Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

فحوصات قابلية للخلايا في الثقافة

Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/50645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

Summary

وغالبا ما يتم فحص المركبات العلاجية الأولى في المختبر مع المقايسات جدوى. عدد الخلايا أعمى من قبل المراقب الإنسان يمكن أن تكون حساسة للغاية للتغيرات صغيرة في عدد الخلايا ولكن لا تقييم وظيفة. المقايسات الجدوى المحوسبة، كما هو موضح هنا، يمكن تقييم كل من هيكل وظيفة بطريقة موضوعية.

Abstract

عدد الخلايا دليل على المجهر هي وسيلة لتقييم الجدوى الحساسة الخلوية ولكنها تستغرق وقتا طويلا، وبالتالي باهظة الثمن. المقايسات الجدوى محوسبة مكلفة من حيث المعدات ولكن يمكن أن يكون أسرع وأكثر موضوعية من عدد الخلايا اليدوي. ويصف هذا التقرير استخدام ثلاثة من هذه المقايسات جدوى. اثنين من هذه المقايسات والأشعة تحت الحمراء واحد هو الانارة. سواء المقايسات الأشعة تحت الحمراء تعتمد على تصوير أوديسي 16 بت. يستخدم فحص الأشعة تحت الحمراء واحدة وصمة عار DRAQ5 للنوى جنبا إلى جنب مع وصمة عار الياقوت لالعصارة الخلوية وتصور في القناة 700 نانومتر. الفحص بالأشعة تحت الحمراء الأخرى، والغربية في خلية، يستخدم الأجسام المضادة ضد البروتينات هيكل الخلية (α-تويولين أنيبيب أو بروتين يرتبط 2) وتصف لهم في القناة 800 نانومتر. فحص صلاحية الثالث هو فحص الانارة تستخدم عادة لاعبي التنس المحترفين، ولكن نحن نستخدم ربع حجم أوصت لانقاذ على التكاليف. هذه القياسات الخطية وكلها ترتبط مع عدد مLLS مطلي، ولكن تختلف في الحساسية. جميع المقايسات ثلاثة الالتفاف المجهر تستغرق وقتا طويلا وأخذ عينات من البئر كله، وبالتالي تقليل هامش الخطأ. أخيرا، كل من المقايسات يمكن بسهولة أن تكتمل في غضون يوم واحد من نهاية التجربة، والسماح أعداد أكبر من التجارب التي يتعين القيام بها ضمن أطر زمنية قصيرة. ومع ذلك، فإنها كلها تعتمد على افتراض أن الأرقام تظل الخلية بما يتناسب مع قوة الإشارة بعد العلاج، وهو افتراض أن في بعض الأحيان لم يتم، وخاصة بالنسبة للاعبي التنس المحترفين الخلوية. وعلاوة على ذلك، إذا كان زيادة أو نقصان الخلايا في الحجم بعد العلاج، وهذا قد يؤثر على قوة الإشارة دون التأثير على عدد الخلايا. نستنتج أن جميع المقايسات الجدوى، بما في ذلك التهم اليدوي، يعاني من عدد من المحاذير، ولكن هذا المقايسات الجدوى محوسبة تستحق الاستثمار الأولي. باستخدام جميع المقايسات الثلاثة معا تعطي رؤية شاملة للبنية الخلية ووظيفتها.

Introduction

فحص الجدوى الأكثر شيوعا في العلوم البيولوجية ينطوي على عدد الخلايا. ويتجلى ذلك من خلال إجراء تحليل للأعلى (أحدث) 200 المطبوعات التي ظهرت في مجلات مع أي من الكلمات الرئيسية "في المختبر" أو "ثقافة" على 2013/04/29 2013/04/30 و. من هذه المنشورات، 23.5٪ تستخدم فحوصات تعداد خلايا، بما في ذلك دليل التهم عدد الخلايا، عدد الخلايا الآلي التهم مع برامج التصوير، والتريبان الأزرق الاستبعاد. تم استخدام لايف / الميت في مقايسة 1٪ من هذه المنشورات. وكان الفحص للبقاء الأيض بنسبة 11٪ - عدد المنشورات باستخدام MTT ((4،5-dimethylthiazol-2-YL) بروميد -2،5-diphenyltetrazolium 3). ويبين هذا المسح من الأدب أيضا أن عدد المنشورات باستخدام فحوصات مثل الإنتقالي العسكري بالتزامن مع المقايسات عدد خلايا كان 3.5٪ فقط. على الرغم من الاتجاه لاستخدام واحد مقايسة جدوى في حد ذاته، وتقييم وظيفة الخلوية بالاشتراك مع عدد الخلايا يبدو الخيار الأفضل لتقييم ط الخلويةntegrity. عدد الخلايا في حد ذاتها ليست كافية لأن الخلايا المتبقية قد لا تكون وظيفية أو صحية على الرغم من أنها موجودة في البئر 1،2. على العكس، وتدابير وظيفية مثل ATP قد تزيد أو تنقص في غياب تغييرات موازية في عدد الخلايا. فك ربط قراءات الأيضية من عدد الخلايا يوحي بأن ATP والمقايسات MTT لا ينبغي أبدا أن تستخدم جدوى الفحص الوحيد. في هذا التقرير، وصفت ثلاثة فحوصات قابلية أن مسح كل الهياكل الخلوية وظيفة التمثيل الغذائي، للحصول على عرض أكثر شمولا من النزاهة الخلوية من أي فحص واحد في حد ذاته يمكن تحمله.

اثنين من المقايسات لدينا تتطلب تصوير بالأشعة تحت الحمراء الذي يقيس مضان في القنوات نانومتر 700 و 800. ضوضاء منخفضة في موجات الأشعة تحت الحمراء، مما يؤدي إلى ارتفاع إشارة إلى الضوضاء نسب 3. وتصوير أوديسي التي نستخدمها لديها مجموعة ديناميكية 4.5 سجل وبت عمق 16، translatinز 16 إلى 2 أو 65،536 ظلال من الأشعة تحت الحمراء. وهذا يمكن أن يتناقض التصوير اللون 8 بت، والتي توفر سوى 2 8 أو 256 ظلال من اللون لكل طول موجي. وبالتالي، والتصوير 16 بت لديه قرار الدقيقة. تجدر الإشارة إلى أن الصور بالأشعة تحت الحمراء الأصلي وغالبا ما pseudocolored الأخضر (800 نانومتر) والحمراء (700 نانومتر) في التقارير المنشورة للعرض. وتستخدم عادة أوديسي التصوير على حد سواء لالنشاف الغربية والغرب في خلية 4-7. في خلية الغرب على الخلايا الثابتة الفورمالديهايد استخدام الأجسام المضادة الأولية ضد أي بروتين من الفائدة وتسمية لهم بدوره مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية الأشعة تحت الحمراء. وتعرف هذه التقنية لتكون مفيدة بشكل خاص بالنسبة لنهايات الفسفرة 6. لدينا في الغرب في خلية، ونحن وصمة عار الخلايا ثابتة لهيكل الخلية البروتينات α-تويولين أنيبيب العصبية أو البروتين 2 (MAP2) المرتبطة في القناة 800 نانومتر. هذه البروتينات وفيرة بما فيه الكفاية لتحقق نسب عالية إشارة إلى الضوضاء. نحن أيضا لدينا لوحات وصمة عار في 700قناة نانومتر للنوى مع وصمة عار DRAQ5 والسيتوبلازم مع وصمة عار الياقوت. كل من البروتينات هيكل الخلية وDRAQ5 + البقع الياقوت بالتالي تعكس الهياكل الخلوية.

فحص صلاحية الثالث يقيس وظيفة التمثيل الغذائي ويسمى "خلية عيار جلو" في هذا الاختبار القائم على luciferase المراسل، والقيم التلألؤ في نسبة مباشرة إلى مستويات ATP. وتستخدم المقايسات ATP شيوعا لقياس خلايا قابلة للحياة 8-12. ومع ذلك، بما في ذلك كلمة "عيار" في اسم الاختبار هو نوعا من تسمية خاطئة لأن الناتج ATP لكل خلية يمكن أن تتغير بوصفها وظيفة من العلاجات السموم وبالتالي فهي ليست دائما في نسبة إلى الخلية رقم 8. كما يمكن أن تتأثر مستويات ATP عن طريق ايقاعات كل يوم 13 وقبل انقسام الخلية 14 و 15 تمايز الخلايا. ومع ذلك، فإن فحص ATP المبين هنا هو بسيطة لأداء ومفيدة لاعبي التنس المحترفين هو مقياس قوية من التمثيل الغذائي16-21 الجدوى، إن لم يكن الخلية رقم في حد ذاته. عن طريق هذا الاختبار لاستكمال الأشعة تحت الحمراء في سيل وبالتالي ينتج الغرب صورة أكثر شمولا من النزاهة الخلوية من أي فحص واحد فقط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ويتضح التخطيطي للبروتوكولات في الشكل 1.

1. خلية تصفيح

خلايا لوحة في لوحات 96 بشكل جيد في مختلف الكثافات الطلاء (الشكل 2). لالشيكات الخطية على خط الخلية العصبية N2A، لوحة 2.5K، 5K، 10K، 15K وخلايا لكل بئر في 3 أو 6 آبار / المجموعة. لاجراء فحوص الخطي في الخلايا العصبية الفئران القشرية الأولية، لوحة 25K، 50K، 100K، 200K وخلايا لكل بئر في 3 أو 6 آبار / المجموعة. إذا كانت خطوط الخلية أو الخلايا الأولية من الفائدة تبدو صحية في كثافة الطلاء المختلفة، لوحة في وحول كثافة الخلية الأمثل لهذا النوع من الخلايا.

ملاحظة: في هذه الدراسة، كانت مطلية الخلايا N2A في وسائل الإعلام 100 ميكرولتر والخلايا العصبية القشرية الأولية في وسائل الإعلام 200 ميكرولتر على لوحات التي تم تصميمها لخفض التبخر. للحصول على معلومات مفصلة عن التعامل مع الخلايا، ووسائل الإعلام، الأمصال والمضادات الحيوية وعلاجات للسموم، يرجى الاطلاع Unnithan وآخرون. لN2A سل8 ليرة سورية وPosimo وآخرون. للثقافات القشرة الأولية 22.

    1. تكرار الطلاء على الثاني لوحة 96 جيدا. سيتم يعاير واحد لوحة للاعبي التنس المحترفين (الشكل 2A) والآخر مع فحوصات الأشعة تحت الحمراء (الشكل 2B). يمكن للمرء أن لا تستخدم نفس لوحة للاعبي التنس المحترفين وفحوصات الأشعة تحت الحمراء لأن الخلايا هي lysed يجب مفتوحة للقياسات ATP داخل الخلايا.
    2. ومن المؤكد أن لوحة لا يقل عن 3 آبار اضافية لخلفية الطرح في فحوصات الأشعة تحت الحمراء في كثافة الطلاء الأمثل (العمود 2؛ الشكل 2B).
  2. إضافة وسائط دون الخلايا أو أكثر غير مكلفة، الماء المعقم إلى الآبار الخارجي في الصفوف ألف وحاء والأعمدة في 1 و 12. تجنب الاعتماد على البيانات من الآبار على طول الحواف، كما هو في كثير من الأحيان أقل جدوى هنا من آثار التبخر وسائل الإعلام ودرجة الحرارة التدرجات. مثل هذه المشاكل مع microplates تسمى عادة آثار حافة 23،24. لا تبقي هذه الآبار فارغةلأن ثم الصفوف B و G والأعمدة 2 و 11 يعانون من تأثير الحافة.
    وربما يتم تخفيض الآثار التي يحتضنها حافة صفيحة المصنفة حديثا في درجة حرارة الغرفة في الظروف المحيطة قبل نقلها إلى الحاضنة CO 2 24. وعلاوة على ذلك، أظهرت دراسة حديثة أجرتها Carralot يصف طريقة تصحيح الرياضية لوحات microtiter باستخدام عمود تحكم واحد 23. تستخدم اوليفر وزملاؤه المصممة خصيصا اضطر microtitration الهواء لوحة حاضنة للحد من التدرجات الحرارية 25. إذا كان تأثير الحافة هو مصدر قلق كبير، وغرف الاستقرار صفيحة ميكروسكوبية (مثل BT و C للإعلام) يمكن شراؤها لإنشاء المكروية متجانسة مع ارتفاع نسبة الرطوبة ودرجة الحرارة حتى التدرجات.
  3. إذا هناك حاجة لمزيد من الآبار هو مبين في الشكل 1 لأن التخفيفات كاشف إضافية أو أكثر كثافة الطلاء وسيتم اختبار، واستخدام الآبار لحافة الطرح الخلفية.
  4. الانتظار بين عشية وضحاها لمرفقمن الخلايا وفحص في صباح اليوم التالي كما هو موضح أدناه.

2. الانارة ATP الفحص

  1. متابعة توصيات خلية عيار جلو الشركة المصنعة لإعادة تشكيل الركيزة مع العازلة وللمرة الحضانة.
    1. إزالة 50 أو 150 ميكرولتر من وسائل الإعلام 100 أو 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام الطلاء، على التوالي. ستظل أقل قليلا من 50 ميكرولتر راء في البئر. إضافة 25 ميكرولتر من الكواشف (الركيزة زائد العازلة) إلى أعمدة 2-6 (الشكل 2A) في 01:02 التخفيف.
      ملاحظة: كميات متفاوتة من وسائل الاعلام تركت وراءها بعد إزالة يمكن تخفيف أو تركيز ATP الكواشف مقايسة تفاضلي عبر الآبار. الحرص على ضمان أن مستوى السائل في كل النصائح ماصة الأقنية هو ما يعادلها. قياس السائل المتبقي في آبار مختارة عبر لوحة مع ماصة على الفور قبل إضافة الكواشف ATP الفحص لضمان الدقة. في حالة وجود تباين عالية من معدلات التفاضلية من evapor وسائل الإعلامأوجه عبر سطح لوحة، وإزالة كافة وسائل الإعلام القديمة وإضافة نفس الحجم من وسائل الإعلام الجديدة أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لجميع الآبار مباشرة قبل إضافة ATP الكواشف مقايسة. إذا لوحات يعانون من مستويات مختلفة من التبخر، في محاولة التحول إلى لوحات تبخر منخفضة من COSTAR كورنينج. في لوحات الأخير، و60 بئرا الداخلية هو مبين في الشكل 2 يعانون فقط من متوسط ​​قدره 0.995٪ ± 0.41 وسائل الإعلام تبخر بين عشية وضحاها. وبالتالي هناك تباين يذكر في حجم وسائل الاعلام في وقت الفحص.
    2. في الأعمدة من 7 إلى 11، الصفوف B إلى D، وإزالة ما يكفي من وسائل الإعلام لترك 50 ميكرولتر وراء، على النحو المفصل أعلاه، وإضافة 50 ميكرولتر من الكواشف في 1:1 التخفيف.
    3. في الأعمدة من 7 إلى 11، من خلال الصفوف E G، وترك الخلايا في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام وإضافة 100 ميكرولتر من الكواشف، ومرة ​​أخرى في 1:1 التخفيف. توصي الشركة أن 100 ميكرولتر من الكواشف يجب تخفيفه 01:01 في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام.
      ملاحظة: من أجللانقاذ على تكاليف، فمن الممكن لخفض هذه التوصيات سواء في الحجم، والتخفيف. ومع ذلك، قبل القيام بذلك، تأكد من أنه لا يقلل من الخطي وحساسية الفحص.
    4. مرة واحدة تم العثور على حجم معين واحد وعامل التخفيف من الكواشف أن تكون مرضية، والعصا معهم في جميع التجارب اللاحقة. وصفت معايير للبيانات مرضية في قسم النتائج.
    5. الكواشف المعاد غير المستخدمة يمكن أعيد تجميدها مرة أخرى واستخدامها في وقت لاحق لانقاذ على التكاليف. وفقا لالصانع، الكواشف المعاد يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 21 أسبوعا مع فقدان ~ 3٪ من النشاط.
  2. وضع لوحة على شاكر المداري لمدة 2 دقيقة أو الإيماء شاكر لمدة 10 دقيقة. إذا كان يتم يعاير جزء من لوحة لقياس مختلفة، وأنه لا يمكن أن تهتز، تستنهض الهمم وسائل الإعلام مع pipetting صعودا ونزولا بسيطة فقط في الآبار من الفائدة. ومع ذلك، فإن فقاعات المفرطة ولدت خلال هذه الخطوة تتعارض مع وميخرج nescent.
    1. 10 دقيقة بعد إضافة الكواشف، ونقل 60 ميكرولتر من محتويات جيدا في لوحات بيضاء 96 جيدا. القيم التلألؤ هي أعلى في لوحات بيضاء مما كان عليه في لوحات واضحة أو الأسود لأنها تعكس الضوء صعودا نحو كاشف.
      ملاحظة: في تجربتنا، وخلايا البقاء على قيد الحياة أفضل على تبخر منخفضة، لوحات COSTAR واضحة من لوحات أخرى. لا تباع هذه اللوحات محددة مع الجدران البيضاء. الثانية، لوحات مبهمة الجدران واضحة القاع هي أكثر تكلفة من لوحات واضحة تماما. إذا كان واحد ينقل السائل الانارة لوحات بيضاء، لوحات بيضاء يمكن غسلها وإعادة استخدامها، مما يوفر على تكلفة استخدام لوحات بيضاء جديدة لكل تجربة. نقل السائل وبالتالي الخيار أرخص على المدى الطويل.
    2. البوب ​​أي فقاعات الهواء قبل قراءة لوحة بإبرة أو، ويفضل، مع الهواء القسري من البلاستيك لمبة ماصة نقل. قراءة لوحة على luminometer مع 1 ثانية التكامل الوقت (recomme الشركةتفاحة 0.25-1 ثانية الوقت التكامل كاف). قراءة لوحة 10-12 دقيقة بعد إضافة ATP الكواشف مقايسة. توقيت حرج للمقارنة عبر لوحات مختلفة، وذلك لأن إشارة الانارة هو عابر مع معدل تسوس بسرعة، كما هو مبين من قبل جيلبرت وزملاؤه 26.
  3. متوسط ​​القيم الانارة من 3 أو 6 آبار في كل مجموعة والحبكة بوصفها وظيفة من عدد الخلايا في مخطط التشتت (انظر الشكل 3). أول طرح متوسط ​​خلفية القيم التلألؤ من الآبار الفارغة المناسبة (الآبار 2B - 2G والآبار 11B - 11D، والآبار 11E - 11G) من كل نقطة البيانات المقابلة. سيكون هناك ثلاث مجموعات مختلفة لكل كثافة الطلاء في هذا الأولي (2A الشكل) التجربة. مستويات ATP قد تكون مرتبطة خطيا مع كثافة خلية في واحد أو كل من هذه المجموعات. المضي قدما وفقا لأعلى التخفيف من الكواشف التي لا تزال تعطي نتائج مرضية لانقاذ على التكاليف. وصفت معايير للحصول على نتائج مرضية طن القسم نتائج.
    ملاحظة: مع وسائل الإعلام المستخدمة في الدراسة الحالية، والقيم الخلفية مع هذا الاختبار ليست مرتفعة، ومن الممكن لتخطي آبار فارغة. ومع ذلك، فإن الشركة المصنعة PROMEGA تقارير الاختلافات في التألق مع وسائل الإعلام ثقافة مختلفة. يستخدم هذه الدراسة Hyclone الجنين استنساخ الثالث، نسخة تركيبية من مصل بقري جنيني لخلايا N2A ومصل العجل البقري للثقافات القشرية الأولية. وفقا لالصانع، ويقلل مصل العجل القيم التلألؤ ولكن لا تقلل من حساسية الفحص. ومع ذلك، إذا كان هذا هو مصدر قلق كبير، وتمييع ATP الكواشف مقايسة في برنامج تلفزيوني بدلا من وسائل الاعلام في وقت الفحص.
    1. إذا تظهر الخلايا لتنمو بشكل غير متساو عبر الأعمدة بين عشية وضحاها، في محاولة منهم يعاير في غضون 6 ساعة من الطلاء. ومع ذلك، نضع في اعتبارنا أن كثافة في الوقت المعتاد للمقايسة (على سبيل المثال، 24 ساعة بعد العلاج) هو الكثافة الذي يجب أن يتحقق الخطي.

3. Infrareد فحوصات

  1. في صباح اليوم التالي والطلاء، وإصلاح الخلايا في لوحة ثانية في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان. تأكد من ارتداء القفازات لهذه الخطوة والتخلص من النفايات الكيميائية كما تثبيتي لأن الفورمالديهايد هو مادة مسرطنة. إضافة 4٪ الفورمالديهايد و 4٪ سكروز في العازلة الفوسفات 0.1 M إلى وسائل الإعلام الموجودة في 1:1 التخفيف. ويمكن أيضا أن وسائل الإعلام أن يغسل مع برنامج تلفزيوني قبل تحديد في كامل القوة تثبيتي. إما التقنية تعمل بشكل جيد.
    1. احتضان في تثبيتي لمدة 20 دقيقة ثم إزالة تثبيتي، وغسل 3X في 200 ميكرولتر PBS.
  2. تخزين لوحة في برنامج تلفزيوني مع 0.2٪ أزيد الصوديوم في 4 درجات مئوية إذا كان سيتم فحص لا يأخذ مكان في نفس اليوم. خلاف ذلك، والمضي قدما مع مقايسة ووضع الخلايا في عرقلة الحل لتقليل ملزم غير محدد من الأجسام المضادة.
    1. تمييع الأسماك المصل أوديسي كتلة 1:1 في برنامج تلفزيوني وإضافة 0.3٪ تريتون X-100 على أنه permeabilizer الخلية. تقديم ما يكفي من الحل الحجب وكذلك antibo الابتدائي والثانويحلول دى بحيث يمكن pipetted 35 ميكرولتر في كل بئر. ومع ذلك، إذا كان الكثير من الفقاعات لوحظ خلال pipetting ل، وجعل> 50 ميكرولتر لكل بئر، وإلا فقاعات تصل بسرعة إلى الخلايا والأجسام المضادة كتلة من ملزمة. سوف تظهر فقاعات الصابون المفرط باعتبارها بقعة دائرية غير ملوثين في منتصف البئر. محاولة لضبط pipetting لفي حالة حدوث ذلك.
    2. احتضان هذا الحل في حجب لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن أيضا 5٪ ألبومين المصل البقري أو الأمصال العادي من نفس الأنواع من الأجسام المضادة الثانوية أن تستخدم عرقلة الحلول لانقاذ على تكاليف كتلة مصل الأسماك. يمكن عرقلة الحلول تؤثر على أداء الأجسام المضادة. وبالتالي، فإن كتلة الأمثل لكل الأجسام المضادة هي أفضل تحدد تجريبيا.
      ملاحظة: بعض المحققين في وضع خلية لوحات الغربية على الهزازات خلال حضانات. ومع ذلك، هذا ليس ضروريا.
  3. جعل الأجسام المضادة الأولية: 1:10،000 التخفيف لمكافحة α-تويولين(وحيدة النسيلة الماوس، الجدول 1) و1:2،000 التخفيف لمكافحة MAP2 (الماوس وحيدة النسيلة، الجدول 1). هذه الأجسام المضادة هي بروتينات محددة إلى الاهتمام بهذه النماذج الخلوية؛ خصوصية أمر ضروري لأية وصمة عار immunocytochemical.
    ملاحظة: MAP2 هو علامة للحصول على الخلايا العصبية وغير مناسبة لالثقافات العصبية / الدبقية مختلطة. ثقافات ما بعد الولادة هو موضح هنا تحتوي أيضا على بعض الدبقية (~ 25٪) وذلك لأن الخلايا النجمية تظهر لأول مرة في يوم 18 الجنينية، مع أعدادهم تبلغ ذروتها في فترة الوليد المبكرة 27،28. يمكن للمرء أن لا يميز بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية في ATP وDRAQ5 + الياقوت المقايسات. من أجل قياس الخلايا العصبية والخلايا النجمية بشكل منفصل، استخدم MAP2 في وقت واحد وتلطيخ GFAP في القنوات نانومتر 800 و 700، كما وصفها Mullett وزملاؤه 4،29، تاركة DRAQ5 + الياقوت. ومع ذلك، إذا كان كل الخلايا في الثقافة ترغب في أن تقيم، استخدم علامة عموم الخلوية مثل α-تويولين، β-الأكتين، أو GAPDH.
    ملاحظة: وقد تم تحسين هذه التخفيفات لN2A والخلايا القشرية الأولية والتعميم قد لا إلى كل نموذج. لذا، حاول اثنين على الأقل من التخفيفات الأجسام المضادة الأولية، واحدة على النصف الأيسر من لوحة واحدة على النصف الأيمن (انظر الشكل 2B). بدلا من ذلك، حاول 3-4 التخفيفات من الأجسام المضادة الأولية في 3 آبار لكل منهما. على سبيل المثال، والتخفيف الموصى بها على ورقة الضد يمكن إدراج يحيط مع التغييرات شقين. وبعبارة أخرى، إذا كان التخفيف الموصى بها للكيمياء سيتولوجية مناعية هو 1:500، 1:250 وأيضا محاولة 1:1،000 عوامل التخفيف.
    1. تمييع الأجسام المضادة في 1:01 كتلة أوديسي: برنامج تلفزيوني وإضافة 0.3٪ تريتون-X. لانقاذ على تكاليف، ومحاولة جعل الأجسام المضادة في عرقلة الحل الذي تم تطبيقه على الخلايا في الخطوة 3.2.1 عن طريق إزالة هذا الحل في نهاية الحضانة. إبقاء الخلايا في برنامج تلفزيوني حين نفعل ذلك، بل يجب أن لا تجف.
    2. احتضان في الأجسام المضادة الأولية إما 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. لضعيفة بinding الأجسام المضادة والبروتينات التي ليست وفيرة، ويمكن أن تساعد على زيادة حضانات بين عشية وضحاها إشارة.
      ملاحظة: اترك على الأقل 3 آبار في عرقلة الحل للالطرح الخلفية في كل تركيز الضد الثانوية (الآبار 2B-2D و 2E-2G الآبار في الشكل 2B). لا تعرض هذه الآبار إلى أي الأجسام المضادة الأولية على الإطلاق. أنها تكشف عن مدى غير محدد ملزمة من قبل الأجسام المضادة الثانوية ومفيدة لحسابات نسب الإشارة إلى الضوضاء. إذا كان هناك قلق من أن الأجسام المضادة الثانوية سوف يؤدي إلى مستويات عالية من الربط غير محددة، وتشمل أيضا آبار المراقبة التي لم يتم كشفها إلى الضد إما الابتدائية أو الثانوية ولكن الحصول على نفس العدد من يغسل. والفرق بين هذه الآبار و"الثانوية فقط" آبار تكشف مدى غير محدد ملزم الناجمة عن الأجسام المضادة الثانوية وحدها. في اختبار لدينا على الماوس الخلايا N2A، مع شدة الإشارة مكافحة فأر الضد الثانوية وحدها كانت 0.557 ± 0.032، إشارة مع المضادة للأرنبكان الضد الثانوية وحدها 0.533 ± 0.041، مع عدم وجود إشارة الضد الثانوية و0.357 ± 0.003، وكان إشارة مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية 11.867 ± 0.911. نكون بذلك قد لا تراعى مستويات عالية من الربط غير محددة حتى عند استخدام الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس على خلايا الفأر. وهناك العديد من الشركات الصانعة للالأجسام المضادة الثانوية الأشعة تحت الحمراء، ونحن نوصي فقط شراء تلك عالية عبر كثف. نلاحظ أن تركيز الأجسام المضادة مفتش الثانوي قد تختلف تبعا للمصدر.
  4. يغسل الأجسام المضادة الأولية مع 3 يغسل من 200 ميكرولتر لكل بئر برنامج تلفزيوني، 10 دقيقة لكل منهما. يمكن حفظ الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات مئوية لمدة بضعة أسابيع في 0.2٪ أزيد الصوديوم وإعادة استخدامها حتى تصبح بقع صغيرة من الحطام وضوحا عندما تقام الحلول حتى الضوء. يتم ذلك فقط لانقاذ على التكاليف. إذا كانت التكلفة ليست قضية، وجعل الأجسام المضادة جديدة لكل استخدام.
  5. تمييع الضد الثانوي بحلول 1:1،000 أو 1:2،000 في 1:01 كتلة أوديسي: برنامج تلفزيوني مع 0.3٪ تريطن-X (الشكل 2B). إضافة إلى التخفيف 1:1،000 النصف العلوي من لوحة و1:2،000 إلى النصف السفلي من اللوحة. هذه التركيزات يمكن تخفيض أخرى لانقاذ على التكاليف، ولكن تحقق لالخطي قبل الالتزام بذلك.
    ملاحظة: تأكد من إضافة محلول الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لآبار الطرح الخلفية (عمود 2 في الشكل 2B).
    1. إذا كان سيتم يعاير بروتين الثانية في مكان DRAQ5 + الياقوت، والخلايا تسمية α-تويولين أو MAP2 مع 700 نانومتر الماعز المضادة للماوس مفتش والبروتين الثاني في القناة 800 نانومتر مع الأجسام المضادة الأولية من الأنواع الأخرى من الماوس. قناة نانومتر 800 لديه الخلفية أقل من 700 نانومتر القناة ويجب أن تكون محفوظة للبروتين الأكثر أهمية من الفائدة.
    2. احتضان في الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في درج بعيدا عن الضوء.
  6. يغسل الأجسام المضادة الثانوية مع 3 يغسل من 200 ميكرولتر لكل بئر برنامج تلفزيوني، 10 دقيقة لكل منهما.
  7. جعل الحلول DRAQ5 + الياقوت. في النصف الأيسر من لوحة، وتمييع DRAQ5 1:10،000 (0.5 ميكرومتر تركيز النهائي) والياقوت 1:1000 في برنامج تلفزيوني مع 0.3٪ تريتون-X (الأعمدة 3-6؛ الشكل 2B). للنصف الأيمن من لوحة، وتمييع DRAQ5 1:20،000 (0.25 ميكرومتر) والياقوت 1:2000 (الأعمدة 7-10؛ الشكل 2B).
    ملاحظة: DRAQ5 المستخدمة ليتم بيعها في الأوراق المالية 1 ملم بدلا من الأسهم 5 ملم. لذا تستخدم بعض التقارير المنشورة سابقا 1:4،000 أو 1:2،000 التخفيفات من DRAQ5 8.
    1. لانقاذ على التكاليف، إذا كان يتم يعاير اثنين من لوحات في وقت واحد، ونفس DRAQ5 + حلول الياقوت يمكن استخدامها على اثنين من لوحات في تسلسل، pipetting لتشغيله لوحة الأول وإضافته إلى الثاني. إذا كان سيتم استخدام نفس حلول مرتين بهذه الطريقة، واستخدامها في غضون يوم واحد. لا يمكن حفظ الحلول DRAQ5 المخفف + الياقوت في 4 درجات مئوية أو تجميدها لاستخدامها لاحقا.
    2. احتضان في هذه الحلول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعيدا وضوء مدمج. إذا كان الوقت قصيرا ولن يتم إعادة استخدام DRAQ5 + حلول الياقوت على لوحات أخرى مع المرتبات الثانية مختلفة، إضافة إلى هذه البقع الحلول الضد الثانوية في الخطوة 3.5 واحتضان لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: لا إضافة DRAQ5 + حل الياقوت إلى الآبار الطرح الخلفية (عمود 2 في الشكل 2B) كما لا ينبغي أن تكون ملطخة هذه الآبار في القناة 700 نانومتر.
  8. غسل 3X لوحة مع 200 ميكرولتر لكل بئر برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما. وضع 0.2٪ أزيد الصوديوم في غسل PBS النهائي إذا كانت لوحة ستكون ملطخة الأخرى الأجسام المضادة الثانوية مرئية المدى بعد التصوير بالأشعة تحت الحمراء كاملة.
  9. تفحص اللوحة على تصوير أوديسي. تبدأ عن طريق المسح الضوئي لوحات في كثافة 5 و 169 مم القرار. إما "جودة متوسطة" أو إعدادات "جودة منخفضة" كافية. الشركة لا يعفي معلومات مفصلة مرشح الإثارة / الانبعاثات. ومع ذلك، فإن المرشحات الانبعاثات ما يقرب من 20 نانومتر واسعة، وتتمحور حول 720 و 820 نانومتر، وفقا إلى الشركة المصنعة.
    ملاحظة: من الممكن لمسح لوحات في حين لا يزال الرطب كما قد يرغب المحققون على مواصلة وصمة عار لهم مع علامات أخرى. ومع ذلك، تقترح الشركة في بروتوكول الإنترنت من أن لوحات الجافة يؤدي إلى انتشار أقل جيدا إلى إشارة جيدا. إذا كنت تفحص لهم على حد سواء الرطب والجاف ثم مقارنة البيانات، تأكد من إزالة كل برنامج تلفزيوني من البئر بسبب الأملاح المتبقية بعد تبخر يمكن أن يؤدي إلى مضان الخلفية عالية على طول الحواف.
    1. الأوديسة تصوير بالاشعة فوق وخلال الجزء السفلي من اللوحة. لوحات من مختلف الصانعين قد يطلبون إزاحة التركيز مختلفة لأن الجزء السفلي من الآبار يمكن أن تختلف في السمك والعمق في اللوحة. محاولة المسح في إزاحة التركيز مختلفة، وترى فيها أعلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء وcrispest (أكثر في التركيز) ويتحقق إشارة: 2.5 ملم، 3.0 ملم، 3.5 ملم، 4.0 ملم. أيضا في محاولة لقياس عمق البئر من أسفل لوحة مع حاكم لتأكيد findinع على الأوديسة. تذكر أن البلاستيك في قاع البئر يمكن أن تضيف ارتفاع إضافي للمقاييس المسطرة. لوحات COSTAR المستخدمة في الدراسة الحالية تتطلب التركيز إزاحة 4.0 ملم.
    2. استخدم الدالة في خلية الغربية في البرنامج لوضع الشبكة ذات حجم مناسب على صورة لوحة وتصدير البيانات إلى Microsoft Excel. دراسة "كثافة متكاملة" القيم من نفس الآبار عبر إزاحة التركيز مختلفة للعثور على أعلى القيم مضان. التركيز تعويض يمكن أن ينتج أعلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء (في إشارة الآبار immunostained مقابل "أي سيطرة السلبية الأولية" آبار) هو واحد أن يختار الآخرة.
    3. بمجرد قررت التركيز على تعويض واحد، تفحص مرة أخرى على دفعات صغيرة. على سبيل المثال، إذا كان ألمع إشارة عند 3.5 و 4.0 ملم، في محاولة المسح على 3.6، 3.7، 3.8، و 3.9 ملم ومعرفة ما إذا كان هناك أي مزيد من التحسن في قوة الإشارة. إذا كان التركيز تعويض خطأ، شدة إشارة عبر 12 عمودا على رر فارغةأكلت (عندما ينبغي أن يكون كافة الأعمدة إشارة المساواة) وسوف تظهر كما منحنى على شكل حرف U بدلا من خط مستو. إذا كان هذا لا يزال يشكل مشكلة مع لوحات من البلاستيك، في محاولة لوحات ذات القاع الزجاجي.
  10. طرح متوسط ​​شدة المتكاملة في الخلفية الآبار الطرح (الشكل 2B؛ الآبار 2B - 2D أو الآبار 2E - 2G) من كل نقطة البيانات المقابلة في القنوات نانومتر 700 و 800. ثم متوسط ​​شدة إشارة متكاملة لكل مجموعة من الآبار. رسم البيانات بمثابة مخطط التشتت ضد كثافة الخلايا (انظر الشكل 3).
    1. مقارنة نتائج اثنين من التخفيفات مختلفة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية ونتائج اثنين من التخفيفات مختلفة من DRAQ5 + الياقوت ليستقر على التخفيف احد في كل من التجارب اللاحقة. إذا لم يتحقق الخطي، في محاولة المسح في كثافة مختلفة. إعادة تفحص مع شدة 3 و 7 بدلا من 5 وreanalyze البيانات. إذا تحسين البيانات في واحدة من تلك الشدة ولكنلا تزال غير مرضية، إعادة تفحص بزيادات حول أن كثافة.
    2. يجب الحرص على عدم تحليل الصور حيث يظهر البرنامج بقع بيضاء في الآبار؛ تلك البقع يعني إشارة المشبعة خارج نطاق من تصوير. مسح في كثافة أقل في حالة حدوث ذلك.
    3. إذا لم يتحقق الخطي، في محاولة أيضا لإصلاح الخلايا في غضون 6 ساعة من الطلاء لأنها قد تنمو بشكل غير متساو أو يموت في أعمدة مختلفة بين عشية وضحاها. أيضا محاولة كثافة الطلاء المختلفة، شدة المسح المختلفة، مزيد من التحسينات من العوامل كاشف التخفيف، لوحات ذات القاع الزجاجي، DRAQ5 في حد ذاته بمثابة وصمة عار النواة فقط، أو الأجسام المضادة المختلفة الأخرى من مكافحة α-تويولين أو المضادة للMAP2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عامل معدل الحد في هذه التجارب هو تلطيخ الأشعة تحت الحمراء، وفحص ATP هو وجيزة نسبيا من حيث المدة. لفحوصات بالأشعة تحت الحمراء، ونحن نتوقع أن ثماني لوحات 96 بشكل جيد يمكن أن تكون ملطخة ومسحها ضوئيا في غضون يوم واحد بواسطة مذهلة دفعتين من أربع لوحات لكل منها (انظر الشكل 1). هذا التقدير يفترض 20 دقيقة من التثبيت، و 30 دقيقة من غسل و 30 دقيقة من عرقلة، 2 ساعة الأولي الحضانة الضد تليها 30 دقيقة من يغسل، 1 ساعة الضد الثانوية الحضانة تليها 30 دقيقة من يغسل، 30 دقيقة DRAQ5 + الياقوت تليها 30 دقيقة من يغسل، و 34 دقيقة من وقت الفحص لمدة 4 لوحات. ويؤخذ خمس عشرة دقيقة إضافية في الشكل 1 ليغسل من أجل لحساب pipetting لمراحل أربع لوحات فردية. لم يتم تضمين الوقت لتحليل البيانات في هذا التقدير. إذا قياسات فحص ATP سوف تحدث بشكل متواز لكل لوحة الأشعة تحت الحمراء، واثني عشر لوحات يمكن أن يعاير في يوم واحد - ستة لوصمة عار الأشعة تحت الحمراءق وستة مستويات لاعبي التنس المحترفين.

معايير للبيانات مرضية في تحليلات الانحدار (الشكل 3)، كما ذكر في قسم البروتوكول، وتشمل وجود علاقة ذات دلالة إحصائية بين كثافة الطلاء وقوة الإشارة (اثنين ع الذيل ≤ 0.05). وينبغي أيضا أن يكون حجم التغيرات في إشارة الأشعة تحت الحمراء أو التلألؤ بما يتناسب مع التغيرات في عدد الخلايا. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون خلايا 5K ما يقرب من نصف التلألؤ أو مستويات ATP من 10K الخلايا، ويجب أن يكون 15K الخلايا القيم أكبر ما يقرب من 50٪ من الخلايا 10K، الخ. يعكس هذا التناسب حساسية الفحص ويتميز عن قيمة R 2 أو معامل التحديد. R 2 فقط تدابير جيدا كيف خط الانحدار يقترب من نقاط البيانات الحقيقية. حتى إذا كانت البيانات هي الخطية، قد لا تكون التغيرات النسبية في قوة الإشارة بما يتناسب مع حجم التغيرات في عدد الخلايا. هذا يمكن أن يحدث ثالدجاجة خط الانحدار لديه عالية R 2 ولكن منحدر منخفض، مما يوحي بأن الفحص ليست حساسة جدا. وبالتالي، يجب أن يكون راضيا معايير الارتباط والتناسب من بيانات هامة على حد سواء. أخيرا، يجب أن التغيرات في قوة الإشارة في جميع أنحاء كثافة الطلاء الأمثل تقع ضمن النطاق الديناميكي الصك والفحص. النطاق الديناميكي هو النسبة بين أكبر وأصغر القيم الممكنة. وتصوير أوديسي لديها مجموعة ديناميكية 4.5 سجل وإشارة المشبعة يظهر كلون أبيض ناصع في مكان الصورة أحمر أو أخضر المعتادة من أجل تنبيه الباحث أن النتائج لم تعد قابلة للقياس الكمي. النطاق الديناميكي خلال الفحص نفسه هو أضيق بسبب قضايا مثل الحد الأقصى والحد الأدنى من كثافة الطلاء عن أي نوع من الخلايا معين. إذا كان أحد لوحات في زيادة كثافة الخلية، فإن منحنى التشبع لهذه المقايسات تكشف عن كثافة الطلاء أعلاه والتي لا توجد فروق مزيد يمكن حلها، إما لأنهم منمجموعة من تصوير أو لأن الخلايا لا تنجو من الازدحام بين عشية وضحاها. وبالمثل، إذا كان أحد لوحات تناقص كثافة الخلية، يمكن للمرء قياس كثافة الخلية الحد الأدنى الذي لا توجد تغييرات أخرى في الإشارة. النطاق الديناميكي للمقايسة يتضمن فقط كثافة الطلاء بين الحد الأدنى والحد الأقصى لعدد خلايا / جيد يمكن حلها. ونحن لا تقاس النطاق الديناميكي الكامل لهذه المقايسات خاصة لأن خلايانا لا البقاء على قيد الحياة بشكل جيد في كثافة تتجاوز تلك التي يتم الإبلاغ عنها.

بعد الأمثل، ونحن الآن وصمة عار الخلايا العصبية N2A الفأر مع المضادة للα-تويولين في 1:10،000 التخفيف، مع المضادة للماوس مفتش في التخفيف 1:2000، ومع حلول DRAQ5 + الياقوت في 1:20،000 و1:2،000، على التوالي. ونحن أيضا استخدام 25 ميكرولتر من الكواشف مقايسة ATP في وسائل الإعلام 50 ميكرولتر. ويوضح النتائج في ظل هذه الظروف في أرقام 3A، B، و C ونشرت قبل احتسابه 8. قوة الإشارة في جميع المقايسات ثلاثة ارتبط بشكل كبير مع عدد من خلايا لكل بئر. على الرغم من أن جميع المقايسات الثلاثة كانوا خطي للغاية، وكانوا لا يعادل في الحساسية. على سبيل المثال، لم خلايا لكل بئر 5K يكن لديك بالضبط نصف كمية الأشعة تحت الحمراء كما تلطيخ 10K خلايا لكل بئر. وعلى النقيض من فحوصات الأشعة تحت الحمراء، وكان الفحص ATP أكثر حساسية للتغيرات في كثافة الطلاء. وبعبارة أخرى، انخفض بنحو النصف التلألؤ من 10K 5K لو5K من ل2.5K خلايا لكل بئر. على الرغم من هذه النتائج على أعلى حساسية للمقايسة ATP، فمن الأفضل لأداء جميع المقايسات الثلاث للبقاء للحصول على صورة أوسع للصحة الخلوية.

نحن الآن وصمة عار الفئران الثقافات العصبية الأولية مع المضادة للMAP2 في التخفيف 1:2،000، مع المضادة للماوس مفتش في 1:1،000 التخفيف، ومع حلول DRAQ5 + الياقوت في 1:10،000 و1:1،000، على التوالي، واستخدم 25 ميكرولتر من الكواشف مقايسة ATP في 50 ميكرولتر وسائل الإعلام (أرقام3D، E، F و). كان قوة الإشارة في DRAQ5 + الياقوت مقايسة أقل خطية من جميع المقايسات الثلاثة لأنه لم يكن هناك فرق كبير بين 100K 200K وخلايا لكل بئر في القناة 700 نانومتر. ومع ذلك، كان قوة الإشارة في 700 نانومتر جيدا بما يتناسب مع عدد الخلايا أدناه 100K خلايا لكل بئر، ونحن دائما وحة الثقافات العصبية في خلايا 100K لكل بئر على أي حال. ومع ذلك، لاحظنا أيضا أن DRAQ5 + الياقوت مقايسة ليست حساسة للعلاج السم كما الأخريين المقايسات (انظر أدناه). وعلى النقيض من DRAQ5 + الياقوت، وكانت قوة الإشارة في أفضل يتناسب مع كثافة الطلاء لكل من MAP2 والمقايسات ATP. تجدر الإشارة إلى أن حجم أكبر من الكواشف مقايسة ATP يمكن أن تحسن النتائج في 200K خلايا لكل بئر. وبعبارة أخرى، يمكن أن ترفع الانتاج الى الانارة بالضبط 200٪ من القيم في 100K خلايا لكل بئر لأن هناك ما هو أكثر كاشف. ومع ذلك، لم نكن لوحة الثقافات القشرية في ذلك ارتفاع كثافة الطلاء لexperimeاليلة. ونحن أيضا وجدت أن MAP2 وATP مستويات حساسة إلى 20٪ التغيرات في القشرة المخية الحديثة العصبية كثافة الطلاء، بدءا من 20K خلايا لكل بئر إلى 120K الخلايا لكل بئر 22. ومع ذلك، ينبغي أن المحققين الأخرى اختبار هذه المقايسات في المختبر خاصة بهم بدلا من استخدام الظروف المثلى من تجاربنا بسبب التباين بين مختبر في الأنسجة والتعامل مع الخلية.

من أجل توضيح فائدة هذه العلاجات التالية المقايسات مع السموم، وتبين لنا منحنيات الاستجابة للجرعة الخلايا N2A تعامل مع MG132، مثبط proteasome و(الشكل 4). تم تطبيق MG132 في وجود أو عدم وجود الجلوتاثيون السلائف N-أسيتيل السيستين. ويمكن أيضا أن هذه البيانات يمكن العثور عليها في المنشور لدينا مؤخرا على آثار وقائية من N-أسيتيل السيستين 30. ويعاير خلايا 48 ساعة التالية العلاجات MG132. MG132 انخفضت الجرعة وبشكل تابع DRAQ5 + الياقوت إشارة (أرقام 4A، D) وα تويولين إشارة ( 50 القيم في غياب أو وجود N-أسيتيل السيستين. كانت المعادلة المستخدمة Y = 100 / (1 ​​+ 10 ^ ((منطق 50-X) * HillSlope))). بلغت قيمة IC 50 لDRAQ5 + الياقوت 1.64 ميكرومتر MG132 (50 = 0.22 المنطق ± 0.03، R 2 = 0.9477، هيل المنحدر = -1.26) ومستويات α تويولين كان 1.96 ميكرومتر MG132 (50 = 0.29 المنطق ± 0.04، R 2 = 0.9296، هيل المنحدر = -1.349). تحولت N-أسيتيل السيستين منحنيات إلى اليمين، مما يشير إلى أن أكثر MG132 كان مطلوبا لقتل الخلايا في وجود هذا المركب واقية. بحضور N-أسيتيل السيستين، بلغت القيمة IC 50 لDRAQ5 + الياقوت 4.64 ميكرومتر MG132 (50 = 0.67 المنطق ± 0.05، R 2 = 0.8732، هيل المنحدر = -1.06) وα-تويولين كان 6.35 ميكرومتر MG132 ( منطق 50 = 0.80 ± 0.04، R 2 = 0.8802، هيل المنحدر = -10.382). وذكرت الدراسة واحدة من الخلايا N2A بواسطة ماديرا وزملاؤها فقدان ما يقرب من 50٪ من الجدوى في 10 ميكرومتر MG132، مقاسا مقايسة الإنتقالي العسكري 31. ذكرت Fioriti فقدان 60٪ من ساعة الجدوى 4 بعد العلاج مع 50 ميكرومتر MG132، ومرة أخرى مع مقايسة الإنتقالي العسكري 32. أخيرا، ذكرت تشانغ وزملاؤه خسارة 60٪ من الجدوى في 10 ميكرومتر MG132، وذلك باستخدام حسابات من نوى هويشت الملون-33. هذه القيم IC 50 هي أعلى من بلدنا. ومع ذلك، فإننا مقايسة للبقاء 48 ساعة بعد بدء العلاج، على عكس هذه الدراسات السابقة.

وفقا لخلية عيار جلو الفحص، أثيرت مستويات ATP في تركيزات منخفضة من MG132 (الشكل 4C)، مما يدل على أن مستويات ATP ليست بالضرورة في نسبة لعيار الخلية على العلاج. البيانات ATP مع ذلك مفيدة لأنها توضح أن N-أسيتيل السيستين أيضا يحمي وظيفة التمثيل الغذائي عندما يتم التعامل مع الخلايا N2A MG132. ويتجلى هذا في رانه تحول في قيمة IC 50 من MG132 مع N-أسيتيل السيستين. بلغت قيمة IC 50 لاعبي التنس المحترفين 3.05 ميكرومتر MG132 (50 = 0.48 المنطق ± 0.07، R 2 = 0.8616، هيل المنحدر = -1.0) مع السيارة و9.12 ميكرومتر MG132 مع N-أسيتيل السيستين (50 = 0.96 المنطق ± 0.04، R 2 = 0.9261، هيل المنحدر = -1.0). نلاحظ أن التركيزات التي أدت إلى ارتفاع في ATP استبعدت في هذا التحليل. بما في ذلك كافة القيم في تحليل خفض معامل التحديد وزيادة القيم IC 50 إلى 4.03 ميكرومتر MG132 (50 = 0.61 المنطق ± 0.09، R 2 = 0.7224، هيل المنحدر = -1.4) في وجود السيارة و9.24 ميكرومتر MG132 (50 = 0.96 المنطق ± 0.07، R 2 = 0.6607، هيل المنحدر = -2.1) في وجود N-أسيتيل السيستين (على النقيض مع الشكل 4C).

ويتضح والمثال الثاني من هذه المقايسات الثلاثة للثقافات الأولية في الارقام ..ه 5. تم microdissected الأنسجة من القشرة المخية الحديثة الفئران والقشرة العريقة، فصلها، مطلي 100K في خلايا لكل بئر، وتعامل بالتوازي مع H 2 O 2. اختبرنا الفرضية القائلة بأن هذه المناطق في الدماغ اثنين سوف تختلف في تعاملها الاكسدة كما هي عرضة بشكل مختلف لأمراض الاعصاب 34-39. وقد نشرت بعض هذه البيانات قبل وتناقش نتائج أخرى في هذه الدراسة 22. كانت القيم IC 50 لDRAQ5 + الياقوت 22.84 ميكرومتر H 2 O 2 في القشرة المخية الحديثة (المنطق 50 = 1.36 ± 0.07، R 2 = 0.7552، هيل المنحدر = -0.95) و24.63 ميكرومتر H 2 O 2 في القشرة العريقة (50 = 1.39 المنطق ± 0.03، R 2 = 0.9379، هيل المنحدر = -1.74). كانت القيم IC 50 لMAP2 11.66 ميكرومتر H 2 O 2 في القشرة المخية الحديثة (المنطق 50 = 1.07 ± 0.04، R 2 = 0.9332، هيل المنحدر = -2.13) و 29.76 ميكرومتر H 2 O 2 في القشرة العريقة (50 = 1.47 المنطق ± 0.04، R 2 = 0.8934، هيل المنحدر = -4.45). كانت القيم IC 50 لاعبي التنس المحترفين 23.82 ميكرومتر H 2 O 2 في القشرة المخية الحديثة (المنطق 50 = 1.38 ± 0.03، R 2 = 0.8907، هيل المنحدر = -2.56) و 44.5 ميكرومتر H 2 O 2 في القشرة العريقة (50 = 1.65 المنطق ± 0.03 ، R 2 = 0.9204، هيل المنحدر = -2.71). كان القشرة العريقة بشكل ملحوظ أكثر مقاومة للالاكسدة من القشرة المخية الحديثة في تركيزات H 2 O 2 أقل من 50 ميكرومتر، ولكن DRAQ5 + الياقوت مقايسة أقل حساسية في توضيح هذا الاختلاف. قد يعكس هذا أن الفحص الأخير لا يمكن التمييز بين الخلايا العصبية الدبقية من، على عكس MAP2. كما ذكر آنفا، ثقافاتنا تحتوي على بعض الخلايا الدبقية، ويتم حصادها من الدماغ ما بعد الولادة 22. من المستغرب، على تركيزات عالية من H 2 O 2 (75 ميكرومتر وما فوق)، عندما تكون جميع MAP2 + الخلايا النجمية في هذه الثقافات هي أكثر مقاومة للH 2 O 2 من MAP2 + الخلايا العصبية (لا يظهر)، ونحن نفترض أن الخلايا النجمية القشرة المخية الحديثة هي أقل عرضة للالضرر التأكسدي من الخلايا النجمية allocortical. قد ينعكس هذا النمط في DRAQ5 + الياقوت فحص ولكن لا مقايسة ATP لأن الخلايا النجمية التالفة oxidatively ليست قابلة للحياة عملية الأيض. أيا كان السبب وراء هذه الأنماط ضرب، ويوضح هذه البيانات الأولية الثقافة هنا فقط لتكشف عن أن المقايسات ليست دائما في الاتفاق.

أخيرا، من أجل توضيح التباين الصفائحية مع جميع المقايسات الثلاث، ونحن تآمر نقاط البيانات الخام من آبار 'الثانية والثالثة من منحنيات الاستجابة للجرعة المذكورة في أرقام 6A-C و6G-I >. وبالمثل، من أجل توضيح التباين interplate، ونحن تآمر متوسط ​​نقاط البيانات الخام (يعني من الآبار ثلاث نسخ) من اثنين من لوحات أرقام في 6D-F و6J-L. قوة الإشارة في الآبار وعبر تكرار تجارب مستقلة أظهرت ارتباط كبير لكل التدبير. كان هناك بعض التباين في القيم الخام عبر تجارب مستقلة في الثقافات العصبية الأولية، ربما لأننا إعادة استخدام الأجسام المضادة القديمة وحلول DRAQ5 + الياقوت واعادة تجميد غير المستخدمة ATP فحص الكواشف بضع مرات. سبب آخر لارتفاع التقلبات interplate في الثقافات الأولية قد تكون نوعية الثقافة نفسها. متفاوتة فترات بعد الوفاة والتعامل مع الأنسجة في مختلف أيام التجريبية يمكن أن تسهم في التباين.

JPG "/>
الشكل 1. تخطيطي التوضيح من جميع المقايسات ثلاثة الجدوى (A) والجدول الزمني لفحوصات الأشعة تحت الحمراء (B). أظهرت هي الإجراءات الموصى بها للخلايا N2A. إذا حلول DRAQ5 + الياقوت لن يتم استخدامها على لوحات أخرى ملطخة الأجسام المضادة الثانوية المختلفة، فإنها يمكن أن تكون مجتمعة مع مكافحة فأر حل الضد الثانوية للنهائي 1 ساعة الحضانة، والحد من الإجراء خطوة واحدة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. شكل لوحة للمقايسة ATP (A) وفحوصات الأشعة تحت الحمراء (B) التي تم وصفها في المقطع الإجراءات. على الرغم من أنلوحة 96 جيدا تتجلى هذه المقايسات يمكن تكييفها لتنسيقات أخرى، مثل 384 لوحات جيدا، لانقاذ على الكواشف والخلايا. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
الرقم 3. الانحدارات الخطية لجميع المقايسات بقاء ثلاثة في الخلايا العصبية N2A الماوس (A، B، C) أو بعد الولادة الفئران الخلايا العصبية الأولية القشرة المخية الحديثة (D، E، F). يتم رسم قوة الإشارة لكل مقايسة بوصفها وظيفة من كثافة الطلاء. تظهر صور الأشعة تحت الحمراء إدراجات ممثل DRAQ5 + الياقوت (A، D)، α-تويولين (B)، أو MAP2 (E) وصمة عار. يتم سرد القيم كثافة الخام أسفل كل صورة. لاحظ أن القيم الخام فيقد يكون جيدا فرد يختلف عن المتوسط ​​من 3 آبار لتلك التجربة وعن متوسط ​​من 3-4 تجارب مستقلة. تم pseudocolored الصور بالأشعة تحت الحمراء الأصلي الحمراء (700 نانومتر) أو الأخضر (800 نانومتر). تم تنفيذ كل تجربة في ثلاث نسخ الآبار و3X المتكررة لDRAQ5 + الياقوت في كل من خلايا N2A والخلايا العصبية الأولية، 3X لα-تويولين، 4X لMAP2، 3X لATP في الخلايا N2A، و4X لATP في الخلايا العصبية. وبلغ متوسط ​​البيانات من الآبار ثلاث نسخ لقيمة واحدة النهائي لكل من 3-4 التجارب. يظهر متوسط ​​ووزارة شؤون المرأة من هذه القيم النهائي 3-4 في الرسم البياني. لاحظ أن DRAQ5 + الياقوت القيم تظهر الانحرافات المعيارية منخفضة بحيث القضبان SEM غير مرئية. ويوضح معامل R 2 تقرير واثنين من الذيل قيمة ع تقييم أهمية العلاقة أيضا لكل التدبير. وقد تم تحليل البيانات في GraphPad بريزم (الإصدار 5.0). طبع من الكيمياء العصبية الدولية، 61، من خلال Unnithوآخرون: "الانقاذ من اثنين ضرب نموذج عالية الإنتاجية من تنكس عصبي مع السيستين N-أسيتيل"، ص 356-368، بإذن من السيفير. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 4
الشكل 4. حماية الخلايا ضد N2A MG132 سمية. تم علاج الخلايا N2A مع تركيزات مبين من MG132 proteasome والمانع في وجود أو عدم وجود مضادات الأكسدة N-أسيتيل سيستين (NAC؛ 3 ملم). أجريت جميع المقايسات بقاء ثلاثة بعد 48 ساعة. ملاحظة ارتفاع في مستويات ATP في تركيزات منخفضة من MG132 (C). أي زيادة موازية في DRAQ5 + الياقوت تلطيخ (A) سكان ص α-تويولين (B) واضحة. تم pseudocolored الصور بالأشعة تحت الحمراء ممثل DRAQ5 + الياقوت والبقع-α تويولين الأحمر والأخضر في D و E على التوالي. تم تنفيذ كل تجربة في ثلاث نسخ الآبار و4x والمتكررة لDRAQ5 + الياقوت، 4X لα-تويولين، و3X لاعبي التنس المحترفين. وبلغ متوسط ​​البيانات من الآبار ثلاث نسخ لقيمة واحدة النهائي لكل من 3-4 التجارب. يظهر متوسط ​​ووزارة شؤون المرأة من هذه القيم النهائية 3-4. * ص ≤ 0.05 للمقارنة بين N-أسيتيل السيستين مقابل المياه، وتصحيح Bonferroni التالية في اتجاهين ANOVA. وقد تم تحليل البيانات في GraphPad بريزم (الإصدار 5.0). طبع من علم الأعصاب، 255، جيانغ آخرون: "N-أسيتيل السيستين يضعف proteotoxicity في الحرارة صدمة التي تعتمد على البروتين بطريقة"، ص 19-32، بإذن من السيفير. Cلعق هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 5
الرقم 5. التفاضلية ضعف الثقافات القشرة المخية الحديثة وallocortical لسمية بيروكسيد الهيدروجين. تم فصلها Microdissections المحرك الأساسي بعد الولادة والقشرة المخية الحديثة الحسية والقشرة العريقة المخية الأنفية الداخلية والكمثري ومطلي الخلايا في 100K لكل بئر. في يوم 2 في المختبر، تم علاج الخلايا مع تركيزات مبين من H 2 O 2. ويعاير لوحات بعد 48 ساعة. نلاحظ أن القشرة العريقة ينجو هذه الظروف زراعة أفضل من القشرة المخية الحديثة، ولها أرقام الخلية أعلى في الأساس. تم تنفيذ كل تجربة في ثلاث نسخ الآبار و4x والمتكررة لDRAQ5 + الياقوت، 3X لMAP2، و6X لاعبي التنس المحترفين. وبلغ متوسط ​​البيانات من الآبار ثلاث نسخلقيمة واحدة النهائي لكل من 3-6 التجارب. يظهر متوسط ​​ووزارة شؤون المرأة من هذه القيم النهائية 3-6. * ص ≤ 0.05 للمقارنة بين النيو مقابل القشرة العريقة، وتصحيح Bonferroni التالية في اتجاهين ANOVA. وقد تم تحليل البيانات في GraphPad بريزم (الإصدار 5.0). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 6
الرقم 6. الارتباطات الصفائحية وinterplate لMG132 وH 2 O 2 منحنيات استجابة جرعة في خلايا N2A والخلايا العصبية القشرية. تم تشغيل جميع التجارب الفردية في الآبار ثلاث نسخ. تم التخطيط البيانات الخام من بئرين الثاني في كل مجموعة كما يعيد 1 و 2 لقياس استنساخ في لوحات (A، C لخلايا N2A وG، H، وأنا لقشرة). تم التخطيط البيانات من نفس المجموعات في تجربتين المستقلة (يعني من الآبار ثلاث نسخ) كما لوحة 1 و 2 لوحة لقياس استنساخ عبر لوحات (D، E، F وللخلايا N2A وJ، K، L للقشرة). ويوضح معامل R 2 تقرير واثنين من الذيل قيمة ع تقييم أهمية العلاقة أيضا لكل التدبير. وقد تم تحليل البيانات في GraphPad بريزم (الإصدار 5.0). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد وجدنا أن قوة الإشارة في جميع المقايسات بقاء ثلاثة هي الخطية والمترابطة مع كثافة الطلاء. ومع ذلك، ليس كل المقايسات حساسة بالتساوي على 2 أضعاف أو تغييرات 1.5 أضعاف في كثافة الطلاء. لخلايا N2A، والأشعة تحت الحمراء هي فحوصات أقل حساسية من فحص ATP، ولا سيما في أقل كثافة الطلاء. على الرغم من أن فحوصات الأشعة تحت الحمراء هي أقل حساسية من ATP، وDRAQ5 + الياقوت المقايسات والمقايسات α-تويولين هي في اتفاق جيد من حيث أنها تكشف عن تأثير واقية للغاية من N-أسيتيل السيستين. كان هناك فقدان للجرعة استجابة لإشارة الأشعة تحت الحمراء مع كل من المقايسات وتم نقل جميع منحنيات بقاء ثلاثة إلى اليمين مع N-أسيتيل السيستين. ولم يلاحظ هذا التداخل دائما لجميع أنواع علاجات الخلايا N2A، كما α-تويولين وATP المقايسات يبدو أن تكون أكثر حساسية لمركبات مثل كلوريد الأمونيوم من DRAQ5 + الياقوت فحص (انظر الشكل 4 في Unnithan وآخرون. 8 ). وبالتالي، صلاحية phenotypليست دائما تمثل وفاق على قدم المساواة من جميع المقايسات الثلاثة. على الرغم من أن الفحص ATP كان في أفضل نسبة لعدد الخلايا N2A مطلي من α-تويولين وDRAQ5 + المقايسات الياقوت، على افتراض أن قوة الإشارة يعكس أعداد الخلايا لم تتحقق دائما بعد العلاج السم. ارتفعت مستويات ATP بتركيزات السم الذي لم انتزاع ارتفاع مماثل في إشارة في فحوصات الأشعة تحت الحمراء. تكشف هذه البيانات التغيرات الأيضية التعويضية في الخلايا N2A ردا على proteasome وتثبيط ومفيدة في حد ذاتها. لاعبي التنس المحترفين منحنى الاستجابة للجرعة على شكل حرف U هو سمة من ظاهرة تسمى إنهاض. يتم تعريف إنهاض كما التفاعلات البيولوجية مواتية لالتعرض منخفض المستوى للسموم وغيرها من الضغوطات 40-42.

لالخلايا العصبية، وكان DRAQ5 + الياقوت وصمة عار أقل حساسية من MAP2 والمقايسات ATP بكثافات عالية الطلاء. ومع ذلك، كانت DRAQ5 + الياقوت، MAP2، والمقايسات ATP بشكل جيد بما يتناسب مع معدد يرة لبنانية في الخلايا العصبية القشرية الأولية أو يقل 100K خلايا لكل بئر. نحن لوحة الخلايا العصبية في خلايا لكل بئر 100K. ليست معروفة الخلايا العصبية من القشرة لتكرار، وبالتالي، كنا أكثر قلقا بشأن الخطي في 100K أو أقل كثافة الطلاء. كان DRAQ5 + الياقوت مقايسة أقل حساسية للاختلافات بين القشرة المخية الحديثة والقشرة العريقة من أي MAP2 أو ATP بتركيزات أقل من 50 ميكرومتر H 2 O 2. وعلاوة على ذلك، لم مستويات ATP لا يسقطون بشكل كبير على H 2 O 2 معاملة إشارة الأشعة تحت الحمراء في الأخريين المقايسات، مما يشير ربما مرة أخرى زيادات تعويضية في الناتج ATP. قد تعكس التناقضات بين ثلاثة فحوصات في الخلايا N2A والخلايا العصبية الأولية أن الوظائف الخلوية يمكن أن تتغير قبل تتأثر الهياكل التشريحية الإجمالي، وأن هياكل الخلية، بما في ذلك البروتينات هيكل الخلية، يمكن أن يتأثر قبل فترة طويلة من الخلايا هي نفسها فقدت. بيانات حديثة عن المقايسات الجدوى متعددة من قبل جيلبرت وزملاؤه مقنعتوضيح أن التدابير الجدوى مختلفة مثل هويشت تلطيخ النووية والقياسات ATP تعطي معلومات عن الخصائص الخلوية محددة جزئيا وبشكل غير مباشر فقط يعكس قابلية ككل 26. لذا نوصي تنفيذ جميع المقايسات الثلاثة في وقت واحد وليس الاعتماد على فحص واحد للبقاء الأيض العديد من المنشورات القيام به. لمزيد من المعلومات حول أي من هذه التدابير، ونحن نوصي عد الخلايا الفردية ومن ثم تقييم هيكل الخلية البروتين التعبير ومستويات ATP بوصفها وظيفة من عدد الخلايا.

على الرغم من أن هناك فحوصات أخرى للبقاء الأيضية، مثل الإنتقالي العسكري، والاستفادة من مقايسة ATP تكمن في حساسيته والنطاق الديناميكي. مقايسة الإنتقالي العسكري يمكن أن نبالغ في تقدير عدد من خلايا قابلة للحياة في مقارنة لقياسات ATP ويسلك على IC 50 الذي هو شقين أعلى 43. علاوة على ذلك، ذكرت تافه وزملاؤه ان الفحص يمكن ATPالكشف عن الحد الأدنى 1563 خلايا لكل بئر في حين أن الفحص الإنتقالي العسكري لا يمكن الكشف عن أقل من 25K خلايا / جيد 12. نسبة الإشارة إلى الضوضاء (إشارة من الآبار مع الخلايا الحية مقابل الآبار مع عدم وجود خلايا) هو 7 فقط لالإنتقالي العسكري ولكن لاعبي التنس المحترفين 230 44. ميزة أخرى لفحوصات ATP الانارة على MTT هو أن فترة حضانة أقصر من ذلك بكثير. بالإضافة إلى ذلك، فحص MTT من PROMEGA يكلف 0.28 ¢ لكل بئر في حين أن الخلية عيار جلو فحص من نفس الشركة المصنعة تكلف 0.09 ¢ لكل بئر في التخفيفات لدينا الموصى بها. ومع ذلك، هناك قيود لجميع المقايسات الأيض؛ النشاط الأيضي يمكن أن يكون وفكت من البقاء، وخصوصا خلال النخر. إذا كان هذا هو مصدر قلق، والمقايسات في هذا التقرير يمكن دمجها مع القياسات الإفراج نازعة اكتات للتأكد من سلامة فقدان الغشاء. فإن هذا لا ينطوي على أي لوحات إضافية، كما يتم إجراء قياسات نازعة اكتات ببساطة في المتوسط ​​خارج الخلية.

على الرغم من أننا نقدم هذه المقايسات كبدائل للتعداد دليل على المجهر، ويمكن هذا الأخير أن يكون وسيلة حساسة للغاية ودقيقة من عدد الخلايا أخذ العينات إذا أجريت بشكل صحيح. في الواقع، ونحن نتوقع أن التهم من نوى هويشت الملون وسوف تكون أكثر حساسية للتغيرات صغيرة في عدد الخلايا N2A من DRAQ5 + الياقوت الفحص. عندما تكون كافة المقايسات فشل في الاختبار الخطي، دليل التهم ضرورية. وخير مثال على هذا هو موقفنا مثقف نموذج نجمية الأولية، التي نؤدي دليل أكثر شاقة التهم 45. ومع ذلك، يجب أن تتحمل التحيزات الكامنة في التهم اليدوي في الاعتبار عند تفسير البيانات عدد خلايا، كما أن العيوب المتأصلة في المقايسات محوسبة يجب ألا نحى جانبا. ولذلك وصف عدد من نقاط القوة والضعف في المقايسات الجدوى أدناه.

أولا، إذا تستخدم دابي أو هويشت البقع، وغالبا ما نوى المعينة منكمشة ومكثف كما1 أفكارك. ومع ذلك، حجم الخلية والتكثيف من نوى الواقعة على طول سلسلة متصلة على نحو سلس. في المقابل، الحياة والموت لا يجتمعان، الظواهر الثنائية. ما لم يتم احظ مجموعتين متميزتين جدا من الخلايا الحية أو الموت، على ما يبدو أفضل لحساب كافة الخلايا دون عتبة قطر النووية أفكارك مع برامج التصوير مثل MetaMorph أو يماغيج بدلا من العين. وبطبيعة الحال، فإن اختيار قطر عتبة هو إجراء تعسفي لأننا لا نعرف ما هي النقطة يبدأ شلال أفكارك لا رجعة فيه. وعلاوة على ذلك، بحكم تعريفها، حتى مع خلايا كاسباس 3 تفعيلها ليست بالضرورة في طريقها الى الموت وربما ينبغي أن يحسب كما لا تزال على قيد الحياة في وقت التثبيت 46. لدينا فحوصات الأشعة تحت الحمراء تجنب مثل هذه المخاوف من خلال معالجة جميع الخلايا التي تعلق على لوحة في وقت التثبيت كما لا تزال تعيش فيه. فقط يتم عد الخلايا التي طرحت بعيدا في عداد الموتى. هذا يضع الخلايا في أي من فئتين متميزتين ويتجنب المزالق من استخدام المشتركmplex، وظيفة مستمرة مثل قطر النووية.

ثانيا، دليل التهم عينة عادة جزء صغير من البئر بأكمله. هذا يمكن أن يؤدي إلى تحيز وأخذ العينات، في بعض الأحيان، وأخطاء مستوى عال من المتوسط. مع المقايسات الجدوى لدينا، يتم أخذ عينات البئر كامل للاعبي التنس المحترفين وعلى مقربة من البئر كله عينات مع فحوصات الأشعة تحت الحمراء. هذا النمط أخذ العينات يزيد حجم العينة ويتجنب القرارات التعسفية في بعض الأحيان من حيث في البئر لالتقاط صورة لدليل التهم. إذا يتم التقاط صورة من وسط البئر، لا بد من الأخذ في الاعتبار أن هذه المنطقة هي من حيث غسل معظم خلايا يحدث، مما يؤدي إلى مبالغات المحتملة السمية. في المقابل، فإن فحوصات الأشعة تحت الحمراء رمي شبكة على الصورة من لوحة 96 جيدا أن يستثني فقط زوايا المدقع من الآبار. إذا رغبت في ذلك، يمكن إدراج زوايا الآبار عن طريق زيادة القطر من الدوائر في الشبكة.

ثالثا، ينبغي أن يكون أعمى المصور والعداد الخلية سواء أثناء العد اليدوي. ومع ذلك، مرة واحدة يتم التعامل مع الخلايا مع السموم، فإنها غالبا ما تحمل التغيرات المورفولوجية التي هي واضحة تماما حتى إلى عين غير المدربة. هذا يجعلها أكثر من ذلك بكثير تحديا لتظل منحازة. العمى ليس شرطا لفحوصات لدينا.

الرابعة، والتهم هي دليل تستغرق وقتا طويلا وتكلف أكثر الباحث الرئيسي في الراتب. الرواتب هي واحدة من أعلى تكاليف إجراء البحوث. الوقت مسح لوحة واحدة على أوديسي ليست سوى 8 دقائق طويلة على "جودة متوسطة" الإعداد ويمكن خفض مزيد من الإعداد على "جودة منخفضة". تجدر الإشارة إلى أن تصوير أوديسي هي مكلفة، حتى عند واحد يشتري النسخة التجريبية المستعملة، وإنما هو التكلفة الثابتة لمرة واحدة. من ناحية أخرى، وعلى المرء أيضا للاستثمار في المجاهر epifluorescence مكلفة نسبيا لعدد خلايا اليدوي للدابي أو Hنوى oechst الملون. على الرغم من التكلفة الأولية، وتصوير أوديسي هو آلة متعددة الأغراض الذي يقيس أيضا immunoblots الغربية بطريقة كمية 47،48. تكيفنا استخدام الأوديسة لquantifications من المناعية في هياكل الدماغ العيانية مثل الفئران أو الماوس أو قشرة الدماغ الانتهائي المخطط. كما تم استخدام هذا النهج من قبل الآخرين 49. واحد ضعف تصوير أوديسي لتصوير الأنسجة هو أن أعلى القرار هو فقط 21 ميكرون. ولذلك لا يمكن الاعتماد الخلايا الفردية وليس المقصود بها لتصور التفاصيل التشريحية الدقيقة.

أخيرا، قد لا يكون فحوصات الأشعة تحت الحمراء حساسة للتغيرات صغيرة في عدد الخلايا كما تهم اليدوي. ولذلك لا يمكن اعتبار القيم IC 50 كما تبين تركيز الذي يتسبب فقدان بالضبط 50٪ من أعداد الخلايا، ولكن فقط لأن تركيز الذي يتسبب فقدان 50٪ من إشارة الأشعة تحت الحمراء. هذا التحذير ربما ينطبق علىجميع المقايسات الجدوى التي تتحايل عدد الخلايا الفردية بواسطة المجهر وأخذ عينات من البئر كله في آن واحد. عدم الدقة المرتبطة بمثل هذه المقايسات قد تكون وظيفة من تضخم، وضمور، أو غيرها من التغييرات في مظهر التي تؤثر على قوة الإشارة. على سبيل المثال، مع بعض السموم، α-تويولين تفاعلية مناعية في كل خلية قد ترتفع بوصفها وظيفة من السمية. وقد لاحظنا هذه الظاهرة في الخلايا N2A تعامل مع تركيزات عالية جدا من MG132 8. إذا كان هذا هو مصدر قلق، وغيرها من البروتينات علامة هيكل الخلية، مثل β-الأكتين أو GAPDH يمكن استخدامها. علاوة على ذلك، شدد خلايا N2A تميل إلى تشكيل عمليات القطبين 8،50،51. مع التغيرات في حجم الخلية، سيتم إخراج إشارة الفلورسنت لكل خلية تختلف أيضا عبر مجموعات العلاج. نوصي أن الخلايا المعالجة السم أن يفحصه القياسية عالية الدقة المجهر التالية كيمياء سيتولوجية مناعية لنفس علامات كما هو مستخدم في في خلية الغربية. إذا تغير كثيرا في حجم السيتوبلازم على العلاج ولكننواة لا، ونحن نوصي باستخدام وصمة عار DRAQ5 دون الياقوت لتحديد نوى فقط. هناك ما يبرر الدراسات المستقبلية مع الأصباغ المختلفة ومع غيرها من البروتينات وفيرة هيكل الخلية أو غيرها للتغلب على هذه العقبات.

نستنتج أن جميع المقايسات يعانون من المحاذير وأثارت مخاوف بشأن الحساسية، والخطي، خطأ أخذ العينات، ونسب الإشارة إلى الضوضاء، والتحيز الإنسان أو الذاتية، والوقت والتكلفة. وعلاوة على ذلك، فإن جميع المقايسات الاعتماد على الافتراضات التي لم يتم الوفاء دائما. ولذلك، فإننا نوصي بأن اثنين على الأقل من المقايسات أن تستخدم لوصف آثار العلاج على مزارع الخلايا، واحد الذي يقيس الصحة الأيضية واحد يعتمد على الجدوى التشريحية. بهذه الطريقة، يمكن للمرء التأكد على نحو أكثر فعالية سواء المركبات العلاجية حماية كل من البنية والوظيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أي من الكتاب لديك أي صراعات في الكشف عنها.

Acknowledgments

نحن نعترف جوليان Jaumotte لفكرة الادخار على كميات الكواشف في مقايسة ATP. نحن ممتنون للغاية للدعم الإداري رائعة مريم كاروسو، ديب ويلسون، وجاكي وفيرر إلى مدرسة MYLAN الصيدلة لتوفير الدعم المالي لهذه الدراسات. وذلك بفضل هي نتيجة لأمراض Hunkele مخيف مؤسسة وباركنسون واضطرابات الحركة مؤسسة على دعمها المالي من الدراسات العصبية الأولية أيضا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Titer Glo Promega G7572 Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin Thermo-Shandon 9990244 Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block LI-COR 927-40003 This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 21568 We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic Fisher S468 One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic Fisher S373 See above
Sodium Azide (250x) Ricca Chemical Company 7144.8-16 Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin Sigma-Aldrich T5168 This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2 Sigma-Aldrich M9942 This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG LI-COR 926-32210 Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5 Biostatus DR50200 This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire LI-COR 928-40022
Luminometer PerkinElmer VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager LI-COR 9201-01
Shaker/Mixer Research Products International 248555

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
  2. Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
  3. Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
  4. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
  5. Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
  6. Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
  7. Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
  8. Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
  9. Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
  10. Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
  11. Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
  12. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  13. Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
  14. Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
  15. Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
  16. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
  17. Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
  18. Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
  19. Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
  20. Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
  21. Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
  22. Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
  23. Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
  24. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
  25. Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
  26. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
  27. Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
  28. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
  29. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
  30. Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
  31. Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
  32. Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
  33. Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
  34. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
  35. Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
  36. Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
  37. Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
  38. Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
  39. Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
  40. Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
  41. Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
  42. Mattson, M. P. Hormesis defined. Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
  43. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
  44. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  45. Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
  46. McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
  47. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
  48. Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
  49. Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
  50. Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
  51. Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).

Tags

علم الأحياء الخلوية، العدد 83، وفي خلايا الغربية، DRAQ5، الياقوت، خلية عيار جلو، ATP، الخلايا العصبية القشرية الأولية، سمية، حماية، N-أسيتيل السيستين، إنهاض
فحوصات قابلية للخلايا في الثقافة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Posimo, J. M., Unnithan, A. S.,… More

Posimo, J. M., Unnithan, A. S., Gleixner, A. M., Choi, H. J., Jiang, Y., Pulugulla, S. H., Leak, R. K. Viability Assays for Cells in Culture. J. Vis. Exp. (83), e50645, doi:10.3791/50645 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter