Los ensayos de viabilidad de las células en cultivo

Summary

Los compuestos terapéuticos a menudo se examinaron por primera vez in vitro con los ensayos de viabilidad. Recuentos de células ciegos por un observador humano puede ser muy sensible a pequeños cambios en el número de células, pero no evaluar la función. Ensayos de viabilidad computarizados, tal como se describe aquí, pueden evaluar tanto la estructura y función de una manera objetiva.

Abstract

Manual de células en un microscopio son un medio sensible de la evaluación de la viabilidad celular, pero consumen mucho tiempo y por lo tanto caro. Ensayos de viabilidad computarizados son costosos en términos de equipo, pero puede ser más rápido y más objetivo que el recuento de células manuales. El presente informe se describe el uso de tres de estos ensayos de viabilidad. Dos de estos ensayos son de infrarrojos y uno es luminiscente. Ambos ensayos infrarrojos se basan en un Imager 16 bits Odyssey. Un ensayo de infrarrojos utiliza la mancha de DRAQ5 para los núcleos combinados con la mancha de zafiro de citosol y se visualiza en el canal de 700 nm. El otro ensayo de infrarrojos, una en la celda Occidental, utiliza anticuerpos contra las proteínas del citoesqueleto (proteína asociada α-tubulina o microtúbulos 2) y los etiqueta en el canal 800 nm. El tercer ensayo de viabilidad es un ensayo luminiscente comúnmente utilizado para el ATP, pero usamos un cuarto del volumen recomendado para ahorrar en coste. Estas mediciones son lineales y se correlacionan con el número de CElls plateado, pero varían en sensibilidad. Todos los tres ensayos de eludir microscopía de tiempo y muestrean todo el pozo, reduciendo así el error de muestreo. Por último, todos los ensayos fácilmente se puede completar en un día del final del experimento, lo que permite un mayor número de experimentos a realizar en plazos cortos. Sin embargo, todos ellos se basan en el supuesto de que el número de células permanecen en proporción a la intensidad de la señal después de los tratamientos, la suposición de que a veces no se cumple, especialmente para ATP celular. Además, si las células aumentan o disminuyen de tamaño después del tratamiento, esto podría afectar la fuerza de la señal sin afectar el número de células. Llegamos a la conclusión de que todos los ensayos de viabilidad, incluidos los recuentos manuales, adolecen de una serie de advertencias, pero que los ensayos de viabilidad computarizados son bien vale la pena la inversión inicial. El uso de los tres ensayos en conjunto da una visión completa de la estructura y la función celular.

Introduction

El ensayo de viabilidad más común en las ciencias biológicas implica el recuento de células. Esto se evidencia por un análisis de los mejores (los más recientes) 200 publicaciones que aparecieron en PubMed con cualquiera de las palabras clave "in vitro" o "cultura" en 29/04/2013 y 30/04/2013. De estas publicaciones, el 23,5% utilizan ensayos de recuento de células, incluyendo recuento de número de células manuales, el número de células automatizado cuenta con software de imágenes, y Trypan exclusión de azul. El ensayo Live / Dead se utilizó en el 1% de estas publicaciones. El número de publicaciones utilizando el MTT (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) de ensayo para la viabilidad metabólica era 11%. Esta revisión de la literatura también muestra que el número de publicaciones que utilizan ensayos tales como MTT junto con ensayos de recuento de células fue sólo del 3,5%. A pesar de la tendencia a usar un ensayo de viabilidad por sí mismo, la evaluación de la función celular en combinación con el número de células parece ser la mejor elección para la evaluación de i celularntegridad. Los recuentos de células por sí mismas no son suficientes debido a que las células restantes pueden no ser funcional o sano a pesar de que están presentes en el pocillo ^1,2. A la inversa, las medidas funcionales tales como ATP pueden aumentar o disminuir en ausencia de cambios paralelos en el número de células. El desacoplamiento de las lecturas metabólicas del número de células sugiere que los ensayos de la ATP y MTT nunca debe ser usado como el único ensayo de viabilidad. En el presente informe, tres ensayos de viabilidad control que analicen tanto las estructuras celulares y la función metabólica se describen, por una visión más completa de la integridad celular que cualquier ensayo por sí solo puede permitirse.

Dos de nuestros ensayos requieren una cámara infrarroja que mide la fluorescencia en los 700 y 800 nm canales. El ruido es baja en las longitudes de onda infrarrojas, lo que lleva al aumento de la relación señal-ruido ^3. El generador de imágenes Odyssey que usamos tiene un rango dinámico 4,5 log y una profundidad de bits de 16, Translatinga 2 ¹⁶ o 65.536 tonos de infrarrojos. Esto se puede contrastar con imágenes en color de 8 bits, que sólo ofrece 2 ⁸ o 256 tonos de color para cada longitud de onda. Por lo tanto, de formación de imágenes de 16 bits tiene una resolución más fina. Cabe señalar que las imágenes infrarrojas originales son a menudo pseudocoloreada verde (800 nm) y roja (700 nm) en los informes publicados para la presentación. Cámaras Odyssey son de uso común tanto para Western Blot e In-Cell Westerns ^4-7. Dentro de la célula del Oeste en las células fijadas con formaldehído utilizan anticuerpos primarios contra cualquier proteína de interés y etiquetarlos a su vez con anticuerpos secundarios fluorescentes infrarrojos. Esta técnica es conocida por ser particularmente útil para los puntos finales de fosforilación ^6. En nuestra en la celda del Oeste, que tiñe las células fijadas para las proteínas del citoesqueleto α-tubulina o microtúbulos neuronales proteína asociada 2 (MAP2) en el canal de 800 nm. Estas proteínas son lo suficientemente abundantes para producir alta relación señal-ruido. También tiñe nuestros platos en el 700canal nm para núcleos con la mancha de DRAQ5 y para el citoplasma con la mancha de zafiro. Tanto las proteínas del citoesqueleto y las DRAQ5 + manchas Sapphire por lo tanto reflejan las estructuras celulares.

El tercer ensayo de viabilidad mide la función metabólica y se llama "célula Titulación Glo." En este ensayo basado en la luciferasa, los valores de luminiscencia están en proporción directa a los niveles de ATP. Ensayos de ATP se utilizan comúnmente para cuantificar las células viables ^8-12. Sin embargo, incluyendo la palabra "título" en el nombre del ensayo es algo de un nombre inapropiado porque la producción de ATP por célula puede cambiar como una función de los tratamientos de toxina y es, por tanto, no siempre en proporción al número de células ^8. Los niveles de ATP también pueden verse afectados por los ritmos circadianos ¹³ y por la división celular y la diferenciación celular ^{14 15.} Sin embargo, el ensayo de ATP se muestra aquí es simple de realizar y útil porque ATP es una medida robusta de metabólicaviabilidad ^16-21, si no del teléfono celular número en sí. Utilizando este ensayo para complementar el infrarrojo en la celda del Oeste, por lo tanto se obtiene un panorama más completo de la integridad celular de un ensayo de cualquier solo.

Protocol

Un diagrama esquemático de los protocolos se ilustra en la Figura 1.

1. Celular Plating

Células de la placa en placas de 96 pocillos a diferentes densidades de chapado (Figura 2). Para comprobaciones de linealidad en la línea celular de neuroblastoma N2a, placa 2.5k, 5k, 10k, 15k y células por pocillo en 3 o 6 pocillos / grupo. Para comprobaciones de linealidad en las neuronas corticales primarias de rata, placa de 25k, 50k, 100k y 200k células por pocillo en 3 o 6 pocillos / grupo. Si las líneas celulares o células primarias de interés se ven saludables a diferentes densidades de placas, la placa en los alrededores de la densidad celular óptima para ese tipo de células.

Nota: En el presente estudio, las células N2a se sembraron en 100 l medios de comunicación y las neuronas corticales primarias en 200 l medio en placas que están diseñadas para baja evaporación. Para obtener información detallada sobre la manipulación de células, medios, sueros, antibióticos y tratamientos de toxina, consulte Unnithan et al. para N2a celLS ⁸ y Posimo et al. para las culturas de la corteza primaria ^22.

1. 1. Repita el forro en una segunda placa de 96 pocillos. Una de las placas se sometió a ensayo para el ATP (Figura 2A) y el otro con los ensayos de infrarrojos (Figura 2B). No se puede usar la misma placa para la ATP y los ensayos de infrarrojos, porque las células deben ser lisadas abierto para mediciones de ATP intracelulares.
   2. Asegúrese de placa, al menos, 3 pozos adicionales para la sustracción de fondo en los ensayos de infrarrojos en la densidad de placas óptima (columna 2, Figura 2B).
2. Añadir medio sin células o, más económicamente, agua estéril a los pocillos exteriores en las filas A y H, y en las columnas 1 y 12. Evite confiar en los datos de los pozos a lo largo de los bordes, ya que la viabilidad es a menudo más bajos que aquí los efectos de la evaporación de los medios y los gradientes de temperatura. Tales problemas con microplacas son comúnmente llamados efectos de borde ^23,24. No mantenga estos pozos vacíosporque entonces las filas B y G y las columnas 2 y 11 sufren el efecto de borde.
   Los efectos de borde pueden ser reducidos mediante la incubación de una placa recién sembrada a temperatura ambiente en condiciones ambientales antes de la transferencia en el incubador de _CO2 ^24. Además, un estudio reciente realizado por Carralot describe un método de corrección matemática para microplacas utilizando una columna de control único ^23. Oliver y sus colegas utilizaron una micropipeta aire placa incubadora forzada especialmente diseñado para reducir los gradientes térmicos ^25. Si el efecto de borde es de gran preocupación, cámaras de estabilidad de microplacas (por ejemplo, BT & C Incorporated) se pueden comprar para crear un microambiente homogéneo con alta humedad e incluso los gradientes de temperatura.
3. Si se necesitan más pozos que se muestra en la Figura 1 porque diluciones de reactivos adicionales o más densidades de placas se pondrá a prueba, utilice los pozos de última generación para la sustracción de fondo.
4. Espere toda la noche para la fijaciónde células y ensayo de la mañana siguiente, como se describe a continuación.

2. Ensayo luminiscente ATP

1. Siga las recomendaciones de la célula Titulación Glo del fabricante para la reconstitución del sustrato con tampón y para tiempos de incubación.
   1. Retire 50 o 150 l de medios de los 100 o 200 l de medio de siembra, respectivamente. Algo menos de 50 l permanecerán detrás en el pozo. Añadir 25 l de los reactivos (sustratos además de amortiguamiento) a las columnas 2-6 (Figura 2A) en una dilución de 1:02.
      Nota: Las diferentes volúmenes de los medios de comunicación dejaron atrás después de la eliminación podría diluir o concentrar los reactivos de ensayo ATP diferencialmente a través de pozos. Tenga cuidado de asegurarse de que el nivel de líquido en todas las puntas de pipeta multicanal es equivalente. Mida el líquido restante en algunos pozos a través de la placa con una pipeta inmediatamente antes de la adición de los reactivos de ensayo de ATP para asegurar la exactitud. Si existe una alta variabilidad de las tasas diferenciales de evapor mediosación través de la superficie de la placa, eliminar todos los viejos medios de comunicación y añadir el mismo volumen de medio fresco o solución salina tamponada de fosfato (PBS) a todos los pocillos inmediatamente antes de la adición de reactivos de ensayo de ATP. Si las placas sufren de niveles variables de evaporación, trate de cambiar a los bajos placas de evaporación de Costar Corning. En los últimos placas, los 60 pozos interiores mostrados en la Figura 2 sólo sufren de un promedio de 0,995% ± 0.41 medios de evaporación durante la noche. No es por lo tanto la variabilidad insignificante en volumen de los medios en el momento de ensayo.
   2. En las columnas 7 a 11, las filas B a D, eliminar suficientes medios para salir de 50 l atrás, como se detalla más arriba, y añadir 50 l de reactivos en una dilución de 1:01.
   3. En las columnas 7 a través de 11, filas E a G, dejar las células en 100 l de los medios de comunicación y añadir 100 l de reactivos, de nuevo en una dilución 1:01. La compañía recomienda que 100 l de los reactivos deben ser diluidos 1:01 en 100 l de medios de comunicación.
      Nota: Con el finpara ahorrar en costos, es posible cortar estas recomendaciones, tanto en volumen como en la dilución. Sin embargo, antes de hacer esto, asegúrese de que no reduce la linealidad y sensibilidad del ensayo.
   4. Una vez que un volumen específico y factor de dilución de los reactivos se encuentran para ser satisfactorio, seguir con ellos en todos los experimentos posteriores. Los criterios de datos satisfactorios se describen en la sección Resultados.
   5. Reactivos reconstituidos no utilizados se pueden volver a congelarse y utilizarse en el futuro para ahorrar en costes. Según el fabricante, los reactivos reconstituidos se pueden almacenar a -20 ° C durante 21 semanas, con la pérdida de ~ 3% de la actividad.
2. Coloque la placa en un agitador orbital durante 2 min o un agitador oscilante durante 10 min. Si una parte de la placa se está ensayando para una medición diferente y no puede ser sacudida, agitar los medios de comunicación con una simple pipeta hacia arriba y hacia abajo sólo en los pozos de interés. Sin embargo, las burbujas excesivos generados durante este paso va a interferir con lumisalida NESCent.
   1. 10 min después de la adición de los reactivos, transferir 60 l de los contenidos del pocillo en placas de 96 pocillos blancas. Valores de luminiscencia son más altos en las placas blancas que en las placas transparentes o negros porque reflejan la luz hacia arriba, hacia el detector.
      Nota: En nuestra experiencia, las células sobreviven mejor en la baja evaporación, placas Costar claras que otras placas. Estas placas específicas que no se venden con paredes blancas. En segundo lugar, las placas-opacos de paredes y fondo transparente son más caros que las placas completamente claras. Si se transfiere el líquido luminiscente para placas blancas, las placas de color blanco se pueden lavar y volver a utilizar, el ahorro en el costo de la utilización de las nuevas placas blancas para cada experimento. Transferencia de líquido es, pues, la opción más barata en el largo plazo.
   2. Pop las burbujas de aire antes de leer la placa con una aguja o, preferentemente, con aire forzado de un bulbo de pipeta de transferencia de plástico. Leer la placa en un luminómetro con un tiempo de integración de 1 segundo (el recomme empresands 0,25-1 seg tiempo de integración suficiente). Leer la placa 10-12 min después de la adición de reactivos de ensayo de ATP. El momento es crítico para la comparación a través de diferentes placas, debido a que la señal luminiscente es transitoria con una tasa de decaimiento rápido, como se muestra por Gilbert y sus colegas ^26.
3. La media de los valores luminiscentes de los 3 o 6 pocillos en cada grupo y la trama como una función del número de células en un diagrama de dispersión (véase la Figura 3). En primer lugar restar fondo promedio valores de luminiscencia de los pozos vacíos apropiados (pozos 2B - 2G, pozos 11B - 11D, 11E y pozos - 11G) de cada punto de datos correspondiente. Habrá tres grupos diferentes para cada densidad de placas en este experimento (Figura 2A) inicial. Los niveles de ATP pueden ser correlacionados linealmente con densidades de células en uno o todos de estos grupos. Proceda con la mayor dilución de los reactivos que todavía da resultados satisfactorios para ahorrar en costes. Criterios para resultados satisfactorios se describen in la sección Resultados.
   Nota: Con los medios utilizados en el presente estudio, los valores de fondo con este ensayo no son altos y es posible saltarse los pocillos de blanco. Sin embargo, el fabricante Promega reporta diferencias en luminiscencia con diferentes medios de cultivo. El presente estudio utiliza Hyclone Fetal Clone III, una versión sintética de suero fetal bovino para las células N2a y suero de ternera bovina para cultivos corticales primarias. Según el fabricante, de suero de ternera disminuye los valores de luminiscencia, pero no disminuye la sensibilidad del ensayo. Sin embargo, si esto es de preocupación significativa, diluir ATP reactivos de ensayo en PBS en lugar de los medios de comunicación en el momento de ensayo.
   1. Si las células parecen crecer de manera desigual entre las columnas durante la noche, trate de someter a ensayo dentro de las 6 horas de la siembra. Sin embargo, tenga en cuenta que la densidad en el horario habitual de ensayo (por ejemplo, 24 horas después del tratamiento) es la densidad con la que se debe lograr la linealidad.

3. Infrared Ensayos

1. La mañana después de la siembra, fijar las células en la segunda placa a temperatura ambiente en una campana de humos. Asegúrese de usar guantes para este paso y desechar el fijador como residuos químicos porque el formaldehído es un carcinógeno. Añadir 4% de formaldehído y 4% de sacarosa en tampón de fosfato 0,1 M a los medios de comunicación existentes en una dilución 1:01. Los medios de comunicación también se puede lavar con PBS antes de fijar en fijador de fuerza completa. De cualquier técnica funciona bien.
   1. Incubar en fijador durante 20 minutos y luego retirar el fijador y lavar 3 veces en 200 l de PBS.
2. Guarde la placa en PBS con 0,2% de azida de sodio a 4 ° C si el análisis no se llevará a cabo en el mismo día. De lo contrario, continúe con el ensayo y colocar las células en solución de bloqueo para minimizar la unión no específica de los anticuerpos.
   1. Diluir el suero de peces Odyssey bloque de 1:01 en PBS y añadir 0,3% de Triton X-100 como un permeabilizador de células. Haga solución de bloqueo suficiente, así como Antibo primaria y secundariasoluciones dy de manera que 35 l pueden ser pipetearon en cada pocillo. Sin embargo, si se observa una gran cantidad de burbujas durante el pipeteado, hacer> 50 l de cada bien, de lo contrario las burbujas alcanzan hacia abajo en las células y los anticuerpos de bloque de unión. Burbujas de jabón excesivas aparecerá como una mancha circular sin teñir en el centro del pozo. Trate de ajustar la pipeta si esto ocurre.
   2. Incubar en esta solución de bloqueo durante 30-60 minutos a temperatura ambiente.
      Nota: 5% de albúmina de suero bovino o sueros normales de la misma especie como el anticuerpo secundario también se pueden utilizar como el bloqueo de soluciones para ahorrar en coste de el bloque de suero de peces. El bloqueo de las soluciones puede afectar al rendimiento del anticuerpo. Por lo tanto, el bloque óptimo para cada anticuerpo se determina mejor empíricamente.
      Nota: Algunos investigadores colocan dentro de la celda platos occidentales en la coctelera durante las incubaciones. Sin embargo, esto no es necesario.
3. Realice los anticuerpos primarios: 1:10000 dilución de anti-α-tubulina(Monoclonal de ratón, Tabla 1) y 1:2000 dilución de anti-MAP2 (monoclonal de ratón, Tabla 1). Estos anticuerpos son específicos para las proteínas de interés en estos modelos celulares; especificidad es esencial para cualquier mancha inmunocitoquímica.
   Nota: MAP2 es un marcador para las neuronas y es apropiado para cultivos neuronales / gliales mixtos. Las culturas postnatales muestran aquí también contienen algo de la glía (~ 25%), ya que los astrocitos aparecen por primera vez en el día embrionario 18, con sus números de alcanzar un máximo en el período neonatal precoz ^27,28. Uno no puede distinguir entre astrocitos y neuronas en el ATP y ensayos DRAQ5 + Sapphire. Con el fin de medir las neuronas y astrocitos por separado, utilizar MAP2 simultánea y la tinción de GFAP en los 800 y 700 nm canales, como se describe por Mullett y colegas ^4,29, dejando fuera de DRAQ5 + zafiro. Sin embargo, si todas las células en el cultivo desean ser evaluado, utilizar un marcador pan-celular tal como α-tubulina, β-actina, o GAPDH.
   Nota: Estas diluciones se han optimizado para el N2a y células corticales primarias y no pueden generalizar a todos los modelos. Por lo tanto, trate al menos dos diluciones de anticuerpos primarios, uno en la mitad izquierda de la placa y el otro en la mitad derecha (ver Figura 2B). Como alternativa, pruebe 3-4 diluciones de anticuerpos primarios en 3 pocillos cada una. Por ejemplo, la dilución recomendada en la hoja de inserción anticuerpo puede ir acompañada de cambios de dos veces. En otras palabras, si la dilución recomendada para inmunocitoquímica es 1:500, 1:250 y también tratar los factores de dilución 1:1.000.
   1. Diluir anticuerpos en 1:01 bloque Odisea: PBS y añadir 0,3% Triton-X. Para ahorrar en coste, trate de hacer los anticuerpos en la solución de bloqueo que se aplicó a las células en la etapa 3.2.1 mediante la eliminación de esta solución al final de la incubación. Mantener las células en PBS mientras se hace esto, sino que no deben secarse.
   2. Incubar en anticuerpos primarios o bien 1-2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Para débilmente bncontrar anticuerpos y proteínas que no son abundantes, las incubaciones durante la noche puede ayudar a aumentar la señal.
      Nota: Deje por lo menos 3 pozos en solución de bloqueo durante la sustracción de fondo a cada concentración de anticuerpo secundario (pozos 2B-2D y 2E-2G pozos en la Figura 2B). No exponga estos pozos a cualquier anticuerpo primario que sea. Revelan la medida de la unión no específica por el anticuerpo secundario y son útiles para los cálculos de relaciones de señal a ruido. Si hay una preocupación de que los anticuerpos secundarios dará lugar a altos niveles de unión no específica, también incluir pocillos de control que no están expuestas al anticuerpo, ya sea primaria o secundaria, pero reciben el mismo número de lavados. La diferencia entre estos pozos y los pozos "secundaria" sólo revelará el grado de unión no específica causada por el anticuerpo secundario solo. En nuestra prueba en las células N2a de ratón, intensidad de la señal con anti-ratón anticuerpo secundario solo fue 0,557 ± 0,032, señal con anti-conejoanticuerpo secundario solo fue 0,533 ± 0,041, la señal sin anticuerpo secundario fue 0,357 ± 0,003, y la señal con anticuerpos primarios y secundarios fue de 11.867 ± 0.911. Nosotros por lo tanto no hemos observado altos niveles de unión no específica incluso cuando se utilizan anti-ratón secundaria de anticuerpos en células de ratón. Hay varios fabricantes de para anticuerpos secundarios infrarrojos; se recomienda comprar sólo los muy cruzada adsorbidos. Tenga en cuenta que la concentración de anticuerpos IgG secundarios puede variar dependiendo de la fuente.
4. Lavar anticuerpos primarios con 3 lavados de 200 l de PBS por pocillo, 10 min cada uno. Los anticuerpos primarios se pueden guardar a 4 ° C durante unas pocas semanas en el 0,2% de azida de sodio y se reutilizan hasta pequeñas motas de escombros se hacen evidentes cuando las soluciones se mantienen hasta la luz. Esto sólo se hace para ahorrar en el precio. Si el costo no es un problema, crear anticuerpos frescos para cada uso.
5. Diluir el anticuerpo secundario por 1:1.000 o 1:2.000 en 1:01 bloque Odisea: PBS con 0,3% Triton-X (Figura 2B). Añadir la dilución 1:1.000 a la mitad superior de la placa y 1:2.000 a la media parte inferior de la placa. Estas concentraciones podrían reducirse aún más para ahorrar en costes, sino comprobar la linealidad antes de comprometerse con esto.
   Nota: Asegúrese de añadir la solución de anticuerpo secundario apropiado para el fondo de pozos de sustracción (columna 2 en la Figura 2B).
   1. Si una segunda proteína se sometió a ensayo en lugar de DRAQ5 + zafiro, células de la etiqueta para α-tubulina o MAP2 con 700 nm de cabra anti-IgG de ratón y la segunda proteína en el canal de 800 nm con anticuerpos primarios de una especie distinta de ratón. El canal 800 nm tiene menos fondo que el canal de 700 nm y se debe reservar para la proteína más crítica de interés.
   2. Incubar en secundaria de anticuerpos durante 1 hora a temperatura ambiente en un cajón de la luz.
6. Lavar la zona secundaria de anticuerpos con 3 lavados de 200 l de PBS por pocillo, 10 min cada uno.
7. Haga las soluciones DRAQ5 + Sapphire. Para la mitad izquierda de la placa, diluir DRAQ5 1:10.000 (0,5 M de concentración final) y zafiro 1:1000 en PBS con 0,3% de Triton-X (columnas 3 - 6; Figura 2B). Para la mitad derecha de la placa, diluir DRAQ5 1:20.000 (0,25 M) y Sapphire 1:2000 (columnas 7-10, Figura 2B).
   Nota: DRAQ5 utilizado para ser vendidos en una madre 1 mM en lugar de una madre 5 mM. Por ello, algunos informes publicados previamente utilizados 1:4.000 o 1:2.000 diluciones de DRAQ5 ^8.
   1. Para ahorrar en costes, si dos placas están siendo analizadas simultáneamente, el mismo soluciones Sapphire DRAQ5 + se puede utilizar en dos placas en secuencia, pipetear si fuera la primera placa y de añadir a la segunda. Si se utilizan las mismas soluciones de dos veces de esta manera, utilizar ellos hasta dentro de un día. Soluciones DRAQ5 diluido + Sapphire no se pueden guardar a 4 º C o se congelan para su uso posterior.
   2. Incubar en estas soluciones durante 30 min a temperatura ambiente lejos fluz rom. Si el tiempo es corto y los DRAQ5 + soluciones Sapphire no se volverá a utilizar en otras placas con diferentes secundarias, añadir estas manchas a las soluciones de anticuerpos secundarios en el paso 3.5 e incubar durante 1 hora.
      Nota: No agregue DRAQ5 + solución Sapphire para el fondo de pozos de sustracción (columna 2 en la Figura 2B), ya que estos pozos no deben teñirse en el canal 700 nm.
8. Lavar las placas 3 veces con 200 l de PBS por pocillo durante 10 min cada uno. Poner 0,2% de azida de sodio en el lavado final de PBS si la placa va a ser teñido con otros anticuerpos secundarios visibles alcance después de la formación de imágenes de infrarrojos es completa.
9. Busque en la placa en un Imager Odyssey. Comience explorando las placas a una intensidad 5 y la resolución 169 mm. Cualquiera de "calidad media" o ajustes de "baja calidad" son suficientes. La compañía no divulga información detallada filtro de excitación / emisión. Sin embargo, los filtros de emisión son de aproximadamente 20 nm de ancho y se centran alrededor de 720 y 820 nm, de acuerdo con el fabricante.
   Nota: Es posible escanear placas mientras aún esté húmedo ya que los investigadores pueden desear seguir manchar con otros marcadores. Sin embargo, la compañía sugiere en su protocolo en línea que las placas secas como resultado una menor propagación de la señal del pozo a pozo. Si escanea ambos húmedo y luego secar al comparar los datos, asegúrese de retirar todo el PBS del pozo porque sales restantes después de la evaporación pueden conducir a alta fluorescencia de fondo a lo largo de los bordes.
   1. La Odisea de imágenes escanea hasta y a través de la parte inferior de la placa. Las placas de diferentes fabricantes pueden exigir diferentes compensaciones de enfoque debido a que el fondo de los pozos puede variar en su grosor y la profundidad en la placa. Intente escanear a diferentes desplazamientos de enfoque y ver donde la relación más alta de señal a ruido y nitidez posibles (la mayoría en el foco) se consigue la señal: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Pruebe también para medir la profundidad del pozo desde el fondo de una placa con una regla para confirmar la Findings en la Odisea. Recuerde que el plástico en el fondo del pozo puede añadir altura adicional para las mediciones con regla. Las placas Costar utilizados en el presente estudio exigen un desplazamiento de 4,0 mm de enfoque.
   2. Utilice la función de Western en la celda en el software para colocar la rejilla del tamaño adecuado a la imagen de la placa y exportar los datos a Microsoft Excel. Examine los valores de intensidad "integrados" de los mismos pozos en los diferentes desplazamientos de enfoque para encontrar los valores más altos de fluorescencia. El desplazamiento de foco que produce la mejor relación señal-ruido (señal en los pozos inmunoteñidas frente a "no hay primarias de control negativo" pozos) es la mejor elección en adelante.
   3. Una vez compensado uno de los focos que se decida, escanear de nuevo en incrementos más pequeños. Por ejemplo, si la señal más brillante fue en el 3,5 y 4,0 mm, intente escanear a 3.6, 3.7, 3.8 y 3.9 mm y ver si hay alguna mejora adicional en la intensidad de la señal. Si el desplazamiento de enfoque es erróneo, intensidad de la señal a través de las 12 columnas en una pl vacíocomió (cuando todas las columnas deben tener igual señal) aparecerá como una curva en lugar de una línea plana en forma de U. Si esto sigue siendo un problema con las placas de plástico, trate placas con fondo de cristal.
10. Reste el promedio de las intensidades integradas en el fondo resta pozos (Figura 2B; pozos 2B - 2D o pozos 2E - 2G) de cada punto de datos correspondiente en los 700 y 800 nm canales. Entonces promediar las intensidades de señal integrados para cada grupo de pozos. Grafica los datos en forma de diagrama de dispersión frente a la densidad celular (ver Figura 3).
    1. Comparar los resultados de las dos diluciones diferentes de anticuerpos primarios y secundarios y los resultados de las dos diluciones diferentes de DRAQ5 + Sapphire para resolver en una dilución de cada uno para los experimentos posteriores. Si no se logra la linealidad, intente escanear con una intensidad diferente. Vuelva a explorar con intensidades 3 y 7 en lugar de 5 y volver a analizar los datos. Si los datos de mejorar en una de esas intensidades perotodavía no es satisfactoria, vuelva a explorar en incrementos de alrededor de esa intensidad.
    2. Tenga cuidado de no analizar imágenes en las que el software muestra manchas blancas en los pozos; esos puntos significan señal saturada fuera del rango de la cámara termográfica. Escanear a una intensidad menor si esto ocurre.
    3. Si no se logra la linealidad, trate también de fijar las células dentro de las 6 horas de la siembra, ya que podría crecer o morir de forma desigual en las diferentes columnas durante la noche. Prueba también diferentes densidades de placas, diferentes intensidades de escaneo, optimizaciones de los factores de dilución de reactivos, placas con fondo de cristal, DRAQ5 por sí mismo como una mancha-núcleo único, o diferentes anticuerpos distintos de anti-α-tubulina o anti-MAP2.

Representative Results

El factor limitante de la velocidad en estos experimentos es la tinción de infrarrojos, como el ensayo de ATP es relativamente de breve duración. Para los ensayos de infrarrojos, anticipamos que ocho placas de 96 pocillos se pueden teñir y escanean el plazo de un día a la asombrosa cifra de dos lotes de cuatro platos cada una (ver Figura 1). Esta estimación asume 20 min de la fijación, de 30 minutos de lavado, 30 min de bloqueo, 2 horas de incubación del anticuerpo primario seguido de 30 min de los lavados, a 1 h de incubación del anticuerpo secundario seguido por 30 min de lavados, 30 min DRAQ5 + Sapphire seguido por 30 min de lavados, y 34 min de tiempo de exploración de 4 platos. Quince minutos adicionales se tienen en cuenta en la Figura 1 para el lavado con el fin de tener en cuenta el pipeteado escalonada de cuatro placas individuales. Tiempo para el análisis de datos no se incluye en esta estimación. Si se producen las mediciones del ensayo de ATP en paralelo para cada plato de infrarrojos, doce placas se pueden ensayar en un día - seis para la mancha de infrarrojoss y seis para los niveles de ATP.

Criterios para los datos satisfactorios en los análisis de regresión (Figura 3), como se mencionó en la sección Protocolo, incluyen una correlación significativa entre la densidad de placas y la fuerza de la señal (dos colas p ≤ 0.05). El tamaño de los cambios de luminiscencia o señal de infrarrojos también debe estar en proporción a los cambios en el número de células. Idealmente, las células 5k deben tener aproximadamente la mitad de la luminiscencia, o los niveles de ATP de las células de 10k, y 15k células deben tener aproximadamente un 50% mayores valores de 10k células, etc. Esta proporcionalidad refleja la sensibilidad del ensayo y es distinto del valor de R ² o coeficiente de determinación. R ² sólo mide qué tan bien la línea de regresión se aproxima a los puntos de datos reales. Incluso si los datos son lineales, los cambios relativos en la intensidad de la señal puede no estar en proporción con el tamaño de los cambios en el número de células. Esto puede suceder Wuando la línea de regresión tiene un alto R ^2, pero una pendiente baja, lo que sugiere que el ensayo no es muy sensible. Por lo tanto, los criterios de correlación y proporcionalidad de los datos significativos tanto deben ser satisfechas. Finalmente, los cambios en la intensidad de la señal alrededor de la densidad óptima de chapado deben caer dentro del rango dinámico del instrumento y el ensayo. El rango dinámico es la relación entre las más grandes y más pequeños valores posibles. El generador de imágenes Odyssey tiene un rango dinámico 4,5 log y la señal saturada se muestra como un color blanco brillante en lugar de la imagen de color rojo o verde habitual con el fin de alertar al investigador que los resultados ya no son cuantificables. El rango dinámico durante el propio ensayo es más estrecho debido a problemas tales como la máxima y mínima densidad de placas para cualquier tipo de célula. Si uno los platos en el aumento de las densidades de células, la curva de saturación para estos ensayos se ponen de manifiesto las densidades de recubrimiento por encima del cual no hay más diferencias se pueden resolver, ya sea porque están fuera degama de la impresora de imágenes o porque las células no sobreviven la aglomeración durante la noche. Del mismo modo, si uno placas disminuir las densidades de células, se pueden medir las densidades celulares mínimos por debajo de los cuales no hay más cambios en la señal. El rango dinámico del ensayo sólo incluye las densidades de galvanoplastia entre el mínimo y el máximo número de células / pocillo que se puede resolver. No hemos medido todo el rango dinámico para estos ensayos particulares porque nuestras células no sobreviven bien en densidades más allá de las que se informó.

Después de la optimización, que ahora teñir las células de neuroblastoma de ratón N2a con anti-α-tubulina a una dilución 1:10.000, con anti-IgG de ratón a una dilución 1:2000, y con soluciones de DRAQ5 + Sapphire en 1:20.000 y 1:2.000, respectivamente. También utilizamos 25 l de los reactivos de ensayo de ATP en 50 l de medios. Los resultados en estas condiciones se ilustran en las figuras 3A, B, y C, y se han publicado se acabene ^8. Intensidad de la señal en los tres ensayos se correlacionó significativamente con el número de células por pocillo. Aunque todos los tres ensayos fueron altamente lineal, que no fueron equivalentes en sensibilidad. Por ejemplo, las células 5k por pocillo no tienen exactamente la mitad de la cantidad de tinción de infrarrojos como 10k células por pocillo. En contraste con los ensayos de infrarrojos, el ensayo de ATP fue más sensible a los cambios de densidad de placas. En otras palabras, la luminiscencia se redujo en aproximadamente la mitad de 10k a 5k y de 5k a 2.5k células por pocillo. A pesar de estos hallazgos en la mayor sensibilidad del ensayo de ATP, lo mejor es llevar a cabo los tres ensayos para la viabilidad de obtener una imagen más amplia de la salud celular.

Ahora tiñe cultivos neuronales primarios de rata con anticuerpos anti-MAP2 a una dilución 1:2.000, con IgG anti-ratón a una dilución 1:1000, y con soluciones de DRAQ5 + Sapphire en 1:10.000 y 1:1.000, respectivamente, y utilizamos 25 l de los reactivos de ensayo de ATP en 50 medios mu l (Figuras3D, E, y F). Intensidad de la señal en el DRAQ5 + ensayo de Sapphire fue la menos lineal de los tres ensayos porque había poca diferencia entre 100k y 200k células por pocillo en el canal 700 nm. Sin embargo, la intensidad de la señal a 700 nm fue bien en proporción al número de células por debajo de 100k células por pocillo y siempre platear cultivos neuronales a 100 mil células por bien de todos modos. Sin embargo, también hemos observado que la DRAQ5 + ensayo de zafiro no es tan sensible a los tratamientos de toxina como los otros dos ensayos (ver más abajo). En contraste con DRAQ5 + Sapphire, intensidad de la señal estaba en mejor proporción con densidades de placas, tanto para el MAP2 y ensayos de ATP. Cabe señalar que un mayor volumen de los reactivos de ensayo de ATP puede mejorar los resultados en 200k células por pocillo. En otras palabras, la salida luminiscente puede ser elevado a exactamente 200% de los valores en 100k células por pocillo porque hay más reactivo. Sin embargo, nunca placa cortical culturas en que la alta densidad de placas para un experiments. También hemos encontrado que los niveles de ATP y MAP2 son sensibles a 20% cambios en neocortical densidad de placas neuronal, que van desde 20k células por pocillo a 120K células por pocillo ^22. Sin embargo, otros investigadores deben probar estos ensayos en su propio laboratorio en lugar de utilizar las condiciones óptimas de nuestros experimentos a causa de la variabilidad inter-laboratorio en la manipulación de tejidos y células.

Con el fin de ilustrar la utilidad de estos ensayos siguientes tratamientos con toxinas, nos muestran curvas de dosis-respuesta de las células N2a tratadas con MG132, un inhibidor del proteasoma (Figura 4). MG132 se aplicó en la presencia o ausencia del precursor del glutatión N-acetil cisteína. Estos datos también se pueden encontrar en nuestra publicación reciente sobre los efectos protectores de N-acetil cisteína ^30. Las células se analizaron 48 horas después de los tratamientos MG132. MG132 disminuyó dependiente de la dosis de la señal de DRAQ5 + zafiro (Figuras 4A, D) y la señal de α-tubulina ( IC50 en ausencia o en presencia de N-acetil cisteína. La ecuación utilizada fue y = 100 / (1 ​​+ 10 ^ ((lógica _50-X) * Hillslope))). El valor de CI ₅₀ para DRAQ5 + zafiro era 1,64 M MG132 (lógica ₅₀ = 0,22 ± 0,03, ^R2 = 0,9477, pendiente de Hill = -1,26) y para los niveles de α-tubulina fue 1,96 M MG132 (lógica ₅₀ = 0,29 ± 0,04, R ² = 0.9296, Colina pendiente = -1,349). N-acetil cisteína desplaza las curvas a la derecha, lo que sugiere que más MG132 se requiere para matar las células en presencia de este compuesto protector. En presencia de N-acetil cisteína, el valor _IC50 para DRAQ5 + Sapphire era 4,64 M MG132 (lógica ₅₀ = 0,67 ± 0,05, R ² = 0,8732, Colina pendiente = -1,06) y de α-tubulina era 6,35 M MG132 ( Lógica ₅₀ = 0,80 ± 0,04, R ² = 0,8802, Colina pendiente = -10.382). Un estudio de las células N2a por Madeira y colegas informó de la pérdida de aproximadamente el 50% de la viabilidad a 10 M MG132, tal como se mide por el ensayo MTT ^31. Fioriti informó de la pérdida de 60% ​​de HR viabilidad 4 después del tratamiento con 50 mM MG132, de nuevo con el ensayo MTT ^32. Finalmente, Zhang y sus colegas informaron de la pérdida del 60% de viabilidad a las 10 M MG132, con cargos de núcleos teñidos con Hoechst ^33. Estos valores de _IC50 son más altos que los nuestros. Sin embargo, nos ensayo para la viabilidad 48 horas después de la iniciación del tratamiento, a diferencia de estos estudios previos.

De acuerdo con el ensayo de valoración de la célula Glo, los niveles de ATP se plantearon a bajas concentraciones de MG132 (Figura 4C), lo que demuestra que los niveles de ATP no son necesariamente en proporción a título celular tras el tratamiento. Los datos de ATP son sin embargo útiles ya que ilustran que la cisteína N-acetil también protege la función metabólica cuando las células N2a son tratadas con MG132. Esto se evidencia en tl cambio en el valor _IC50 de MG132 con N-acetilcisteína. El valor _IC50 para el ATP es 3,05 M MG132 (lógica ₅₀ = 0,48 ± 0,07, R ² = 0,8616, Colina pendiente = -1,0) con vehículo y 9,12 M MG132 con N-acetil cisteína (lógica ₅₀ = 0,96 ± 0,04, R ² = 0,9261, Colina pendiente = -1.0). Tenga en cuenta que las concentraciones que dieron lugar a aumentos de ATP fueron excluidos de este análisis. Incluyendo todos los valores en el análisis rebajado el coeficiente de determinación y el aumento de los valores de CI ₅₀ a 4,03 M MG132 (lógica ₅₀ = 0,61 ± 0,09, R ² = 0,7224, Colina Pendiente = -1,4), en presencia de vehículo ya 9,24 M MG132 (lógica ₅₀ = 0,96 ± 0,07, R ² = 0,6607, Colina Pendiente = -2,1), en presencia de N-acetil cisteína (contraste con la figura 4C).

Un segundo ejemplo de estos tres ensayos se ilustra para los cultivos primarios en Figure 5. El tejido se microdissected del neocortex de rata y allocortex, disociado, chapada a 100 mil células por pocillo, y se trata en paralelo con H ₂ O _2. Pusimos a prueba la hipótesis de que estas dos regiones del cerebro se diferencian en su manejo de estrés oxidativo, ya que son diferencialmente vulnerables a las enfermedades neurodegenerativas ^34-39. Algunos de estos datos han sido publicados antes y los resultados se analiza en este estudio ^22. Los valores IC ₅₀ para DRAQ5 + Sapphire fueron 22,84 M H ₂ O ₂ en la neocorteza (la lógica ₅₀ = 1,36 ± 0,07, R ² = 0,7552, Colina pendiente = -0,95) y 24,63 M H ₂ O ₂ en allocortex (lógica ₅₀ = 1,39 ± 0,03, R ² = 0,9379, Colina pendiente = -1,74). Los valores IC ₅₀ para MAP2 fueron 11,66 M H ₂ O ₂ en la neocorteza (la lógica ₅₀ = 1,07 ± 0,04, R ² = 0,9332, Colina pendiente = -2,13) ​​y 29,76 mM H ₂ O ₂ en allocortex (lógica ₅₀ = 1,47 ± 0,04, R ² = 0,8934, Colina pendiente = -4,45). Los valores IC ₅₀ para ATP fueron 23,82 M H ₂ O ₂ en la neocorteza (la lógica ₅₀ = 1,38 ± 0,03, R ² = 0,8907, Colina pendiente = -2,56) y 44,5 M de H ₂ O ₂ en allocortex (lógica ₅₀ = 1,65 ± 0,03 , R ² = 0,9204, Colina pendiente = -2,71). Allocortex fue significativamente más resistentes al estrés oxidativo que neocórtex en concentraciones de H ₂ O ₂ por debajo de 50 micras, pero el DRAQ5 + ensayo de zafiro era la menos sensible en la ilustración de esta diferencia. Esto puede reflejar que el último ensayo no puede distinguir la glía de las neuronas, a diferencia de MAP2. Como se mencionó anteriormente, nuestras culturas contienen algo de la glía, ya que se cosechan a partir de cerebro postnatal ^22. Sorprendentemente, a altas concentraciones de H ₂ O ₂ (75 M y más arriba), cuando todo MAP2 + astrocitos en estos cultivos sean más resistentes a H ₂ O ₂ de MAP2 ⁺ neuronas (no se muestra), que postula que los astrocitos neocorticales son menos vulnerables al daño oxidativo que los astrocitos allocortical. Este patrón puede ser reflejada en el DRAQ5 + ensayo de zafiro pero no el ensayo de ATP debido a que los astrocitos oxidativamente dañadas no son metabólicamente viables. Cualquiera que sea la razón de estos patrones llamativos, estos datos de cultivo primario se ilustran aquí sólo para revelar que los ensayos no siempre están de acuerdo.

Por último, con el fin de ilustrar la variabilidad intraplaca con todos los tres ensayos, que trazan los puntos de datos en bruto de los segundos y terceros Wells partir de las curvas de respuesta a dosis antes mencionados en las figuras 6A-C y 6G-I >. Del mismo modo, con el fin de ilustrar la variabilidad Interplate, que trazan la media de puntos de datos en bruto (la media de los pocillos por triplicado) a partir de dos placas en las Figuras 6D-F y 6J-L. Intensidad de la señal en pocillos de réplica y en experimentos independientes mostró correlaciones significativas para todas las medidas. Hubo cierta variabilidad en los valores de primas a través de experimentos independientes en cultivos primarios de neuronas, tal vez porque reutilizamos anticuerpo antiguo y soluciones DRAQ5 + zafiro y volver a congelar ensayo de ATP sin usar reactivos de un par de veces. Otra razón de la mayor variabilidad interplacas en cultivos primarios puede ser la calidad de la propia cultura. Las diferentes intervalos postmortem y la manipulación de tejidos en diferentes días experimentales pueden contribuir a la varianza.

jpg "/>
Figura 1. Ilustración esquemática de los tres ensayos de viabilidad (A) y línea de tiempo para los ensayos de infrarrojos (B). Se muestran los procedimientos recomendados para las células N2a. Si las soluciones DRAQ5 + Sapphire no van a volver a utilizar en otras placas que están manchadas con diferentes anticuerpos secundarios, se pueden combinar con la solución de anticuerpo secundario anti-ratón para una final de 1 h de incubación, lo que reduce el procedimiento en un paso. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. Formato de placa de ensayo de ATP (A) y los ensayos de infrarrojos (B) que se describen en la sección de Procedimientos. Aunque unPlaca de 96 pocillos se ilustra, estos ensayos se pueden adaptar a otros formatos, tales como placas de 384 pocillos, para ahorrar en reactivos y células. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Regresiones lineales para todos los tres ensayos de viabilidad en células de neuroblastoma de ratón N2a (A, B, C) ​​o de rata neuronas neocorticales postnatales primarias (D, E, F). Intensidad de la señal para cada ensayo se representa gráficamente como una función de densidad de placas. El recuadro muestra imágenes infrarrojas representativos de la DRAQ5 + Sapphire (A, D), α-tubulina (B), o MAPA 2 (E) tinción. Valores de intensidad primas se enumeran debajo de cada imagen. Tenga en cuenta que los valores de primas enun pozo individual puede ser diferente de la media de 3 pocillos para ese experimento y de la media de 3-4 experimentos independientes. Las imágenes infrarrojas originales fueron pseudocoloreada rojo (700 nm) o verde (800 nm). Cada experimento se realizó en pocillos por triplicado y se repitió 3x para DRAQ5 + zafiro tanto en las células N2a y neuronas primarias, 3x para α-tubulina, 4x para MAP2, 3x para el ATP en las células N2a, y 4x para el ATP en las neuronas. Los datos de los pocillos por triplicado se promediaron para un valor final para cada uno de 3-4 experimentos. La media y la SEM de estos valores 3-4 final se muestra en el gráfico. Tenga en cuenta que los valores DRAQ5 + Sapphire presentan desviaciones estándar bajo de modo que SEM bares no son visibles. El coeficiente de determinación R ² y dos valores p cola evaluar la importancia de la correlación también se ilustran para cada medida. Se analizaron los datos en GraphPad Prism (Versión 5.0). Reproducido de Neuroquímica Internacional, de 61 años, por Unnithuna y otros: "Rescate de un modelo de dos hit de alto rendimiento de la neurodegeneración con N-acetilcisteína," p 356-368, con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4. Protección de las células N2a contra la toxicidad MG132. Células N2a fueron tratados con concentraciones indicadas de inhibidor del proteasoma MG132 en la presencia o ausencia del antioxidante N-acetil cisteína (NAC; 3 mM). Los tres ensayos de viabilidad se realizaron 48 horas después. Tenga en cuenta el aumento de los niveles de ATP a bajas concentraciones de MG132 (C). No hay un aumento paralelo en la tinción DRAQ5 + Sapphire (A) oR α-tubulina (B) era evidente. Imágenes infrarrojas representativas del DRAQ5 + Sapphire y manchas-α-tubulina se pseudocoloreada rojo y verde en D y E, respectivamente. Cada experimento se realizó en pocillos por triplicado y se repitió 4x para DRAQ5 + zafiro, 4x para α-tubulina, y 3x para el ATP. Los datos de los pocillos por triplicado se promediaron para un valor final para cada uno de 3-4 experimentos. Se muestra la media y SEM de estos valores finales 3-4. * P ≤ 0,05 para la comparación de N-acetil cisteína comparación con el agua, la corrección de Bonferroni después de dos vías ANOVA. Se analizaron los datos en GraphPad Prism (Versión 5.0). Tomado de la Neurociencia, 255, por Jiang et al: "N-acetil cisteína embota proteotoxicity en un choque de manera dependiente de la proteína de calor", p 19-32, con permiso de Elsevier. Clamer aquí para ver la imagen más grande.

Figura 5. Vulnerabilidad diferencial de las culturas neocortical y allocortical a la toxicidad del peróxido de hidrógeno. Microdisecciones de postnatal motora primaria y la neocorteza sensorial y de allocortex entorrinal y piriforme se disocian y se sembraron en 100 mil células por pocillo. En el día 2 in vitro, las células se trataron con las concentraciones indicadas de H ₂ O _2. Las placas se sometieron a ensayo 48 horas más tarde. Tenga en cuenta que allocortex sobrevive estas condiciones de cultivo mejor que neocórtex y tiene el número de células más altos en la línea base. Cada experimento se realizó en pocillos por triplicado y se repitió 4x para DRAQ5 + zafiro, 3x para MAP2, y 6x para el ATP. Se promediaron los datos de los pocillos por triplicadopor un valor final para cada uno de 3-6 experimentos. Se muestra la media y SEM de estos valores finales 3-6. * P ≤ 0,05 para la comparación de los neo-contra allocortex, corrección de Bonferroni después de dos vías ANOVA. Se analizaron los datos en GraphPad Prism (Versión 5.0). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 6. Correlaciones Intraplate y interplaca para MG132 y H ₂ O ₂ curvas de respuesta a la dosis en células N2a y neuronas corticales. Todos los experimentos individuales se llevaron a cabo en pocillos por triplicado. Los datos en bruto de los segundos dos pozos dentro de cada grupo se representaron como repeticiones 1 y 2 para medir la reproducibilidad dentro de las placas (A, C para las células N2a y G, H e I de la corteza). Datos de los mismos grupos en dos experimentos independientes (la media de los pocillos por triplicado) se representaron gráficamente como la placa 1 y la placa 2 para medir la reproducibilidad través de las placas (D, E, y F para células N2a y J, K, L para la corteza). El coeficiente de determinación R ² y dos valores p cola evaluar la importancia de la correlación también se ilustran para cada medida. Se analizaron los datos en GraphPad Prism (Versión 5.0). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Discussion

Hemos encontrado que la intensidad de la señal en los tres ensayos de viabilidad es lineal y se correlacionó con densidad de placas. Sin embargo, no todos los ensayos son igualmente sensibles a 2 veces o cambios 1.5 veces en la densidad de placas. Para las células N2a, los ensayos de infrarrojos son menos sensibles que el ensayo de ATP, particularmente a densidades más bajas de chapado. Aunque los ensayos de infrarrojos son menos sensibles que los ATP, los ensayos DRAQ5 + Zafiro y los ensayos de α-tubulina están en buen acuerdo en que revelan el impacto altamente protector de N-acetil cisteína. No hubo pérdida de dosis-sensible de la señal de infrarrojos con ambos ensayos y las tres curvas de viabilidad se desplaza a la derecha con N-acetilcisteína. Esta superposición no siempre se observa para todos los tipos de tratamientos de células N2a, como los ensayos de α-tubulina y ATP parecen ser más sensibles a los compuestos tales como cloruro de amonio de la DRAQ5 + ensayo de zafiro (véase la Figura 4 en Unnithan et al. ⁸ ). Por lo tanto, phenotyp viabilidades no siempre están representados por igual en los tres ensayos. Aunque el ensayo de ATP estaba en mejor proporción al número de células N2a plateados que la α-tubulina y DRAQ5 + ensayos de zafiro, el supuesto de que la intensidad de señal refleja el número de células no siempre se cumplió después de tratamiento con la toxina. Niveles de ATP se elevaron a concentraciones de toxinas que no provocan un aumento similar en la señal en los ensayos de infrarrojos. Estos datos revelan cambios metabólicos compensatorios en las células N2a en respuesta a la inhibición del proteasoma y son útiles por derecho propio. La curva de dosis-respuesta de ATP en forma de U es característica del fenómeno llamado hormesis. Hormesis se define como reacciones biológicas favorables a la exposición de bajo nivel a las toxinas y otros factores de estrés ^40-42.

Para las neuronas, la DRAQ5 + Sapphire mancha fue menos sensible que la MAP2 y ensayos de ATP a altas densidades de galvanoplastia. Sin embargo, el DRAQ5 + Sapphire, MAP2, y los ensayos de ATP estaban bien en proporción a cenúmero ll en las neuronas corticales primarias iguales o inferiores a 100 mil células por pocillo. Nos placa neuronas en 100k células por pocillo. Las neuronas de la corteza no se conocen para replicar, por lo que estábamos más preocupados acerca de la linealidad a 100k o más bajas densidades de galvanoplastia. El DRAQ5 + ensayo de Sapphire fue menos sensible a las diferencias entre la neocorteza y allocortex que cualquiera MAP2 o ATP en concentraciones por debajo de 50 mM H ₂ O _2. Por otra parte, los niveles de ATP no cayeron tan drásticamente en H ₂ O ₂ tratamiento como señal de infrarrojos en los otros dos ensayos, lo que sugiere tal vez de nuevo aumentos compensatorios en la producción de ATP. Las discrepancias entre los tres ensayos en células N2a y neuronas primarias siempre son representativas de las funciones celulares que pueden cambiar antes de que las estructuras anatómicas están afectados, y que las estructuras de las células, incluyendo las proteínas del citoesqueleto, pueden ser afectadas mucho antes de que las células son ellos mismos perdieron. Los datos recientes sobre los ensayos de viabilidad múltiplex por Gilbert y sus colegas convincentementeilustran que las diferentes medidas de viabilidad como tinción nuclear Hoechst y mediciones de ATP dan información sobre las características celulares específicos que sólo reflejan parcialmente la viabilidad e indirectamente en su conjunto ^26. Por ello, recomendamos la realización de los tres ensayos de forma simultánea y no depender de un único ensayo para la viabilidad metabólica como muchas publicaciones hacen. Para más información sobre cualquiera de estas medidas, se recomienda el recuento de células individuales y, a continuación la evaluación de la expresión de proteínas del citoesqueleto y de los niveles de ATP como una función del número de células.

Aunque hay otros ensayos de viabilidad metabólica, tales como MTT, la ventaja del ensayo de ATP se encuentra en su sensibilidad y el rango dinámico. El ensayo de MTT puede sobreestimar el número de células viables en comparación con las mediciones de ATP y exhibe un IC ₅₀ que es de dos veces mayor ^43. Por otra parte, Petty y sus colegas informaron que el ensayo de ATP podríadetectar el límite inferior de 1.563 células por pocillo, mientras que el ensayo de MTT no pudo detectar menos de 25K células / pocillo ^12. La relación señal-ruido (señal de pozos con células vivas frente a los pocillos sin células) es sólo 7 para MTT pero 230 para el ATP ^44. Otra de las ventajas de los ensayos de ATP luminiscentes más de MTT es que el tiempo de incubación es mucho más corto. Además, el ensayo MTT de Promega cuesta 0.28 ¢ por pozo, mientras que la célula Titulación Glo ensayo del mismo fabricante cuesta 0.09 ¢ por pozo en nuestras diluciones recomendadas. Sin embargo, hay limitaciones a todos los ensayos metabólicos; actividad metabólica puede ser desacoplado de la supervivencia, en particular durante la necrosis. Si esto es una preocupación, los análisis en el presente informe se pueden combinar con las mediciones de la liberación de lactato deshidrogenasa para determinar la pérdida de la integridad de la membrana. Esto no implicaría ningún placas adicionales, como mediciones de lactato deshidrogenasa son simplemente hechas en el medio extracelular.

Aunque estos ensayos se presentan como alternativas a los recuentos manuales en el microscopio, este último puede ser un medio altamente sensibles y precisos del número de células de muestreo si se realiza correctamente. De hecho, esperamos que los cargos de los núcleos teñidos con Hoechst sería más sensible a pequeños cambios en el número de células N2a que el DRAQ5 + ensayo de Sapphire. Cuando todos los ensayos no pasan la prueba de linealidad, conteos manuales son esenciales. Un buen ejemplo de esto es nuestro modelo de astrocitos en cultivo primario, en el que llevamos a cabo el manual más laborioso que cuenta ^45. Sin embargo, los sesgos inherentes a los recuentos manuales deben ser tenidos en cuenta al interpretar los datos de recuento de células, al igual que los defectos inherentes de ensayos computarizados no deben dejarse de lado. Por lo tanto, se describen a continuación una serie de puntos fuertes y débiles de los ensayos de viabilidad.

En primer lugar, si se emplean DAPI o Hoechst manchas, núcleos reducidas y condensadas a menudo se designan comoapoptótica ^1. Sin embargo, el tamaño celular y la condensación de núcleos están dispuestos a lo largo de un continuo suave. Por el contrario, la vida y la muerte son fenómenos binarios que se excluyen mutuamente. A menos que se observan dos grupos muy distintos de células vivas y muertas, parece mejor que contar todas las celdas debajo de un diámetro nuclear umbral apoptótico con software de imágenes como MetaMorph o ImageJ y no por vista. Por supuesto, la elección de un diámetro límite es arbitraria porque no sabemos en qué momento se inicia una cascada de la apoptosis irreversible. Además, por definición, incluso las células con la caspasa 3 activada no son necesariamente en camino a la muerte y tal vez deberían ser contados como sigue vivo en el momento de la fijación ^46. Nuestros ensayos de infrarrojos evitar tales preocupaciones por el tratamiento de todas las células que se unen a la placa en el momento de la fijación como todavía viven. Sólo las células que han flotado lejos se cuentan como muertos. Esto coloca a las células en una de dos categorías distintas y evita las trampas de usar un complex, función continua como diámetro nuclear.

En segundo lugar, los recuentos manuales típicamente muestrean una pequeña fracción de todo el pozo. Esto puede llevar a un sesgo de muestreo y, en ocasiones, altos errores estándar de la media. Con nuestros ensayos de viabilidad, todo el pozo se muestrea para el ATP y cerca de todo el pozo se muestrea con los ensayos de infrarrojos. Este patrón de muestreo aumenta el tamaño de la muestra y evita la decisión a veces arbitraria de donde en el pozo para sacar una fotografía para los recuentos manuales. Si las fotos son tomadas del centro del pozo, hay que tener en cuenta que esta región es donde el off-lavar la mayoría de las células se produce, dando lugar a posibles sobreestimaciones de la toxicidad. Por el contrario, los ensayos de infrarrojos arrojan una cuadrícula sobre la imagen de la placa de 96 pocillos que sólo excluye a las esquinas exteriores de los pozos. Si así se desea, las esquinas de los pozos pueden ser incluidos por el aumento del diámetro de los círculos de la cuadrícula.

En tercer lugar, el fotógrafo y el contador de células deben ambos ser cegados durante conteos manuales. Sin embargo, una vez que las células se tratan con toxinas, que a menudo asumen cambios morfológicos que son bastante obvio incluso para un ojo no entrenado. Esto hace que sea mucho más difícil de permanecer imparcial. La ceguera no es un requisito para nuestros ensayos.

En cuarto lugar, los recuentos manuales son mucho tiempo y cuestan el investigador principal más de sueldo. Los salarios son uno de los más altos costos de la realización de la investigación. El tiempo de exploración para una placa en el Odyssey está a sólo 8 minutos de largo en la "calidad media" fijar y puede bajar aún más en la configuración de "baja calidad". Cabe señalar que la Odisea Imager es caro, incluso cuando uno compra una versión de demostración utilizado, pero es un costo fijo de una sola vez. Por otro lado, también hay que invertir en los microscopios de epifluorescencia relativamente caros para contar las células manuales de DAPI-o Hnúcleos oechst manchado. A pesar del costo inicial, la Odisea Imager es una máquina multiuso que también mide inmunotransferencias Western de una manera cuantitativa ^47,48. Hemos adaptado el uso de la Odisea para cuantificaciones de inmunotinción en las estructuras cerebrales macroscópicas tales como la rata o el cuerpo estriado del ratón o la corteza telencephalic. Este enfoque también se ha usado por otros ^49. Una debilidad del Imager Odyssey para obtener imágenes de los tejidos es que la resolución más alta es sólo 21 micras. Por lo tanto, no puede contar las células individuales y no es la intención de visualizar los detalles más finos anatómicas.

Por último, los ensayos de infrarrojos pueden no ser tan sensible a pequeños cambios en el número de células como recuentos manuales. Los valores de _CI50 por lo tanto no pueden ser consideradas como que muestra la concentración que provoca la pérdida de precisión 50% del número de células, pero sólo como la concentración que provoca la pérdida de 50% de la señal de infrarrojos. Esta advertencia se aplica probablemente atodos los ensayos de viabilidad que eluden los recuentos de células individuales mediante microscopía y de la muestra de todo el bien de una sola vez. La imprecisión asociada con tales ensayos puede ser una función de la hipertrofia, atrofia, u otros cambios en la apariencia que afectan intensidad de la señal. Por ejemplo, con algunas toxinas, α-tubulina inmunorreactividad en cada célula puede aumentar en función de la toxicidad. Hemos observado este fenómeno en las células N2a tratados con concentraciones muy altas de MG132 ^8. Si esto es motivo de preocupación, otras proteínas marcadoras del citoesqueleto, tales como β-actina o GAPDH se pueden utilizar. Por otra parte, hizo hincapié en las células N2a tienden a formar procesos bipolares ^8,50,51. Con los cambios en el tamaño celular, la producción de la señal fluorescente por célula también diferirá entre los grupos de tratamiento. Recomendamos que las células tratadas con toxina ser examinadas por microscopía de alta resolución estándar después de inmunocitoquímica para los mismos marcadores que se utilizan en el In-Cell occidental. Si el citoplasma cambia mucho en tamaño tras el tratamiento, pero lanúcleo no, le recomendamos que utilice la mancha DRAQ5 sin Sapphire sólo para cuantificar núcleos. Futuros estudios con diferentes tintes y con otras proteínas del citoesqueleto abundantes u otros están garantizados para superar estos obstáculos.

Llegamos a la conclusión de que todos los ensayos adolecen de advertencias y han expresado su preocupación por la sensibilidad, linealidad, error de muestreo, relación señal a ruido, el sesgo humano o subjetividad, tiempo y costo. Además, todos los ensayos se basan en supuestos que no siempre se cumplen. Por lo tanto, se recomienda que al menos dos ensayos se utilizan para describir los efectos del tratamiento en los cultivos celulares, uno que mide la salud metabólica y uno que se basa en la viabilidad anatómica. De esta manera, se puede determinar de manera más eficaz si los compuestos terapéuticos protegen tanto la estructura y la función.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555