary

Les composés thérapeutiques sont souvent d'abord examiné in vitro par des tests de viabilité. Le nombre de cellules aveugles par un observateur humain peuvent être très sensibles à de faibles variations du nombre de cellules mais ne pas évaluer la fonction. Essais de viabilité informatiques, tel que décrit ici, peuvent évaluer à la fois la structure et la fonction d'une manière objective.

Abstract

Le nombre de cellules manuelles sur un microscope sont des moyens sensibles à l'évaluation de la viabilité cellulaire, mais prennent du temps et par conséquent coûteux. Essais de viabilité informatiques sont coûteux en termes d'équipement, mais peut être plus rapide et plus objective que les comptages manuels cellulaires. Le présent rapport décrit l'utilisation de ces trois essais de viabilité. Deux de ces dosages sont l'infrarouge et l'autre est luminescent. Les deux tests infrarouges reposent sur un imageur 16 bits Odyssey. Une analyse infrarouge utilise la tache de DRAQ5 pour les noyaux combinés avec la tache de Sapphire pour cytosol et est visualisé dans le canal 700 nm. L'autre test infrarouge, un In-Cell occidentale, utilise des anticorps contre les protéines du cytosquelette (α-tubuline ou microtubules protéines associées 2) et les étiquettes dans le canal 800 nm. Le troisième test de viabilité est un dosage luminescent couramment utilisé pour l'ATP, mais nous utilisons un quart de la quantité recommandée pour économiser sur les coûts. Ces mesures sont toutes linéaires et sont en corrélation avec le nombre de CElls plaqué, mais varient en sensibilité. Tous les trois essais contourner microscopie temps et déguster l'ensemble bien, ce qui réduit l'erreur d'échantillonnage. Enfin, tous les tests peuvent facilement être achevée dans un délai d'une journée de la fin de l'expérience, ce qui permet un plus grand nombre d'expériences à réaliser dans des délais courts. Cependant, elles reposent toutes sur l'hypothèse que le nombre de cellules restent en proportion de la force du signal après les traitements, une hypothèse qui est parfois pas satisfaite, en particulier pour l'ATP cellulaire. En outre, si les cellules augmentent ou diminuent en taille après le traitement, cela pourrait affecter la force du signal sans affecter le nombre de cellules. Nous concluons que tous les tests de viabilité, y compris les comptages manuels, souffrent d'un certain nombre de réserves, mais que les essais de viabilité informatisés valent bien l'investissement initial. En utilisant les trois dosages donne ainsi une vue d'ensemble de la structure et de la fonction cellulaire.

Introduction

Le test de viabilité la plus courante dans les sciences biologiques implique nombre de cellules. Ceci est démontré par une analyse des meilleurs (les plus récents) de 200 publications parues dans PubMed avec l'un des mots-clés «in vitro» ou «culture» sur 29/04/2013 et 30/04/2013. Parmi ces publications, 23,5% utilisés essais de comptage de cellules, y compris les manuels nombre de cellules chiffres, le nombre de cellules automatisé compte avec un logiciel d'imagerie, et exclusion au bleu Trypan. Le dosage Vivant / Mort a été utilisé dans 1% de ces publications. Le nombre de publications utilisant le MTT (3 - (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényl) test pour la viabilité métabolique était de 11%. Cette revue de la littérature montre également que le nombre de publications en utilisant des tests tels que MTT en conjonction avec les tests de comptage cellulaire n'était que de 3,5%. Malgré la tendance à utiliser un test de viabilité par lui-même, l'évaluation de la fonction cellulaire en combinaison avec le nombre de cellules semble le meilleur choix pour l'évaluation i cellulaireNtegrity. Les comptages cellulaires par eux-mêmes ne sont pas suffisants parce que les cellules restantes ne peuvent pas être fonctionnel ou en bonne santé, même si elles sont présentes dans le puits de 1,2. A l'inverse, les mesures fonctionnelles telles que l'ATP peut augmenter ou diminuer en l'absence de changements parallèles dans le nombre de cellules. Le découplage de lectures métaboliques du nombre de cellules suggère que l'ATP et MTT essais ne doivent jamais être utilisés comme seul test de viabilité. Dans le présent rapport, trois essais de viabilité, qui sondent les structures cellulaires et la fonction métabolique sont décrits, pour une vision plus globale de l'intégrité cellulaire que n'importe quel test en lui-même ne peut se permettre.

Deux de nos tests nécessitent un imageur infrarouge qui mesure la fluorescence dans les canaux 700 et 800 nm. Le bruit est faible dans les longueurs d'onde infrarouges, entraînant une hausse des signal-bruit ratios 3. L'imageur de l'Odyssée que nous utilisons a une gamme dynamique de 4,5 log et une profondeur de bits de 16, Translating à 2 16 ou 65 536 nuances de l'infrarouge. Cela peut être comparé à l'imagerie de couleur 8 bits, qui ne donne 2 8 ou 256 nuances de couleur pour chaque longueur d'onde. Ainsi, l'imagerie 16 bits a une résolution plus fine. Il convient de noter que les images infrarouges d'origine sont souvent pseudocolored vert (800 nm) et le rouge (700 nm) dans des rapports publiés pour la présentation. imageurs Odyssey sont couramment utilisés à la fois pour Western blot et In-Cell Westerns 4-7. In-Cell Westerns sur les cellules fixées au formaldehyde utilisent des anticorps primaires contre toute protéine d'intérêt et de les étiqueter à son tour avec des anticorps secondaires fluorescents infrarouges. Cette technique est connue pour être particulièrement utile pour les points d'extrémité de phosphorylation 6. Dans notre In-Cell Westerns, nous colorer les cellules fixes de protéines du cytosquelette α-tubuline ou aux microtubules neuronaux de la protéine associée à 2 (MAP2) dans le canal de 800 nm. Ces protéines sont assez abondantes pour donner rapports signal sur bruit. Nous tachons également nos assiettes dans le 700canal nm pour les noyaux avec la tache de DRAQ5 et pour le cytoplasme avec la tache de Sapphire. Tant les protéines du cytosquelette et les DRAQ5 + taches Sapphire reflètent donc des structures cellulaires.

Le troisième test de viabilité de mesurer la fonction métabolique et est appelé "Cell Titer Glo." Pour ce dosage à base de luciférase-, valeurs de luminescence sont en proportion directe avec les taux d'ATP. Essais ATP sont couramment utilisés pour quantifier les cellules viables 8-12. Cependant, y compris le mot «titre» dans le nom de l'analyse est un peu un abus de langage car la production d'ATP par cellule peut changer en fonction des traitements de toxine et n'est donc pas toujours en proportion du nombre de cellules 8. Les niveaux d'ATP peuvent également être affectés par les rythmes circadiens 13 et par la division cellulaire 14 et la différenciation des cellules 15. Néanmoins, le dosage de l'ATP montré ici est simple à réaliser et utile car l'ATP est une mesure robuste métaboliqueviabilité 16-21, sinon la cellule numéro en soi. L'utilisation de ce test pour compléter l'infrarouge In-Cell Westerns cède donc une image plus complète de l'intégrité cellulaire que tout un test seul.

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Protocol

Un schéma des protocoles est illustré sur la figure 1.

Une. Cellule de placage

Cellules de la plaque dans des plaques à 96 puits à des densités différentes de placage (Figure 2). Pour les contrôles de linéarité sur la ligne N2a de cellules de neuroblastome, plaque 2.5k, 5k, 10k, 15k et cellules par puits dans 3 ou 6 puits / groupe. Pour les contrôles de linéarité dans les neurones corticaux de rat primaires, plaque 25k, 50k, 100k, 200k et cellules par puits dans 3 ou 6 puits / groupe. Si les lignées cellulaires ou des cellules primaires d'intérêt semblent en bonne santé à différentes densités de placage, et autour de la plaque à la densité cellulaire optimale pour ce type de cellule.

Remarque: Dans la présente étude, les cellules ont été étalées dans N2a 100 pi médias et les neurones corticaux primaires de 200 médias pi sur des plaques qui sont conçus pour une évaporation plus faible. Pour plus d'informations sur la manipulation des cellules, des médias, des sérums, des antibiotiques et des traitements de toxine, s'il vous plaît voir Unnithan et al. pour N2a cells 8 et Posimo et al. pour les cultures de cortex 22 primaires.

    1. Répéter le placage sur une seconde plaque à 96 puits. Une plaque sera analysé pour déterminer l'ATP (Figure 2A) et l'autre avec les analyses infrarouges (Figure 2B). On ne peut pas utiliser la même plaque pour l'ATP et analyses infrarouge parce que les cellules doivent être lysées ouverte pour les mesures ATP intracellulaires.
    2. Assurez-vous de la plaque au moins 3 puits supplémentaires pour soustraction de fond dans les essais infrarouges à la densité de placage optimal (colonne 2; figure 2B).
  2. Ajouter un média sans cellules ou plus, à peu de frais, de l'eau stérile pour les puits extérieurs dans les lignes A et H et dans les colonnes 1 et 12. Éviter de s'appuyer sur des données provenant de puits le long des bords, que la viabilité est souvent plus faible ici des effets de l'évaporation des médias et des gradients de température. Ces problèmes de microplaques sont communément appelés des effets de bord 23,24. Ne pas garder ces puits videcar alors les lignes B et G et les colonnes 2 et 11 souffrent de l'effet de bord.
    Des effets de bord peuvent être réduits par l'incubation d'une plaque fraîchement ensemencée à la température ambiante dans les conditions ambiantes avant d'être transférés dans l'incubateur à CO 2 24. En outre, une étude récente de Carralot décrit une méthode de correction mathématique pour microplaques en utilisant une colonne de contrôle unique 23. Oliver et ses collègues ont utilisé une force microtitration d'air plaque incubateur spécialement conçu pour réduire les gradients thermiques 25. Si l'effet de bord est une préoccupation importante, chambres de stabilité de microplaques (par exemple BT & C Incorporated) peuvent être achetés pour créer un micro-environnement homogène avec une humidité élevée et même des gradients de température.
  3. Si plusieurs puits que montré à la figure 1 sont nécessaires parce dilution des réactifs supplémentaires ou plus de la densité de placage seront testés, utiliser les puits de pointe pour soustraction de fond.
  4. Attendez le lendemain pour la fixationdosage des cellules et le lendemain matin comme décrit ci-dessous.

2. Luminescent ATP Assay

  1. Suivez les recommandations de la Cellule Titer Glo fabricant pour la reconstitution du substrat avec un tampon et pour des temps d'incubation.
    1. Retirer 50 ou 150 médias pi de 100 ou 200 pi de milieu de placage, respectivement. Un peu moins de 50 pl restent derrière dans le puits. Ajouter 25 ul de substrat des réactifs (tampon) ainsi que pour les colonnes 2-6 (figure 2A) à une dilution de 1:02.
      Remarque: les volumes variables de médias laissés après le retrait pourrait diluer ou concentrer les réactifs de dosage de l'ATP différentielle entre les puits. Veillez à ce que le niveau de liquide dans tous les embouts de pipette multicanaux est équivalent. Mesurer le liquide restant dans les puits sélectionnés à travers la plaque avec une pipette immédiatement avant l'addition des réactifs de dosage de l'ATP pour assurer la précision. Si la grande variabilité existe de taux différentiels de EVAPOR des médiastion à travers la surface de la plaque, supprimer tous les anciens supports et ajouter le même volume de milieu frais ou de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à tous les puits immédiatement avant l'addition de réactifs de dosage de l'ATP. Si les plaques souffrent de niveaux variables de l'évaporation, essayez de passer à des plaques de faible évaporation de Costar Corning. Dans les dernières plaques, les 60 puits intérieur de la figure 2 ne souffrent d'une moyenne de 0,995% ± 0,41 médias évaporation pendant la nuit. Il est donc variabilité négligeable du volume des médias au moment de l'analyse.
    2. Dans les colonnes 7 à 11, les lignes B à D, retirer suffisamment de médias à laisser 50 pi derrière, comme détaillé ci-dessus, et ajouter 50 ul de réactifs à une dilution 1:1.
    3. Dans les colonnes 7 à 11, les lignes E à G, laisser les cellules dans 100 ul de milieu et ajouter 100 ul de réactifs, de nouveau à une dilution 1:1. La société recommande à 100 pi de réactifs doivent être dilués 1:1 dans 100 ul de milieu.
      Remarque: Pourà économiser sur les coûts, il est possible de réduire ces recommandations à la fois en volume et en dilution. Cependant, avant de le faire, en sorte que cela ne réduit pas la linéarité et la sensibilité de l'essai.
    4. Une fois un volume spécifique et le facteur de dilution des réactifs sont jugées satisfaisantes, rester avec eux dans toutes les expériences ultérieures. Les critères de données satisfaisantes sont décrits dans la section Résultats.
    5. Réactifs reconstitués non utilisés peuvent être congelés à nouveau et utilisés à une date ultérieure à économiser sur les coûts. Selon le fabricant, des réactifs reconstitués peuvent être conservés à -20 ° C pendant 21 semaines, avec une perte d'activité ~ 3%.
  2. Placer la plaque sur un agitateur orbital pendant 2 min ou un agitateur oscillant pendant 10 min. Si une partie de la plaque est en cours d'analyse pour une mesure différente et il ne peut pas être ébranlée, agiter les médias avec une simple pipetage de haut en bas que dans les puits d'intérêt. Cependant, des bulles excessives générées au cours de cette étape d'interférer avec lumiNESCent sortie.
    1. 10 min après l'addition des réactifs, transférer 60 pi de contenu des puits dans des plaques à 96 puits blanches. valeurs de luminescence sont plus élevés en plaques blanches que dans les plaques claires ou noires, car ils reflètent la lumière vers le haut vers le détecteur.
      Remarque: Dans notre expérience, les cellules survivent mieux sur la faible évaporation, plaques Costar clairs que les autres plaques. Ces plaques spécifiques ne sont pas vendus avec des murs blancs. Ensuite, les plaques à parois opaques et clairs à fond sont plus chers que les plaques complètement claires. Si on transfère le liquide luminescent à plaques blanches, les plaques blanches peuvent être lavés et réutilisés, économiser sur le coût de l'utilisation de nouvelles plaques blanches pour chaque expérience. Transfert de liquide est donc l'option la moins chère sur le long terme.
    2. Pop les bulles d'air avant la lecture de la plaque avec une aiguille ou, de préférence, avec de l'air forcé à partir d'une ampoule de transfert de pipette en plastique. Lire la plaque sur un luminomètre avec un temps d'intégration de 1 s (la société de recommends 0,25-1 s temps d'intégration suffisante). Lire la plaque 10-12 minutes après l'addition de réactifs de dosage de l'ATP. Le moment est crucial pour la comparaison entre les différentes plaques, parce que le signal luminescent est transitoire avec un taux de décroissance rapide, comme le montre par Gilbert et ses collègues 26.
  3. Faire la moyenne des valeurs de luminescence à partir des trois ou six puits dans chaque groupe et tracé en fonction du nombre de cellules dans un diagramme de dispersion (voir figure 3). Première soustraire fond valeurs moyennes de luminescence des puits vides appropriées (puits 2B - 2G, puits 11B - 11D, 11E et puits - 11G) de chaque point de données correspondant. Il y aura trois groupes différents pour chaque densité de placage dans cette expérience initiale (figure 2A). Les niveaux d'ATP peuvent être corrélées de façon linéaire avec des densités de cellules dans une ou plusieurs de ces groupes. Procéder à la plus forte dilution des réactifs qui donne toujours des résultats satisfaisants pour économiser sur les coûts. Critères de résultats satisfaisants sont décrits in la section Résultats.
    Remarque: Avec les médias utilisés dans la présente étude, les valeurs de fond avec ce dosage ne sont pas élevés, et il est possible de sauter les puits vierges. Toutefois, le fabricant Promega signale les différences de luminescence avec différents milieux de culture. La présente étude utilise Hyclone fœtale Clone III, une version synthétique de sérum de veau fœtal pour les cellules N2a et sérum de veau pour les cultures corticales primaires. Selon le fabricant, le sérum de veau diminue les valeurs de luminescence mais ne diminue pas la sensibilité du dosage. Néanmoins, si cela est une préoccupation importante, diluer ATP réactifs de dosage dans du PBS à la place des médias au moment de l'analyse.
    1. Si les cellules semblent se développer de manière inégale dans les colonnes nuit, essayez de les doser dans les 6 h de placage. Cependant, gardez à l'esprit que la densité à l'heure habituelle de test (par exemple, 24 heures après le traitement) est la densité à laquelle la linéarité doit être atteint.

3. Infrared dosages

  1. Le matin après le placage, fixer les cellules dans la deuxième plaque à la température ambiante dans une hotte de laboratoire. Assurez-vous de porter des gants pour cette étape et disposer du fixateur comme un déchet chimique car le formaldéhyde est cancérogène. Ajouter 4% de formaldéhyde et de 4% de saccharose dans du tampon phosphate 0,1 M pour le support existant à une dilution de 1:01. Les médias peuvent aussi être lavés avec du PBS avant de fixer en pleine force fixateur. Soit technique fonctionne bien.
    1. Incuber dans un fixateur pendant 20 min, puis retirez le fixateur et laver 3x dans 200 pi de PBS.
  2. Conservez la plaque dans du PBS avec de l'azoture de sodium à 0,2% à 4 ° C si le test n'aura pas lieu le même jour. Sinon, procéder à l'essai et placer les cellules dans une solution de blocage pour minimiser la liaison non spécifique d'anticorps.
    1. Diluer le sérum Odyssey bloc 1h01 de poisson dans du PBS et ajouter 0,3% de Triton-X 100 comme perméabilisant cellulaire. Faites suffisamment de solution de blocage ainsi que Antibo primaire et secondairesolutions dy de sorte que 35 pi peuvent être déposés à la pipette dans chaque puits. Cependant, si beaucoup de bulles sont observées pendant le pipetage, faire> 50 pi pour chaque bien, sinon les bulles atteignent le bas dans les cellules et d'anticorps de blocs de liaison. Bulles de savon excessifs apparaissent comme une tache tache circulaire au milieu du puits. Essayez de régler le pipetage si cela se produit.
    2. Incuber dans cette solution de blocage pendant 30 à 60 min à température ambiante.
      Note: 5% d'albumine de sérum bovin ou du sérum normal à partir de la même espèce que l'anticorps secondaire peuvent également être utilisés en tant que solutions de blocage pour économiser sur le coût du bloc de sérum de poisson. Blocage des solutions peut affecter les performances de l'anticorps. Ainsi, le bloc optimale pour chaque anticorps est le mieux déterminée de manière empirique.
      Remarque: Certains chercheurs mettent In-Cell plaques occidentaux sur secoueurs pendant les incubations. Cependant, cela n'est pas nécessaire.
  3. Faites les anticorps primaires: 1:10.000 dilution pour l'anti-α-tubuline(Anticorps monoclonal de souris, tableau 1) et 1:2000 dilution pour l'anti-MAP2 (anticorps monoclonal de souris, tableau 1). Ces anticorps sont spécifiques aux protéines d'intérêt dans ces modèles cellulaires; spécificité est essentiel pour toute tache immunocytochimique.
    Remarque: MAP2 est un marqueur de neurones et est approprié pour des cultures de neurones / cellules gliales mixtes. Les cultures postnatales présentés ici contiennent également des cellules gliales (~ 25%), parce que les astrocytes apparaissent d'abord le jour embryonnaire 18, avec leurs numéros pic dans la période néonatale précoce 27,28. On ne peut pas faire la distinction entre les astrocytes et les neurones de l'ATP et DRAQ5 + Sapphire essais. Afin de mesurer les neurones et les astrocytes séparément, utiliser MAP2 simultanée et GFAP coloration dans les canaux nm 800 et 700, comme décrit par Mullett et collègues 4,29, en laissant de DRAQ5 + Sapphire. Toutefois, si toutes les cellules de la culture souhaitent être évalués, utiliser un marqueur pan-cellulaire tel que α-tubuline, β-actine, ou GAPDH.
    Remarque: Ces dilutions ont été optimisés pour l'N2a et cellules corticales primaires et peuvent ne pas généraliser à tous les modèles. Par conséquent, essayez au moins deux dilutions d'anticorps primaires, l'un sur la partie gauche de la plaque et l'autre sur la moitié droite (voir figure 2B). Sinon, essayez 3-4 dilutions d'anticorps primaires sur 3 puits chacune. Par exemple, la dilution recommandée sur la feuille d'insertion d'anticorps peut être flanqué par des modifications de deux ordres. En d'autres termes, si la dilution recommandée pour immunocytochimie est 1:500, 1:250 et aussi essayer de 1:1000 facteurs de dilution.
    1. Diluer anticorps 01:01 bloc Odyssée: PBS et ajouter 0,3% de Triton-X. Pour économiser sur le coût, essayer la préparation des anticorps dans la solution de blocage qui a été appliquée aux cellules à l'étape 3.2.1 en retirant de cette solution à la fin de l'incubation. Maintenir les cellules dans du PBS pendant cette, ils ne doivent pas se dessécher.
    2. Incuber des anticorps primaires soit 1-2 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. Pour faiblement brouver anticorps et de protéines qui ne sont pas abondantes, les incubations d'une nuit peuvent aider à augmenter le signal.
      Remarque: Laissez au moins 3 puits dans une solution de blocage pour soustraction de fond à chaque concentration d'anticorps secondaire (puits 2B-2D et 2E puits-2G à la figure 2B). Ne pas exposer ces puits à tout anticorps primaire que ce soit. Ils révèlent la mesure de la liaison non spécifique par l'anticorps secondaire, et sont utiles pour le calcul de rapports signal sur bruit. Si il est à craindre que les anticorps secondaires mèneront à des niveaux élevés de la liaison non spécifique, incluent également des puits de contrôle qui ne sont pas exposés à des anticorps primaire ou secondaire, mais reçoivent le même nombre de lavages. La différence entre ces puits et les puits "secondaire" ne révélera l'étendue de la liaison non spécifique causée par l'anticorps secondaire seul. Dans notre essai sur des cellules de souris N2a, l'intensité du signal avec un anticorps secondaire anti-souris seul était de 0,032 ± 0,557, un signal avec un anticorps anti-lapinanticorps secondaire seul était de 0,533 ± 0,041, le signal sans anticorps secondaire a été de 0,357 ± 0,003, et le signal avec des anticorps primaires et secondaires était 11,867 ± 0,911. Nous avons donc pas observé des niveaux élevés de liaison non spécifique, même en utilisant des anticorps secondaires anti-souris sur des cellules de souris. Il ya plusieurs fabricant des anticorps secondaires infrarouge, nous recommandons que l'achat de ceux qui sont très contre-adsorbées. A noter que la concentration en anticorps IgG secondaire peut varier en fonction de la source.
  4. Laver les anticorps primaires avec 3 lavages de 200 pi de PBS par puits, 10 min chacun. Les anticorps primaires peuvent être sauvegardés à 4 ° C pendant quelques semaines dans l'azoture de sodium à 0,2% et réutilisés jusqu'à de minuscules taches de débris deviennent apparents lorsque les solutions sont retenus à la lumière. Ceci est fait uniquement pour économiser sur les coûts. Si le coût n'est pas un problème, des anticorps frais pour chaque utilisation.
  5. Diluer l'anticorps secondaire par 1:1000 ou 1:2000 à 1:01 bloc Odyssée: PBS avec 0,3% Tritonne-X (Figure 2B). Ajouter une dilution de 1:1000 à la moitié supérieure de la plaque et 1:2000 à la moitié inférieure de la plaque. Ces concentrations pourraient être encore réduits à économiser sur les coûts, mais vérifier la linéarité avant de s'engager à ce.
    Note: Soyez sûr d'ajouter la solution appropriée d'anticorps secondaire dans les puits de soustraction de fond (colonne 2 de la figure 2B).
    1. Si une seconde protéine est dosée en place de DRAQ5 + saphir, les cellules de l'étiquette pour α-tubuline ou MAP2 avec 700 nm de chèvre anti-IgG de souris et de la seconde protéine dans le canal 800 nm avec des anticorps primaires provenant d'une espèce autre que la souris. Le canal de 800 nm a moins de fond que le canal 700 nm et devrait être réservé pour la protéine la plus critique d'intérêt.
    2. Incuber des anticorps secondaires pendant 1 heure à température ambiante dans un tiroir de la lumière.
  6. Laver Anticorps secondaires avec 3 lavages de 200 pi de PBS par puits, 10 min chacun.
  7. Faites les solutions DRAQ5 + Sapphire. Pour la moitié gauche de la plaque, diluer DRAQ5 1:10.000 (0,5 uM de concentration finale) et de saphir 1:1000 dans du PBS avec 0,3% de Triton-X (colonnes 3-6; Figure 2B). Pour la moitié droite de la plaque, diluer DRAQ5 1:20,000 (0,25 M) et Sapphire 1:2000 (colonnes 7-10; figure 2B).
    Remarque: DRAQ5 utilisé pour être vendu à un stock 1 mM au lieu d'un stock 5 mM. Certains rapports publiés précédemment utilisés donc 1:4000 ou 1:2000 dilutions de DRAQ5 8.
    1. Pour économiser sur le coût, si les deux plaques sont dosés simultanément, le même DRAQ5 + solutions de saphir peuvent être utilisés sur les deux plaques qui se suivent, il pipetage large de la première plaque et de l'ajouter à la seconde. Si les mêmes solutions seront utilisées deux fois de cette manière, les utiliser en moins d'une journée. Solutions DRAQ5 dilué + Sapphire ne peuvent pas être enregistrés à 4 ° C ou congelés pour une utilisation ultérieure.
    2. Incuber dans ces solutions pendant 30 min à température ambiante à l'abri from lumière. Si le temps est court et les solutions + Sapphire de DRAQ5 ne sera pas réutilisé sur d'autres plaques avec différentes secondaires, ajouter ces taches pour les solutions d'anticorps secondaires dans l'étape 3.5 et incuber pendant 1 heure.
      Remarque: Ne pas ajouter DRAQ5 + solution Sapphire pour les puits de soustraction de fond (colonne 2 de la figure 2B) que ces puits ne doivent pas être colorés dans le canal 700 nm.
  8. Laver les plaque 3x avec 200 ul de PBS par puits pendant 10 min chacun. Mettez de l'azoture de sodium à 0,2% dans le dernier lavage PBS si la plaque va être teinté avec d'autres anticorps secondaires visibles portée après l'imagerie infrarouge est complète.
  9. Balayez la plaque sur un imageur Odyssey. Commencez par balayer les plaques à l'intensité 5 et 169 mm de résolution. Soit «qualité moyenne» ou «faible réglages de qualité" sont suffisantes. La société ne communique pas les informations de filtre d'excitation / d'émission détaillées. Cependant, les filtres d'émission est d'environ 20 nm de large et sont centrées autour de sept20 et 820 nm, selon le fabricant.
    Note: Il est possible de numériser des plaques encore humide que les enquêteurs peuvent souhaiter continuer à les colorer avec d'autres marqueurs. Toutefois, la société indique dans son protocole en ligne que les plaques sèches entraînent moins de signal à étalement de puits à puits. Si vous analysez les deux humide et sec pour comparer les données, assurez-vous d'enlever toute la PBS du bien parce que les sels restants après évaporation peuvent conduire à fond haute fluorescence le long des bords.
    1. L'Odyssey Imager numériser jusqu'à et à travers le fond de la plaque. Plaques de différents fabricants peuvent exiger différents décalages de discussion parce que le fond des puits peut varier dans leur épaisseur et de la profondeur de la plaque. Essayez balayage à différents décalages de discussion et de voir où le ratio le plus élevé signal-bruit et la plus nette (plus au point) signal est atteint: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Essayez aussi de mesurer la profondeur du puits à partir de la partie inférieure d'une plaque avec une règle pour confirmer la findings sur l'Odyssée. Rappelons que la matière plastique dans le fond du puits peut ajouter de la hauteur supplémentaire pour les mesures à la règle. Les plaques Costar utilisées dans la présente étude exigent un décalage de 4,0 mm mise au point.
    2. Utilisez la fonction de l'Ouest In-Cell dans le logiciel pour placer la grille de la bonne taille sur l'image de la plaque et d'exporter les données dans Microsoft Excel. Examiner les "intégrés" intensité valeurs des mêmes puits à travers différents décalages de discussion pour trouver les valeurs de fluorescence les plus élevés. Le décalage de focalisation qui donne le ratio le plus élevé signal-bruit (signal puits immunocolorées contre "aucun contrôle négatif primaires" puits) est celui de choisir par la suite.
    3. Une fois compenser un foyer est décidée, numériser à nouveau par petits incréments. Par exemple, si le signal lumineux était de 3,5 et 4,0 mm, essayez de numériser à 3,6, 3,7, 3,8, et 3,9 mm et de voir s'il ya une amélioration dans la force du signal. Si le décalage de focalisation est erroné, l'intensité des signaux à travers les 12 colonnes sur un pl videmangé (quand toutes les colonnes doivent avoir signal égal) apparaît comme une courbe en forme de U à la place d'une ligne plate. Si cela continue d'être un problème avec des plaques en plastique, essayez plaques de verre à fond.
  10. Soustraire la moyenne des intensités intégrées dans le fond soustraction puits (figure 2B; puits 2B - 2D ou 2E puits - 2G) de chaque point de données correspondant dans les canaux 700 et 800 nm. Puis faire la moyenne des intensités de signal intégrés de chaque groupe de puits. Tracer les données sous forme de nuage de points contre la densité cellulaire (voir figure 3).
    1. Comparer les résultats des deux dilutions différentes d'anticorps primaires et secondaires ainsi que les résultats des deux dilutions différentes de DRAQ5 + saphir de s'installer sur une dilution de chacun des expériences ultérieures. Si la linéarité n'est pas atteint, essayez de numériser à une intensité différente. Rescan avec des intensités 3 et 7 au lieu de 5 et réanalyser les données. Si les données à améliorer un de ces intensités maisne sont toujours pas satisfaisants, réanalyser par incréments autour de cette intensité.
    2. Veillez à ne pas analyser les images où le logiciel montre des taches blanches dans les puits; ces taches signifient le signal saturé hors de la portée de l'imageur. Numérisez à une intensité plus faible si cela se produit.
    3. Si la linéarité n'est pas atteint, essayez aussi de fixer les cellules dans les 6 h de placage, car ils pourraient se développer ou de mourir de façon inégale dans les différentes colonnes nuit. Essayez également de différentes densités de placage, différentes intensités de numérisation, d'autres optimisations de facteurs réactifs de dilution, des plaques de verre à fond, DRAQ5 par elle-même comme une tache de noyau uniquement, ou différents anticorps autres que anti-α-tubuline ou anti-MAP2.

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Representative Results

Le facteur limitant la vitesse dans ces expériences est la coloration de l'infrarouge, comme le dosage de l'ATP est relativement courte en durée. Pour les tests infrarouges, nous prévoyons que huit plaques à 96 puits peuvent être colorés et analysés dans un jour par échelonnement deux lots de quatre assiettes maximum (voir la figure 1). Cette estimation suppose 20 min de fixation, 30 min de lavage, 30 min de blocage, 2 h primaire incubation d'anticorps puis 30 min de lavages, 1 heure d'incubation de l'anticorps secondaire suivie par 30 min de lavages, 30 min DRAQ5 + Sapphire suivie par 30 min de lavages, et 34 min de temps d'analyse pour 4 assiettes. Quinze minutes supplémentaires sont pris en compte dans la figure 1 pour les lavages afin de tenir compte de la pipette décalée de quatre assiettes individuelles. Temps pour l'analyse des données n'est pas inclus dans cette estimation. Si les mesures d'essai ATP auront lieu en parallèle pour chaque plaque infrarouge, douze plaques peuvent être analysés en une seule journée - six pour la tache infrarouges et six pour les niveaux d'ATP.

Critères de données satisfaisantes dans les analyses de régression (figure 3), tel que mentionné dans la section Protocole, notamment une corrélation significative entre la densité de placage et la force du signal (deux p queue ≤ 0,05). La taille des changements de luminescence ou un signal infrarouge doit également être en rapport avec les changements dans le nombre de cellules. Idéalement, les cellules 5k devraient avoir environ la moitié du taux d'ATP de 10k cellules luminescence ou, et 15k cellules doivent avoir des valeurs d'environ 50% supérieur à 10k cellules, etc. Cette proportionnalité reflète la sensibilité de l'essai et est distincte de la valeur ou du coefficient de détermination R 2. R 2 seules mesures à quel point la ligne de régression se rapproche des véritables points de données. Même si les données sont linéaires, les changements relatifs de l'intensité du signal peuvent ne pas être proportionnelle à la dimension des changements dans le nombre de cellules. Cela peut se produire avecpoule la droite de régression a une forte R 2, mais une pente faible, ce qui suggère que le test n'est pas très sensible. Ainsi, les critères de corrélation et de proportionnalité des données importantes doivent aussi être satisfaites. Enfin, les variations de l'intensité du signal autour de la densité de placage optimal doivent se situer dans la gamme dynamique de l'instrument et le dosage. La gamme dynamique est le rapport entre les valeurs les plus grandes et les plus petites possibles. L'imageur Odyssey offre une gamme dynamique de 4,5 log et le signal saturé apparaît comme une couleur blanc brillant à la place de l'image rouge ou verte habituelle afin d'alerter le chercheur que les résultats ne sont plus quantifiables. La gamme dynamique pendant le test lui-même est plus étroite en raison de problèmes tels que la densité maximale et minimale de placage pour n'importe quel type de cellule donné. Si une des plaques à l'augmentation des densités cellulaires, la courbe de saturation pour ces tests va révéler les densités de placage au-dessus duquel aucun autres différences peuvent être résolues, soit parce qu'ils sont hors degamme de l'imageur ou parce que les cellules ne survivent pas à l'éviction du jour au lendemain. De même, si une diminution de plaques densités cellulaires, on peut mesurer les densités cellulaires minimum en dessous de laquelle il n'y a pas d'autres changements dans le signal. La dynamique de l'analyse ne comprend que les densités de placage entre le minimum et le nombre maximum de cellules / puits qui peut être résolu. Nous n'avons pas mesuré la gamme dynamique complète de ces essais particuliers parce que nos cellules ne survivent pas bien à des densités au-delà de ceux qui sont signalés.

Après l'optimisation, nous tachons maintenant les cellules de neuroblastome de souris avec N2a anti-α-tubuline à une dilution de 1:10000, avec anti-IgG de souris à une dilution de 1:2000, et avec des solutions DRAQ5 + saphir et 1:2000 à 1:20000, respectivement. Nous utilisons également 25 pl des réactifs de dosage d'ATP dans 50 ul de médias. Les résultats dans ces conditions sont illustrés dans les figures 3A, B et C et ont été publiées before 8. La puissance du signal dans les trois essais a été significativement corrélée avec le nombre de cellules par puits. Bien que tous les trois essais ont été très linéaire, ils n'étaient pas d'équivalent dans la sensibilité. Par exemple, les cellules 5k par puits n'ont pas exactement la moitié du montant de la coloration infrarouge 10k cellules par puits. Contrairement aux dosages infrarouges, le dosage de l'ATP est plus sensible aux variations de densité de placage. En d'autres termes, la luminescence a chuté de près de la moitié de 10k à 5k et de 5k à 2.5k cellules par puits. Malgré ces résultats sur la plus haute sensibilité du test ATP, il est préférable d'effectuer les trois essais de viabilité pour obtenir une image plus large de la santé cellulaire.

Nous tachons maintenant cultures primaires de neurones de rat avec des anti-MAP2 à une dilution de 1:2000, avec des anticorps anti-IgG de souris à une dilution de 1:1000, et avec des solutions DRAQ5 + saphir à 1:10000 et 1:1000, respectivement, et l'utilisation 25 ul des réactifs de dosage d'ATP dans 50 ul de médias (Figures3D, E et F). L'intensité du signal dans le DRAQ5 + test Sapphire est le moins linéaire des trois essais parce qu'il y avait peu de différence entre 100k et 200k cellules par puits dans le canal 700 nm. Cependant, la force du signal à 700 nm était bien en proportion du nombre de cellules ci-dessous 100k cellules par puits et nous assiette toujours des cultures de neurones à 100k cellules par puits de toute façon. Néanmoins, nous avons également observé que la DRAQ5 + test Sapphire n'est pas aussi sensible aux traitements de toxine que les deux autres essais (voir ci-dessous). Contrairement à DRAQ5 + Sapphire, la force du signal était en meilleure proportion avec la densité de placage à la fois pour la MAP2 et essais ATP. Il convient de noter qu'un plus grand volume des réactifs de dosage de l'ATP peut améliorer les résultats à 200k cellules par puits. En d'autres termes, la sortie luminescent peut être porté à exactement 200% des valeurs à 100k cellules par puits, car il est plus réactif. Cependant, nous n'avons jamais plaquons cultures corticales à cette forte densité de placage pour experiments. Nous avons également constaté que les niveaux MAP2 et ATP sont sensibles à 20% des changements dans la densité de placage neuronale du néocortex, allant de 20k cellules par puits à 120k cellules par puits 22. Néanmoins, d'autres chercheurs doivent tester ces dosages dans leur propre laboratoire plutôt que d'utiliser des conditions optimales à partir de nos expériences, en raison de la variabilité inter-laboratoire dans un tissu et la manipulation des cellules.

Afin d'illustrer l'utilité de ces dosages suivants traitements avec des toxines, on montre les courbes de cellules traitées avec MG132 N2a, un inhibiteur du protéasome (figure 4) de dose-réponse. MG132 a été appliquée en présence ou en absence du précurseur de glutathion N-acétyl-cystéine. Ces données peuvent également être trouvés dans notre récente publication sur les effets protecteurs de la N-acétyl-cystéine 30. Les cellules ont été analysés 48 heures suivant traitements MG132. MG132 dose-dépendante a diminué de signal DRAQ5 + Sapphire (figures 4A, D) et le signal de α-tubuline ( de CI50 en l'absence ou en présence de N-acétyl-cystéine. L'équation utilisée était Y = 100 / (1 ​​+ 10 ^ ((logique 50-X) * versant))). La valeur IC 50 pour DRAQ5 + Sapphire était de 1,64 uM MG132 (logique 50 = 0,22 ± 0,03, R 2 = 0,9477, Colline pente = -1,26) et les niveaux de α-tubuline était de 1,96 uM MG132 (logique 50 = 0,29 ± 0,04, R 2 = 0,9296, la pente de Hill = -1,349). N-acétyl-cystéine décalée les courbes à droite, ce qui suggère que plus MG132 est nécessaire pour tuer les cellules en présence de ce composé protecteur. En présence de N-acétyl-cystéine, la valeur de CI50 pour DRAQ5 + saphir est de 4,64 uM de MG132 (logique 50 = 0,67 ± 0,05, R 2 = 0,8732, Colline pente = -1,06) et de α-tubuline était de 6,35 pM MG132 ( Logic 50 = 0,80 ± 0,04, R 2 = 0,8802, la pente de Hill = -10,382). Une étude de cellules N2a par Madère et ses collègues ont signalé une perte de viabilité environ 50% à 10 uM MG132, telle que mesurée par le test MTT 31. Fioriti rapporté une perte de viabilité de 4 heures à 60% après un traitement par 50 uM de MG132, à nouveau avec le test MTT 32. Enfin, Zhang et ses collègues ont rapporté une perte de viabilité de 60% ​​à 10 uM MG132, en utilisant les chiffres de noyaux Hoechst colorées 33. Ces valeurs IC50 sont plus élevés que les nôtres. Cependant, nous essai de viabilité de 48 heures après le début du traitement, contrairement à ces études antérieures.

Selon la cellule de test Titer Glo, les niveaux d'ATP ont été soulevées à de faibles concentrations de MG132 (figure 4C), qui démontre que les niveaux d'ATP ne sont pas nécessairement en proportion de titre de cellule lors d'un traitement. Les données de l'ATP sont néanmoins utiles en ce qu'ils montrent que la N-acétylcystéine protège également la fonction métabolique lorsque les cellules sont traitées avec N2a MG132. Ceci est démontré dans til décaler de la valeur CI 50 de MG132 avec la N-acétyl cystéine. La valeur IC 50 pour l'ATP était de 3,05 uM MG132 (logique 50 = 0,48 ± 0,07, R 2 = 0,8616, la pente de Hill = -1,0) avec le véhicule et 9,12 uM MG132 avec la N-acétyl-cystéine (logique 50 = 0,96 ± 0,04, R 2 = 0,9261, la pente de Hill = -1,0). Notez que les concentrations qui ont conduit à la hausse des ATP ont été exclus de cette analyse. Y compris toutes les valeurs dans l'analyse réduit le coefficient de détermination et augmenté les valeurs IC 50 de 4,03 uM MG132 (logique 50 = 0,61 ± 0,09, R 2 = 0,7224, Colline Pente = -1,4), en présence de véhicule et à 9,24 uM MG132 (logique 50 = 0,96 ± 0,07, R 2 = 0,6607, Colline Pente = -2,1) en présence de N-acétyl-cystéine (contrairement à la figure 4C).

Un deuxième exemple de ces trois essais est illustrée pour des cultures primaires de Figure 5. Le tissu a été microdisséquées de néocortex de rat et allocortex, dissocié, plaqué à 100k cellules par puits, et traitée en parallèle avec H 2 O 2. Nous avons testé l'hypothèse que ces deux régions du cerveau seraient diffèrent dans leur traitement du stress oxydatif comme ils sont différemment vulnérables aux maladies neurodégénératives 34-39. Certaines de ces données ont été publiées avant et les résultats sont discutés plus loin dans cette étude 22. Les valeurs IC50 pour DRAQ5 + Sapphire étaient 22,84 uM H 2 O 2 dans le néocortex (logique 50 = 1,36 ± 0,07, R 2 = 0,7552, Colline pente = -0,95) et 24,63 uM H 2 O 2 dans allocortex (logique 50 = 1,39 ± 0,03, R 2 = 0,9379, Colline pente = -1,74). Les valeurs IC50 pour MAP2 étaient 11,66 uM H 2 O 2 dans le néocortex (logique 50 = 1,07 ± 0,04, R 2 = 0,9332, Colline pente = -2,13) ​​et 29,76 uM H 2 O 2 dans allocortex (logique 50 = 1,47 ± 0,04, R 2 = 0,8934, Colline pente = -4,45). Les valeurs IC50 pour l'ATP étaient 23,82 uM H 2 O 2 dans le néocortex (logique 50 = 1,38 ± 0,03, R 2 = 0,8907, Colline pente = -2,56) et 44,5 uM H 2 O 2 dans allocortex (logique 50 = 1,65 ± 0,03 , R 2 = 0,9204, Colline pente = -2,71). Allocortex était significativement plus résistants au stress oxydatif de néocortex à des concentrations de H 2 O 2 en dessous de 50 uM, mais la DRAQ5 + dosage saphir est le moins sensible à illustrer cette différence. Cela peut refléter le fait que ce dernier test ne peut pas distinguer les cellules gliales de neurones, contrairement MAP2. Comme mentionné précédemment, nos cultures contiennent des cellules gliales, car ils sont récoltés à partir du cerveau postnatal 22. De manière surprenante, à des concentrations élevées de H 2 O 2 (75 pM) et au-dessus, lorsque l'ensemble MAP2 + astrocytes dans ces cultures plus résistantes à H 2 O 2 de MAP2 + neurones (non représenté), nous faisons l'hypothèse que les astrocytes néocortex sont moins vulnérables aux dommages oxydatifs que les astrocytes allocortical. Ce modèle peut être reflété dans le DRAQ5 + test Sapphire mais pas le dosage ATP parce que les astrocytes oxydation endommagés ne sont pas métaboliquement viable. Quelle que soit la raison de ces modèles frappants, ces données de culture primaire sont illustrés ici que de révéler que les tests ne sont pas toujours d'accord.

Enfin, dans le but d'illustrer la variabilité intra-plaque avec les trois dosages, nous avons tracé des points de données brutes par les deuxième et troisième puits à partir des courbes de réponse de dose mentionnés ci-dessus dans les figures 6A-C et I-6G >. De même, dans le but d'illustrer la variabilité interplaque, nous avons tracé la moyenne des points de données brutes (la moyenne des puits en trois exemplaires) de deux plaques des figures 6D-F et-L 6J. La puissance du signal dans les puits répétés et à travers expériences indépendantes exposé des corrélations significatives pour chaque mesure. Il y avait une certaine variabilité dans les valeurs brutes à travers expériences indépendantes dans des cultures primaires de neurones, peut-être parce que nous réutilisons anticorps ancien et solutions DRAQ5 + Sapphire et recongeler dosage de l'ATP utilisé Réactifs une couple de fois. Une autre raison de la variabilité interplaque ultérieure dans des cultures primaires peut être la qualité de la culture elle-même. Intervalles post-mortem variables et la manipulation des tissus dans les différents jours expérimentales peuvent contribuer à la variance.

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Figure 1. Illustration schématique des trois essais de viabilité (A) et le calendrier de tests infrarouges (B). Vivant sont les procédures recommandées pour les cellules N2a. Si les solutions DRAQ5 + saphir ne vont pas être réutilisé sur d'autres plaques qui sont colorées avec des anticorps secondaires différents, ils peuvent être combinés avec la solution d'anticorps secondaire anti-souris pour une finale 1 h d'incubation, la réduction de la procédure en une étape. Cliquer ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Format de la figure 2. Plaque de dosage de l'ATP (A) et les analyses infrarouges (B) qui sont décrits dans la section Procédures. Bien qu'unPlaque de 96 puits est illustrée, ces tests peuvent être adaptés à d'autres formats, tels que plaques de 384 puits, pour économiser sur les réactifs et les cellules. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3
Figure 3. Des régressions linéaires pour l'ensemble des trois essais de viabilité des cellules de neuroblastome de souris N2a (A, B, C) ​​ou primaires de rats post-nataux neurones du néocortex (D, E, F). L'intensité du signal pour chaque dosage est tracée en fonction de la densité de placage. Encarts montrent des images infrarouges représentatifs de la DRAQ5 + Sapphire (A, D), α-tubuline (B), ou MAP2 (E) tache. Valeurs d'intensité premières sont énumérés ci-dessous chaque image. Notez que les valeurs premières dansun puits individuel peut être différent de la moyenne des trois puits pour cette expérience et de la moyenne de 3-4 expériences indépendantes. Les images infrarouges originaux ont été pseudocolored rouge (700 nm) ou vert (800 nm). Chaque expérience a été réalisée dans des puits en triple et répétées 3 fois pour DRAQ5 + Sapphire dans les deux cellules et les neurones primaires N2a, 3x pour α-tubuline, 4x pour MAP2, 3x pour l'ATP dans les cellules N2a, et 4x pour l'ATP dans les neurones. Les données provenant des puits en triple ont été moyennées pour une valeur finale pour chacune des expériences 3-4. La moyenne et la SEM de ces valeurs finales 3-4 sont indiquées dans le graphique. On notera que les valeurs de DRAQ5 + Sapphire présentent de faibles écarts-types de telle sorte que les barres ne sont pas visibles au MEB. Le R 2 coefficient de détermination et deux valeurs de p queue évaluer l'importance de la corrélation sont également illustré pour chaque mesure. Les données ont été analysées dans GraphPad Prism (version 5.0). Reproduit de neurochimie internationale, 61, par Unnithun et al: "Sauvetage de l'un deux a frappé modèle à haut débit de la neurodégénérescence avec la N-acétyl-cystéine," p 356-368, avec la permission de Elsevier. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4
Figure 4. Protection des cellules contre la toxicité N2a MG132. N2a cellules ont été traitées avec les concentrations indiquées de la MG132 d'inhibiteur de protéasome, en présence ou en l'absence de l'antioxydant N-acétyl-cystéine (NAC, 3 mM). Les trois essais de viabilité ont été effectués 48 heures plus tard. Notez la hausse des taux d'ATP à de faibles concentrations de MG132 (C). Aucune augmentation parallèle de DRAQ5 + Sapphire coloration (A) or α-tubuline (B) était évident. Images infrarouges représentatifs de la DRAQ5 + Sapphire et les taches de α-tubuline ont été pseudocolored rouge et vert en D et E, respectivement. Chaque expérience a été réalisée dans des puits en triple et répétées pour DRAQ5 4x + saphir, 4x pour α-tubuline, et 3x pour l'ATP. Les données provenant des puits en triple ont été moyennées pour une valeur finale pour chacune des expériences 3-4. La moyenne et la SEM de ces 3-4 dernières valeurs sont affichés. * P ≤ 0,05 pour la comparaison de la N-acétyl cystéine par rapport à l'eau, suivant la correction de Bonferroni ANOVA à deux voies. Les données ont été analysées dans GraphPad Prism (version 5.0). Tiré de Neuroscience, 255, par Jiang et al: "N-acétyl-cystéine émousse proteotoxicity dans une protéine de choc manière dépendante de la chaleur», p 19-32, avec la permission de Elsevier. Clécher ici pour agrandir l'image.

Figure 5
Figure 5. Vulnérabilité différentielle des cultures néocortex et allocortical à la toxicité du peroxyde d'hydrogène. Microdissections de moteur primaire postnatale et le néocortex sensoriel et de allocortex entorhinal et piriforme ont été dissociées et étalées à 100k cellules par puits. Au jour 2, in vitro, les cellules ont été traitées avec les concentrations de H 2 O 2 indiquées. Les plaques ont été analysées 48 h plus tard. Notez que allocortex survit ces conditions mieux que le néocortex de culture et a un nombre de cellules plus élevées au départ. Chaque expérience a été réalisée dans des puits en triple et répétées pour DRAQ5 4x + saphir, 3x pour MAP2, et 6x pour l'ATP. Les données provenant des puits en triple ont été moyennéespour une valeur finale pour chacune des expériences 3-6. La moyenne et la SEM de ces 3-6 dernières valeurs sont affichés. * P ≤ 0,05 pour la comparaison du néo-allocortex contre, la correction de Bonferroni suivant ANOVA à deux voies. Les données ont été analysées dans GraphPad Prism (version 5.0). Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 6
Figure 6. Corrélations Intraplate et interplaques pour MG132 et H 2 O Les courbes de réponse de 2 doses dans les cellules N2a et les neurones corticaux. Toutes les expériences ont été effectuées dans chaque puits en triple. Les données brutes des deux autres puits dans chaque groupe ont été tracées en réplique 1 et 2 pour mesurer la reproductibilité dans les plaques (A, C pour les cellules N2a et G, H et I pour cortex). Les données provenant des mêmes groupes de deux expériences indépendantes (la moyenne des puits en trois exemplaires) ont été tracées en tant que plaque 1 et la plaque 2 pour mesurer la reproductibilité de l'autre côté des plaques (D, E, et F pour des cellules N2a et J, K, L pour le cortex). Le R 2 coefficient de détermination et deux valeurs de p queue évaluer l'importance de la corrélation sont également illustré pour chaque mesure. Les données ont été analysées dans GraphPad Prism (version 5.0). Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Discussion

Nous avons trouvé que la puissance du signal dans les trois essais de viabilité est linéaire et en corrélation avec la densité de placage. Cependant, tous les tests sont également sensibles à 2 fois ou 1,5 fois les changements dans la densité de placage. Pour les cellules N2a, les analyses infrarouges sont moins sensibles que le dosage de l'ATP, en particulier à des densités de plaquage inférieure. Bien que les analyses infrarouges sont moins sensibles que l'ATP, les DRAQ5 + Sapphire tests et les essais α-tubuline sont en bon accord en ce qu'ils révèlent l'impact très protecteur de N-acétyl-cystéine. Il y avait une perte sensible de la dose signal infrarouge avec les deux dosages et les trois courbes de viabilité ont été déplacé vers la droite avec la N-acétyl cystéine. Ce chevauchement n'est pas toujours observée pour tous les types de traitements de cellules N2a, comme les α-tubuline et ATP essais semblent être plus sensibles à des composés tels que le chlorure d'ammonium que l'DRAQ5 + test Sapphire (voir la figure 4 dans Unnithan et al. 8 ). Ainsi, la viabilité phenotypes ne sont pas toujours représentés de façon égale par les trois essais. Bien que le dosage de l'ATP était en meilleure proportion du nombre de cellules N2a plaqués que la α-tubuline et DRAQ5 + tests de Sapphire, l'hypothèse que la force du signal reflète le nombre de cellules n'a pas toujours rencontré après traitement par la toxine. Les niveaux d'ATP ont augmenté à des concentrations de toxines qui ne provoquent une hausse similaire du signal dans les analyses infrarouges. Ces données révèlent les changements métaboliques dans les cellules N2a compensatoires en réponse à l'inhibition du protéasome et sont utiles dans leur propre droit. La courbe dose-réponse ATP en forme de U est caractéristique du phénomène appelé hormèse. Hormesis est défini comme réactions biologiques favorables à des expositions de bas niveau à des toxines et d'autres facteurs de stress 40-42.

Pour les neurones, la DRAQ5 + Sapphire tache était moins sensible que le MAP2 et essais ATP à forte densité de placage. Cependant, la DRAQ5 + Sapphire, MAP2, et des essais ATP étaient bien en proportion de CEnombre de ll dans les neurones corticaux primaires égales ou inférieures à 100k cellules par puits. Nous plaquons neurones à 100k cellules par puits. Les neurones du cortex ne sont pas connus à reproduire, par conséquent, nous étions plus préoccupés par linéarité à 100k ou faible densité de placage. Le DRAQ5 + Sapphire dosage était moins sensible aux différences entre le néocortex et allocortex que soit MAP2 ou l'ATP à des concentrations inférieures à 50 uM de H 2 O 2. En outre, les niveaux d'ATP ne relèvent pas de façon aussi spectaculaire sur H 2 O 2 en tant que traitement de signal infrarouge dans les deux autres essais, ce qui suggère peut-être encore des augmentations compensatoires de la production d'ATP. Les écarts entre les trois essais dans les cellules N2a et neurones primaires peuvent refléter que les fonctions cellulaires peuvent changer avant que les structures anatomiques brutes sont affectés, et que les structures cellulaires, y compris les protéines du cytosquelette, peuvent être affectées à long avant que les cellules sont eux-mêmes perdu. Des données récentes sur multiplex essais de viabilité par Gilbert et ses collègues convaincantemontrent que différentes mesures de viabilité tels que Hoechst coloration nucléaire et les mesures ATP fournissent des informations sur les caractéristiques cellulaires spécifiques que partiellement et indirectement reflètent viabilité dans son ensemble 26. Nous recommandons donc d'effectuer tous les trois dosages simultanément et ne pas compter sur un seul test pour la viabilité du métabolisme de nombreuses publications font. Pour plus d'informations sur l'une de ces mesures, nous recommandons le comptage des cellules individuelles, puis d'évaluer l'expression des protéines du cytosquelette et les niveaux d'ATP en fonction du nombre de cellules.

Bien qu'il existe d'autres dosages de viabilité métabolique, tels que le MTT, l'avantage de l'analyse de l'ATP réside dans sa sensibilité et la plage dynamique. Le test au MTT peut surestimer le nombre de cellules viables en comparaison à des mesures d'ATP et présente une CI50 qui est deux fois plus élevée 43. En outre, Petty et ses collègues ont rapporté que le dosage de l'ATP pourraitdétecter la limite inférieure de 1563 cellules par puits, tandis que le test MTT ne pouvait pas détecter moins de 25k cellules / puits 12. Le rapport signal sur bruit (signal du puits avec des cellules vivantes en puits sans cellules) est à seulement 7 pour MTT mais 230 pour l'ATP 44. Un autre avantage de dosages d'ATP luminescents plus de MTT est que le temps d'incubation est beaucoup plus courte. En outre, le test MTT de Promega coûte 0,28 ¢ par puits alors que la cellule Titer Glo essai du même fabricant coûte 0,09 ¢ par puits à nos dilutions recommandées. Cependant, il ya des limites à tous les tests métaboliques; activité métabolique peut être désaccouplé de la survie, en particulier pendant la nécrose. Si c'est un problème, les essais dans le présent rapport peuvent être combinées avec des mesures de libération de lactate déshydrogénase pour déterminer la perte de l'intégrité de la membrane. Il ne s'agirait pas des plaques supplémentaires, comme des mesures de lactate déshydrogénase sont tout simplement fait dans le milieu extracellulaire.

Bien que nous présentions ces essais comme des alternatives aux comptages manuels sur le microscope, ce dernier peut être un moyen très sensibles et précises d'échantillonnage du nombre de cellules si elles sont menées correctement. En effet, nous nous attendons à ce que les chiffres de noyaux Hoechst colorées seraient plus sensibles aux petits changements dans le nombre de cellules N2a que la DRAQ5 + test Sapphire. Lorsque tous les tests échouent le test de linéarité, comptages manuels sont essentiels. Un bon exemple de ceci est notre modèle d'astrocytes primaires en culture, sur laquelle nous effectuons le manuel plus laborieuse compte 45. Cependant, les biais inhérents de comptages manuels doivent être pris en considération lors de l'interprétation des données de comptage de cellules, de même que les défauts inhérents de tests informatisés ne doivent pas être écartées. Un certain nombre de points forts et les faiblesses des analyses de viabilité sont donc décrits ci-dessous.

Tout d'abord, si les taches DAPI ou Hoechst sont employés, les noyaux réduites et résumés sont souvent désignés commeapoptotique 1. Toutefois, la taille des cellules et des noyaux de condensation se situent le long d'un continuum lisse. En revanche, la vie et la mort sont des phénomènes qui s'excluent mutuellement, binaires. Sauf deux groupes très distincts de cellules vivantes ou mourants sont observés, il semble préférable de compter toutes les cellules en dessous d'un diamètre nucléaire de seuil apoptotique avec le logiciel d'imagerie comme MetaMorph ou ImageJ plutôt que par les yeux. Bien sûr, le choix d'un diamètre de seuil est arbitraire parce que nous ne savons pas à quel moment une cascade apoptotique irréversible est lancé. En outre, par définition, même des cellules avec caspase 3 ne sont pas nécessairement en route vers la mort et devraient peut-être être considérés comme encore en vie au moment de la fixation 46. Nos tests infrarouges éviter ces préoccupations en traitant toutes les cellules qui sont attachés à la plaque au moment de la fixation que vivent encore. Seules les cellules qui ont flotté loin sont comptés comme morts. Cela place les cellules dans l'une des deux catégories distinctes et évite les pièges de l'utilisation d'un complex, fonction continue comme diamètre nucléaire.

Deuxièmement, les comptages manuels goûter typiquement une petite fraction de l'ensemble du bien. Cela peut conduire à un biais d'échantillonnage et, à l'occasion, des erreurs standards élevés de la moyenne. Avec nos essais de viabilité, l'ensemble de puits est échantillonnée pour l'ATP et à proximité de l'ensemble de puits est échantillonnée avec les analyses infrarouges. Ce modèle d'échantillonnage augmente la taille de l'échantillon et évite la décision parfois arbitraire où dans le puits pour prendre une photo de comptages manuels. Si les photos sont prises du centre du puits, il faut garder à l'esprit que cette région est l'endroit où le hors-laver la plupart des cellules se produit, conduisant à une surestimation potentiels de toxicité. En revanche, les essais infrarouges jettent une grille sur l'image de la plaque à 96 puits qui exclut uniquement les coins extrêmes des puits. Si on le souhaite, les angles des puits peut être inclus en augmentant le diamètre des cercles dans la grille.

Troisièmement, le photographe et le compteur de cellules devraient tous deux être aveuglés pendant les comptages manuels. Cependant, une fois les cellules sont traitées avec des toxines, ils supposent souvent des changements morphologiques qui sont tout à fait évident, même pour un œil non averti. Cela rend beaucoup plus difficile de rester impartial. Cécité n'est pas une exigence pour nos essais.

Quatrièmement, les comptages manuels sont longs et coûtent le chercheur principal plus de salaire. Les salaires sont un des coûts les plus élevés de la recherche. Le temps de balayage pour une plaque sur l'Odyssée est à seulement 8 min longtemps sur la "qualité moyenne" réglage et peut être réduit en outre le réglage "de faible qualité". Il convient de noter que l'Odyssée Imager est cher, même quand on achète une version de démonstration utilisé, mais il est un coût fixe un temps. D'autre part, il faut aussi investir dans les microscopes à épifluorescence relativement coûteux pour nombre de cellules manuelles de DAPI ou Hnoyaux oechst teinté. Malgré le coût initial, l'Odyssée Imager est une machine polyvalente qui mesure également immunoblots occidentaux d'une manière quantitative 47,48. Nous avons adapté utilisation de l'Odyssey à quantifications de immunocoloration dans les structures cérébrales macroscopiques telles que le rat ou le striatum de souris ou télencéphalique cortex. Cette approche a également été utilisée par d'autres 49. Une faiblesse de l'imageur Odyssey pour l'imagerie des tissus est que la plus haute résolution n'est que de 21 um. Par conséquent, il ne peut pas compter les cellules individuelles et n'est pas destiné à visualiser les détails anatomiques plus fine.

Enfin, les analyses infrarouges peuvent ne pas être aussi sensible aux petits changements dans le nombre de cellules que les comptages manuels. Les valeurs de CI50 peuvent donc pas être considérées comme représentant la concentration qui provoque une perte de précision le nombre de cellules de 50%, mais seulement comme étant la concentration qui provoque la perte de signal infrarouge de 50%. Cette mise en garde s'applique probablement àtous les tests de viabilité qui contournent le nombre de cellules individuelles par microscopie et de l'échantillon l'ensemble bien à la fois. L'imprécision associée à ces dosages peut être une fonction de l'hypertrophie, l'atrophie, ou d'autres changements dans l'apparence qui affectent l'intensité du signal. Par exemple, avec certaines toxines, α-tubuline immunoréactivité dans chaque cellule peut augmenter en fonction de la toxicité. Nous avons observé ce phénomène dans les cellules N2a traitées avec des concentrations très élevées de MG132 8. Si cela est préoccupante, d'autres protéines marqueurs du cytosquelette telles que β-actine ou GAPDH peuvent être utilisés. En outre, souligné cellules N2a ont tendance à former des processus bipolaires 8,50,51. Avec les changements dans la taille des cellules, la sortie de signal fluorescent par cellule diffère également entre les groupes de traitement. Nous recommandons que les cellules de la toxine traités seront examinés par microscopie standard haute résolution suivante immunocytochimie pour les mêmes marqueurs que ceux utilisés dans l'In-Cell occidentale. Si le cytoplasme change considérablement en taille sur le traitement, mais lanoyau n'a pas, nous vous recommandons d'utiliser la tache de DRAQ5 sans Sapphire seulement de quantifier les noyaux. Les études à venir avec différents colorants et avec d'autres protéines du cytosquelette abondantes ou autres sont garantis pour surmonter ces obstacles.

Nous concluons que toutes les analyses souffrent de réserves et ont soulevé des préoccupations au sujet de la sensibilité, linéarité, l'erreur d'échantillonnage, les rapports signal sur bruit, partialité ou de subjectivité humaine, le temps et le coût. En outre, toutes les analyses reposent sur des hypothèses qui ne sont pas toujours respectées. Par conséquent, nous recommandons qu'au moins deux tests utilisés pour décrire les effets du traitement sur les cultures de cellules, qui mesure la santé métabolique et qui s'appuie sur la viabilité anatomique. De cette manière, on peut déterminer de façon plus efficace que les composés thérapeutiques de protéger à la fois la structure et la fonction.

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Disclosures

Aucun des auteurs n'a de conflit de divulguer.

Acknowledgments

Nous reconnaissons Juliann Jaumotte à l'idée d'économiser sur les volumes de réactifs dans le dosage de l'ATP. Nous sommes profondément reconnaissants pour le soutien administratif superbe de Marie Caruso, Deb Willson, et Jackie Farrer et à l'École de pharmacie de Mylan pour fournir un soutien financier pour ces études. Merci aussi aux maladies Hunkele redouté Fondation et le Parkinson et les troubles du mouvement de la Fondation pour le soutien financier des études primaires de neurones.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Titer Glo Promega G7572 Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin Thermo-Shandon 9990244 Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block LI-COR 927-40003 This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 21568 We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic Fisher S468 One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic Fisher S373 See above
Sodium Azide (250x) Ricca Chemical Company 7144.8-16 Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin Sigma-Aldrich T5168 This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2 Sigma-Aldrich M9942 This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG LI-COR 926-32210 Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5 Biostatus DR50200 This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire LI-COR 928-40022
Luminometer PerkinElmer VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager LI-COR 9201-01
Shaker/Mixer Research Products International 248555

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Posimo, J. M., Unnithan, A. S.,… More

Posimo, J. M., Unnithan, A. S., Gleixner, A. M., Choi, H. J., Jiang, Y., Pulugulla, S. H., Leak, R. K. Viability Assays for Cells in Culture. J. Vis. Exp. (83), e50645, doi:10.3791/50645 (2014).

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